广告
浏览主题范围
?

点击公共科学图书馆分类法找到你所在领域的文章。

有关公共科学图书馆学科领域的更多信息，请单击在这里．

  • 加载指标

188滚球软件

同行评议

研究文章

宿主遗传背景强烈影响对甲型流感病毒感染的反应

  • Barkha斯利瓦斯塔瓦,

    联系德国汉诺威兽医大学赫姆霍兹感染研究中心实验小鼠遗传学系

    ⨯
  • Paulina Błżejewska,

    联系德国汉诺威兽医大学赫姆霍兹感染研究中心实验小鼠遗传学系

    ⨯
  • 他ß曼曼,

    联系德国汉诺威兽医大学赫姆霍兹感染研究中心实验小鼠遗传学系

    ⨯
  • Dunja Bruder,

    联系免疫调节研究小组，Helmholtz感染研究中心，布劳恩施威格，德国

    ⨯
  • 罗伯特•Geffers

    联系基因表达分析，细胞生物学系，Helmholtz感染研究中心，德国，布劳恩斯威格

    ⨯
  • Susanne Mauel,

    联系兽医学院兽医病理学系，Freie Universität柏林，德国柏林

    ⨯
  • Achim D. Gruber，

    联系兽医学院兽医病理学系，Freie Universität柏林，德国柏林

    ⨯
  • 克劳斯Schughart

    kls@helmholtz-hzi.de

    联系德国汉诺威兽医大学赫姆霍兹感染研究中心实验小鼠遗传学系

    ⨯

摘要

宿主的基因组成对其对抗病原体的反应有重大影响。对于甲型流感病毒，已经描述了几种有助于存活、免疫反应和宿主机体清除病原体的单基因突变。在这里，我们研究了遗传背景对甲型H1N1 (PR8)和H7N7 (SC35M)流感病毒的影响。所分析的7个实验室自交系小鼠在感染PR8后表现出不同的失重动力学和存活率。其中DBA/2J和A/J两个菌株对病毒感染表现出非常高的易感性。LD的50DBA/2J小鼠对流感病毒PR8的活性比C57BL/6J小鼠低1000倍以上。DBA/2J小鼠在感染流感株SC35M后也出现高敏感性。此外，与感染的C57BL/6J小鼠相比，感染的DBA/2J小鼠的肺部病毒载量更高，细胞因子和趋化因子表达升高，肺部病理更严重和扩展。这些发现表明宿主的遗传背景对甲型流感病毒感染的主要贡献。高易感DBA/2J小鼠的总体反应与高毒流感H1N1-1918和新出现的H5N1病毒感染的病理描述相似。

引用:Srivastava B, bzaejewska P, Heßmann M, Bruder D, Geffers R, Mauel S，等(2009)宿主遗传背景强烈影响对甲型流感病毒感染的反应。科学通报4(3):e4857。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857

编辑器:Alexander Idnurm，美利坚合众国密苏里-堪萨斯城大学

收到:2008年11月4日;接受:2009年1月14日;发表:2009年3月18日

版权:©2009 Srivastava等人。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

资助:这项工作得到了helmholtz -协会(项目感染和免疫)的内部资助和德国教育和研究部给KS的FluResearchNet (No. 01KI07137)的研究资助。PB获得了george - christoph - lichtenberg基金会的博士奖学金。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决定或稿件准备方面没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

在人类近代史上，甲型流感病毒感染造成了多次严重的大流行。据估计，在1918年“西班牙流感”大流行期间，全世界约有5 000万人死亡[1]在1957年和1968年的流感大流行期间，约有100万人死于流感[２]，[3]．每年的季节性流行病是由H1N1和H3N2亚型的变种引起的，每年在全世界造成约100万人死亡[4]．最近，出现了一种新的亚型H5N1，它在鸟类中具有高致病性，可传播给与受感染鸟类密切接触的人。人类感染H5N1会导致严重肺炎，约50%的感染者会死亡［5］，[6]．

对流感病毒的毒性和演化进行了深入的研究[7]，[8]．然而，人们对人类特定基因或遗传背景对流感感染易感性或抵抗力的影响知之甚少。宿主遗传因素在人类中的重要性已被证明为几种细菌和病毒病原体[9]- - - - - -[11]．一项对过去100年犹他州人口中流感死亡记录的调查提供了证据，证明近亲属和远亲患流感的风险增加[12]尽管对西班牙流感大流行期间冰岛人口中与流感相关的死亡进行的分析没有发现任何有关基因贡献的结论性证据[13]．值得注意的是，由于遗传变异的复杂性和环境影响的很大不同，如营养、生活方式、药物、接触其他病原体等，对人类宿主对急性感染的易感性进行研究非常困难，等．因此，更好地理解对传染病易感性或耐药性的基本机制的方法是使用实验动物模型系统。

小鼠已被证明是研究高致病性H5N1和1918年H1N1流感病毒毒性的特别有用的模型[14]，[15]．对于毒性较低的病毒亚型，特异性免疫细胞群的耗损已证明涉及嗜中性粒细胞的关键作用[16]，[17]、巨噬细胞[17]，[18]，树突状细胞[19]，[20]，自然杀伤细胞[21]， B细胞[22]和T杀手细胞[23]在主机响应期间。

使用小鼠突变株，一些哺乳动物基因已被证明对宿主防御流感病毒感染很重要，其中包括mx₁，Stat1，Pkr，Ifnar1，和Ncr1基因[21]，[24]- - - - - -[26]．然而，很明显，这只是所涉及的基本基因中非常小的一部分。Crozat等人在2006年进行的一项研究[27]据估计，大约有480个基因对宿主防御小鼠巨细胞病毒感染至关重要，超过1000个基因在感染后改变了它们的表达水平结核分枝杆菌[28]或甲型流感病毒[29]．

从遗传易感性的研究可以清楚地看到，宿主反应不仅受单个基因的影响，而且受基因及其变异的组合的影响。因此，除了孟德尔(单)基因，还需要分析复杂(多基因)的遗传效应，以了解宿主对病原体的全部反应。对于小鼠，存在明确的遗传参考群体(GRP)，可以分析复杂的遗传性状和多个贡献基因位点的影响。小鼠GRP可分为实验室近交系和野生来源的小鼠品系、重组近交系、种间重组近交系、染色体替代品系和共体品系[30]．这些资源已被广泛用于识别有助于宿主对不同病原体感染反应的数量性状和单基因位点如。，[31]- - - - - -[37])．然而，在大多数关于流感病毒的研究中，只使用了BALB/c和C57BL/6两种小鼠菌株，但没有进行直接比较。到目前为止，只有一项研究直接比较了遗传背景对BALB/cByJ和C57BL/6J小鼠基因表达和易感性的影响[29]．

作为分析影响流感抵抗力和易感性的复杂遗传性状的第一步，我们在7个近交系实验室小鼠品系中研究了宿主对两种病毒亚型的反应。两种小鼠菌株对流感感染表现出非常明显的易感性。然后，我们比较了高度敏感株DBA/2J和较耐药株C57BL/6J之间的体重减轻、存活率、肺病理、细胞因子/趋化因子反应和病毒复制。C57BL/6J小鼠能够控制病毒复制并清除感染，而DBA/2J小鼠表现出更高的病毒载量、更高水平的细胞因子和趋化因子，增强肺部病理，但不能清除病毒感染。

结果

近交系小鼠对甲型流感病毒的反应有很大差异

7个不同的近交系实验室小鼠菌株被2×10感染3.对甲型流感病毒PR8 (H1N1)的FFU进行观察，并在感染后随访14天。如图1，观察到体重减轻和存活的动力学有很大差异。最值得注意的是，来自两个自交系DBA/2J和A/J的小鼠体重下降非常迅速，在感染后的头7天内死亡，或因体重下降超过25%而被牺牲。所有来自其他菌株的感染小鼠都在这个感染剂量下存活下来。高感株DBA/2J和A/J小鼠株的减重与所有耐药株相比有显著差异(表1)．存活菌株表现出三种主要的失重动力学类型。BALB/cByJ、CBA/J和SJL/JOrlCrl在感染后的最初几天内体重迅速下降，直到大约第6 ~ 7天，然后缓慢恢复，其中SJL/JOrlCrl在该组中受影响最小(图1)．C57BL/6J小鼠在感染后早期体重没有下降，但在第4天至第7天体重迅速下降，然后迅速恢复(图1)．C57BL/6J小鼠的体重减轻在第2-4天与BALB/c小鼠品系有显著差异，但在之后的时间点无显著差异(表1)．FVB/NJ小鼠受感染剂量影响最小(图1，表1)．感染DBA/2J和C57BL/6J小鼠的体重变化与仅灌注PBS的模拟感染小鼠有显著差异(数据未显示)。

缩略图
下载:
图1所示。不同的实验室自交系小鼠在感染甲型流感病毒后表现出不同的体重减轻和存活动力学。

C57BL/6J、DBA/2J、FVB/NJ、CBA/J、BALB/cByJ、A/J和SJL/JOrlCrl小鼠经鼻内感染2×103.PR8病毒的FFU。受感染小鼠的体重减轻和存活时间长达14天。死亡率还包括那些因为体重下降超过25%而被牺牲的小鼠。每组自交系的平均体重变化百分比(±SEM)显示。DBA/2J和C57BL/6J小鼠的数据来自两个独立的实验。所有菌株和天的成对比较的统计分析在表1．

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g001

缩略图
下载:
表1。所有小鼠品系的成对统计比较图1．

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.t001

LD50C57BL/6J和DBA/2J小鼠株之间的感染过程有很大差异

杂交小鼠(C57BL/6J×DBA/2J) F1在感染后的最初几天内表现出体重迅速下降的中间表型(图2)．然而，这种减重并不像DBA/2J那样显著。在第7天达到峰值，与观察到的C57BL/6J小鼠的动力学相似。第7天后，与C57BL/6J小鼠相比，F1杂交小鼠恢复，体重增加略有延迟。

缩略图
下载:
图2。(C57BL/6J×DBA/2J) F1小鼠感染A型流感病毒后表现为中间表型，DBA/2NHsd表现出与DBA/2J相同的易感性。

用2×10经鼻内感染C57BL/6J、DBA/2J、DBA/2NHsd和(C57BL/6J×DBA/2J) F1(图中标记为B6D2F1)小鼠3.FFU PR8病毒。受感染小鼠的体重减轻和存活时间长达14天。死亡率还包括那些因为体重下降超过25%而被牺牲的小鼠。体重变化的平均百分比(±SEM)显示。对于DBA/2J、C57BL/6J和B6D2F1，结合两个独立实验的数据。用非参数mann - whitney - u检验计算所有菌株之间的配对比较和所有天的显著性p值。(C57BL/6J×DBA/2J) F1组与C57BL/6J组相比，在第2 - 4天体重减轻显著差异(p<0.001，第2、3天;与DBA/2J组和DBA/2NHsd组相比，第4天p<0.01)和第3 ~ 5天p<0.01。在第2 ~ 5天，DBA/2J和DBA/2NHsd菌株的减重与C57BL/6J相比差异显著(p<0.001，除DBA/2NHsd菌株与C57BL/6J相比在第5天p<0.01)。DBA/2J和DBA/2NHsd组之间的体重下降全天无显著差异。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g002

DBA/2J亚品系缺乏一个特定的自然杀伤细胞亚群[38]．因此，我们研究了DBA的另一个亚株DBA/2NHsd，它能够产生这个NK细胞子集。如图2DBA/2NHsd亚品系与DBA/2J亚品系一样敏感。因此，DBA小鼠的高敏感性不是由于DBA/2J亚品系的这种独特特征。

为了进一步研究小鼠敏感株和耐药株之间的宿主反应，我们选择了高敏感株DBA/2J和耐药株C57BL/6J进行详细研究。

对C57BL/6J和DBA/2J小鼠接种不断增加的病毒，以确定其相对敏感性范围。如图3， DBA/2J小鼠在极低的病毒剂量下死亡(LD50(36 FFU)而所有C57BL/6J小鼠存活剂量为103.洁净。在本实验中，半数C57BL/6J小鼠死于2×10的FFU5．然而，当体重下降超过25%时，作为实验方案的一部分，小鼠必须被处死，C57BL/6J小鼠的致死剂量阈值是不同的。在其他的实验中，剂量为2×105FFU、C57BL/6J小鼠体重下降接近25%，但没有超过这个阈值，记录为幸存者。因此，我们认为LD50对于C57BL/6J的值大于或等于2×105洁净。因此它超过了LD50对DBA/2J小鼠的影响至少是10倍3.．

缩略图
下载:
图3。与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠对PR8感染高度敏感。

DBA/2J (A)和C57BL/6J (B)小鼠经鼻内途径感染增加剂量的PR8病毒，记录其生存时间为14 d。死亡率也包括那些因为体重下降超过25%而被牺牲的老鼠。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g003

就传染病而言，在一些病例中观察到性别差异。因此，我们比较了雄性和雌性小鼠对流感感染的易感性。如图4DBA/2J株雄性和雌性小鼠表现出相似的失重动力学，都是高度敏感的。C57BL/6J株雌雄小鼠均耐药。在两种毒株中，雄性和雌性小鼠的体重减轻曲线有轻微差异，但在C57BL/6J组中差异不显著。DBA/2J小鼠在感染后2-4天观察到显著差异。

缩略图
下载:
图4。DBA/2J和C57BL/6J小鼠在感染A型流感病毒后，雌雄小鼠的体重下降和存活率相似。

DBA/2J女、DBA/2J男、C57BL/6J女、C57BL/J男经鼻内感染2×103.FFU PR8病毒。受感染小鼠的体重减轻和存活时间长达14天。死亡率也包括那些因为体重下降超过25%而被牺牲的老鼠。体重变化的平均百分比(±SEM)显示。用非参数Mann-Whitney-U-test计算显著性p值，用于各组之间的两两比较和所有天的p值。试验第2-4天，DBA/2J组和C57BL/6J组在减重方面均有显著差异(p<0.001)。雌雄C57BL/6J组间差异不显著(除第4天外，p<0.05)，而雌雄DBA/2J组在第2 ~ 4天差异显著(第2天p<0.05，第3、4天p<0.01)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g004

甲型PR8 (H1N1)流感病毒最初从人身上分离出来，随后适应于小鼠[39]．为了排除观察到的小鼠毒株差异只针对一种流感亚型，我们用另一种小鼠适应病毒亚型SC35M感染C57BL/6J和DBA/2J小鼠。该病毒代表一种H7N7甲型流感病毒亚型，最初从海豹中分离出来，然后适应于小鼠[40]．DBA/2J小鼠鼻内感染SC35M病毒后表现出同样高的易感性(图5一个)， C57BL/6J小鼠比DBA/2J小鼠具有更强的耐药性。然而，与PR8感染相比(图1而且3.)， C57BL/6J小鼠在低剂量感染SC35M后开始死亡，并表现出略有不同的失重动力学(图5 c)．在第7天和第8天仍然观察到体重下降的峰值。但与感染PR8相比，感染SC35M的C57BL/6J小鼠在感染前三天体重早期下降，尽管在这个感染剂量下，C57BL/6J小鼠没有死亡。随后，C57BL/6J小鼠短暂恢复并再次体重下降，其动力学与PR8感染时观察到的体重下降相似。

缩略图
下载:
图5。与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠对H7N7 (SC35M)病毒感染高度敏感。

(A): DBA/2J和C57BL/6J小鼠经鼻内感染2×103.FFU SC35M病毒。DBA/2J (B)和C57BL/6J (C)小鼠经鼻内途径感染了增加剂量的SC35M (H7N7)病毒。受感染小鼠的体重减轻和存活时间长达14天。死亡率也包括那些因为体重下降超过25%而被牺牲的老鼠。数据来自两个独立的实验。体重变化的平均百分比(±SEM)显示。DBA/2J组与C57BL/6J组比较，采用非参数mann - whitney - u检验，差异有统计学意义。*: p值<0.05;* *: p < 0.01;***: p值<0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g005

C57BL/6J和DBA/2J小鼠品系之间存在早期病毒载量的差异

DBA/2J小鼠的极端易感性可能是由于增强的病毒复制和相关的组织损伤或宿主反应的有害免疫病理，或两者兼有。因此，我们通过测定肺中感染颗粒和血凝素(HA)基因的病毒mRNA拷贝来分析病毒载量。在第1天和第2天，DBA/2J小鼠的传染性病毒颗粒量是C57BL/6J小鼠的约100倍和80倍(图6)．在第3天和第4天，这一差异分别减少到约20和10倍(图6)．在存活的C57BL/6J小鼠中，病毒滴度在第8天低于检测水平(图6)．同样，在第1-3天和第6天，DBA/2J小鼠的病毒HA mRNA比C57BL/6J小鼠高5- 9倍(图6 b)．在感染后第4天，这种差异不太明显(2.6倍)(图6 b)．DBA/2J小鼠在第4天和第6天的病毒复制减少，最可能是由于这些小鼠肺部的严重病理(另见组织学研究)导致上皮细胞坏死，不允许病毒复制进一步增加。在C57BL/6J小鼠中，病毒HA RNA拷贝数在第6天后显著下降，并在第14天低于检测水平(图6 b)．

缩略图
下载:
图6。DBA/2J小鼠检测到的病毒载量高于C57BL/6J小鼠。

DBA/2J和C57BL/6J小鼠鼻内感染2×103.FFU和病毒载量在接种感染颗粒后的指定时间内测定，测定方法为疫点测定法(A)或病毒血凝素(HA) RNA拷贝数(B)。(A)中病灶检测在所有时间点使用DBA/2J小鼠9只，C57BL/6J在第1天使用6只，第2天使用8只，第3、4、8天使用9只。在(B)中，除第4天15只和第6天5只外，共使用10只小鼠进行RNA检测。DBA/2J和C57BL/6J小鼠采用非参数mann - whitney - u检验进行比较，差异有统计学意义。*: p值<0.05;* *: p < 0.01;***: p值<0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g006

DBA/2J小鼠炎症细胞因子表达较高

在感染过程中，宿主产生各种细胞因子和趋化因子，然后激活先天和适应性免疫系统的不同组成部分。因此，我们在感染C57BL/6J和DBA/2J小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)中研究了几种细胞因子和趋化因子的存在。共分析了22种细胞因子和趋化因子。如图7与未感染小鼠相比，感染小鼠肺部细胞因子Il5、Il6、Il1α、Il12和Csf3 (G-CSF)升高。在所有病例中，DBA/2J小鼠的表达水平高于C57BL/6J小鼠。同样，与未感染的DBA/2J和C57BL/6J小鼠相比，感染小鼠的趋化因子Ccl2 (MCP-1)、Ccl3 (MIP-1α)、Ccl5 (RANTES)、Cxcl1 (KC)、Cxcl2 (MIP-2)、Cxcl9 (MIG)和Cxcl10 (IP-10)升高(p < 0.05)。图7 b)．DBA/2J小鼠的所有趋化因子均表现出较高的表达水平。同时，在转录水平上，DBA/2J小鼠的趋化因子和细胞因子的表达高于C57BL/6J小鼠Ccl2，Ccl3，Cxcl10而且白细胞介素6（图7 c)．

缩略图
下载:
图7。DBA/2J小鼠比C57BL/6J小鼠表现出更强的炎症反应。

DBA/2J(检查柱)和C57BL/6J(黑柱)小鼠经鼻内感染2×103.PR8病毒的FFU。在非感染对照组(c)或感染后指定天数(d1, d2, d3, d4)采集支气管肺泡灌洗液(BAL)，并测定细胞因子(A)或趋化因子(B)的浓度。采用real-time PCR (C)检测细胞因子和趋化因子的表达。每个时间点代表(A)和(B)每组7只小鼠的平均值±SEM， (C)每组10只小鼠的平均值±SEM。采用非参数mann - whitney - u检验比较DBA/2J和C57BL/6J小鼠，比较差异有统计学意义。*: p值<0.05;* *: p < 0.01;***: p值<0.001。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g007

DBA/2J小鼠支气管上皮发生严重损伤

对感染小鼠的组织学分析显示，DBA/2J和C57BL/6J小鼠的组织病变存在显著差异。与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠的整体肺组织更加致密，受影响的气道数量更多(图8A, B)．在两种小鼠株中，支气管和细支气管上皮细胞在感染后第2和第3天出现变性、坏死和丢失，并在气道腔内堆积脱落细胞和大部分变性中性粒细胞。然而，DBA/2J小鼠的支气管上皮坏死和气道被细胞碎片堵塞的程度比C57BL/6J小鼠更明显。DBA/2J小鼠受影响气道周围出现大量的中性粒细胞和巨噬细胞(c, D)．另一方面，C57BL/6J小鼠在感染后第4天出现了更强的血管周围和支气管周围淋巴细胞浸润(图8E, F)．肺泡上皮细胞基本不受影响。肺部几乎没有巨噬细胞和浆细胞，在感染后的第2至4天，两种小鼠菌株之间没有差异。

缩略图
下载:
图8。与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠支气管上皮发生严重损伤。

DBA/2J (A, C, E)和C57BL/6J (B, D, F)小鼠经鼻内感染2×103.PR8病毒的FFU。肺切片用苏木精和伊红染色。A, B:感染后2天，DBA/2J小鼠(A)的肺部比C57BL/6J小鼠(B)的肺部更加巩固，气道堵塞数量(箭头)更多。C, D: DBA/2J小鼠(C)的支气管和支气管在感染后2天被退化的支气管上皮细胞和中性粒细胞堵塞，上皮细胞变性、坏死和丢失程度(箭头)更高。此外，气道周围有大量的中性粒细胞和巨噬细胞(星号)。C57BL/6J小鼠(D)气道损伤较轻，气道堵塞很少或不堵塞。两株菌肺内淋巴细胞浸润较少。E, F:感染后4天，DBA/2J小鼠几乎未发现淋巴细胞外渗(E)，而C57BL/6J小鼠肺间质中可见明显的血管周围淋巴细胞浸润(箭头)。bar = 250 μ m (A, B)， 25 μ m (C, D)， 50 μ m (E, F)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004857.g008

讨论

对小鼠模型系统的研究表明，数百个基因参与宿主对微生物感染的防御，这些基因和途径的相互作用非常复杂[27]，[31]- - - - - -[37]．尽管已知有几个单基因突变会导致对甲型流感病毒感染的耐药性或易感性，但很少有研究涉及小鼠遗传参考群体中多个复杂遗传相互作用的影响[29]，[41]．因此，作为了解与宿主对流感感染反应相关的复杂遗传特征的第一步，我们研究了不同近交系实验室小鼠对H1N1和H7N7流感病毒亚型感染的易感性。

我们的研究表明，近交系小鼠品系在宿主对甲型H1N1流感病毒(PR8)感染的反应上有很大差异。在不同的实验小鼠品系之间，体重减轻的时间过程和存活率都有显著差异。这些结果表明，基因对宿主对流感病毒感染的易感性有很强的影响。我们假设，失重曲线的不同动力学表明不同的小鼠品系在宿主防御的定性、定量和时间上都不同。例如，C57BL/6J小鼠在感染肺部的表达trail的流感特异性CD8 T细胞活性相关的点受到影响[42]．另一方面，BALB/cByJ、CBA/J和SJL/JOrlCrl小鼠株在感染后早期出现体重下降，而此时正是病毒在呼吸道上皮复制的高峰期。

最值得注意的是，两种小鼠品系DBA/2J和A/J对流感感染表现出极高的易感性。所有受感染的动物在接种低剂量病毒后的头7天内死亡。其他菌株在这些条件下的存活率为100%。LD的50高感株DBA/2J的致病性比耐药株C57BL/6J低3个数量级以上。DBA/2J小鼠对H1N1 (PR8)和H7N7流感病毒(SC35M)亚型均高度敏感。因此，DBA/2J小鼠似乎对流感病毒感染表现出普遍的高易感性，与病毒亚型无关。

据我们所知，这是第一项直接比较不同自交系小鼠实验室品系对甲型流感病毒易感性的研究。大多数实验室都使用了BALB/c小鼠，或者在敲除突变体的情况下使用了C57BL/6J小鼠。目前，仅对BALB/cByJ和C57BL/6J自交系进行了敏感性的直接比较[29]．本研究的基因表达谱分析显示，感染流感病毒A/HKX31 (H3N2)后，有1000多个基因存在差异表达。

DBA/2J小鼠也被用于与其他自交系小鼠进行比较，以了解它们对其他病原体感染的易感性。DBA/2J感染A组链球菌后，属于耐药小鼠组[43]，[44]，而感染后结核分枝杆菌在美国，这些小鼠属于易感菌株[45]，[46]．因此，DBA/2J小鼠似乎没有普遍的免疫缺陷。

我们对敏感株DBA/2J和耐药株C57BL/6J进行了更详细的比较，以进一步了解可能导致DBA/2J小鼠对流感感染高易感性的细胞和分子因素。在感染DBA/2J小鼠中，我们观察到在感染后的早期时间点有更高的病毒复制和比C57BL/6J感染小鼠更强的免疫反应。组织学分析显示，感染后第4天，C57BL/6J小鼠支气管上皮损伤得到修复，但DBA/2J小鼠仍表现出与第2天相同的严重肺部表型。因此，DBA/2J小鼠的高易感性最有可能的解释是，持续的高水平病毒复制和相关的肺上皮破坏，以及高度激活和有害的免疫反应导致了感染的致命结果。一些研究表明，这两个因素都可能导致流感引起的肺部病理［5］．

目前，我们还没有对DBA/2J小鼠感染后早期时间点病毒快速积累的原因做出解释。这种效应可能是由于上皮细胞的高复制率，正如在高毒力的PR8变体中所显示的那样[47]．另外，在DBA/2J小鼠中，病毒进入上皮细胞的受体可能分布更密集或表现出更有利的结构。我们已经开始研究更详细地调查肺部感染细胞的空间分布和单个细胞病毒载量，并比较小鼠胚胎成纤维细胞的复制速率。

C57BL/6J和DBA/2J小鼠感染后支气管肺泡液和肺转录物的分析显示，许多细胞因子和趋化因子在C57BL/6J和DBA/2J小鼠中表达。因此，DBA/2J小鼠能够建立正常的早期免疫防御。然而，敏感DBA/2J小鼠表现出比耐药C57BL/6J小鼠更强的炎症反应。DBA/2J小鼠中cxc趋化因子Cxcl1、Cxcl2、Cxcl9和Cxcl10在支气管肺泡间隙的分泌水平高于C57BL/6J小鼠。Cxcl9和Cxcl10趋化因子靶向活化T细胞上表达的Cxcr3受体，而Cxcl2趋化因子靶向中性粒细胞上表达的Cxcr2受体[48]．在CC趋化因子中，DBA/2J小鼠Ccl2、Ccl3和Ccl5升高。两种趋化因子都靶向巨噬细胞、T细胞、NK细胞、粒细胞和树突状细胞上的受体[49]．同样，两株株感染后支气管肺泡间隙均分泌细胞因子Il1α、Il5、Il6和Il12，但在DBA/2J小鼠中升高。炎症蛋白Tnfα在DBA/2J小鼠中含量较低，但在C57BL/6J小鼠中没有(数据未显示)。在各种研究中已经描述了在小鼠和人类中产生细胞因子和趋化因子作为对甲型流感感染的反应(如。［5］，[50]，[51])并且已经假定强烈的先天免疫反应可能会导致严重的有害免疫病理［5］．因此，这些观察结果表明，强烈的早期炎症反应有助于DBA/2J小鼠严重的肺部病理和致死性。

本研究在DBA/2J小鼠中观察到的强烈升高的炎症宿主反应和相关的严重肺部病理与耐药BALB/c和C57BL/6J小鼠感染高致病性病毒的反应非常相似。与毒力较低的病毒亚型感染相比，高致病性H5N1禽流感病毒和1918年西班牙流感病毒感染发现细胞因子和趋化因子水平显著升高[14]，[15]，[52]．此外，感染高致病性病毒的小鼠病毒载量更高[52]这些发现与人类患者的结果相关联［5］．根据这些观察，有人假设，高致病性禽流感病毒会引起“细胞因子风暴”，从而导致有害的免疫反应，尽管最近这一点在与H5N1病毒有关的问题上受到了质疑[53]．

在流感感染的背景下，已经在小鼠敲除或自然突变体中研究了几个单基因位点。mx₁在大多数实验室菌株中突变，但在一些野生来源的小鼠中完全有效[54]- - - - - -[57]．mx₁通过抑制病毒复制表示干扰素反应的主要效应器[54]．我们研究中使用的小鼠品系都带有突变的mx₁等位基因[55]，但FVB除外，其状态目前尚未被表征。因为DBA/2J和C57BL/6J小鼠都缺乏mx₁尽管DBA/2J小鼠高度敏感，但我们假设DBA/2J小鼠对流感病毒的高敏感性可能是由于非干扰素反应下游通路的差异。

我们的发现现在为绘制宿主对流感感染易感性的其他基因组区域提供了基础。DBA/2J和C57BL/6J杂交的F1杂种表现出中等重量损失表型，在2×10剂量下具有抗性3.．因此，我们推测流感感染的易感性是一个多基因性状。我们进行了f2回交和BXD重组自交系(由亲本菌株DBA/2J和C57BL/6J生成;[58]，［５９］)进一步缩小DBA/2J小鼠高易感性的基因组区域。

综上所述，持续的高病毒载量和高反应性炎症反应可能是DBA/2J小鼠A型流感感染后高敏感性和致死性的主要原因。DBA/2J小鼠表现出增强的免疫反应，这与感染高毒力1918-H1N1或H5N1流感病毒的宿主相似［5］，[17]．因此，我们希望通过进一步的研究，在细胞、遗传和分子水平上揭示自交系小鼠品系中宿主的差异反应，不仅能够识别关键的易感基因组区域，而且有助于更好地理解与高致病性a型流感病毒亚型感染相关的病理。

材料与方法

病毒，鼠株和感染

鼠适应病毒株，A型流感/波多黎各/8/34 (H1N1;甲型/海豹/马萨诸塞州/1/80流感(H7N7;SC35M)，于37°C条件下在10日龄鸡胚的绒毛膜尿囊腔中繁殖48 h。自交系小鼠品系C57BL/6J、DBA/2J、FVB/NJ、CBA/J、BALB/cByJ和(C57BL/6J×DBA/2J) F1来自法国Janvier, SJL/JOrlCrl来自德国Charles River;DBA/2NHsd来自德国哈兰，A/JOlaHsD (A/J)来自英国哈兰，小鼠在特定的无病原体条件下根据德国动物福利法进行饲养。所有的实验都是由一个外部委员会根据德国动物福利条例批准的。在感染实验中，小鼠通过腹腔内注射氯胺酮-龙蓬麻醉，剂量根据个体体重调整。病毒以20 μ l无菌PBS的总容积鼻内注射。受感染小鼠的体重减轻和存活时间长达14天。除了被发现死亡的老鼠，体重下降超过起始体重25%的老鼠被安乐死并记录为死亡。

RNA的提取和实时PCR

按照制造商的协议，使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从肺中制备总RNA。采用安捷伦2100生物分析仪进行质量和数量检查。为了测定病毒载量，根据制造商说明使用ThermoScript™RT-PCR试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, USA)进行反转录。简单地说，将500 ng肺提取RNA和随机六聚体引物(Invitrogen)混合，在70℃变性8 min，然后在60℃反转录1 h。在85℃孵育5 min，在37℃RNase h处理20 min结束反应。样品稀释至最终体积50µl，在−20℃保存。cDNA产物的5µl用特异性引物扩增。HA分析使用以下引物:HA01 (3 ' ')和HA02 (5 ' gatccgctgcatagcctgat)．对于外部标准曲线，连续稀释(在1010和102分子)在体外使用转录的pGEM-T Easy-HA RNA。为了测定细胞因子的表达，根据制造商的协议，用SuperScriptII逆转录酶试剂盒(Invitrogen)逆转录RNA。将500 ng肺提取rna和随机六聚体(Invitrogen)混合，在70°C下变性10分钟，然后在42°下反转录1小时。对于细胞因子和趋化因子分析，使用以下引物:Rps9（5 ' CTGGACGAGGGCAAGATGAAGC，3 ' TGACGTTGGCGGATGAGCACA)，il - 6（5 ' TAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGT，3 ' TTGGAAATTGGGGTAGGAAAG)，Cxcl10（5 ' CTCTCCATCACTCCCCTTTACCC，3 ' GCTTCGGCAGTTACTTTTGTCTCA)，il - 1β（5 ' ACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC，3 ' CCCAAGGCCACAGGTATTTT)，Mip-1α（5 ' CTCCCAGCCAGGTGTCATTTTC，3 ' CTCAGGCATTCAGTTCCAGGTCAG)，Ccl2（5 ' CATGCTTCTGGGCCTGCTGTT，3 ' CCTGCTGCTGGTGATCCTCTTGTA)．采用DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche, Mannheim, Germany)进行实时PCR，使用LightCycler 480仪器(Multiwell Plate 96, Roche)。管家核糖体蛋白S9 (Rps9)基因归一化。

病灶测定病毒滴定法

MDCK II细胞(American Type Culture Collection, Manassas, USA)在37℃、5% CO中培养2在杜尔贝科改良鹰培养基(DMEM)中，添加10%胎牛血清(FCS)， 1%青霉素/链霉素。1×105细胞接种于96孔培养板中，37°C, 5% CO培养2为进行聚焦试验，使用PolyTron 2100均质器将小鼠肺均质于含0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。以1000转/分钟的转速离心10分钟去除碎屑。样品取别名，保存于- 70°C。在含0.1%牛血清白蛋白的DMEM中制备10倍稀释的肺匀浆，并加入MDCK II细胞。1 h后，用PBS冲洗细胞2次，用4%福尔马林PBS固定(100 μ l/孔)。在37℃5% CO中孵育2吸出接种物，用100 μ l的1% Avicell覆盖层置换，37℃孵育24 h。随后，用PBS洗2次，室温下用4%福尔林固定PBS 10 min。除去福尔马林，用100 μ l/孔淬火剂(0.5% Triton ×100, 20 mM甘氨酸在PBS中)清洗细胞并孵育10分钟。10分钟后，用洗涤液(0.5%吐温20在PBS中)清洗细胞，然后用50 μ l阻塞缓冲液(0.5%吐温20,1% BSA在PBS中)在37°C,5% CO中阻塞细胞2一抗(美国波特兰Virostat公司生产的抗流感Nucleocapsid NP多克隆山羊抗体)和二抗(美国Gaithersburg MD公司生产的抗山羊- hrp多克隆山羊抗体)用阻断缓冲液稀释1∶1000，每孔加入一抗50µl，室温孵育1 h。1 h后，用Wash缓冲液洗涤三次，与50µl的二抗孵育45 min。再次清洗，用50 μ l的底物(KPL的True Blue)孵育，直到感染细胞病灶出现蓝色斑点。以病灶形成单位(FFU/肺)计算病灶数量和病毒滴度。

细胞因子和趋化因子分析

用CO对小鼠实施安乐死2．一根22号无菌导管插入暴露的气管腔内。从每只小鼠两次0.5 ml含2mm EDTA的PBS中收集支气管肺泡灌洗液。上清保存在−20°C。使用Biosource公司(Carlsbad, USA)的多重细胞因子分析试剂盒，按照制造商说明分析细胞因子和趋化因子水平。在Luminex 100™仪器上读取铭牌。MIP-2和IL-10 (Biorad, Hercules, CA, USA)和G-CSF和RANTES (Invitrogen)按照制造商说明分别进行四组分析。

组织学分析

用CO对小鼠实施安乐死2．制备肺，在4%缓冲甲醛溶液(pH 7.4)中浸泡固定24小时，在一系列分级醇中脱水，并在石蜡中包埋。从3个均匀分布的石蜡块上切取3µm，用苏木精和伊红染色。组织学切片由两名病理学家进行盲法检查和分级。

统计检验

计算平均值±SEM，采用非参数mann - whitney - u检验(GraphPad Prism版本5.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego, California;www.graphpad.com)．P值≤0.05为显著性。

致谢

我们要感谢Stephanie Edler, Ivonne Wegner和Petra Hagendorff的出色技术帮助，Jonathan Holmén对DBA/2J表型的初步确认，以及Bastian Pasche对细胞因子分析的支持。这些实验用的小鼠由HZI中央动物设施的动物管理员维护。流感病毒株PR8的初始库存由Stephan Ludwig(分子病毒学研究所，Westfälische-Wilhelms-University, Münster，德国)提供，菌株SC35M的初始库存由Peter Stäheli(德国弗赖堡albert -Ludwig大学医学微生物学和卫生研究所病毒学系)提供。我们感谢Stephan Ludwig和Peter Stäheli，感谢他们非常有帮助的建议和支持，感谢Victor Wray对手稿的批判性阅读。

作者的贡献

构思并设计了BS PB MH KS实验。进行实验:BS PB MH DB RG。分析数据:BS PB MH SM ADG KS。贡献试剂/材料/分析工具:RG。撰写论文:BS PB ADG KS。

参考文献

  1. 1.Johnson NP, Mueller J(2002)更新账户:1918-1920年“西班牙”流感大流行的全球死亡率。公牛历史医学76:105-115。
  2. 2.Kilbourne ED(2006) 20世纪的流感大流行。出现感染症状12:9-14。
  3. 3.拉贾戈帕尔，崔诺。J(2007)大流行(禽流感)。Semin呼吸危重护理28:159-170。
  4. 4.Fauci AS(2006)季节性和大流行性流感的防备:科学和对策。J感染病194:供应2S73-76。
  5. 5.拉·格鲁塔，凯兹尔斯卡，斯丹巴斯，杜赫蒂(2007)流感病毒感染的自我保护问题:免疫病理学。免疫细胞生物学85:85 - 92。
  6. 6.Taubenberger JK, Morens DM(2008)流感病毒感染的病理。哀乐3:499-522。
  7. 7.Obenauer JC, Denson J, Mehta PK, Su X, Mukatira S，等(2006)禽流感分离株的大规模序列分析。科学311:1576-1580。
  8. 8.韦伯斯特RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y(1992)甲型流感病毒的进化和生态学。微生物学报56:152-179。
  9. 9.卡萨诺瓦JL，阿贝尔L(2004)人类模型:自然条件下对感染免疫的遗传解剖。免疫应答4:55-66。
  10. 10.Hill AV(2006)人类传染病的遗传易感性方面。《年鉴》40:469-486。
  11. 11.Sorensen TI, Nielsen GG, Andersen PK, Teasdale TW(1988)基因和环境对成年被收养者过早死亡的影响。英国医学杂志318:727-732。
  12. 12.Albright FS, Orlando P, Pavia AT, Jackson GG, Cannon Albright LA(2008)流感导致死亡的遗传易感性证据。中华传染病杂志197:18-24。
  13. 13.Gottfredsson M, Halldorsson BV, Jonsson S, Kristjansson M, Kristjansson K, et al.(2008)过去的教训:1918年冰岛致命大流行性流感(西班牙流感)的家族聚集分析。美国科学院学报105:1303-1308。
  14. 14.Kash JC, Tumpey TM, Proll SC, Carter V, Perwitasari O，等(2006)1918年流感病毒诱导的宿主免疫和细胞死亡反应增加的基因组分析。自然443:578-581。
  15. 15.Lipatov AS, Andreansky S, Webby RJ, Hulse DJ, Rehg JE，等(2005)香港H5N1流感病毒Ns基因重组在小鼠中的发病机制:细胞因子和B细胞和t细胞反应的作用。普通病毒学杂志86:1121-1130。
  16. 16.Tate MD, Brooks AG, Reading PC(2008)小鼠流感病毒感染过程中上呼吸道和下呼吸道中性粒细胞的作用。呼吸Res 9:57。
  17. 17.Tumpey TM, Garcia-Sastre A, Taubenberger JK, Palese P, Swayne DE，等(2005)带有1918年大流行病毒基因的流感病毒的致病性:肺泡巨噬细胞和中性粒细胞在限制小鼠病毒复制和死亡率中的功能作用。病毒学杂志39:14933-14944。
  18. 18.王晓燕，李晓燕，李晓燕，等。(2008)CD200在流感病毒感染中免疫稳态和严重程度的作用。Nat Immunol 9: 1074-1083。
  19. 19.GeurtsvanKessel CH, Willart MA, van Rijt LS, Muskens F, Kool M, et al.(2008)从肺中清除流感病毒依赖于迁移的朗格erin+CD11b-，而不是浆细胞样树突状细胞。中华医学杂志205:1621-1634。
  20. 20.McGill J, Van Rooijen N, Legge KL(2008)保护性流感特异性CD8 T细胞应答需要与肺中的树突状细胞相互作用。中华医学杂志205:1635-1646。
  21. 21.Gazit R, Gruda R, Elboim M, Arnon TI, Katz G，等(2006)缺乏自然杀伤细胞受体基因Ncr1的致死性流感感染。Nat Immunol 7: 517-523。
  22. 22.Coro ES, Chang WL, Baumgarth N (2006) I型IFN受体信号在流感病毒感染后早期直接刺激局部B细胞。中国免疫学杂志(英文版)
  23. 23.Stambas J, Guillonneau C, Kedzierska K, Mintern JD, Doherty PC，等(2008)流感中的杀伤T细胞。杂志。
  24. 24.Bergmann M, Garcia-Sastre A, Carnero E, Pehamberger H, Wolff K，等(2000)流感病毒NS1蛋白对抗pkr介导的复制抑制。病毒学报74:6203-6206。
  25. 25.Haller O, Arnheiter H, Lindenmann J(1976)基因决定的小鼠对嗜肝型甲型流感病毒感染的耐药性:免疫抑制的影响。感染Immun 13: 844-854。
  26. 26.Koerner I, Kochs G, Kalinke U, Weiss S, Staeheli P (2007) β干扰素在宿主防御甲型流感病毒中的保护作用。J virrol 81: 2025-2030。
  27. 27.Crozat K, Georgel P, Rutschmann S, Mann N, Du X，等(2006)用ENU诱变分析MCMV电阻体。哺乳动物基因组17:398-406。
  28. 28.侯marquis JF, Nantel A, lac当然R, Ryan L, North RJ，等(2008)小鼠对结核分枝杆菌肺部感染的耐药和易感的一个显著特征是纤维化反应。感染Immun 76: 78-88。
  29. 29.丁明，陆林，托特拉(2008)流感感染小鼠肺和基底前脑的基因表达。大脑行为基因7:173-183。
  30. 30.Peters LL, Robledo RF, Bult CJ, Churchill GA, Paigen BJ, et al.(2007)小鼠作为人类生物学模型:复杂性状分析的资源指南。Nat Rev Genet 8: 58-69。
  31. 31.Beutler B, Eidenschenk C, Crozat K, Imler JL, Takeuchi O，等(2007)抗病毒感染的遗传分析。免疫应答7:753-766。
  32. 32.王晓燕，王晓燕，王晓燕(2003)小鼠、微生物和感染模型。Nat Rev Genet 4: 195-205。
  33. 33.Campino S, Kwiatkowski D, Dessein A(2006)孟德尔和复杂遗传学对寄生虫感染的易感性和耐药性。免疫球蛋白18:411-422。
  34. 34.Fortin A, Abel L, Casanova JL, Gros P(2007)小鼠和男性分枝杆菌疾病的宿主遗传学:正向遗传学研究BCG-osis和结核病。中国基因组学杂志8:163-192。
  35. 35.冷灵A, Pfeffer K, Balling R(2001)两个基因组的战斗:小鼠中细菌宿主/病原体相互作用的遗传学。哺乳动物基因组12:261-271。
  36. 36.马奎斯·JF，格罗斯·P(2008)小鼠对感染的耐药性遗传分析:A/J满足C57BL/6J。微生物免疫学杂志321:27-57。
  37. 37.Vidal SM, Malo D, Marquis JF, Gros P(2008)小鼠感染免疫的正向遗传解剖。免疫学杂志26:81-132。
  38. 38.Vance RE, Jamieson AM, Cado D, Raulet DH (2002) CD94缺失和NKG2A单等位基因表达对自然杀伤细胞发育和基因组形成的影响。美国科学院学报99:868-873。
  39. 39.Hoffmann E, Krauss S, Perez D, Webby R, Webster RG(2002)快速生成流感病毒疫苗的八质粒系统。疫苗20:3165-3170。
  40. 40.Gabriel G, Dauber B, Wolff T, Planz O, Klenk HD，等(2005)病毒聚合酶介导禽流感病毒对哺乳动物宿主的适应。美国科学院学报102:18590-18595。
  41. 41.Trammell RA, Toth LA(2008)人和小鼠对流感感染和疾病的遗传易感性和耐药性。专家Rev Mol诊断8,515 - 529。
  42. 42.Brincks EL, Katewa A, Kucaba TA, Griffith TS, Legge KL (2008) CD8 T细胞利用TRAIL控制流感病毒感染。中华免疫学杂志(英文版)
  43. 43.Hollingsworth JW, Whitehead G, Berman KG, Tekippe EM, Gilmour MI，等(2007)小鼠对链球菌肺部感染抗菌防御的遗传基础。免疫遗传学59:713-724。
  44. 44.梅迪纳，高德曼，罗德梅，李玲，张志强(2001)小鼠对A组链球菌感染易感性的遗传控制。传染病杂志184:846-852。
  45. 45.米特索斯，卡登，林立军，李志军，等。(2000)小鼠对结核分枝杆菌感染易感性的遗传控制。基因Immun 1:46 67 - 477。
  46. 46.Mitsos LM, Cardon LR, Ryan L, laccourr, North RJ，等(2003)结核病易感:小鼠19号染色体上的一个位点(Trl-4)调节结核分枝杆菌在肺部的复制。中国科学院学报100:6610-6615。
  47. 47.格林D, Staeheli P, Hufbauer M, Koerner I, Martinez-Sobrido L，等(2007)复制适应度决定了携带功能性Mx1抗性基因的小鼠中甲型流感病毒的高毒力。美国国家科学院学报104:6806-6811。
  48. 48.Murphy PM, Baggiolini M, Charo IF, Hebert CA, Horuk R，等人(2000)国际药理学联盟。第二十二。趋化因子受体的命名法。药典Rev 52: 145-176。
  49. 49.简维·CA, T P, Walport M, Sholchik MJ(2001)免疫生物学。纽约:Garland出版社。
    • 50.Wareing MD, Lyon AB, Lu B, Gerard C, Sarawar SR(2004)小鼠肺白细胞对甲型流感病毒感染反应的发展和消退过程中的趋化因子表达。中华白细胞生物学杂志76:886-895。
    • 51.Fadel Sa Fau - Bromley SK, Bromley SK Fau - Medoff BD, Medoff BD Fau - Luster AD, Luster AD (2008) cxcr3缺陷保护流感感染的ccr5缺陷小鼠免于死亡。中华免疫学杂志38:3376-3387。
    • 52.Perrone LA, Plowden JK, Garcia-Sastre A, Katz JM, Tumpey TM (2008) H5N1和1918大流行性流感病毒感染导致小鼠肺部巨噬细胞和中性粒细胞早期过度浸润。PLoS Pathog 4: e1000115。
    • 53.高细胞素血症在NF-{kappa}B p50缺陷小鼠感染H5N1型流感病毒后的作用。J性研究。
    • 54.Haller O, Staeheli P, Kochs G(2007)干扰素诱导的抗病宿主防御中的Mx蛋白。生物化学89:812-818。
    • 55.Staeheli P, Grob R, Meier E, Sutcliffe JG, Haller O(1988)流感病毒易感小鼠携带Mx基因大量缺失或无义突变。摩尔细胞生物学8:4518-4523。
    • 56.Staeheli P, Haller O, Boll W, Lindenmann J, Weissmann C (1986) Mx蛋白:在克隆Mx cDNA转化的3T3细胞中组成性表达，提供对流感病毒的选择性抗性。44号牢房:147-158。
    • 57.Vanlaere I, Vanderrijst A, Guenet JL, De Filette M, Libert C (2008) Mx1在鼠种鼠源的近交系SPRET/Ei中引起对甲型流感病毒的耐药性。细胞因子42:62-70。
    • 58.Peirce JL, Lu L, Gu J, Silver LM, Williams RW(2004)一套来自高级杂交群体的BXD重组自交系。BMC Genet 5:7。
    • 59.Taylor BA, Wnek C, Kotlus BS, Roemer N, MacTaggart T, Phillips SJ(1999)重组BXD自交系新鼠株的基因分型及BXD与共识图谱的比较。哺乳动物基因组10:335-348。