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研究文章

MMP7脱落Syndecan-1促进组织愈合的影响α2β1整合素激活

MMP7脱落Syndecan-1促进组织愈合的影响α2β1整合素激活

  • 彼得•陈
  • 劳拉·e·Abacherli
  • 塞缪尔·t·纳德勒
  • 应王
  • Qinglang李
  • 威廉·c·公园
公共科学图书馆
x

文摘

背景

肺损伤促进矩阵的表达metalloproteinase-7 (MMP7 matrilysin),中性粒细胞招募和组织愈合所需。MMP7支配肺部炎症反应通过syndecan-1的脱落。因为炎症和修复相关的事件,我们评估syndecan-1脱落在肺组织愈合的作用。

方法/主要发现

从野生型上皮损伤诱导syndecan-1脱落上皮但不从Mmp7−−/老鼠在体外和在活的有机体内。此外,细胞迁移和伤口关闭增强了MMP7 syndecan-1脱落。此外,我们发现syndecan-1细胞粘附增强胶原蛋白α的通过控制关联状态2β1整合素。

结论/意义

MMP7 syndecan-1促进伤口闭合的脱落导致α2β1整合素承担更少的活性构象从而消除限制移民。肺部MMP7行为调节炎症和修复,现在我们的数据表明,这些功能都是通过剥离syndecan-1控制。

引用:陈P Abacherli勒纳德勒圣王Y,李问,公园WC (2009) MMP7脱落Syndecan-1促进组织愈合的影响α2β1整合素激活。《公共科学图书馆•综合》4 (8):e6565。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565

编辑器:Neeraj Vij说,约翰霍普金斯大学医学院的美利坚合众国

收到:2009年6月13日;接受:2009年7月15日;发表:2009年8月10日,

版权:©2009 Chen等人。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作得到了国家卫生研究院的基金(HL08396电脑;HL077555 HL029594航空),美国肺脏协会生物医学研究格兰特(PC)和美国心脏协会开始补助金(PC)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

与环境相邻,粘膜表面不断暴露于毒性和致病性的侮辱[1],[2]。作为第一道防线,粘膜上皮细胞进化迅速应对各种形式的协调炎症反应而伤修复受伤的组织。MMP7 (matrilysin)、基质金属蛋白酶(MMP)家族的一员,是表达的粘膜表面和快速调节上皮损伤的反应[3]- - - - - -[11]。因此,MMP7功能促进修复和调节急性炎症反应[3]- - - - - -[7]。

肺由一个典型的粘膜上皮排列。像其他粘膜表面,伤肺迅速启动预定的响应招募炎症细胞和修复受损组织。MMP7的作用在调节修复并在肺部炎症尤为突出。事实上,肺表型是如此明显,组织愈合和中性粒细胞招募到肺泡空间几乎完全废除MMP7-deficient老鼠[3]- - - - - -[6]。我们组之前报道上皮脱落在活的有机体内由MMP7受伤的肺上皮细胞[5]。虽然我们建议上皮脱落可以促进修复重组和信息联系,新研究表明,MMP7脱落的上皮功能适应性免疫反应在反应损伤(McGuire et al .,未发表的观察)。在损伤的早期反应,MMP7促进炎症的脱落syndecan-1 / KC (CXCL8)复合物,允许transepithelial运动的中性粒细胞[4]。syndecan-1脱落的发生与组织愈合的发生重合,我们假设膜蛋白质水解的因素可能也在修复功能。

Syndecan-1是四个家庭的成员之一的跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与截然不同的表达模式和功能[12]。上皮细胞主要表达syndecan-1,从各种模型和观察表明,它参与伤口愈合[4],[13]- - - - - -[17]。例如,抑制syndecan-1表达在上皮细胞诱发pro-migratory表型[18],[19],这表明完整syndecan-1可能温和的组织愈合。与这个想法一致,syndecan-1表面水平下降在积极修复受伤的角膜和皮肤[20],[21],水平的提高syndecan-1 ectodomain出现在皮肤伤口液[22]- - - - - -[24]。Syndecan-1脱落的细胞表面是一个MMP-dependent过程在体外和在活的有机体内,MMP脱落syndecan-1诱发细胞迁移[25]。此外,MMP7已被确认为syndecan-1 sheddase肺粘膜[4],[25]- - - - - -[29]。

因为它可以调节修复,我们测试了syndecan-1的想法,减少受伤的肺上皮细胞功能,促进组织愈合。使用在体外和在活的有机体内模型,我们发现syndecan-1从损伤后修复上皮细胞脱落。此外,MMP7脱落syndecan-1增强细胞的迁移和伤口关闭。我们的数据进一步表明,syndecan-1抑制细胞迁移通过修改α的激活状态2β1整合素。我们的结果证实MMP7脱落syndecan-1促进肺组织愈合和作为一个统一的机制,调节急性炎症和修复。

结果

MMP7需要细胞迁移

气液界面(ALI)文化的气道上皮细胞分化成一个完整的黏膜纤毛的上皮细胞的表型和行为相似在活的有机体内上皮细胞提供一个相关的器官型培养系统研究气道粘膜上皮[6]。我们受伤的野生型(WT)和MMP7-null (Mmp7−−/)阿里文化和与延时显微观察伤口关闭(视频S1)。而受伤的WT上皮覆盖伤口的视野在24 h,Mmp7−−/细胞有一个戏剧性的无法关闭伤口。受伤的上皮细胞响应最初伤蔓延在伤口上紧随其后的是细胞增殖和迁移到受损区域[30],[31]。延时显微镜显示Mmp7−−/上皮似乎保留在伤口上传播的能力,因为这些细胞形成扩展lamellipodial方面受伤后不久。然而,只有WT上皮继续迁移,完成伤口愈合过程。这些数据需要确认MMP7组织愈合。

MMP7 syndecan-1脱落的修复

因为MMP7棚屋syndecan-1从反应肺上皮细胞损伤[4],我们评估如果释放的蛋白多糖在愈合的功能。免疫荧光信号syndecan-1是减少伤口WT阿里文化但仍在前面Mmp7−−/上皮损伤后图1一个)。细胞远端伤口,代表的上皮细胞,相当于syndecan-1 WT和之间的信号Mmp7−−/文化。我们也评估组织愈合在活的有机体内使用萘损伤模型。萘专门克拉拉细胞死亡,占大约60%的小鼠气道上皮细胞,而保留其他上皮细胞类型和用最小的炎症[6],[32]。很好的描述模式的修复,其余上皮变的有鳞的,迁移的剥蚀地区留下的克拉拉细胞排泄出来。具有抑制受损,延伸到14天上皮修复,克拉拉细胞群全面恢复。使用这个模型,我们观察syndecan-1信号坚持Mmp7−−/上皮细胞在WT气道上皮损伤,但减少后(图1 b)。Vehicle-injected WT和Mmp7−−/老鼠有类似水平的syndecan-1基底信号预期分布(数据没有显示)。此外,摆脱syndecan-1发现受伤的WT媒介文化和支气管肺泡灌洗液从萘WT老鼠而不是受伤Mmp7−−/样品(图1 c)。这些在体外和在活的有机体内研究结果证实MMP7棚屋syndecan-1从受伤的肺上皮细胞。

缩略图
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图1所示。Syndecan-1从受伤的肺上皮细胞脱落。

(A)阿里文化受伤后24 h和(B)肺萘受伤后两天处理了syndecan-1疣状(比例尺= 100µm)。阿里文化部分与Dapi复染色(蓝色)。白色虚线和白色箭头划分伤口在阿里文化和naphthalene-injured气道上皮细胞,分别。图像的代表一致的结果在几个复制(n≥3阿里文化或老鼠)。(C) Syndecan-1点污点都使用了281 - 2抗体(1∶1000)如前所述[4]条件培养基(CM)从受伤的阿里文化和支气管肺泡灌洗(BAL)流体收集从肺萘损伤后4天。两个独立样本从每个基因型涂抹,但最左边的WT BAL样品没有完全流。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g001

MMP7释放syndecan-1限制伤口关闭

的观测数据迁移和syndecan-1脱落了Mmp7−−/组织和细胞损伤后建议释放syndecan-1需要促进组织愈合。研究这个想法,我们受伤syndecan-1 null (Sdc1−−/)阿里文化、生长和分化的WT文化,发现伤口关闭明显快于WT文化(图2一个)。此外,萘受伤后,组织愈合在活的有机体内定量的速度在Sdc1−−/老鼠与立方形的细胞出现早WT航空公司相比,在衬砌仍然参差不齐,有鳞的(这个时候图2 b)。量化修复在活的有机体内,我们应用Clara-cell特定蛋白(CCSP),发现沿航空CCSP-positive细胞的数量是2.5倍Sdc1−−/老鼠在4天post-naphthalene WT(小鼠相比图2 c)。在WT,气道上皮细胞Sdc1−−/老鼠在vehicle-injected等效控制和萘受伤后受伤的有相似度(数据没有显示)。加速伤口关闭Sdc1−−/文化和航空公司表明MMP7 syndecan-1版本的脱落上皮细胞运动的限制。

缩略图
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图2。Syndecan-1抑制肺组织愈合。

(一)野生型和Sdc1−−/阿里文化受伤,修复被量化。每个实验进行了一式三份和重复至少6次。原来放大×100。* p < 0.0005,学生的学习任务。(B)野生型Sdc1−−/萘损伤后小鼠4天处理)染色法(B)和(C) CCSP疣状(比例尺= 100µm)。每个小组从不同的鼠标和有一个附带的放大部分气道(即。,航空公司从3个不同的老鼠如图所示)。在他走时彩色部分,Sdc1−−/气道上皮细胞是更多的立方形的外观。相比之下,野生型上皮鳞状为主,持续接触下层(箭头)。此外,CCSP +细胞的数量每线性长度的基底膜(BM)航空公司(星号)决心量化萘后上皮修复损伤。n = 4老鼠,* p < 0.01,学生的学习任务。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g002

更好地理解syndecan-1抑制修复的机制,我们用逆转录病毒载体创建BEAS-2b细胞(永生化人支气管气道上皮细胞线)稳定表达成分,补充人类syndecan-1 mRNA (B2bshRNA.Sdc1)或无稽之谈(荧光素酶)的mRNA (B2bshRNA.luc)。Syndecan-1表情明显是在B2b撞倒了shRNA.Sdc1细胞在B2b但不改变shRNA.luc基底细胞,预期的蛋白多糖的分布(图3一)。单层细胞受伤,在B2b透露更快伤口关闭shRNA.Sdc1B2b相比shRNA.luc细胞(图3 b)。这些研究结果重现了更高效的组织愈合表型Sdc1−−/阿里和萘损伤模型,进一步支持我们的结论完整syndecan-1功能抑制迁移。

缩略图
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图3。MMP7脱落syndecan-1版本的限制移民。

BEAS-2b细胞被用来创建稳定的可拆卸的细胞系使用shRNA针对荧光素酶基因控制(B2bshRNA.luc)或syndecan-1 (B2bshRNA.Sdc1)。层的B2bshRNA.luc和B2bshRNA.Sdc1细胞(A)应用syndecan-1(绿色;比例尺= 100µm),和(B)挠伤口闭合是量化。n = 4, p < 0.0001,学生的学习任务。(C)伤口关闭B2b的决心shRNA.Sdc1细胞稳定overexpressing MMP7和暂时性的转染质粒(模拟),鼠标syndecan-1 (mSdc1)或MMP7-resistant syndecan-1突变(NC-Sdc1)。图是一个代表人物I型胶原蛋白的可重复的结果。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g003

因为MMP7被免疫印迹检测不到从BEAS-2b细胞条件培养液(数据未显示),更快地迁移与靶向消融syndecan-1表明释放这表面proteoglycan-and不是其他潜在的基体MMP7-mediated机制,促进组织愈合。我们在B2b MMP7稳定中活跃shRNA.Sdc1细胞和暂时性的转染细胞与结构表达野生型老鼠syndecan-1 (mSdc1),不会影响的shRNA针对人类的记录,或抗突变老鼠syndecan-1 MMP7蛋白质水解(NC-mSdc1)。细胞表达NC-mSdc1降低了伤口闭合率相比,细胞表达可分裂的WT syndecan-1 (图3 c)。评估的作用syndecan-1直接在细胞迁移,我们使用phagokinetic胶体金迁移试验[33]测量单个细胞的运动超过24小时(图4一)。符合快速修复的Sdc1−−/阿里的文化和组织,细胞缺乏syndecan-1 (B2bshRNA.Sdc1(B2b)迁移速度比控制细胞shRNA.luc)(图4一)。这些发现表明MMP7乳沟syndecan-1版本的限制移民。

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图4。Syndecan-1监管cell-matrix交互。

(一)B2bshRNA.luc和B2bshRNA.Sdc1细胞被用于金胶体迁移试验(比例尺= 100µm)。总迁移面积测量细胞镀在I型胶原蛋白。n = 4 * p < 0.05,学生的学习任务。(B)传播细胞的百分比与所有细胞测定镀后I型胶原蛋白。n = 5 * p < 0.005,学生的学习任务。(C)的百分比相对粘附细胞I型胶原蛋白的决心。n = 6 * p < 0.0005,学生的学习任务。(D)层的B2bshRNA.luc和B2bshRNA.Sdc1β细胞被应用1整合素亚单位(红色)使用所有(克隆AIIB2)或活跃conformation-specific(克隆12 g10)抗体。与Dapi Immunofluorescent图像复染色(比例尺= 100µm)。(E)的相对粘附在I型胶原细胞百分比测量的控制、β1亚基抑制抗体(克隆AIIB2;1µg /毫升),β1亚基激活抗体(克隆HUTS-21;10µg /毫升)和/或α2β1整合素抑制抗体(克隆BHA2.1, 20µg /毫升)。同形像统计图控制抗体匹配到特定的抗体实验。n≥3, * * * p < 0.05, p < 0.01, * * *由双向方差分析和Bonferroni分析p < 0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g004

Syndecan-1影响细胞粘附和蔓延

细胞的能力遵守和传播矩阵下层移民至关重要。尽管他们更快地迁移,细胞扩散在B2b明显减弱shRNA.Sdc1细胞相比,B2bshRNA.luc细胞(分别为13.3%和49.8%±2.9±7.7,;p < 0.005;图4 b)。此外,B2bshRNA.Sdc1细胞粘附减少了双重的I型胶原蛋白相比,B2bshRNA.luc细胞接触后30分钟(p < 0.0001;图4 c)。然而,混战syndecan-1不完全切除结扎胶原蛋白的能力,只有改变了粘附动力学的B2bshRNA.Sdc1和B2bshRNA.luc细胞被附着在下层4 h(数据未显示)。

Syndecan-1调节α2β1整合素亲和力

我们的研究结果一致显示syndecan-1-dependent影响胶原蛋白矩阵表明该蛋白多糖影响特定cell-matrix交互来调节它对细胞迁移的影响。Syndecan-1可以联想到某些整合蛋白[34],我们评估了β1整合素亚基通常所有的整合蛋白纤维胶原蛋白绑定[35]。缺乏syndecan-1并不影响β的总体水平1整合蛋白(图4 d)。然而,β1整合素亚基可以假设活跃的和不活跃的构象赋予戏剧性的底物亲和力的差异[36]。使用conformation-specific抗体,我们发现活性β1目前B2b的基底外侧表面上shRNA.luc在B2b细胞,但基本上没有shRNA.Sdc1细胞缺乏syndecan-1 (图4 d)。由于α2β1整合素是主要的胶原蛋白绑定在大多数上皮细胞包括肺吗[37],这些数据表明syndecan-1支配这种受体的激活状态。

我们测试了syndecan-1在α的影响2β1整合素与细胞粘附实验的功能激活和抑制抗体(图4 e)。在同形像抗体的存在,我们再次显示微分绑定的B2bshRNA.luc和B2bshRNA.Sdc1细胞胶原蛋白(分别为100%和50.5±8.4%)。β阻断抗体1整合素α亚基或特定2β1整合素废除B2b的绑定shRNA.luc和B2bshRNA.Sdc1胶原蛋白(β细胞粘附1分别为:9.3±2.5%和9.7±3.0%;α2β1分别为:24.4±12.0%和7.9±3.1%)。相比之下,而添加β1激活抗体没有明显影响B2bshRNA.luc粘附到胶原蛋白(87.0±15.7%),并增加syndecan-1-deficient B2b的附着力shRNA.Sdc1细胞相比,同形像控制(分别为87.9±11.0%和50.5±8.4%)。迫使β1整合素亚单位激活没有救援细胞粘附在一个α2β1整合素抑制剂对B2bshRNA.luc或B2bshRNA.Sdc1细胞(分别为30.9±15.5%和17.5±10.5%)。这些数据表明,syndecan-1调节胶原蛋白通过α细胞粘附2β1整合素,表明本条例通过控制发生关联整合素的状态。

调制的α2β1整合素在愈合

因为syndecan-1似乎将α的存在2β1整合素更高的亲和力,MMP7 syndecan-1脱落可能释放这种控制和关闭整合素亲和力较低,从而允许更放松cell-matrix交互宽容的细胞迁移。的确,而需要一定程度的细胞粘附生成迁徙的牵引,过度粘附阻碍细胞运动[38],[39]。考虑到这些概念,我们的模型预测在syndecan-1面前,α2β1整合素抑制细胞迁移在愈合。如果这是真的,迫使激活β1整合素亚单位应该缓慢愈合的见过Sdc1−−/阿里的文化。此外,抑制α2β1整合素连接应该克服减少迁移中看到Mmp7−−/情况syndecan-1持续在细胞表面。

要测试这些想法,我们首先建立,阻断α2β1整合素增强伤口修复在阿里气道上皮的文化。受伤的WT阿里文化增强伤口关闭在一个α的存在2亚基抑制抗体或α2β1抑制肽(图5和6)。相比之下,Sdc1−−/阿里文化没有额外的伤口关闭表明α的增大2β1整合素的贡献最小细胞迁移在缺乏syndecan-1 (图5)。然而,与我们的假设一致,α2子单元和α2β1整合素抑制剂都增加了受伤的伤口闭合率Mmp7−−/阿里文化(图6)。这些数据支持我们的想法在syndecan-1面前,高亲和力的α2β1整合素抑制气道上皮修复的迁移。

缩略图
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图5。受伤的Sdc1−−/肺上皮细胞是byα的影响2β1整合素抑制。

野生型和Sdc1−−/阿里文化受伤的控制(仓鼠同形像免疫球蛋白2;10µg /毫升),α2整合素亚基抑制抗体(克隆Ha1/29;10µg /毫升)或α2β1整合素抑制肽(5毫米)。伤口关闭百分比确定损伤后24小时。*通过双向方差分析和Bonferroni分析p < 0.05。n = 4;原来放大×100。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g005

缩略图
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图6。受伤的Mmp7−−/肺上皮细胞与α增强伤口关闭2β1整合素抑制。

野生型和Mmp7−−/阿里文化受伤的控制(仓鼠同形像免疫球蛋白2;10µg /毫升),α2整合素亚基抑制抗体(克隆Ha1/29;10µg /毫升)或α2β1整合素抑制肽(5毫米)。伤口关闭百分比确定损伤后24小时。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * *由双向方差分析和Bonferroni分析p < 0.001。n = 4;原来放大×100。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g006

接下来,我们WT和受伤Sdc1−−/阿里文化的控制,β1激活或β1抑制抗体(图7)。抑制β1整合蛋白增强伤口闭合的受伤率相当于WT阿里文化水平Sdc1−−/文化。相反,强迫激活β1整合素亚基受伤的伤口闭合速度放缓Sdc1−−/阿里文化WT的条件。与我们的假设一致的,抑制β1整合素亚单位恢复伤口闭合率Mmp7−−/文化WT水平(图8)。在WT阿里文化中,激活β1整合素抗体显著放缓伤口关闭相对控制条件,但这种效果在较高的浓度(比较使用图7和8)。相反,β的浓度就越高1整合素激活抗体没有影响Mmp7−−/伤口闭合率表明β1整合素亚单位已经最大限度地激活。

缩略图
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图7。受伤的Sdc1−−/肺上皮细胞与强迫β衰减修复1整合素亚单位激活。

野生型和Sdc1−−/阿里文化受伤的控制(鼠同形像免疫球蛋白g, 1µg /毫升)或β1整合素亚单位激活(克隆9 eg7 1µg /毫升)或抑制(克隆AIIB2, 1µg /毫升)抗体。伤口关闭百分比确定损伤后24小时。*通过双向方差分析和Bonferroni分析p < 0.05。n = 4;原来放大×100。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g007

缩略图
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图8。受伤的Mmp7−−/肺上皮细胞与β增强修复1整合素亚基抑制。

野生型和Mmp7−−/阿里文化受伤的控制(鼠同形像免疫球蛋白,10µg /毫升)或β1整合素亚单位激活(克隆9 eg7 10µg /毫升)或抑制(克隆AIIB2, 1µg /毫升)抗体。伤口关闭百分比确定损伤后24小时。* * * p < 0.01, p < 0.001,双向方差分析和Bonferroni分析。n = 4;原来放大×100。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.g008

讨论

受伤打开途径为致病性条目在突破障碍。因此,身体已经进化机制招募炎症细胞对抗潜在的病原体,迅速修复受损组织。尤其是肺部,适应其粘膜表面利用MMP7调节炎症和修复。各种损伤刺激MMP7生产的迅速和显著的感应受伤的上皮细胞[3]- - - - - -[11]。这个表达式是招聘炎症细胞,同时促进组织愈合所必需的[3]- - - - - -[6]。我们组之前报道MMP7控制炎症反应通过syndecan-1的脱落[4]。在这里,我们提供的证据表明,syndecan-1脱落也可以促进组织愈合。

受损上皮损伤后几分钟内开始蔓延而引发的细胞迁移是推迟了好几个小时[30],[31]。我们的数据表明,MMP7调节移植愈合过程的组件。移民是一个复杂的过程,是由多个细胞之间的相互作用及其环境影响[40]。特别是,cell-matrix交互必须严格控制,以确保亲和力是足够的牵引力,但不过度,防止向前迁移[38],[39]。因此,MMP7似乎所需蛋白质水解的底物通常抑制细胞迁移。MMP7的初级sheddase syndecan-1后的肺损伤[4]。我们的研究结果表明,MMP7脱落syndecan-1也促进伤口关闭。事实上,syndecan-1限制迁移证明缺乏syndecan-1增强伤口关闭的条件。此外,肺上皮细胞转染syndecan-1耐MMP7蛋白水解作用变弱比野生型syndecan-1细胞迁移。的Sdc1−−/和Mmp7−−/条件也有相反的修复表型,和这些影响是一致的,MMP7 syndecan-1版本限制的脱落细胞迁移。

我们的数据表明,syndecan-1增强胶原蛋白细胞粘附。cell-matrix绑定的增加反过来促进细胞传播但压制细胞迁移。大量研究记录的功能耦合syndecan-1整合蛋白[34]。我们的结果描述syndecan-1间接控制通过调节αcell-matrix绑定在肺部2β1整合素亲和力。Syndecan-1脱落可以促进细胞迁移通过改组细胞与环境的相互作用[25],[40]。事实上,失去syndecan-1可以诱导细胞机制的变化,促进迁移[18],[19]。Integrin-mediated附件也可以促进细胞扩散[41],但细胞也可能需要syndecan-1作为额外信号重组肌动蛋白细胞骨架和促进细胞扩散[42]- - - - - -[49]。当然,变化cell-matrix交互可以切换功能细胞的结果[50],[51]。我们的发现表明syndecan-1调节α的关联状态2β1整合素亚基,进而协调细胞出现附件所需的矩阵和迁移扩散。这个激活事件可能发生快速通过构象变化没有任何需要蛋白表达所需的组件已经到位。

Syndecan-1被功能耦合的整合蛋白已经证明在其他模型[34]。例如,syndecan-1调节α的激活状态vβ3整合素对乳腺癌细胞有可能作为一种获得更具有攻击性的表型[44],[45]。此外,syndecan-1 associates和促进α的激活vβ5整合素纤维母细胞细胞系[47]。同样,syndecan-1发现直接相互作用和调节α的关联状态vβ3和αvβ5整合蛋白在内皮细胞促进血管生成在活的有机体内[52]。研究与角质细胞显示迁徙缺陷syndecan-1不足时,可能通过改变332年层粘连蛋白绑定整合蛋白[17],[53]- - - - - -[55]。相比之下,Sdc1−−/真皮成纤维细胞迁移,增加β增加1和αv整合素α亚基表达和增强v整合素亚单位活动相比WT条件[56]。最近,syndecan-1发现身体与β交互1整合素亚单位[57]和增加细胞粘附的I型胶原蛋白配合α2β1整合素[58]。相反,其他研究专门评估syndecan-1对β的影响1整合素亚单位没有发现差异表达和激活[19],[43],[46]。Syndecan-1似乎有多个可能的相互作用与各种整合蛋白,这取决于所使用的电池系统。这可能代表不同谱系的细胞的表面和胞内蛋白表达不同体验syndecan-1可以联系起来。

Syndecan-1似乎也在组织特定的方式。皮肤和角膜上皮缺乏syndecan-1有缺陷的愈合在活的有机体内显然由于减毒增殖和迁移反应[16],[17],[59]。有趣的是,syndecan-1超表达还能抑制皮肤修复在活的有机体内可能通过抑制行动syndecan-1 ectodomain[14]。syndecan-1不同的效果的一种解释是,皮肤和角膜的复层上皮结构上和功能上不同于简单的上皮细胞在肺部。

最近的一项研究使用A549细胞,carcinoma-derived肺泡II型细胞系,报道,击倒syndecan-1表达式减缓细胞的迁移[60]。这里提供的结果直接反驳A549细胞株中的结果。A549细胞株癌变的起源,因此,与转化表型相关的变化可能改变syndecan-1和通路的功能控制细胞运动,如与乳腺癌细胞[44],[45]。相反,我们使用一个非肿瘤细胞系(BEAS-2b)和organotypic文化主要来源于上皮细胞,以及在活的有机体内模型。进一步调查才能完全理解的根本原因在这些研究发现的不同的结果。

在一起,我们的数据支持这样的结论,MMP7促进组织愈合通过syndecan-1脱落,然后改变α的激活状态2β1整合素减少胶原蛋白细胞亲和力和删除限制移民。MMP7诱导的肺损伤和棚syndecan-1招募中性粒细胞,同时促进组织愈合的保护机制。因为炎症和修复是两个相互关联的现象,MMP7脱落syndecan-1可以进化的结果指派两个重要的生物过程为一个统一的机制。

材料和方法

道德声明

所有动物程序批准的机构动物保健和使用委员会华盛顿大学和国家健康研究所的指导的护理和使用实验动物。

抗体和多肽

克拉拉细胞特定蛋白(CCSP)是应用在老鼠组织兔多克隆抗体(纽约北部,普莱西德湖)。Syndecan-1抗体克隆为疣状B-B4人类样本(BD生物科学,圣何塞,CA)和281.2克隆小鼠组织(请提供的毛重公园;儿童医院、哈佛医学院、波士顿,MA)。活性构象β1整合素亚基是应用与克隆人体组织12 g10(微孔、Billerica MA)如前所述[61]。所有β1整合素与克隆immuostained AIIB2(发展研究杂种细胞银行,爱荷华州的城市,IA;沉积在c . Damsky UCSF)。适当的Alexa萤石标记二次抗体来自表达载体(CA)卡尔斯巴德。

功能整合素催化剂和抑制剂如下。克隆BHA2.1被用作功能性α2β1整合素在人类细胞抑制剂[62],[63]。的α2β1配体肽(Anaspec Fremont, CA)抑制整合素结合胶原蛋白[64]用于老鼠的细胞。克隆Ha1/29 (BD生物科学)被用作鼠标α2亚基抑制剂[65],[66]。克隆HUTS-21[67]和9 eg7[68],[69]分别使用在人类和小鼠β1亚基激活抗体。克隆AIIB2被用来抑制β1亚基函数在人类和小鼠系统[70]。虽然克隆对人类βAIIB2抗体生成1亚基,大已经建立了几个种类[71]- - - - - -[73],初步研究显示,阻断小鼠细胞的粘附效果(数据没有显示)。所有功能实验与同形像抗体控制从圣克鲁斯生物技术(一般老鼠同形像),BD生物科学(亚美尼亚仓鼠免疫球蛋白2)和BioLegend(所有鼠标和鼠单克隆同形像控件)。一个例外是当9 eg7(鼠免疫球蛋白2)和AIIB2(鼠免疫球蛋白1)都是使用(图7和8),一般的老鼠同形像IgG抗体(圣克鲁斯生物技术)作为共同控制。初步实验显示没有区别鼠单克隆免疫球蛋白同形像和普通老鼠免疫球蛋白控制(数据未显示)。

肺损伤模型

气液界面(ALI)文化从野生型(WT)创建,MMP7-null (Mmp7−−/)和syndecan-1-null (Sdc1−−/)在C57BL / 6小鼠所有背景,和伤口关闭化验进行如前所述[6]。此外,延时显微修复阿里文化获得DIC图像每6分钟24 h在DeltaVision奥林巴斯IX71倒置显微镜使用20 x / 0.75 U计划Apo客观、光度Coolsnap总部相机(应用精度,Issaquah WA)。

萘损伤模型被用来研究修复在活的有机体内[6]。WT,Mmp7−−/和Sdc1−−/小鼠腹腔注射200毫克/公斤无菌萘溶解在玉米油。8 - 10点到最小化之间的所有小白鼠注射日萘代谢的变化。老鼠牺牲在定义的时间点,支气管肺泡灌洗液是收集和组织学的肺部组织处理。

可拆卸的和超表达细胞系

pSM2向量包含人类syndecan-1 shRNA特定基因或荧光素酶基因从开放购买生物系统(AL亨茨维尔)。野生型人类MMP7变异包含一种furin裂解位点的结pro -和催化域(d . Madtes慷慨地提供给我们;弗雷德哈钦森癌症研究中心,西雅图,华盛顿州)。这种构造subcloned使用BamHI和NotI限制性位点到pBM-IRES-blastocidin逆转录病毒表达质粒(请提供由e·雷恩斯;华盛顿大学西雅图,华盛顿州)。长篇WT鼠标syndecan-1 (mSdc1)也从整个肺的互补脱氧核糖核酸创建RNA PCR克隆,以及PCR产品插入到GFP融合威尼斯平底渔船助教表达工具包(Carlesbad表达载体,CA)。一个non-cleavable syndecan-1 (NC-mSdc1)是由取代近膜MMP的裂解位点与15个氨基酸从人类CD4近膜序列如前所述[25]- - - - - -[27]。

稳定的可拆卸的细胞使用逆转录病毒转导系统创建的。成分和overexpressing逆转录病毒表达系统中,逆转录病毒粒子产生的瞬变使转染质粒DNA入PhiNx两性包装细胞系(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州;沉积由g·诺兰)[74]。靶细胞被感染逆转录病毒条件培养基含有10µg /毫升DEAE-Dextran 16 h在33°C被转移到新鲜培养基的37°C[75]。感染后两天,中含有抗生素添加适当的选择和稳定转导细胞系。此外,细胞是暂时性的转染表达mSdc1或NC-mSdc1 Lipofectamine 2000(表达载体)制造商的方向。

组织学和免疫染色

所有阿里文化和组织化学染色的细胞系进行100% methanol-fixed文化。)染色和CCSP immunofluorescent formalin-fixed染色进行10%,石蜡包埋萘受伤组织部分如前所述[6]。数字化的图像捕获使用奥林巴斯BX-51荧光/ DIC显微镜与U计划Apo 40 x / 20 x / 0.85和0.70的目标和一个奥林巴斯DP25 5.5像素的数码相机。immunofluorescent幻灯片都是处理相同的条件。图片都被以同样的曝光和显微镜设置。在必要的时候,小线性变化强度是同样与ImageJ软件。

迁移、扩散和粘附化验

分析评估cell-matrix交互影响组件的修理了。细胞传播评估如前所述[6]。镀细胞被允许传播60分钟各种矩阵,和镀细胞传播相比,所有细胞的百分比。我们也评估细胞迁移使用修改后的胶体金迁移试验[33]。协议被修改以便实验进行Permanox室幻灯片(Nunc,罗彻斯特,纽约)。在每个实验迁移试验,至少10细胞是随机选择的,迁移与ImageJ软件测量领域。刮伤化验也作为一个方法来衡量移民和伤口关闭[5],[6]。

细胞粘附到一个矩阵的确定与修改后的细胞粘附试验[76]。细胞与5 pre-labeledµM钙黄绿素点(Alexis生化药剂,圣地亚哥,CA)在10%的边后卫DMEM培养基30分钟。细胞进行清洗和从文化板块,酝酿在PBS-EDTA 37°C 10分钟。所有细胞收集和PBS镀前清洗到矩阵覆盖96 -圆底板块在1%的边后卫phenol-free DMEM(10000细胞/ 100年µl总量)。同步初始cell-matrix接触,盘子离心机在30 g×3分钟。总荧光(励磁485,发射530)在0 h作为基准来衡量。30分钟后37°C,盘子洗了一个电子多通道吸量器设定在一个一致的弹射力实验来去除non-adherent细胞。PBS的三个洗后,100µl 1%的边后卫phenol-free DMEM替换成每个好,整个荧光测定。坚持决心的比率百分比30分钟的荧光信号与基线相比。当表示,细胞粘附实验进行的同形像和功能激活和抑制抗体。比较不同实验中,可能需要不同的控制抗体,所有数据归一化到积极的控制条件和相对粘附百分率。

支持信息

视频S1。

伤口关闭野生型和MMP7−−/阿里的文化。野生型和MMP7−−/阿里文化观察受伤,伤口关闭超过24小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006565.s001

(21.22 MB MOV)

作者的贡献

构思和设计实验:PC航空。进行了实验:PC LEA。分析了数据:PC LEA航空。造成试剂/材料/分析工具:电脑STN YW QL。该报写道:PC航空。

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