广告gydF4y2Ba
浏览主题领域gydF4y2Ba
吗?gydF4y2Ba

点击公共科学图书馆分类找到你所在领域的文章。gydF4y2Ba

关于公共科学图书馆主题领域的更多信息,请点击gydF4y2Ba在这里gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

  • 加载指标gydF4y2Ba

188滚球软件

同行评议gydF4y2Ba

研究文章gydF4y2Ba

cIAP-1控制先天免疫gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba肺部感染gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

上皮细胞感染的抵抗gydF4y2BaChlamydophila肺炎gydF4y2Ba对细胞凋亡归因于抗凋亡蛋白的诱导表达和增加稳定性称为凋亡蛋白(iap)的抑制剂。细胞凋亡蛋白1的抑制剂的意义(cIAP-1)gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba肺部感染和先天免疫反应是调查cIAP-1敲除小鼠(KO)使用一种新颖的非侵入性intra-tracheal感染的方法。与野生型相比,cIAP-1基因敲除小鼠未能从肺部清除感染。野生型老鼠对感染肺部炎症反应。相比之下,巨噬细胞的招募是减少cIAP-1 KO小鼠与野生型小鼠相比。干扰素γ(IFN-γ)的浓度增加而减少肿瘤坏死因子(TNF-α)在肺部感染cIAP-1 KO小鼠感染了野生型小鼠相比。gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba实验小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞显示cIAP-1需要这些细胞的先天免疫反应。因此我们的研究结果表明一个新的cIAP-1的细菌感染的免疫调节作用。gydF4y2Ba

引用:gydF4y2Ba普拉卡什H,贝克尔D,伯麦L,阿尔伯特·L Witzenrath M,罗索的年代,et al。(2009) cIAP-1控制先天免疫gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba肺部感染。《公共科学图书馆•综合》4 (8):e6519。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519gydF4y2Ba

编辑器:gydF4y2Ba拉斐尔·h·瓦尔迪维亚,杜克大学医学中心,美利坚合众国gydF4y2Ba

收到:gydF4y2Ba2009年5月12日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2009年6月8日;gydF4y2Ba发表:gydF4y2Ba2009年8月6日,gydF4y2Ba

版权:gydF4y2Ba©2009普拉卡什等。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。gydF4y2Ba

资助:gydF4y2Ba这项工作是支持的资助下第六研究欧盟框架计划,项目正确(lshb - ct - 2004 005276)西奥多。罗斯福投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。gydF4y2Ba

利益冲突:gydF4y2Ba作者宣称没有利益冲突存在。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba是一种革兰氏阴性专性细胞内细菌负责肺部感染性疾病。这种病原体的存在在动脉粥样硬化斑块引起其与心血管疾病如动脉粥样硬化导致冠心病、负责全球死亡率的主要因素之一。gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba感染始于毒性的依恋和细菌的新陈代谢惰性形式被称为基本的身体(EB)上皮细胞。这是紧随其后的是一个独特的bi-phasic生命周期,EBs分化成non-virulent和代谢活性形式称为网状体(RBs)gydF4y2Ba[1]gydF4y2Ba。gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染上皮细胞以外的细胞类型的感染,如内皮细胞、平滑肌细胞、肺泡巨噬细胞和血液gydF4y2Ba[2]gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba[5]gydF4y2Ba。其中,巨噬细胞在近几年引起重大关注,因为他们吞噬这些细菌和传输为消除他们从肺外周淋巴组织gydF4y2Ba[6]gydF4y2Ba。巨噬细胞的先天免疫防御的关键球员各种细胞内细菌感染gydF4y2Ba[7]gydF4y2Ba。他们居住在几乎所有的组织构成的单核吞噬细胞系统。这种复杂的网络使免疫系统有效地感觉从身体微生物入侵者并消除它们。在其分子模式的识别gydF4y2Ba[8]gydF4y2Ba或分子发布的受损宿主细胞,称为“危险信号”gydF4y2Ba[9]gydF4y2Ba巨噬细胞表现强烈的炎症反应,其特点是分泌的各种介质,像TNF-αIFN-γ,引发和一氧化氮。这些效应分子免疫防御各种细胞内细菌感染包括授予gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba[10]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在感染的早期阶段,gydF4y2Ba衣原体gydF4y2Ba诱导抗凋亡途径感染宿主的抗细胞凋亡刺激TNF-α、环己酰亚胺,staurosporine FasL,紫外线和γ辐照gydF4y2Ba[11]gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba[13]gydF4y2Ba。最近,它已经表明,抵抗感染细胞的凋亡诱导是由于诱导表达和抗凋亡iap稳定性增加,像x染色体相关(XIAP)和细胞凋亡抑制剂(cIAPs)gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba。最初IAP蛋白质,杆状病毒中发现,从昆虫到人类进化的保守和原则的作用在调节细胞凋亡gydF4y2Ba[16]gydF4y2Ba。尽管人类IAP家族的一些成员的蛋白质,包括XIAP cIAP-1 cIAP-2,与caspase-3交互,7和9块如果过度表达在细胞凋亡gydF4y2Ba[17]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[18]gydF4y2Ba,iap的功能gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba目前还不清楚。XIAP可能是唯一有效的直接抑制剂caspase-3, 7或9gydF4y2Ba[19]gydF4y2Ba,但凋亡相关表型尚未确定XIAP基因敲除小鼠gydF4y2Ba[20]gydF4y2Ba。最近的一份报告表明,iap多功能信号设备,先天免疫的影响gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba[21]gydF4y2Ba。人类cIAP-1 cIAP-2可能发挥作用在控制肿瘤坏死因子通路,因为他们已被证明与TNF受体复杂的组件交互,TRAF1 TRAF2gydF4y2Ba[22]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[23]gydF4y2Ba。两者的意义,cIAP-1和cIAP-2 NF-κB激活基因敲除小鼠已经证明了gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba。cIAP-2基因敲除小鼠也显示一个减毒炎症反应和深刻的抗LPS在实验内毒素休克。此外,cIAP-2淘汰赛巨噬细胞被报道高度易感细胞凋亡在LPS-induced促炎的环境,表明cIAP-2是一个关键因素在维护正常的先天免疫反应gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba。最近,有人建议,XIAP参与先天免疫反应控制gydF4y2Ba李斯特菌gydF4y2Ba感染小鼠gydF4y2Ba[25]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

我们目前的数据显示妥协cIAP-1 KO小鼠的免疫能力gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染。从cIAP-1 KO小鼠巨噬细胞杀菌先天免疫信号通路的严重影响。我们提出一个新的函数的控制细胞凋亡蛋白抑制剂的专性胞内感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

cIAP-1 KO小鼠的敏感性增加gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

调查如果cIAP-1参与衣原体感染的控制,野生型和cIAP-1 KO小鼠感染使用非侵入性的方法(详细信息请参阅气管内的感染gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba)。不同小鼠器官的感染监测通过展示细菌DNA的存在通过嵌套PCR (gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba和gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)。测试中所有的器官,肺感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba在第三天,感染后的10到20 (d . p)在野生型和cIAP-1 KO小鼠(gydF4y2Ba表S2gydF4y2Ba)。衣原体包涵体可以感染小鼠肺中发现早在3的结论。gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba)。然而,定量实时PCR显示细菌负荷的逐渐减少肺部感染的野生型小鼠,而在cIAP-1 KO小鼠水平仍然很高(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。与野生型小鼠相比,cIAP-1 KO小鼠未能控制肺部感染gydF4y2Ba肺炎。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图1所示。gydF4y2Ba敏化cIAP-1 KO小鼠gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba肺部感染。gydF4y2Ba

每组5小鼠感染了gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba、衣原体gydF4y2Ba经济新闻gydF4y2Ba基因是放大从每只小鼠的肺组织(如描述的支持gydF4y2Ba材料和方法S1gydF4y2Ba)。的相对数量gydF4y2Ba经济新闻gydF4y2Ba使用GAPDH基因在每个肺样本计算作为内部控制。* * p≤0.01。b .受损的解决gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba从cIAP-1 KO小鼠的肺部感染。5个每组小鼠感染了gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba和传染性细菌测定肺传染性化验中描述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。HEp2上皮细胞被感染肺匀浆在不同时间点后感染和传染性分析了量化immuofluoresence显微镜。传染性是每感染衣原体包涵体形成的数量计算HEp2细胞(cIAP-1 KO感染0.73±0.023;WT感染0.28±0.06天20)。包含数字的数据代表均值±SEM每个细胞从三个独立的实验。c .衣原体的微观图像包含在HEp2细胞感染肺匀浆后形成的。蓝色代表核(赫斯特染色)HEp2细胞感染和红色显示gydF4y2Ba衣原体gydF4y2Ba包含(Cpn等;箭头)每个细胞形成的。红色的背景染色控制样品可能是由于非特定的抗体聚合形成。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g001gydF4y2Ba

比较可行的负荷细菌感染小鼠的肺,肺传染性进行化验。未受感染的肺部受感染动物和均质和感染衣原体粒子是由感染新鲜HEp2细胞和由自动显微镜计数夹杂物。这些化验显示增加肺部感染性细菌感染的野生型小鼠从第三天到第十天感染后下降,直到一天20后感染(gydF4y2Ba图1 b, CgydF4y2Ba)。与野生型小鼠相比,cIAP-1 KO小鼠无法解决感染。在整个实验期间传染性细菌的数量逐渐增加(gydF4y2Ba图1 b, CgydF4y2Ba)。总的来说,这些结果表明cIAP-1 KO小鼠的敏感性增加gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba肺部感染。gydF4y2Ba

管制cIAP-1 KO小鼠炎症反应gydF4y2Ba

获得的第一个迹象机制的不同的结果在野生型和cIAP-1 KO小鼠肺部感染,肺部感染和未受感染的动物进行了分析炎性细胞因子的生产。组织病理学分析表明增加炎症的积累和招聘(CD68 +)肺泡巨噬细胞在野生型小鼠的肺反应gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。这些巨噬细胞靠近细菌夹杂物在野生型小鼠肺部感染。积累的野生型小鼠肺部炎症巨噬细胞感染反应表明趋化现象的反应,发现妥协于cIAP-1 KO小鼠的肺部感染。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图2。gydF4y2Ba特异表达cIAP-1 KO小鼠的炎症反应。gydF4y2Ba

答:降低数字cIAP-1 KO小鼠肺巨噬细胞的感染。从小鼠肺部未受感染或感染了20天切除无菌分段和5毫米块固定。的部分与兔抗染色gydF4y2Ba衣原体gydF4y2Ba与anti-CD68 LPS抗体和Cy3-conjugated二级抗体,抗体检测用alexa - 488共轭二次抗体本地化gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba和肺泡巨噬细胞,分别。肺上皮细胞与赫斯特染色和显微镜下检查使用荧光显微镜下40×的目标。图显示了一个典型的例子至少五个独立的感染。B, C . IFN-γ水平(B)和TNF-α(C)测定肺匀浆从野生型,ELISA cIAP-1 KO小鼠在不同时间点后感染。数据代表均值±SEM从五个独立的感染实验。* p≤0.05;* * p≤0.01。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g002gydF4y2Ba

我们下一个量化的炎症反应通过确定IFN-γ和TNF-α浓度在野生型和cIAP-1 KO小鼠肺部感染的反应。gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染引起的肺IFN-γ和增加TNF-α野生型和cIAP-1 KO小鼠比未受感染的控制(gydF4y2Ba图2 b, C, DgydF4y2Ba)。感染了cIAP-1 KO小鼠产生更高的肺IFN-γ比野生型小鼠感染滴度。这些数据展示了部分删除管制cIAP-1 KO小鼠的炎症反应。gydF4y2Ba

需要cIAP-1 TNF-α在巨噬细胞的生产gydF4y2Ba

理解的原因提供cIAP-1 KO小鼠炎症反应,野生型和cIAP-1 KO巨噬细胞的先天免疫功能进行了分析。因为增加cIAP-2密切相关的表达式可能平衡功能cIAP-1的损失gydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba的表达水平cIAP-2被immuoblot检查分析。没有cIAP-2水平的增加巨噬细胞而在肺组织中观察到高浓度的cIAP-2观察(gydF4y2Ba无花果S2。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 a, BgydF4y2Ba)。从野生型和cIAP-1 KO小鼠腹腔巨噬细胞与细菌LPS刺激(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)和/或感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)。野生型巨噬细胞的治疗增加剂量的有限合伙人(1 - 5µg /毫升)导致剂量依赖性TNF-α分泌物的刺激。cIAP-1 KO巨噬细胞反应类似于有限合伙人治疗,然而,TNF-α浓度仍明显低于野生型巨噬细胞(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。这种趋势也观察到如果巨噬细胞被感染或刺激有限合伙人和感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)。这些发现在一起表示一个可能的角色cIAP-1有限合伙人和侵染诱导生产TNF-α的巨噬细胞。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图3。gydF4y2Ba需要cIAP-1内毒素(LPS)和IFN-γ-induced炎症反应。gydF4y2Ba

答:cIAP-2是调节基因敲除小鼠的肺。基因敲除小鼠肺匀浆从野生型广告受到免疫印迹分析的量化cIAP-2和XIAP中描述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。发现了β-tubulin加载控制。b光密度定量数据所示gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba规范化为β-tubulin加载控制。c .孤立的腹膜巨噬细胞从野生型和cIAP-1 KO小鼠接受不同剂量的有限合伙人,和TNF-α决心文化上层清液治疗后48 h。数据代表均值±SEM从三个独立的实验。d . TNF-α生产cIAP-1 KO感染巨噬细胞受损。巨噬细胞培养和感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba莫伊1和/或处理有限合伙人在5µg /毫升。TNF-α滴度测定文化上层清液48 h后感染和治疗。数据提出了均值±SE从三个独立的实验。大肠cIAP-1 IFN-γ-mediated TNF-α的生产需要。腹膜巨噬细胞从野生型和cIAP-1 KO小鼠IFN-γ孤立和刺激不同剂量的老鼠gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba。上层清液收集在48 h后刺激和TNF-α浓度被ELISA量化。数据代表均值±SEM从两个独立的实验。* p≤0.05;* * p≤0.01。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g003gydF4y2Ba

缺陷在有限合伙人和侵染诱导TNF-α生产cIAP-1 KO巨噬细胞可以限制LPS-induced通路。因此我们与IFN-γ刺激巨噬细胞,通过NF-κB独立于LPS刺激TNF-α生产gydF4y2Ba[26]gydF4y2Ba。然而,cIAP-1 KO TNF-α比野生型巨噬细胞(巨噬细胞产生大大减少gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba),排除LPS-specific缺陷在这些巨噬细胞。gydF4y2Ba

cIAP-1所需生产的巨噬细胞gydF4y2Ba

另一个重要的中介参与的杀菌效果巨噬细胞一氧化氮(NO)自由基。野生型巨噬细胞的治疗细菌内毒素诱导的生成大量的没有剂量和时间的方式(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。相比之下,cIAP-1 KO巨噬细胞有强烈降低生产能力没有在LPS刺激。gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba野生型感染巨噬细胞诱导只有少量的没有24小时后感染(没有显示),这是温和但明显高于48 h后感染相比未感染的控制(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。相比之下,cIAP-1 KO增加巨噬细胞没有任何没有在实验期间感染(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图4。gydF4y2BacIAP-1一氧化氮产量需要响应的有限合伙人和TNF-α腹膜巨噬细胞。gydF4y2Ba

答:巨噬细胞从野生型和cIAP-1 KO小鼠不同剂量LPS刺激和没有确定效价文化上层清液治疗后在指定的时间点。b . LPS -和感染(Cpn)诱导没有生产cIAP-1 KO和野生型巨噬细胞。1×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba腹膜巨噬细胞被感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba我的1。在感染后细胞LPS处理30分钟在37°C,进一步培养48 h。没有量化文化上层的一代。c . TNF-α-induced生产没有cIAP-1 KO和野生型腹膜巨噬细胞治疗后24小时。野生型和cIAP-1 KO巨噬细胞培养和刺激显示剂量的TNF-α和上层清液中没有测量24小时后归纳。d . KO IFN-γ-mediated没有生产和野生型巨噬细胞。1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba巨噬细胞与小鼠IFN-γ刺激和没有确定文化上层清液48 h后。数据的均值±SEM从三个独立的实验。大肠cIAP-1伊诺的感应要求有限合伙人和TNF-α老鼠巨噬细胞。表示的细胞培养试剂和伊诺的水平决定了整个细胞溶解产物的免疫印迹。α-actin检测加载控制。F和g .电阻对LPS-induced cIAP-1 KO小鼠内毒素休克。小鼠服用不同剂量LPS腹腔内(从0.1到0.5毫克/公斤体重(合著))和野生型(F)的生存和cIAP-1 KO小鼠(G)监测在14天内。显示的结果代表三个独立的实验。* p≤0.05;* * p≤0.01。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g004gydF4y2Ba

测试cIAP-1是否参与先天的刺激没有生产,我们刺激这些巨噬细胞与不同剂量的TNF-αIFN-γ,和没有量化的滴度。TNF-treatment野生型巨噬细胞诱导生产没有剂量依赖性的方式(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。cIAP-1 KO巨噬细胞未能产生TNF-α显著水平的反应。缺乏生产KO巨噬细胞在TNF-α刺激并不是由于减少的可行性治疗细胞(gydF4y2BaS3无花果。gydF4y2Ba)。TNF-α相比,治疗与IFN-γ引起巨噬细胞相似的野生型和KO巨噬细胞中没有反应,证明cIAP-1 KO巨噬细胞在没有信号(stimulus-dependent缺陷gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

没有诱导产生的主要是没有合酶(间接宾语)巨噬细胞gydF4y2Ba[27]gydF4y2Ba。cIAP-1 KO巨噬细胞在没有生产的明显缺陷促使我们研究这些细胞是否影响伊诺表达式。有趣的是,有限合伙人或TNF-α治疗诱导伊诺表达野生型,但不是在cIAP KO巨噬细胞(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)。相比之下,IFN-γ引起伊诺老年病的野生型和KO (gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)排除一般缺陷在KO小鼠伊诺表达式。因为cIAP-1涉及细胞凋亡的控制,我们研究了这些治疗的效果在野生型和突变体巨噬细胞诱导细胞凋亡。因为没有治疗引起的凋亡显著增加人口或影响巨噬细胞治疗的可行性(gydF4y2BaS3无花果。gydF4y2Ba),生产没有减少了变异巨噬细胞响应某些刺激并不是由于细胞死亡的增加在这些情况下。这些数据表明cIAP KO巨噬细胞在诱导的缺陷没有起源于一个缺陷刺激依赖伊诺的老年病。gydF4y2Ba

阻力cIAP-1 KO小鼠内毒素休克gydF4y2Ba

TNF-α和没有endotoxin-mediated毒性的主要介质。自从cIAP-1 KO巨噬细胞显然是TNF-α的生产没有影响,我们预计这些老鼠的阻力增加endotoxin-induced毒性。因此,我们确定了致命剂量的endotoxin-induced冲击在野生型和cIAP-1 KO小鼠。野生型老鼠死于时尚存在剂量依赖的相关性;例如,剂量为0.5毫克/公斤体重细菌LPS引起100%的死亡率在96 h后诱导激波在野生型小鼠(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba)。相比之下,60%的cIAP-1 KO小鼠存活治疗相同的剂量的有限合伙人(gydF4y2Ba图4 ggydF4y2Ba),展示了这些老鼠的阻力显著增加LPS-induced冲击。LPS-induced冲击相比,我们发现没有区别在生存和细菌负荷后的脾静脉输液野生型和cIAP-1 KO小鼠的挑战gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba沙门氏菌感染SL1344 (gydF4y2Ba无花果。S4gydF4y2Ba),这表明额外的机制除了内毒素暴露导致的毒性gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba巨噬细胞感染引发细胞毒性gydF4y2Ba

的损耗的肺巨噬细胞感染cIAP-1 KO小鼠感染提出了质疑直接影响巨噬细胞的生存。因此,我们调查的角色cIAP-1巨噬细胞的生存和增殖反应gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染和/或促有丝分裂的刺激。测试是否cIAP-1影响感染效率,从野生型和cIAP-1 KO动物巨噬细胞被感染和夹杂物被免疫荧光显微镜检测。夹杂物数量可以发现类似的野生型和KO巨噬细胞排除cIAP-1感染的一个主要的角色gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)。我们下一个测试是否感染或有限合伙人治疗影响的扩散Mac-1-positive巨噬细胞不同。巨噬细胞治疗与有限合伙人和代谢活动用WST试验测量。如果接受有限合伙人,cIAP-1 KO巨噬细胞表现出更少的代谢活动与野生型相比,巨噬细胞(gydF4y2Ba图5 c, DgydF4y2Ba)。降低代谢活动观察感染后,野生型和KO巨噬细胞gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba)。类似的结果是获得治疗和被感染的巨噬细胞的生存时用MTT试验(gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba)。我们还观察到感染的损失cIAP-1 KO巨噬细胞从细胞培养板经过长时间的感染(gydF4y2Ba图6 a, BgydF4y2Ba)。进一步描述细胞丧失的原因,LDH释放和激活半胱天冬酶3/7测量分析坏死和凋亡细胞死亡,分别。而半胱天冬酶3/7不是KO增加的巨噬细胞与野生型细胞相比,一个小但是LDH活性明显增加(p≤0.05)可以以文化上层清液(gydF4y2Ba图6 c, DgydF4y2Ba),表明一种坏死引起的细胞死亡gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图5。gydF4y2Ba受损cIAP-1 KO巨噬细胞的增长。gydF4y2Ba

答:腹膜巨噬细胞从野生型和ciap-1 KO小鼠收获和培养在抗生素自由rpmi - 1640中过夜。第二天巨噬细胞被感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba在不同的我。72 h后感染,巨噬细胞被固定冷冻无水甲醇和沾染了反gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba抗体。这里展示的是巨噬细胞的显微图代表感染。b .量化巨噬细胞的内含物。1×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba野生型和cIAP-1 KO巨噬细胞培养在96孔板无抗生素培养基和不同剂量的感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba。反的细胞被固定和染色gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba抗血清。包含在巨噬细胞由自动显微镜中描述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。数据被表示为均值±SEM从三个独立的实验。c .量化Mac-1 + (CD11b +)腹膜巨噬细胞。巨噬细胞从野生型和cIAP-1巨噬细胞治疗和增加剂量LPS Mac-1 +腹膜巨噬细胞比较野生型和KO小鼠。这里显示是Mac-1 +巨噬细胞的免疫荧光图片(绿色)和DNA(蓝色)和免疫荧光显微镜分析。d .小鼠腹腔巨噬细胞从野生型和cIAP-1 KO小鼠刺激gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba不同剂量的有限合伙人和他们的生存被WST试验测量48 h后。大肠的毒性gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染巨噬细胞。代谢活动的感染是由标准WST化验所描述的支持gydF4y2Ba材料和方法S1gydF4y2Ba。数据被表示为OD±SEM的意思是三个独立的实验。f .巨噬细胞感染实验测量下的生存标准MTT分析中描述的支持gydF4y2Ba材料和方法S1gydF4y2Ba。数据被表示为平均OD±SEM从三个独立的重复。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g005gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图6。gydF4y2Ba细胞毒性的gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染巨噬细胞。gydF4y2Ba

A和b相衬的照片未受(控制)和被感染的巨噬细胞从野生型(WT)和cIAP-1 KO (KO)小鼠24 h, 48 h和96 h后感染40×放大。所代表的照片的三个独立的实验。c .文化上层清液从巨噬细胞感染gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba或6 a、B被感染的细胞毒性定量比较,LDH释放在72 h后感染使用LDH细胞毒性检测设备(罗氏)。d .野生型和cIAP-1 KO巨噬细胞被感染和刺激TNF-α和干扰素和活动使用Caspase-Glo caspase-3和7的量化gydF4y2Ba®gydF4y2Ba发光分析在24 h后感染。* p≤0.05。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g006gydF4y2Ba

从cIAP-1 KO损失在免疫细胞的功能gydF4y2Ba

找出缺陷观察是否特定为巨噬细胞我们测试了其他免疫细胞的促有丝分裂的刺激反应gydF4y2Ba3gydF4y2BaH-thymidine吸收化验。多形核细胞(PMC)和治疗脾T细胞(详情见支持gydF4y2Ba材料和方法S1gydF4y2Ba有限合伙人和伴刀豆球蛋白A,分别导致了增强cIAP-1 KO和野生型细胞的扩散。然而,cIAP-1 KO白细胞强烈破坏的扩散与野生型细胞(gydF4y2Ba图7 a, BgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
图7。gydF4y2Ba刺激潜在cIAP-1 KO小鼠的脾细胞受损。gydF4y2Ba

A和b 1×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaPMC (A)和脾T细胞(B)从野生型和cIAP-1 KO小鼠不同剂量的有限合伙人和反面刺激,分别,刺激潜在的被测量gydF4y2Ba3gydF4y2BaH-thymidine合并。数据代表的意思是每分钟计数CPM±SEM从三个独立的实验。* p≤0.05;* * p≤0.01。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.g007gydF4y2Ba

总之,这些数据证明cIAP-1参与的控制gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染和先天免疫小鼠巨噬细胞功能的完整性和脾细胞。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba感染诱导的表达和增加稳定性gydF4y2Ba细胞凋亡蛋白的抑制剂gydF4y2Baiap,给予抗感染细胞的凋亡诱导不同的刺激gydF4y2Ba[14]gydF4y2Ba。在此基础上观察和诱导细胞凋亡以来提出了一个潜在的策略来激活抗菌反应所需的分辨率细菌感染gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba我们假设抑制感染细胞的凋亡将确保细菌的生存。干扰侵染诱导抗凋亡信号应该赋予抵抗细菌感染。在与我们的预期相反,显然cIAP-1 KO小鼠致敏的肺部感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba强烈支持cIAP-1在对这些专性细胞内细菌的免疫反应。gydF4y2Ba

越来越多的证据表明,cIAP-1和包括NF-κB cIAP-2参与信号转导通路gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba[32]gydF4y2Ba。最近的数据表明这些iap的关键作用的控制TNF-α-induced NF-κB信号。然而,cIAP-1 cIAP-2信号通路产生冗余功能gydF4y2Ba[29]gydF4y2Ba。此外,cIAP-1淘汰赛最初报道没有明显的表型,因为薪酬的老年病cIAP-2等各种组织和细胞脾、胸腺和mefgydF4y2Ba[33]gydF4y2Ba。我们观察到的老年病cIAP-2在肺组织中,但不是在cIAP-1基因敲除小鼠的巨噬细胞。由于明显的表型cIAP-1基因敲除小鼠,我们假设非冗余cIAP-1在衣原体肺部感染中的作用。这并不排除cIAP-2的函数在衣原体后肺部感染可能是组织在功能复合体gydF4y2Ba[15]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba感染诱导的分泌炎症介质如IFN-γ宿主巨噬细胞,这是通过诱导TNF-α抗菌防御的关键gydF4y2Ba[34]gydF4y2Ba。因此希望IFN-γ浓度的增加在肺部感染cIAP-1 KO小鼠TNF-α增加产量的结果。然而,感染了cIAP-1 KO小鼠TNF-α较低浓度比野生型老鼠。这可能是由于肺泡巨噬细胞的损耗或减少招聘cIAP-1 KO小鼠的肺部感染。支持这些假设我们比较histo-pathological分析肺部感染KO和野生型动物(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。我们发现增加的敏感性的高浓度的TNF-αcIAP-1 KO巨噬细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(图中未显示)相比,巨噬细胞从野生型的动物。因此可能从cIAP-1 KO小鼠巨噬细胞进行凋亡细胞死亡在肺组织发炎,建议为cIAP-2基因敲除小鼠gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba。然而,独自增强巨噬细胞凋亡可能并不占cIAP-1 KO小鼠感染的增加我们观察到,因为巨噬细胞凋亡在完全免疫动物,而主管支持清除肺部感染gydF4y2Ba[28]gydF4y2Ba。此外,我们不能观察巨噬细胞的凋亡KO的敏感与野生型动物感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba与不同的刺激(或治疗gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba和gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。因此,我们假定一个缺陷的先天免疫反应是负责减少巨噬细胞数量和增加受感染动物的细菌负荷。gydF4y2Ba

在各种致命的因素,gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba有限合伙人和HSP60的macrophage-mediated炎症反应是众所周知的刺激器清单一个强大的抗菌防御gydF4y2Ba[35]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[36]gydF4y2Ba。符合cIAP-1 KO巨噬细胞的功能障碍在这些信号通路,有限合伙人或治疗gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba感染诱导的上层清液生产TNF-α野生型巨噬细胞而迷人的巨噬细胞的反应是减少。类似的缺陷已经在cIAP-2 KO小鼠,观察显示的抵抗LPS-induced炎症反应gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba。然而,cIAP-1 KO小鼠不仅影响LPS-triggered信号通路导致TNF-α分泌。响应IFN-γ治疗也强烈减少与野生型巨噬细胞相比,证明受损IFN-γ诱导信号TNF-α生产cIAP-1 KO巨噬细胞。自中央细胞因子参与anti-chlamydial TNF-α是防御上皮细胞和巨噬细胞gydF4y2Ba[37]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[38]gydF4y2Ba,减少生产TNF-αcIAP-1 KO小鼠的肺巨噬细胞很可能机会生存的主要原因之一gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba在肺部感染cIAP-1 KO小鼠。gydF4y2Ba

诱导没有生产是另一个有效的机制,巨噬细胞杀死细菌病原体gydF4y2Ba[27]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[39]gydF4y2Ba和gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba特别是gydF4y2Ba[40]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[41]gydF4y2Ba。没有生成一氧化氮合成酶(NOS)。三号同形像哺乳动物细胞中发现,NOS2也叫gydF4y2Ba我gydF4y2Ba号(gydF4y2Ba我gydF4y2Banducible或gydF4y2Ba我gydF4y2Bandependent高架的gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba的上下文中)是最重要的感染,炎症和免疫调节gydF4y2Ba[27]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[39]gydF4y2Ba。我们发现一个强大的生产减少cIAP-1 KO小鼠巨噬细胞的刺激与有限合伙人和TNF-α比野生型细胞。有意思的是,并没有观察到这种效应如果巨噬细胞治疗IFN-γ表明cIAP-1参与特定信号通路导致的生成。块没有生产cIAP-1 KO巨噬细胞可能是上游伊诺感应自诱导物引发cIAP-1-dependent没有增加(有限合伙人,TNF-α)也诱导伊诺表达式。然而,没有在野生型和cIAP-1 KO的刺激巨噬细胞通过IFN-γ仍可比和冗余(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba),表明cIAP-1-independent IFN-γ刺激的。这是特别有趣,因为诱导的小鼠伊诺有限合伙人还涉及IFN-γ通路,如IFN-γ证明之前gydF4y2Ba[42]gydF4y2Ba,IFN-γ受体gydF4y2Ba[43]gydF4y2Ba和STAT-1gydF4y2Ba[44]gydF4y2Ba有缺陷的老鼠。自cIAP-1 KO巨噬细胞表达正常数量的LPS受体,CD14和TLR4(惠普和TR,未发表),我们推测,cIAP-1徒LPS受体下游和上游IFN-γ感应调控伊诺。gydF4y2Ba

我们发现cIAP-1阻力的增加对内毒素休克小鼠LPS引起的治疗。死亡率的KO和野生型小鼠感染gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba然而,类似,这表明未知机制除了内毒素接触造成毒性,以防感染。gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba感染巨噬细胞被激活不同的路径导致细胞死亡gydF4y2Ba[45]gydF4y2Ba。其中一个,叫做pyroptosis由于其促炎效应,是一种caspase-1-dependent的依赖于细胞死亡gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba类型三分泌系统(T3SS)和效应器gydF4y2Ba[46]gydF4y2Ba。caspase-1 KO小鼠抵抗gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba[47]gydF4y2Ba,pyroptosis引起的gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba可能不会受到cIAP-1吗gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

至少有两个不同的可能机制cIAP-1 KO小鼠抵抗内毒素休克。首先,有限合伙人cIAP-1 KO治疗敏感性增加巨噬细胞细胞死亡(见gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)可能会导致损耗的巨噬细胞在诱导系统性炎症反应。因此,促炎细胞因子的主要来源是切除导致的减毒免疫反应和保护的冲击。这个场景被建议作为抗内毒素休克cIAP-2 KO小鼠的机制gydF4y2Ba[24]gydF4y2Ba。然而,发现严重的缺陷TNF-α生产cIAP-1 KO小鼠和伊诺TNF-α和LPS诱导的挑战转变焦点没有冲击的效应。系统性TNF治疗引发致命休克综合症,心血管崩溃的集中策划的gydF4y2Ba[48]gydF4y2Ba。几行血管舒张药没有证据支持一个重要的角色的低血压,感染性休克的一个特点gydF4y2Ba[49]gydF4y2Ba,gydF4y2Ba[50]gydF4y2Ba。cIAP-1 KO响应降低巨噬细胞和脾细胞增殖反应有限合伙人和反面治疗可能会导致这些动物的阻力LPS-induced内毒素休克。gydF4y2Ba

这些发现表明,除了他们的角色在细胞凋亡调控,iap先天和适应性细胞免疫中发挥重要的作用。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

动物实验是根据德国动物保护法律执行(TierSchG)。实验的应用程序是由地方政府负责,Landesamt毛皮和Soziales一厢情愿,柏林和批准(批准号G0325/05)。gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba股票gydF4y2Ba

c .肺炎gydF4y2Ba应变VR1310 HEp-2细胞传播。这些细胞被感染gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba和细胞溶解机械用橡胶警察中断72小时后感染病例。细菌被离心500×随后收获gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 10分钟。颗粒是用玻璃珠和破裂溶解产物是离心机。上层清液被移除和离心机45000×gydF4y2BaggydF4y2Ba45分钟在4°C SS34转子(Sorvall仪器)颗粒CgydF4y2BahlamydiagydF4y2Ba。细菌在抢断resuspended(蔗糖磷酸谷氨酸)缓冲区和储存在−80°C。gydF4y2Ba

非侵入式气管内的感染的老鼠gydF4y2Ba

一种新颖的非侵入性的喷雾方法建立了感染小鼠gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba。小鼠腹腔内注射麻醉的克他命(120毫克/公斤)和甲苯噻嗪(16毫克/公斤),向后放在一个小盒子。微灌(Penn-Century、费城、PA)被口咽入气管与喉镜和双目光学显微镜的帮助,和老鼠被毒素感染5×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细菌在25µl抢断缓冲到航空公司。控制老鼠继续安慰剂和接收相同数量的抢断缓冲区。老鼠经常检查和传染性监控结束了21天的安排。每个鼠标和其他毒理学的体重测量记录的感染。gydF4y2Ba

肺传染性试验gydF4y2Ba

细菌负荷的肺感染的老鼠被传统的肺部感染监测试验gydF4y2Ba[51]gydF4y2Ba。肺部感染的老鼠分别保存介质(RPMI + 5% FCS)切碎的机械使用网格和均质使用组织均质器获得一个暂停。细胞碎片和纤维组织被通过匀浆通过40µm细胞过滤器。滤液离心机在500 g×10分钟在4°C和得到的上层清液中含有衣原体基本的身体。新鲜HEp2细胞单层用于感染在96孔板离心后在RT 1 h。700×g离心盘子被孵化有限公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在35°C 1 h中被新的取代RPMI包含5% FCS,庆大霉素1%和1µg环己酰亚胺和文化是保存在一个有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba孵化器进一步在35°C 72 h。gydF4y2Ba

疣状和自动显微镜gydF4y2Ba

衣原体包含染色,细胞单层屏蔽了PBS + 0.2% BSA与鼠标反1 h和孵化gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba抗体(Ab-Cam) 1 h rt,洗涤后,细胞进一步孵化Cy3-conjugated亲和纯化山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(单克隆)为1 h rt,细胞核与赫斯特染料染色。图像扫描获得的R自动显微镜系统(奥林巴斯)使用UPLSAPO眼镜(10×放大)如前所述gydF4y2Ba[52]gydF4y2Ba。传染性是衣原体包涵体的数量计算每个细胞使用扫描非线性分析软件。gydF4y2Ba

组织病理学的肺组织gydF4y2Ba

肺组织病理学分析,老鼠被切成5毫米长片和固定4% PFA 1 h rt,组织洗净,风干和被放置在cryo-stat媒介组织−20°C。十µm部分削减在cryotome(莱卡)和风干在一个封闭的盒子在4°C。第二天,这些部分被封锁与2% FCS / TBS 1 h rt的部分与兔抗探测gydF4y2Ba衣原体gydF4y2Ba有限合伙人和反鼠标CD68标记染色gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba和巨噬细胞。在RT 3洗TBS后,部分被孵化与反兔子Cy3-conjugated免疫球蛋白gydF4y2Bac .肺炎gydF4y2Ba为巨噬细胞和抗鼠Alexa 488 1 h rt,肺上皮细胞被可视化为5分钟通过赫斯特染料染色rt, TBS的部分被洗了三次,冲洗不久蒸馏水和安装在盖玻片。分析了部分使用荧光显微镜下40×放大。gydF4y2Ba

亚硝酸盐总产量gydF4y2Ba

上层清液从巨噬细胞被用来确定没有亚硝酸盐(形式的不稳定),格里斯试剂测定的标准。平等的文化上层清液和格里斯试剂(1%对氨基苯磺酰胺/ 0.1% N -(萘)ethylene-diaminedihydrochloride 1∶1比例)涨跌互现,吸光度测量在550纳米光谱马克斯光谱仪(分子设备)。亚硝酸盐产生的样本的数量计算纳米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba使用SPF程序标准曲线。gydF4y2Ba

ELISA对细胞因子gydF4y2Ba

TNF-α和IFN-γ肺匀浆的浓度和/或巨噬细胞文化上层清液测定使用酶联免疫试剂盒(美国BD Pharmingen)。聚苯乙烯板(美国Nunc Maxisorp)涂层与单克隆抗体anti-cytokine孵化一夜之间在4°C。盘子洗,封锁与PBS + 10%的边后卫1 h。重组细胞因子标准和样本孵化为2 h rt,洗涤后,盘子进一步孵化与生物素化的检测抗体1 h 25°C。衬底的解决方案是添加和盘子被孵化为10 ~ 30分钟rt,反应停止,板块在492海里多井光谱仪,读谱最大值250(分子设备)。细胞因子浓度样本SPF计算软件使用重组细胞因子标准曲线。gydF4y2Ba

为iap WesternblottinggydF4y2Ba

肺KO和WT动物用PBS和均质3卷里帕缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷/液盐酸(pH值7、5),130毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 0, 02% SDS,磷酸酶抑制剂(PhoSTOP),蛋白酶抑制剂[完成])。孵化后冰1 h,溶解产物是sonificated 10秒,通过离心30分钟在4°C和14000 rpm。包含蛋白质的中间层是离心机作为额外的清算和蛋白质含量高于由布拉德福德化验。XIAP检测变化,溶解产物孵化在4°C与G琼脂糖珠一夜之间减少血清免疫球蛋白。2×Laemmli缓冲区(100毫米三羟甲基氨基甲烷/液盐酸(pH值6、8),20%甘油、4% SDS, 1, 2-mercaptoethanol 5%, 0, 2%溴酚蓝)被加入到溶解产物在95°C和煮5分钟。蛋白质溶解产物分离通过SDS - page和转移到PVDF膜(通用电气医疗集团)。后阻塞1 h和脱脂奶粉5% TBS含有0.5% Tween-20 (TBST),膜装饰着一夜之间在4°C以下主要抗体:兔多克隆cIAP-2 (h - 85)和beta-Tubulin (h - 235) (Santa Cruz)和小鼠单克隆XIAP (BD转导)。Antibody-antigen复合物被HRP-linked驴anti-rabbit或羊anti-mouse二级抗体(通用电气医疗集团)。gydF4y2Ba

西方墨点法对伊诺gydF4y2Ba

腹膜巨噬细胞治疗各种炎症诱导物(有限合伙人,IFN-γTNF-α)在50 mM细胞溶解Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,2毫米EDTA, 1%诺乃清洁剂p 40,蛋白酶抑制剂混合物和用。溶菌产物是在14000转离心20分钟在4°C分离细胞溶质和颗粒分数。蛋白质含量是由布拉德福德法(Bio-Rad,慕尼黑,德国)。蛋白质(10每车道µg)分离7.5% sds - page和涂抹上湿electroblotting PVDF膜。墨迹在一夜之间被封锁在4°C和5%脱脂奶粉在TBS-T pH值7.5(20毫米三基地、137毫米氯化钠和0.1%渐变20)为2.5 h,然后孵化anti-iNOS (BD Pharmingen、海德堡、德国)其次是合共轭二次抗体。墨迹是由发射极耦合逻辑(Amersham、生命科学、弗莱堡、德国)和肌动蛋白被用作加载控制规范化。gydF4y2Ba

脾细胞主要细胞培养和增殖gydF4y2Ba

从野生型和cIAP-1 KO小鼠脾脏切除无菌和单个细胞悬液制备如前所述gydF4y2Ba[53]gydF4y2Ba。脾脏是保存在自由RPMI 1640血清培养基和碎两个frosted-end幻灯片。脾匀浆是透过40µM细胞清除过滤器的组织和碎片。暂停小心地转移到15毫升锥形离心管,离心10分钟,每分钟1500转4°C。红血球被红细胞溶解清除缓冲区NH(0.1米gydF4y2Ba4gydF4y2BaCl)。淋巴细胞分离附着中性粒细胞和单核细胞的依从性的方法。为此目的的单一细胞悬液在37°C所以准备孵化3 h和浮动淋巴细胞收集,离心机在1500 rpm, 10分钟在4°C和resuspended RPMI 1640中补充10% heat-inactivated的边后卫,15毫米消息灵通的缓冲区,2毫米庆大霉素谷酰胺和1%。台盼蓝染料排斥的可行的淋巴细胞数量的方法。这些淋巴细胞刺激与反对诱导扩散。PNM细胞与淋巴细胞以类似的方式刺激与LPS诱导增殖的平底96孔聚苯乙烯微量滴定及其扩散测定氚化胸苷(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH-Td)吸收的方法。72 h后治疗后细胞与0.5µCi脉冲gydF4y2Ba3gydF4y2BaH-Td (18.5 kbq) 18 h和收获的玻璃纤维过滤器垫通过细胞收割机。放射性是计算通过使用液体闪烁计数器(珀金埃尔默)。gydF4y2Ba

实验内毒素休克gydF4y2Ba

诱导内毒素休克,cIAP-1 KO小鼠和野生型(8 - 10周,每组5)管理各种子类和supra-lethal)剂量的细菌内毒素(LPS;gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba沙门氏菌感染σ)0.2毫升热原盐水的体积,腹腔内。控制老鼠管理正常non-pyrogenic-saline同样体积的。生存的野生型和cIAP-1 KO小鼠比较观察期间的一个星期。gydF4y2Ba

支持信息gydF4y2Ba

材料和方法S1。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s001gydF4y2Ba

(0.06 MB的医生)gydF4y2Ba

图S1。gydF4y2Ba

感染的小鼠肺Chlamydophila肺炎。肺组织病理学分析进行验证小说非侵入性intra-tracheal感染的方法。动物被感染和肺部切除无菌在不同时间后感染。5µm cryo-sections感染和控制老鼠的肺组织固定和染色存在的c .肺炎抗原(红色)和Mac-1 +巨噬细胞(绿色)。肺上皮细胞计数器与DAPI染色(蓝色)。epi-florescent显微镜的部分进行了分析。图片所示是部分的典型例子分析从三个独立的重复。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s002gydF4y2Ba

气管无名动脉瘘管的(1.30 MB)gydF4y2Ba

图S2。gydF4y2Ba

中断IAP水平cIAP-1 KO巨噬细胞。(一)Mac-1 +巨噬细胞WT和cIAP-1 KO小鼠孤立。总蛋白溶菌产物是准备从1×10 e6巨噬细胞和20所述µg WT和cIAP-1 KO巨噬细胞的蛋白质sds - page和涂抹到PVDF膜隔开。iap水平和beta-actin(加载控制)在这些巨噬细胞被免疫印迹检测分析使用cIAP-1 (BD转导),兔多克隆抗血清cIAP-2 (h - 85) (Santa Cruz)和小鼠单克隆XIAP (BD转导)。(B)型PCR野生型和cIAP-1 KO小鼠的肺组织。从肺组织中提取DNA的野生型(WT)或cIAP-1 KO小鼠(KO)放大与引物结合序列内cIAP-1基因的外显子1(例1)或新霉素基因序列(neo)插入cIAP-1基因的外显子1生成KO小鼠(neo)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s003gydF4y2Ba

气管无名动脉瘘管的(0.42 MB)gydF4y2Ba

图S3。gydF4y2Ba

没有增加ciap-1 KO巨噬细胞的凋亡刺激治疗。A和b 1×106从野生型和cIAP-1 KO小鼠巨噬细胞分离和培养。细胞凋亡是评估通过确定caspases-3/7活动由Caspase-Glo®发光测定。巨噬细胞刺激了各种炎症介质(tnf: 50 ng / ml;IFN-gamma: 50 ng / ml;有限合伙人:5µg /毫升;硝普酸钠(SNP): 300海里)和他们的反应是监控24 h后48小时(A)和(B)后处理。无论是野生型的治疗引起的凋亡反应或cIAP-1 KO巨噬细胞。数据被表示为意味着发光±SEM从两个独立的实验中也得到了类似的结果。(C)测定巨噬细胞生存能力。 Macrophages treated with inflammatory cytokines and their survival was measured by MTT dye reduction method. The macrophages under above treatments were incubated with MTT dye and The amount of purple formazon crystals formed as a result of its reduction was measured at 570 nm by a spectrometer, Spectra max 250 (Molecular Devices, Munich, Germany). Data are represented as mean OD±SEM from three independent experiments.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s004gydF4y2Ba

气管无名动脉瘘管的(0.25 MB)gydF4y2Ba

图S4。gydF4y2Ba

没有影响的cIAP-1沙门氏菌感染的控制和毒性静脉感染C57BL / 6和KO cIAP-1小鼠鼠伤寒沙门氏菌。KO cIAP-1小鼠感染C57BL / 6和500个集落形成单位(cfu)鼠伤寒沙门氏菌SL1344通过尾静脉。答:cfu /脾测定感染后的5天。细菌负荷等效C57BL / 6和KO cIAP老鼠。b .生存在一周后感染监测。所有老鼠都死了6天邮报感染C57BL / 6没有显著差异或KO cIAP-1老鼠。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s005gydF4y2Ba

气管无名动脉瘘管的(0.16 MB)gydF4y2Ba

表S1。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s006gydF4y2Ba

(0.03 MB的医生)gydF4y2Ba

表S2。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006519.s007gydF4y2Ba

(0.03 MB的医生)gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢社会霍夫曼和亚历山大•克莱恩优秀的技术支持。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

构思和设计实验:惠普DB磅TR。执行实验:惠普DB磅。分析了数据:惠普DB磅TR。造成试剂/材料/分析工具:LA兆瓦SR解冻。该报写道:惠普TR。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

  1. 1。gydF4y2BaAbdelrahman YM, Belland RJ(2005)衣原体发育周期。《牧师29日:949 - 959。gydF4y2Ba
  2. 2。gydF4y2BaMolestina再保险,米勒RD、拉米雷斯JA Summersgill JT(1999)与肺炎衣原体感染人类内皮细胞的刺激transendothelial中性粒细胞和单核细胞的迁移。感染Immun 67: 1323 - 1330。gydF4y2Ba
  3. 3所示。gydF4y2BaGaydos CA, Summersgill JT, Sahney NN,拉米雷斯是的,奎因TC(1996)的肺炎衣原体在体外复制人类巨噬细胞、内皮细胞、主动脉动脉平滑肌细胞。感染Immun 64: 1614 - 1620。gydF4y2Ba
  4. 4所示。gydF4y2BaHeinemann M,苏萨M Simnacher U, Marre R, Essig增长(1996)肺炎衣原体诱导细胞因子的生产和CD14表达人类单核细胞的细胞系。感染Immun 64: 4872 - 4875。gydF4y2Ba
  5. 5。gydF4y2BaAirenne年代,Surcel嗯,Alakarppa H, Laitinen K, Paavonen J, et al .(1999)肺炎衣原体感染人类单核细胞。感染Immun 67: 1445 - 1449。gydF4y2Ba
  6. 6。gydF4y2BaCochrane M, Pospischil,沃克P,吉布斯H,蒂姆斯P(2005)不整合的肺炎衣原体检测颈动脉疾病患者使用聚合酶链反应,免疫荧光显微镜和血清学方法。病理学37:69 - 75。gydF4y2Ba
  7. 7所示。gydF4y2BaAppelberg R(2006)巨噬细胞nutriprive抗菌机制。J Leukoc 79: 1117 - 1128。gydF4y2Ba
  8. 8。gydF4y2Ba小Janeway CA, Medzhitov R(2002)先天免疫识别。为Immunol 20: 197 - 216。gydF4y2Ba
  9. 9。gydF4y2BaMatzinger P(2002)模型的危险:一个新的自我。科学296:301 - 305。gydF4y2Ba
  10. 10。gydF4y2BaTopley N, Mackenzie RK,威廉姆斯JD(1996)巨噬细胞和间皮的细胞在细菌性腹膜炎。免疫生物学195:563 - 573。gydF4y2Ba
  11. 11。gydF4y2Ba胡风扇T,卢H, H, L, McClarty GA, et al .(1998)抑制细胞凋亡在chlamydia-infected细胞:封锁线粒体细胞色素c的释放和半胱天冬酶激活。J Exp 187: 487 - 496。gydF4y2Ba
  12. 12。gydF4y2BaRajalingam K,艾尔·尤尼斯H,穆勒,Meyer TF, Szczepek AJ, et Al。(2001)上皮细胞感染Chlamydophila肺炎(肺炎衣原体)抗细胞凋亡。感染Immun 69: 7880 - 7888。gydF4y2Ba
  13. 13。gydF4y2Ba费舍尔科幻,施瓦兹C,竞争者J,黑客G(2001)描述的肺炎衣原体感染的人类细胞凋亡活动。感染Immun 69: 7121 - 7129。gydF4y2Ba
  14. 14。gydF4y2BaPaland N, Rajalingam K, Machuy N, Szczepek, Wehrl W, et al。(2006) NF-kappaB和所需的细胞凋亡蛋白抑制剂抗细胞凋亡的上皮细胞持续感染Chlamydophila肺炎。细胞Microbiol 8: 1643 - 1655。gydF4y2Ba
  15. 15。gydF4y2BaRajalingam K,沙玛,Paland N,赫维茨R, Thieck O, et al . (2006) IAP-IAP复合物抗凋亡所需的c . trachomatis& # 8211;感染细胞。PLoS病原体2:e114。gydF4y2Ba
  16. 16。gydF4y2Ba米勒路(1999)iap的注释:从BIR主题救赎和惊喜。趋势细胞杂志9:323 - 328。gydF4y2Ba
  17. 17所示。gydF4y2Ba罗伊·N Deveraux QL,高桥R, Salvesen GS,里德JC (1997) c-IAP-1和c-IAP-2直接抑制剂还存在特定的蛋白质。EMBO J 16: 6914 - 6925。gydF4y2Ba
  18. 18岁。gydF4y2BaDeveraux QL,高桥R, Salvesen GS,里德JC (1997) x连锁IAP是一个直接的细胞死亡蛋白酶抑制剂。自然388:300 - 304。gydF4y2Ba
  19. 19所示。gydF4y2BaEckelman BP Salvesen GS,斯科特FL人类细胞凋亡蛋白的抑制剂(2006):为什么XIAP是家里的败家子。EMBO代表7:988 - 994。gydF4y2Ba
  20. 20.gydF4y2Ba哈林H, Reffey某人Duckett CS, Lindsten T,汤普森CB(2001)表征XIAP-deficient老鼠。摩尔细胞杂志21:3604 - 3608。gydF4y2Ba
  21. 21。gydF4y2BaLeulier F, Lhocine N, P Lemaitre B,迈耶(2006)细胞凋亡蛋白的果蝇抑制剂DIAP2函数在先天免疫和抵抗革兰氏阴性细菌感染至关重要。摩尔细胞杂志26日:7821 - 7831。gydF4y2Ba
  22. 22。gydF4y2Ba蜀HB,竹内M, Goeddel DV(1996)肿瘤坏死因子受体2信号传感器TRAF2和c-IAP1组件的肿瘤坏死因子受体1信号复杂。93年《美国国家科学院刊年代:13973 - 13978。gydF4y2Ba
  23. 23。gydF4y2Ba西格尔先生,陈KF Lenardo JM TNF受体(2000)信号的总科和T细胞内稳态。免疫13:419 - 422。gydF4y2Ba
  24. 24。gydF4y2Ba孔蒂D, Holcik M, Lefebvre CA, Lacasse E,皮科特DJ, et al .(2006)细胞凋亡蛋白的抑制剂cIAP2 lipopolysaccharide-induced巨噬细胞生存至关重要。摩尔细胞杂志26日:699 - 708。gydF4y2Ba
  25. 25。gydF4y2Ba包尔LD、Duckett CS baillie gifford MX (2008) XIAP调节Cytosol-Specific先天免疫李斯特菌感染。公共科学图书馆Pathog 4: e1000142。gydF4y2Ba
  26. 26岁。gydF4y2BaKlimp啊,德弗里斯如Scherphof GL,德门T(2002)巨噬细胞激活的潜在作用的治疗癌症。暴击牧师杂志内科杂志44:143 - 161。gydF4y2Ba
  27. 27。gydF4y2BaBogdan C(2001)一氧化氮和免疫应答。Nat Immunol 2: 907 - 916。gydF4y2Ba
  28. 28。gydF4y2BaDockrell DH,万豪嗯,LR王子,起垄犁VC,因斯PG, et al。(2003)肺泡巨噬细胞凋亡导致肺部感染的肺炎球菌间隙解决模型。J Immunol 171: 5380 - 5388。gydF4y2Ba
  29. 29。gydF4y2BaMahoney DJ,张HH, Mrad RL, Plenchette年代,Simard C, et al。(2008) cIAP1和cIAP2调节TNFalpha-mediated NF-kappaB激活。105年《美国国家科学院刊年代:11778 - 11783。gydF4y2Ba
  30. 30.gydF4y2BaVarfolomeev E,布兰肯希普JW,还有Wayson SM Fedorova AV, Kayagaki N, et al。(2007) IAP拮抗剂诱导autoubiquitination c-IAPs, NF-kappaB激活,TNFalpha-dependent细胞凋亡。细胞131:669 - 681。gydF4y2Ba
  31. 31日。gydF4y2Ba楚ZL,麦肯锡助教,刘L,贵族JJ, Malim MH, et al .(1997)抑制剂抑制肿瘤坏死因素细胞死亡的凋亡c-IAP2 NF-kappaB控制。94年《美国国家科学院刊年代:10057 - 10062。gydF4y2Ba
  32. 32。gydF4y2Ba蜀HB,竹内M, Goeddel DV(1996)肿瘤坏死因子受体2信号传感器TRAF2和c-IAP1组件的肿瘤坏死因子受体1信号复杂。93年《美国国家科学院刊年代:13973 - 13978。gydF4y2Ba
  33. 33。gydF4y2BaConze DB,阿尔伯特·L, Ferrick哒,Goeddel DV,叶WC, et al。(2005)的c-IAP2差别转录后的对这些泛素蛋白连接酶c-IAP1体内。摩尔细胞杂志25日:3348 - 3356。gydF4y2Ba
  34. 34。gydF4y2Ba次我,Gigliotti-Rothfuchs Wigzell H (2002) IFN-gamma在衣原体感染的结果。当今Immunol 14: 444 - 451。gydF4y2Ba
  35. 35。gydF4y2Ba科斯塔CP、Kirschning CJ Busch D·杜尔年代,Jennen L, et al .(2002)衣原体的作用热休克蛋白60肺炎衣原体在先天免疫细胞的刺激。J Immunol 32欧元:2460 - 2470。gydF4y2Ba
  36. 36。gydF4y2BaRedecke V, Dalhoff K, Bohnet年代,布劳恩J,马斯河M(1998)肺炎衣原体和人类肺泡巨噬细胞的相互作用:感染和炎症反应。我和细胞杂志19:721 - 727。gydF4y2Ba
  37. 37岁。gydF4y2Ba制革匠AR、齐格勒MH Riley MM,巴布科克助教,Telbis VP, et al。(2000)肿瘤坏死因子-α和脂多糖提高干扰素诱导antichlamydial吲哚胺加双氧酶单独活动。干扰素与细胞因子研究杂志》20:369 - 376。gydF4y2Ba
  38. 38。gydF4y2Ba弗里德曼Haranaga年代,山口H, Ikejima H, H,山本Y(2003)肺炎衣原体感染肺泡巨噬细胞:一个模型。187年J感染说:1107 - 1115。gydF4y2Ba
  39. 39岁。gydF4y2BaChakravortty D, Hensel M(2003)诱导一氧化氮合酶和胞内细菌病原体的控制。微生物感染5:621 - 627。gydF4y2Ba
  40. 40。gydF4y2Ba陈BJ,结实的R,坎贝尔WF(1996)一氧化氮生产:沙眼衣原体抑制的机制interferon-gamma-treated RAW264.7细胞。《免疫学和医学微生物学14:109 - 120。gydF4y2Ba
  41. 41岁。gydF4y2BaCarratelli CR,里佐,Paolillo R,卡塔尼亚先生,Catalanotti P, et al。(2005)一氧化氮对肺炎Chlamydophila的生长的影响。加拿大《微生物学51:941 - 947。gydF4y2Ba
  42. 42。gydF4y2BaKeshav道尔顿DK, Pitts-Meek S, S, Figari布拉德利,et al。(1993)免疫细胞功能的多个缺陷小鼠中断移行细胞的基因。科学259:1739 - 1742。gydF4y2Ba
  43. 43。gydF4y2BaKamijo R,夏皮罗D J,黄年代,Aguet M, et al。(1993)代一氧化氮和类主要组织相容性复合体II抗原诱导巨噬细胞从老鼠缺乏干扰素γ受体。90年《美国国家科学院刊年代:6626 - 6630。gydF4y2Ba
  44. 44岁。gydF4y2BaMeraz马,白色的JM,希恩KC,巴赫EA, Rodig SJ, et al .(1996)目标破坏Stat1基因的老鼠揭示意想不到的生理JAK-STAT信号通路的特异性。细胞84:431 - 442。gydF4y2Ba
  45. 45岁。gydF4y2Ba博伊西LH,柯林斯CM (2001) Salmonella-induced细胞死亡,细胞凋亡,坏死或程序性细胞死亡?趋势Microbiol 9: 64 - 67。gydF4y2Ba
  46. 46岁。gydF4y2Ba芬克SL, Cookson BT (2007) Pyroptosis和宿主细胞死亡反应在沙门氏菌感染。细胞Microbiol 9: 2562 - 2570。gydF4y2Ba
  47. 47岁。gydF4y2BaMonack DM,赫斯D, Ghori N, Bouley等D, Zychlinsky, et al .(2000)沙门氏菌利用caspase-1殖民派尔集合淋巴结补丁在鼠伤寒模型。J Exp 192: 249 - 258。gydF4y2Ba
  48. 48。gydF4y2Ba总值Kilbourn RG, SS, Jubran,亚当斯J,格里菲斯噢,et al . (1990) NG-methyl-L-arginine抑制肿瘤坏死因素低血压:对一氧化氮的参与的影响。87年《美国国家科学院刊年代:3629 - 3632。gydF4y2Ba
  49. 49。gydF4y2BaFeihl F, Waeber B, Liaudet L(2001)一氧化氮生产过剩的目标选择感染性休克的管理?杂志91:179 - 213。gydF4y2Ba
  50. 50。gydF4y2BaThiemermann C,麦当劳MC, Cuzzocrea年代(2001)硝基氧稳定,tempol,减弱过氧硝酸盐的危害和oxygen-derived自由基。暴击治疗地中海29日:223 - 224。gydF4y2Ba
  51. 51。gydF4y2Ba陈W,郭C(1980)沙眼衣原体引起的肺炎的小鼠模型:形态学,微生物学,免疫学研究。是中草药100:365 - 382。gydF4y2Ba
  52. 52岁。gydF4y2Ba看法Paland N, L, Gurumurthy RK,毛雷尔,Szczepek AJ, et al。(2008)显示肿瘤坏死因子受体减少我在宿主细胞表面支持感染沙眼衣原体。283年J临床生物化学:6438 - 6448。gydF4y2Ba
  53. 53岁。gydF4y2BaIA, Mishell RI(1974)分离小鼠脾细胞通过交联葡聚糖g10的列。J Immunol方法5:239 - 247。gydF4y2Ba