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研究文章

人tlr2 /1诱导的抗菌反应中IL-1β和VDR激活通路的收敛

  • Philip T. Liu,

    philip@bruinphd.com

    联系美国加利福尼亚州洛杉矶市加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院医学系皮肤病学部

    ⨯
  • Mirjam Schenk

    联系美国加利福尼亚州洛杉矶市加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院医学系皮肤病学部

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  • 瓦伦西亚·p·沃克，

    联系美国加利福尼亚州洛杉矶市，加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院，儿科，新生儿科和发育生物学分部，新生儿研究中心

    ⨯
  • 保罗·w·邓普西，

    联系加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系，美国加利福尼亚州洛杉矶

    ⨯
  • 梅丽莎Kanchanapoomi,

    联系加州大学旧金山分校医学院，美国加利福尼亚州旧金山市

    ⨯
  • 马修匠,

    联系加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系，美国加利福尼亚州洛杉矶

    ⨯
  • 咏叹调Vazirnia,

    联系加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系，美国加利福尼亚州洛杉矶

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  • Xiaoran张

    联系加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系，美国加利福尼亚州洛杉矶

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  • Andreas Steinmeyer

    联系药物化学，拜耳先灵制药公司，柏林，德国

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  • 乌尔里希Zugel,

    联系通用机制研究早期项目，拜耳先灵制药公司，柏林，德国

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  • 布鲁斯·w·霍利斯，

    联系美国南卡罗来纳查尔斯顿市南卡罗来纳医科大学儿科、生物化学和分子生物学系

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  • Genhong Cheng

    联系加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系，美国加利福尼亚州洛杉矶

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  • 罗伯特·l·莫德林

    从属关系美国加利福尼亚州洛杉矶，加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院医学系皮肤病学部，美国加利福尼亚州洛杉矶，加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系

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摘要

抗微生物效应机制是宿主防御微生物病原体的先天免疫反应的核心功能。在人体内，激活单核细胞上的toll样受体2/1 (TLR2/1)可诱导维生素D依赖性的抗细胞内分枝杆菌抗菌活性。在这里，我们报道了单核细胞的TLR激活触发防御素β 4基因(DEFB4)的诱导，需要IL-1β和维生素D受体(VDR)通路的收敛。TLR2/1激活可触发IL-1β活性，包括IL-1β和IL-1受体上调，IL-1受体拮抗剂下调。TLR2/1L诱导IL-1β是上调DEFB4的必要条件，而cathelicidin则不需要，而VDR激活则是这两种抗菌基因表达的必要条件。诱导DEFB4和cathelicidin的差异需求体现在它们各自启动子区域的差异上;DEFB4启动子有1个维生素D反应元件(VDRE)和2个NF-κB位点，而cathelicidin启动子有3个VDRE，无NF-κB位点。NF-κB转染原代单核细胞与1,25d3协同诱导DEFB4表达。原代单核细胞中DEFB4或cathelicidin的下调导致tlr2 /1介导的对细胞内分枝杆菌的抗菌活性丧失。因此，这些数据确定了一种新的宿主防御机制，需要诱导IL-1β与维生素D激活协同作用，用于tlr诱导的对抗细胞内病原体的抗菌途径。

引用:Liu PT, Schenk M, Walker VP, Dempsey PW, Kanchanapoomi M, Wheelwright M，等(2009)人tlr2 /1诱导的抗菌反应中IL-1β和VDR激活通路的趋同。PLoS ONE 4(6): e5810。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810

编辑器:Derya Unutmaz，美国纽约大学医学院

收到:2009年3月9日;接受:2009年5月5日;发表:二九年六月五日

版权:©2009刘等。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。

资助:为这项工作提供资助:Robert L. Modlin (NIH RO1 AI047868)， Valencia P. Walker (NIH K12 HD034610和Robert Wood Johnson基金会053510)和Mirjam Schenk(瑞士国家基金会117533)。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

先天免疫系统通过识别微生物配体并随后触发抗菌反应，对感染性病原体迅速做出反应。细胞内病原体结核分枝杆菌，一个关键的抗菌机制包括toll样受体(TLRs)识别细菌脂蛋白，诱导25-羟基维生素d3 -1α-羟化酶(CYP27B1)，将维生素D原激素(25D)转化为活性1,25D形式，上调和激活维生素D受体(VDR)。[1]- - - - - -［5］．VDR中的单核苷酸多态性增加了对结核病的易感性，这表明VDR激活在人类宿主对结核病的防御中起着关键作用[6]．

人们早就知道，单独激活人类单核细胞中的VDR可诱导抗微生物活性结核分枝杆菌在Crowle和Rook的实验室中首次通过添加VDR激动剂进行了演示[7],[8]．我们推断，vdr诱导的抗菌途径涉及一组调节基因，有助于宿主防御结核分枝杆菌感染。维生素D受体反应元件(VDREs)已被证明可以调节抗菌肽cathelicidin和defensin β 4 (DEFB4，以前的HBD2)[1]．之前，我们证明了cathelicidin直接杀伤结核分枝杆菌[3]此外，维生素d诱导的cathelicidin表达是抗菌活性所必需的[4]．相反，仅VDR激活不足以诱导单核细胞中DEFB4的表达[4]．在这里，我们研究了先天系统的激活可以诱导人单核细胞中DEFB4表达的机制。

材料与方法

道德声明

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》所表达的原则进行的。这项研究得到了加州大学洛杉矶分校机构审查委员会的批准。所有献血者都提供了采集外周血并进行后续分析的书面知情同意。

试剂和细菌

TLR2/1L是一种合成的19 kDa结核分枝杆菌衍生脂肽(EMC Microcollections, Tuebingen, Germany)。TLR2/1L对cathelicidin的最佳诱导时间为24小时(数据未显示)。1,25 d3购买(BioMol，普利茅斯会议，PA，美国)，并在无菌过滤乙醇中重新悬浮于10−2M装在琥珀色管中，在- 80°C下储存。1,25D3以10的浓度加入培养−7从M到10−9M，或者10−8在没有滴定的情况下，先前确定的激发人原代单核细胞的最佳浓度。VDR拮抗剂ZK 159 222 (VAZ)由拜耳先灵制药公司提供，在10时使用−7从M到10−9M，或者10−8在没有滴定的情况下。结核分枝杆菌H37Ra菌株是恩斯特博士的一份厚礼，如下所述。Cathelicidin (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA)和DEFB4 (Peptides International, Louisville, KY)肽按照制造商的建议购买和储存。非特异性肽控制是淀粉样β蛋白的1-40个氨基酸(多肽国际)，选择其长度和分子量与cathelicidin和DEFB4多肽相似，它没有已知的抗菌活性。购买预先设计的siRNA寡核苷酸(Dharmacon, Lafayette, CO): siCTRL, siCath和siDEFB4按照制造商的建议重新悬挂和储存。Cell Line Nucleofection Kit V购买并用于siRNA转染(Amaxa, Gaithersburg, MD)。IL-1β中和抗体和重组IL-1β分别以10µg/ml和10 ng/ml的价格使用(R&D Systems, Minneapolis, MN)。NF-κB p65表达载体已有报道[9]．

单核细胞分离和血清采集

使用Ficoll-Paque和Percoll梯度分离单核细胞(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)，用含有10%维生素d充足的人血清的RPMI培养，并在指定条件下刺激。采集血清时，不使用抗凝剂，让血液凝固1小时。然后破坏凝块，离心分离血清，分离并过滤。25D和1,25 d水平的测量如前所述[4]．收集多种维生素D充足或接近不足供体的血清，如果需要，在大量血清中补充外源性25D3以达到100 nM的浓度。

ELISA和流式细胞仪

如前所述进行elisa[10]．IL-1β抗体对购买(Invitrogen, Carlsbad, CA)。为了测量IL-1RA水平，我们使用了制造商(研发系统)推荐的人IL-1RA Duoset ELISA试剂盒。采用三步流式细胞术检测细胞表面IL-1R1水平。简单地说，TLR2/1L刺激后，从培养板中收获细胞，用抗IL-1R1的一级单克隆抗体(R&D Systems)孵育，然后是生物素化的二抗，最后是荧光色素偶联的链亲和素。由于IL-1R1在人原代单核细胞上的低表达水平，需要用三步流式细胞术来扩增荧光信号。

直接抗菌活性测定

我们之前的研究表明H37Ra减毒株结核分枝杆菌与毒株H37Rv相比，对cathelicidin具有相似的敏感性;因此，我们认为H37Ra是抗菌肽对细菌生长影响的充分模型[3],[4]．直接抗菌实验是在抗菌素活性和抗菌活性优化的条件下进行的结核分枝杆菌H37Ra如前所述生长[4]．短暂的2×106细菌与cathelicidin, DEFB4或非特异性肽孵育两天，然后用3 μ Ci脉冲3.h -尿嘧啶一天。培养后，将细菌固定在2%多聚甲醛的最终浓度下20分钟，然后收集用于液体闪烁计数。抗菌活性计算为与无肽对照相比，使用肽处理后CPM值下降的百分比。

CFU化验

原代人单核细胞感染结核分枝杆菌H37Ra在MOI为0.5的条件下持续16小时。感染效率由金胺罗丹明染色确定，通常在30%的范围内，平均每个感染细胞1.1个细菌。用1×PBS清洗感染细胞，去除细胞外细菌，计数后镀至96孔培养板。感染细胞用TLR2/1L在三个重复孔中处理3天，然后用大力移液将其重悬溶解到0.3%的皂素溶液中。收集细胞内细菌进行CFU测定[4]．为了对每个实验的可变起始材料进行归一化，通过将tlr2 / 1l处理的细胞的相对值外推到10来计算相对CFU5培养基处理细胞的CFU[3]．

qPCR

使用Trizol Reagent (Invitrogen)分离RNA，使用iSCRIPT cDNA Synthesis Kit (BioRad, Hercules, CA)合成cDNA。36B4、DEFB4和cathelicidin的引物序列已发表，方法也已描述[4],[11]．每个样本检测的基因的相对数量是根据核糖体蛋白，大，P0 mRNA (36B4)计算的，使用ΔΔC(T)公式，如前所述[12]．

原发性单核细胞转染

根据制造商的建议，使用Amaxa™Nucleofection System和human Monocyte Kit将siRNA或表达构建物转染到原代人单核细胞中。每次转染使用100 pmol的siRNA结构物，每次转染使用1µg的质粒。siRNA转染原代单核细胞的效率使用siGLO进行评估，siGLO是一种荧光标记的对照寡聚物(Dharmacon)，平均转染率为95%。使用pMAX-GFP构建(Amaxa)评估表达结构的转染效率，平均转染率为38%。

结果

tlr2 /1激活导致DEFB4 mRNA上调

正如先前报道的，在原代单核细胞中直接激活VDR与1,25d3 (10−8M)没有诱导DEFB4 mRNA，但足以诱导cathelicidin表达增加25倍(Student's t检验，p<0.05) (图1一个）[4]．同样，DEFB4也没有被任何10激活的单核细胞诱导−7M或10−9M浓度1,25 d3(数据未显示)。1,25 d3在人单核细胞中诱导cathelicidin，如前面所示，下游靶点CYP24A1表明VDR是功能性的[4]，但其激活不足以诱导DEFB4。

缩略图
下载:
图1所示。从单核细胞诱导抗菌肽DEFB4和cathelicidin。

(A)在10点用1,25 d3刺激原代人单核细胞−818个小时。采用qPCR法检测DEFB4或cathelicidin mRNA水平。(平均折叠变化vs介质±SEM, n≥5)。(B) TLR2/1L(10µg/ml)刺激单核细胞24小时。采用qPCR法检测DEFB4或cathelicidin mRNA水平。(平均折叠变化vs介质±SEM, n≥4)。NS =不显著，* = p≤0.05，** = p≤0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g001

为了确定是否有其他途径参与了单核细胞中DEFB4的诱导，我们考虑了TLR2/1的激活，这是单核细胞中先天性免疫反应的强大诱导剂，包括VDR的激活以及其他信号通路。与1,25d3刺激相反，TLR2/1配体(TLR2/1L，结核分枝杆菌衍生19 kDa脂肽)导致DEFB4 mRNA上调4.2倍(t检验，p<0.005)。在相同的实验中，Cathelicidin上调2.6倍(t检验，p<0.05) (图1 b)，与先前的结果一致[4]．tlr2 / 1l诱导的DEFB4 mRNA表达水平为培养基对照的2 - 10倍，一些供体的诱导水平达到培养基对照的30 - 70倍(数据未显示)。这些数据表明，可以通过激活TLR2/1在人单核细胞中触发DEFB4诱导。

tlr2 /1诱导的DEFB4 mRNA依赖于VDR的激活

TLR2/1L而不是1,25d3在人单核细胞中激活DEFB4的能力提出了一个问题，即是否需要VDR激活才能诱导DEFB4。为了解决这一问题，VDR拮抗剂ZK 159 222 (VAZ)首次测试了其阻断1,25 d3诱导的cathelicidin mRNA表达的能力。用VAZ滴定预孵育单核细胞(10−9从M到10−7M)还原1,25 d3诱导(10−8M) cathelicidin mRNA呈剂量依赖性，在等摩尔浓度时减少56% (t检验，p<0.05)，在10倍摩尔过量时减少87% (t检验，p<0.05) (图2一个)．然后用VAZ预处理单核细胞(10−8M)然后TLR2/1L 24小时。采用qPCR法检测DEFB4和cathelicidin mRNA水平。在VAZ存在时，tlr2 / 1l介导的DEFB4减少了98% (t检验，p<0.001)， cathelicidin mRNA表达完全被抑制到低于未受刺激背景的水平，计算为减少120% (t检验，p<0.01) (图2 b)．综上所述，这些数据表明tlr2 / 1l介导的DEFB4 mRNA的诱导依赖于VDR的激活。

缩略图
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图2。维生素D受体激活对tlr2 /1诱导的DEFB4表达的作用

(A) 10时用维生素D受体拮抗剂ZK 159 222 (VAZ)处理单核细胞−710米,−810米,−9M或介质20分钟，然后在10点用1,25 d3激活−818个小时。采用qPCR法检测cathelicidin mRNA水平。(平均折叠变化vs介质±SEM, n = 4)。(B)用VAZ 10处理单核细胞−8M或介质20分钟，然后用TLR2/1L(10µg/ml)激活24小时。采用qPCR检测DEFB4或cathelicidin mRNA水平(平均折叠变化vs培养基±SEM, n≥4)。* = p≤0.05，** = p≤0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g002

tlr2 / 1l介导的DEFB4 mRNA的诱导需要IL-1β

研究发现，TLR2/1介导的DEFB4诱导是vdr依赖的，但1,25d3单独不是一个充分的触发因素，这表明TLR2/1激活还诱导了vdr独立的免疫机制。我们假设IL-1β介导tlr2 /1诱导的DEFB4表达:i) IL-1β能够触发上皮细胞中DEFB4的表达[1]和ii)单核细胞TLR激活导致IL-1β分泌[13],[14]．为了确定原代人单核细胞中依赖tlr2 /1的DEFB4诱导是否需要产生IL-1β，用IL-1β中和单克隆抗体或IgG同型对照预处理单核细胞20分钟，然后在人血清中培养，并用TLR2/1L刺激。IL-1β中和抗体的存在可使tlr2 / 1l诱导的DEFB4 mRNA表达降低97% (t检验，p<0.05)，但对cathelicidin的表达无影响(图3一)．这些数据表明，在tlr2 /1介导的DEFB4诱导中需要IL-1β的诱导，而不是cathelicidin。

缩略图
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图3。IL-1β活化对DEFB4表达的影响

(A)用IL-1β中和抗体(10µg/ml)、同型对照(10µg/ml)或培养基孵育单核细胞20分钟，然后用TLR2/1L(10µg/ml)激活24小时。采用qPCR检测DEFB4或cathelicidin mRNA水平(平均折叠变化vs培养基±SEM, n≥4)。(B)用TLR2/1L(10µg/ml)、重组IL-1β (10 ng/ml)或两种介质刺激单核细胞24小时。采用qPCR检测DEFB4或cathelicidin mRNA水平(平均折叠变化vs培养基±SEM, n = 5)。NS =不显著，* = p≤0.05，** = p≤0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g003

鉴于这些结果，我们测试了IL-1β和1,25d3共同刺激单核细胞是否能诱导DEFB4表达。用任一培养基刺激单核细胞，重组人IL-1β (10 ng/ml)， 1,25d3 (10−8M)，或IL-1β和1,25d3一起作用24小时，并检测DEFB4和cathelicidin mRNA的表达。IL-1β单独对DEFB4和cathelicidin mRNA表达均无诱导作用，1,25d3单独诱导cathelicidin mRNA表达增加50倍(t检验，p<0.01) (图3 b)．然而，当IL-1β和1,25 d3一起添加时，尽管cathelicidin mRNA上调了40倍(t检验，p<0.01)，但IL-1β和1,25 d3并没有诱导DEFB4 mRNA的表达(图3 b)．这些结果表明，tlr2 /1诱导的DEFB4 mRNA表达需要IL-1β的释放和VDR的激活，但IL-1β和VDR激动剂的共同添加不足以诱导DEFB4 mRNA的表达。

TLR2/1L触发IL-1β、IL-1R1并抑制单核细胞产生IL-1RA

基于以下观察结果，我们假设单核细胞上的TLR2/1激活导致IL-1β功能的增强，1)IL-1β和VDR的激活都是TLR2/1介导的DEFB4诱导所必需的，2)IL-1β和1,25d3的共刺激不诱导DEFB4。因此，在TLR2/1刺激的单核细胞中检测了影响IL-1β活性的三个关键因素:IL-1β±IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)和IL-1受体1 (IL-1R1)。分离原代人单核细胞，TLR2/1L(0.1µg/ml, 1µg/ml, 10µg/ml)滴定18小时，ELISA法检测培养上清液中IL-1β和IL-1RA水平。TLR2/1刺激导致IL-1β显著分泌，且呈剂量依赖性，最高TLR2/1L浓度达到2.8 ng/ml (t检验vs培养基，p<0.05) (图4一)．尽管单独在培养基中培养的单核细胞自发产生IL-1RA，但添加TLR2/1L以剂量依赖的方式减少IL-1RA的释放(图4 b)．在TLR2/1L最高浓度(10 ug/ml)时，IL-1RA较培养基降低60% (t检验，p<0.01)。然后，通过流式细胞术检测IL-1R1在培养基或TLR2/1L刺激的单核细胞(10µg/ml)表面的表达。TLR2/1激活导致IL-1R1表达增强(图4 c平均荧光强度平均增加3.1倍(t检验，p<0.05) (图4 d)．综上所述，这些数据表明，TLR2/1刺激单核细胞通过分泌IL-1β、增加IL-1R1的表达和抑制IL-1RA来增加IL-1β的活性。

缩略图
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图4。TLR激活对IL-1β活性的调控。

TLR2/1L分别以0.1µg/ml、1µg/ml或10µg/ml刺激单核细胞18小时。(A) ELISA法测定培养上清液中IL-1β或(B) IL-1RA水平(均值±SEM, n = 5)。用TLR2/1L(10µg/ml)刺激单核细胞24小时。流式细胞仪检测细胞表面il - 1r1的表达。所示数据是(C)代表三个个人捐赠者，或(D)平均值ΔMFI (n = 3)。(E)用TLR2/1L(10µg/ml)、重组IL-1β (10 ng/ml)或两者刺激单核细胞24小时。采用qPCR检测DEFB4或cathelicidin mRNA水平(平均折叠变化vs培养基±SEM, n = 5)。NS =不显著，* = p≤0.05，** = p≤0.01。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g004

我们假设，TLR2/1刺激的单核细胞对IL-1β刺激更敏感，因为IL-1R1表达更高，IL-1RA分泌更低。为了验证这一点，在人血清中培养的原代单核细胞用培养基、重组IL-1β、TLR2/1L或两者同时处理24小时，并检测DEFB4和cathelicidin mRNA的表达。与之前的结果一致，在培养基中单独添加重组IL-1β不会诱导DEFB4或cathelicidin mRNA (图4 e)，再次，TLR2/1L诱导DEBF4和cathelicidin mrna的表达。然而，当单核细胞与IL-1β和TLR2/1L共同处理时，DEFB4 mRNA的表达水平比单独TLR2/1L协同增加了3倍(t检验，p<0.01)，但cathelicidin水平不受影响(图4 e)．此外，IL-1β并没有增加tlr2 /1诱导的CYP27B1或VDR的表达，这两个基因都是维生素D通路中的关键基因(图S1)．这些实验证明TLR2/1刺激可使单核细胞对IL-1β活化敏感。

NF-κB激活促进单核细胞DEFB4 mRNA表达

为了深入了解在DEFB4与cathelicidin诱导中单核细胞IL-1β激活需求差异的潜在机制，MatInspector分析了它们各自的上游启动子区域的调控元件。三种维生素D受体反应元件(VDREs)位于cathelicidin启动子的- 144、- 502和- 653位置，而在DEFB4启动子的- 938位置只有一个(图5一个)．有趣的是，在DEFB4启动子的- 406和- 795位置发现了两个NF-κB反应元件，而在cathelicidin启动子区域则没有出现(图5一个)．先前发表的研究已证实上述所有反应要素均为善意的它们各自的转录因子启动子元件[1],[15]．

缩略图
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图5。NF-κB活化在tlr2 /1诱导的DEFB4中的作用

(A) cathelicidin和DEFB4上游1 kb区域启动子分析，代表NF-κB结合位点和维生素D反应元件(VDRE)。用NF-κB p65表达构建物(CMV-p65)或对照质粒转染单核细胞，然后用1,25 d3刺激单核细胞(10−8M) 18小时。(B) DEFB4和(C) cathelicidin mRNA水平用qPCR测定(平均折叠变化vs培养基±SEM, n = 6)。* = p≤0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g005

基于DEFB4启动子中两个NF-κB反应元件的存在，我们确定了NF-κB激活是否能触发DEFB4 mRNA的单核细胞表达。IL-1β可诱导p65和p50 NF-κB亚基的活化和核转位，但不激活上皮细胞中的c-Rel、RelB或p52[15],[16]．因此，在cmv启动子控制下，用表达p65nf -κB亚基的质粒或CMV-GFP控制质粒转染原代人单核细胞。在CMV-p65转染的情况下，1,25d3刺激单核细胞导致DEFB4 mRNA表达显著增加4.6倍(t检验，p<0.05, n = 6)，而在CMV-GFP转染对照细胞中，1,25d3没有诱导DEFB4表达(图5 b)．在缺乏1,25 d3的情况下，CMV-p65也诱导了DEFB4表达增加的趋势(t检验，p = 0.14, n = 6) (图5 b)．另一方面，转染CMV-p65对1,25d3诱导的cathelicidin表达的抑制率为77% (t检验，p = 0.08, n = 6)，与转染1,25d3诱导的CMV-GFP对照细胞(图5 b)．这些数据表明，在人单核细胞中，NF-κB和VDR反应元件的激活都是诱导DEBF4的最佳条件。

DEFB4肽具有直接抗菌活性

尽管人类的DEFB4已被证明与结核分枝杆菌感染期间的肺泡巨噬细胞[17]， DEFB4对该细菌的抑菌活性尚未被研究。为了解决这个问题，结核分枝杆菌(减毒H37Ra菌株)与DEFB4肽或cathelicidin肽(LL-37)以及不相关的对照肽(CTRL)在0.01 μ g/ml至10 μ g/ml的范围内孵育3天。然后用3.尿嘧啶摄取试验。抗菌肽表现出剂量依赖性抗菌活性，证实了先前的结果[２],[4]．DEFB4肽表现出与cathelicidin相似的剂量依赖性抗菌能力。相反，对照肽不能降低细菌的生存能力(图6)．与对照肽相比，观察到的DEFB4和cathelicidin在10µg/ml时的抗菌活性分别为44% (t检验，p<0.001)和41% (t检验，p<0.001) (图6 b)．这些结果表明，DEFB4是直接抗菌结核分枝杆菌．

缩略图
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图6。DEFB4和cathelicidin肽的直接抗菌活性。

结核分枝杆菌H37Ra分别与对照肽、DEFB4肽或cathelicidin肽在0.01µg/ml、0.1µg/ml、1µg/ml和10µg/ml以及培养基孵育3天。测定细菌增殖3.尿嘧啶上服。所示数据(A)代表三个独立的实验，(B)平均抗菌活性±SEM (n≥5)。* = p≤0.05，** = p≤0.01，*** = p≤0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g006

DEFB4和cathelicidin都是tlr2 /1介导的抗菌活性所必需的

我们之前已经证明，1,25 d3介导的抗菌活性需要诱导cathelicidin[3]．为了比较DEFB4和cathelicidin在tlr2 /1介导的抗菌途径中的作用，我们使用siRNA技术敲除特定基因的表达。原代人单核细胞转染与DEFB4 mRNA (siDEFB4)互补的siRNA寡核苷酸、cathelicidin mRNA (siCath)或非特异性对照寡核苷酸(siCTRL)。TLR2/1L处理转染细胞24小时后，检测cathelicidin和DEFB4 mrna的表达。siDEFB4和siCath都能完全抑制tlr2 / 1l诱导的各自靶标的表达，而siCTRL则没有效果(图S2)．

随后，siDEFB4、siCath和siCTRL转染的单核细胞和未转染的单核细胞感染siDEFB4结核分枝杆菌H37Ra在MOI为0.5的条件下持续18小时。感染细胞用培养基或TLR2/1L处理3天，用菌落形成单位法(CFU)测定细胞内细菌活力。在一个具有代表性的实验中，TLR2/1L处理使未转染细胞和siCTRL转染细胞内细菌的活力分别降低了30%和36% (图7)．相比之下，用siCath或siDEFB4转染单核细胞可减弱tlr2 / 1l诱导的抗菌活性(图7)．TLR2/1L处理未转染和siCTRL转染单核细胞的平均抗菌活性分别为20% (t检验vs培养基，p<0.001)和14% (t检验vs培养基，p<0.05) (图5 b)．然而，与siCTRL转染的细胞相比，siCath或siDEFB4转染导致tlr2 / 1l诱导的抗菌活性分别降低134%和107% (t检验，p<0.05)，表明细菌生长增强(图7 b)．这些数据表明，tlr2 / 1l诱导的DEFB4和cathelicidin的表达是对人单核细胞内分枝杆菌感染的最佳抗菌活性所必需的。

缩略图
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图7。DEFB4和cathelicidin在tlr介导的抗菌活性中的作用。

用siRNA寡核苷酸(siDEFB4)或cathelicidin (siCath)以及非特异性siRNA寡核苷酸(siCTRL)或不含siRNA转染单核细胞。然后细胞被感染结核分枝杆菌以MOI为0.5的H37Ra治疗18小时，然后用TLR2/1L治疗3天。采用CFU法测定细胞内细菌载量。所示数据(A)代表6个单独实验，(B)平均抗菌活性±SEM (n≥6)。* = p≤0.05，*** = p≤0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g007

讨论

单核细胞TLR2/1激活触发维生素d依赖性抗菌活性诱导的机制是宿主对细胞内防御的核心结核分枝杆菌[4]．在这里，我们证明了IL-1β和维生素D转录激活的收敛诱导了抗菌肽DEFB4的表达。重要的是，TLR2/1L激活触发了IL-1β活性，包括IL-1β和IL-1受体的上调，以及IL-1受体拮抗剂的下调(图8)．TLR2/1L诱导IL-1β是上调DEFB4的必要条件，而cathelicidin则不需要，而VDR激活则是这两种抗菌基因表达的必要条件。NF-κB与VDR活化之间的协同作用足以上调DEFB4的表达。最后，无论是敲低DEFB4还是cathelicidin，都导致tlr2 /1诱导的对细胞内分枝杆菌的抗菌活性丧失。因此，这些数据确定了一种新的宿主防御机制，需要诱导两种不同的信号通路，涉及il -1β与维生素D激活的协同作用，用于tlr诱导的对细胞内病原体的抗菌活性。

缩略图
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图8。模型。

人tlr2 / 1l介导的单核细胞抗菌活性需要两种不同的途径。触发TLR2/1L导致维生素D通路的激活，包括VDR和CYP27B1的表达，导致cathelicidin的诱导。另一方面，tlr介导的DEFB4表达需要IL-1β和VDR通路的收敛。TLR2/1的激活导致IL-1β活性的调节，通过释放其受体IL-1R1的IL-1β表达，并同时下调IL-1RA。cathelicidin和DEFB4都是tlr2 /1介导的抗菌活性所必需的。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005810.g008

在脂肽触发TLR2/1后，人和小鼠巨噬细胞都激活了针对细胞内分枝杆菌的抗菌途径[4],[18]．在比较人类和小鼠tlr诱导的抗菌途径时，值得注意的是，人类的抗菌反应需要诱导多种抗菌肽，包括cathelicidin和DEFB4，而小鼠的抗菌反应依赖于一氧化氮的产生[18]- - - - - -[20]．cathelicidin和defb4介导的抗菌活性是杀菌还是抑菌仍有待确定。在人类中，cathelicidin和DEFB4启动子都含有VDREs[1]，需要激活VDR来诱导它们，以及tlr诱导的抗菌活性[4]．相比之下，在小鼠cathelicidin启动子区域没有VDRE位点[21]，据我们所知，在小鼠基因组中没有其他已知的维生素d依赖性抗菌肽。有趣的是，1,25 d诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化氮[22]，尽管维生素D在小鼠tlr诱导的抗菌反应中的作用仍有待确定。虽然我们的数据表明，人类先天免疫系统已经进化出一种强大的抗菌机制，通过维生素D依赖的抗菌肽的产生来对抗细胞内分枝杆菌感染，但这并不排除一氧化氮的作用[6],[23],[24]以及其他机制，如超氧化物的产生和自噬[6],[25]．

虽然VDR激活对诱导DEFB4和cathelicidin都是必要的，但在tlr激活之前，IL-1β的中和导致DEFB4的损失，而不是cathelicidin的损失。对cathelicidin和DEFB4启动子区域的分析显示，在DEFB4启动子区域中存在两个NF-κB反应元件，而在cathelicidin启动子区域中没有。相反，两个基因都含有维生素D反应元件，一个在DEFB4启动子中，三个在cathelicidin中。这些数据提示了IL-1β唯一影响tlr诱导的DEFB4表达而不影响cathelicidin的潜在机制，而这两个基因都需要维生素d。转染NF-κB p65，主要的IL-1β诱导的NF-κB亚基[15],[16]仅在VDR激活时，即可导致DEFB4显著表达。相反，NF-κB p65转染减少1,25 d3诱导的cathelicidin，进一步强调了这两个抗菌基因的差异调控。然而，NF-κB p65转染抑制cathelicidin的机制目前尚不清楚，有待进一步研究。综上所述，这些数据表明IL-1β通过诱导DEFB4与维生素d协同作用，在对抗细胞内病原体的抗菌活性中发挥了新的作用。此外，这表明存在两种不同的依赖维生素d的tlr诱导的抗菌机制，DEFB4的表达也依赖于IL-1β的诱导。

除了诱导IL-1β表达和VDR激活外，TLR2/1的触发还发现通过增加细胞对分泌的IL-1β的反应性来调节IL-1β活性。单核细胞对IL-1β的反应通过TLR2/1激活同时分泌IL-1β、细胞表面IL-1R1上调和基线IL-1RA下调而上调。将IL-1β添加到TLR2/1L刺激的单核细胞中导致DEFB4的协同上调，这反映了IL-1β反应性的增强。另一方面，IL-1β + 1,25d3没有诱导DEFB4的表达，可能是因为IL-1R1没有上调和/或IL-1RA没有下调。这些发现为先前已知的高IL-1β/低IL-1RA产生单倍型与胸膜结核之间的关联提供了一种潜在的分子机制，胸膜结核是一种通常不需要化疗就能治愈的疾病[26]．此外，与同一个体的血清相比，胸腔积液中1,25 d的水平也有所升高，导致局部微环境有利于诱导抗菌反应，包括cathelicidin和DEFB4[27]．此外，IL-1R1已被证明是宿主防御所必需的结核分枝杆菌在小鼠模型中[28]．考虑到IL-1β的过度激活会导致组织损伤和败血症[29]， IL-1β活性受IL-1RA的负反馈影响［30］．虽然IL-1β和IL-1RA都是在炎症状态下产生的，IL-1RA也是由抗炎信号诱导的[29],[31]- - - - - -［36］．因此，先天免疫反应中IL-1β和IL-1RA之间的平衡在炎症性疾病(如糖尿病、关节炎、炎症性肠病)的发病机制中起着重要作用[37]，如本文所述，tlr介导的宿主防御机制。

尽管TLR激活在单核细胞和上皮细胞中诱导DEFB4[4],[38],[39]， IL-1β单独不足以诱导单核细胞中DEFB4的表达，但它是上皮细胞中DEFB4的强诱导物[40]- - - - - -[42]．抗菌肽在单核细胞和上皮细胞中表达的差异调控反映了这些细胞类型的位置和抗菌肽的免疫调节特性。上皮细胞形成病原体最初遇到的屏障，它们有效地利用抗菌肽基因家族，在体表与外部环境相互作用时进行宿主防御[38],[43]- - - - - -[45]．然而，除了抗菌活性外，β-防御素和cathelicidin还通过其对先天和适应性免疫细胞(如单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和T细胞)的趋化活性引发炎症[46]．在身体表面，抗菌肽迅速脱落，因此这种炎症活动是短暂的，但当在组织中释放时，所产生的炎症细胞浸润有助于免疫介导的损伤，这是慢性传染病中宿主防御的并发症，包括分枝杆菌感染，如麻风病，结核病和布鲁里溃疡。因此，对cathelicidin和DEFB4的单核细胞表达进行更严格的调控可能代表一种防止在密闭空间中组织损伤的机制。

IL-1β显然是宿主防御微生物病原体的关键，是细胞募集和炎症诱导所必需的，但也增强获得性淋巴细胞反应[29],[47]．在小鼠模型中，IL-1在对多种病原体的免疫中发挥了关键作用，包括单核细胞增多性李斯特氏菌,金黄色葡萄球菌,幽门螺杆菌[47]- - - - - -[51]．在这里，我们已经确定了IL-1β有助于人类宿主防御的一种新机制，需要tlr诱导的IL-1β和VDR通路的收敛来触发DEFB4的表达。此外，这些数据表明，在tlr诱导的巨噬细胞对细胞内分枝杆菌的抗菌反应中，抗菌肽DEFB4和cathelicidin是必需的效应分子。阐明人类巨噬细胞用于对抗病原体的免疫防御机制为开发新的治疗策略提供了可能的靶点，鉴于多药耐药菌株的出现，这可能是有用的结核分枝杆菌还有其他致命的微生物。

作者的贡献

构想并设计实验:PTL MS PWD GC RM。进行实验:PTL MS VPW MK MW AV XZ。分析数据:PTL MS VPW。贡献的试剂/材料/分析工具:AS UZ BH。写论文:PTL RM。

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