加载指标

188滚球软件

同行评审

研究文章

呼吸树突状细胞亚群在支持病毒特异性细胞毒性CD8诱导能力上的差异⁺T细胞反应

Taeg金,

联系Beirne B.弗吉尼亚大学，弗吉尼亚州弗吉尼亚大学，弗吉尼亚州，美利坚合众国
⨯
托马斯J. Braciale.

*电子邮件:tjb2r@virginia.edu

隶属关系美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学贝妮·b·卡特免疫学研究中心，美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学微生物学和病理学系
⨯

呼吸树突状细胞亚群在支持病毒特异性细胞毒性CD8诱导能力上的差异⁺T细胞反应

Taeg金,
托马斯J. Braciale.

发布日期:2009年1月15日
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204

数据

摘要

树突状细胞位于身体表面，如皮肤、呼吸道和胃肠道，在诱导对这些表面的病原体和惰性抗原的适应性免疫反应中发挥重要作用。在呼吸道中，在正常和炎症的肺中都发现了多个树突状细胞(RDC)亚群。RDC的重要性在抗原运输的淋巴结发炎或感染呼吸道排水这个网站很容易被识别,个人的贡献RDC子集这个过程和流动的精确作用RDC内淋巴结T细胞抗原表达是不清楚。在这份报告中，我们证明了两个不同的迁移RDC子集-显示CD103⁺和CD11b.^你好分别为原始DC呈递抗原naïve CD4⁺和CD8.⁺呼吸道流感病毒感染后引流淋巴结内的T淋巴细胞此外，迁移CD103⁺RDC亚群优先驱动naive CD8的增殖和分化⁺T细胞应对感染效应细胞，只有CD103⁺RDC子集可以呈现给NaïveCD8⁺T细胞不传染性病毒疫苗引入呼吸道。这些结果识别CD103⁺和CD11b.^你好RDC作为呼吸道感染适应性免疫反应的关键调控因子和粘膜疫苗设计中的潜在靶点。

引文：Kim TS，Braciale TJ（2009）呼吸道树突细胞亚群差异的能力与诱导病毒特异性细胞毒性CD8的能力不同⁺T细胞应答。PLO一4（1）：E4204。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204

编辑：Derya Unutmaz，纽约大学医学院，美利坚合众国

收到:2008年9月3日;公认：2008年11月25日;发表:2009年1月15日

资金：作者没有支持或资金报告。

利益争夺：作者宣布没有存在竞争利益。

介绍

在诱导适应性免疫反应的一个关键的初始事件是树突状细胞(DC)摄取抗原并将其呈递给适应性免疫细胞。DC驻留在有组织的次级淋巴器官(如脾脏、淋巴结、派耶氏斑)中，也定位于体表(如皮肤、胃肠道和呼吸道)，在那里它们采集外部环境中的外来抗原和入侵的感染微生物[1]那[2]那[3]那[4]．在体面，DC通常显示不成熟的表型。诸如感染的炎症刺激引发了一系列成熟的事件，导致活化的抗原DC迁移到次级淋巴结器，例如淋巴结（LN），通过沿着趋化因子依赖性梯度排出发炎体表的淋巴管[5]那[6]．它位于排出的淋巴结（DLN）中，启动适应性免疫应答[7]那[8]．DLN中存在的DC群体不仅包括移植抗原DC和DC驻留在淋巴器官中[3]，也是循环中的DC，即血浆谱DC（PDC）[9]那[10]那[11]和Gr-1⁺单核细胞DC（MODC）源自循环GR-1^你好单核细胞前体[12]那[13]那[14]，直接从循环进入DLN，或者首先进入炎症刺激的炎症刺激的外周位点。分化/成熟后，这些炎症诱导的DC还可以捕获感染部位并迁移到DLN的抗原。

在淋巴器官和周围组织中发现的DC是由多个细胞亚群组成的[2]那[3]．该子集主要基于特定细胞表面标志物的差异表达，而是对特定DC群体的解剖分布和DC子集的作用或功能作为先天免疫效应细胞或在适应性免疫反应的诱导中。例如，CD8αα⁺在次级淋巴器官中发现的DC被认为在非复制抗原，如可溶性蛋白，到naïve CD8的交叉呈现中起主要作用⁺T细胞[15]那[16]．在正常(非炎症)呼吸道中，已经定义了几个不同的RDC亚型[17]那[18]那[19]那[20]．RDC沿着大(导)气道和小气道的上皮和粘膜形成指间网状结构。它们也存在于肺实质中，偶尔也存在于气道中。最近，CD11c的两个子集^你好MHC II.^你好已经确定了具有解剖学不同分布的RDC[19]：RDC子集中的一个是通过表达αe整合蛋白CD103（CD103）来定义的⁺RDC），优先定位于气道粘膜（和肺部血管）;第二个子集，CD103⁻CD11B.^你好DC（CD11B.^你好RDC），定位于粘膜下和肺实质。最近的证据表明，不同的RDC子集可能涉及呼吸道中的T细胞应答的诱导[19]那[21]那[22]，但这两个MHC II的角色^你好RDC子集以及更突出的GR-1的贡献⁺在宿主对呼吸道感染的宿主反应中的单核细胞DC（MODC）在很大程度上是未知的。

实验性流感病毒感染呼吸道触发器将RDC从呼吸道中的迁移加速迁移到DLN中，并诱导剧烈的CD4⁺和CD8.⁺T细胞反应[7]那[8]那[23]那[24]．RDC在病毒抗原呈递中的RDC一般和特异性子集的贡献尚不清楚NaïveT细胞的催化呈递和激活。然而，几种证据表明，组织DC，例如RDC，响应于感染或炎症可能主要用于抗原输送到DLN，其中LN驻留DC从移民组织衍生的DC中获取抗原并将其交叉T细胞[7]那[25]那[26]．在本报告中，我们在流感感染前后居住在呼吸道中的DC - 并评估移民RDC特异性亚群激活流感病毒特异性CD8的能力⁺和CD4⁺T细胞对感染和非感染性病毒疫苗的反应被引入呼吸道。

结果

呼吸道树突状细胞亚群与病毒感染

树突状细胞可在淋巴器官和周围部位发现，如皮肤、肺等，并由不同的亚群组成。我们采用6色流式细胞技术在CD45的异质群体中鉴定RDC亚群⁺CD11C.⁺在正常（非发炎）和感染的小鼠呼吸道中的细胞（图。S1）.肺泡巨噬细胞是CD11c的主导细胞(60%-70%)⁺细胞亚群，并通过Siglec F表达鉴定[19]那[27]以及他们的高侧散射和高自发荧光［２８］导致表观中等高水平的MHC II类表达（图S1 A, B）.

我们在CD11C中确定了四个DC的子集⁺Siglec F.⁻根据MHC II类的表达水平和不同的细胞表面标记物的存在，在正常肺中的细胞。其中包括:1)少量的B220⁺GR-1⁺MHC II.^lo血浆谱DC（PDC）（图S1A- 面板E）和3个更丰富的RDC子集，2）CD103⁺MHC II.^你好CD11B.^否定DC（指定为CD103⁺RDC以后,无花果。1和S1A.- f);3) CD103⁻MHC II.^你好CD11B.^Med-Hi.DC（指定CD11B^你好RDC,无花果。1和S1A.- 面板h）;4）CD103⁻MHC II.^neg-medCD11B.^你好单核细胞DC(指定为MoRDC，无花果。1和S1A - 面板G）。后者3 RDC子集的尺寸也不同，光散，以及各种激活/差异标记的表达（图S1D并且没有描述)，这加强了细胞可能是不同的RDC子集的观点。

下载：

图1。DC子集在正常和流感感染的肺中。

(A和C)正常和流感感染肺部的常规RDC亚群。肺悬液中的造血起源细胞被鉴定为CD45⁺．在CD45中⁺CD11C.⁺细胞，高度自动荧光肺泡巨噬细胞（AM）和B220⁺浆细胞样DC被排除在进一步的分析之外(见图S1 A和B用于门控和识别策略)。CD103⁺RDC（F），MODC（G）和CD11B^你好未感染(左)或感染(d2 p.i.，右)肺中的RDC (h)被鉴定(A)并在指定的日子枚举(C) p.i. (B) RDC亚群吸收可溶性抗原的能力体内．小鼠处死前1小时给予i.n fitc标记卵清蛋白(FITC-Ova)或未标记卵清蛋白。将RDC亚群所占的FITC-Ova的数量(%)与卵子的数量进行比较，插入的数字表示FITC-Ova的平均荧光强度(MFI) (n>3)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.g001

由于Mordc是主要的RDC子集，我们认为该RDC子集可能在抗原的吸收和呼吸道中的呈现中发挥主要作用，特别是响应于病毒感染等强炎症刺激。但是，两个RDC的子集，CD103⁺RDC和CD11b^你好RDC也是抗原摄取和识别的潜在候选者，因为它们优先定位于气道上皮黏膜和肺黏膜下层/实质[19]．

为了监测这些独特的RDC亚群吸收进入呼吸道的抗原的相对效率，我们采用标准方法，通过鼻内(i.n)途径将荧光素标记的卵清蛋白导入正常(未感染)小鼠呼吸道。处死小鼠后，用流式细胞术检测4个RDC亚群对该抗原的摄取情况。早于给卵清蛋白后1小时(图1 b），通过CD103，RDC的抗原的摄取是明显的⁺RDC和CD11b^你好RDC表现出最高效率。如下下面讨论的用于排出淋巴结中的移民RDC，标记的卵形蛋白在RDC内的内吞囊泡局部地定位在未成熟的直流测量和外周位点的抗原[1]．值得注意的是,CD103⁺和CD11b.^你好RDC但不是Mordc或Pdc，表达高水平的共刺激配体和抗原呈递分子（即CD1D和MHC II类），缺乏共同抑制配体B7-H1（图S1D而不是描述）。CD103的这些属性⁺和CD11b.^你好RDC子集将使它们具有有吸引力的候选者作为呈现细胞的有效抗原。

在i.n.流感(A/PR/8/34)感染后，受感染肺部的这些RDC保留了感染后早期(即1-2天)个体亚群的特征标记(图1一个和S1D）并且至少达到d5 p.i仍然可区分。（未描述）。然而，流感感染导致CD11b绝对数量逐渐但显着增加^你好rdc和mordc在cd103时渗透肺部⁺最小限度地增加RDC数目(图1 c）.

CD103⁺和CD11b.^你好DC子集在呼吸流感病毒感染后累积在纵隔淋巴结中

在排出鼠肺的纵隔淋巴结（MLN）中已经鉴定了DC的不同亚组。据信已迁移到MLN的RDC或响应于肺炎炎症/感染，促进MLN中发现的DC群体，但移民RDC的各个子集的贡献呼吸道感染后MLN中发现的扩增DC群体尚未明确定义。我们分析了从正常MLN中释放的DC种群，并通过两种方法，机械破坏或酶消化从次致死流感感染的MLN中解放出来。

在正常淋巴结中，DC显示CD103⁺或CD11b^你好表型是用GR-1的最小代表和DC⁻MHC II级^㈡无论采用哪种淋巴结细胞分散方法，MoDC表型都是显性DC群体(图2 b和S2）.酶消化后[2]那[7]然而，这是MHC II类的一个典型子集⁺CD8αα⁺节点驻留DC也是明显的CD11C⁺淋巴结中的细胞（图S3A）.遵循i.n.感染预期增加[7]在CD11C的总数⁺MLN中的细胞（图2一个和S3A）.基于细胞表面标记表达，以区分DC子集，CD103⁺和CD11b.^你好d3 p.i可以容易地证明DC.以及GR-1⁺表达细胞表面标记炎性单核细胞树突细胞的细胞表面标记的DC群体，即GR-1⁺modc（无花果2 b。和S2）.MLN中的PDC编号在此期间仅适度增加（未示出）。值得注意的是，高级别表达式配体的高水平表达在很大程度上仅限于累积CD103⁺和CD11b.^你好DC和趋化因子受体CCR7也仅在这2个DC亚群上选择性表达(图2 c）.相反，CD8αα⁺节点驻留DC同样在感染的前3天内仅谦虚地增加数量（图S3A并且未描述）并且在表达最高水平的CD11C时，该DC子集表达了比上述直流子集更低的共鸣配体（图S3B）.根据肺部常驻RDC的观察，感染后MLN中发现的这几个DC亚群具有明显的大小、细胞复杂性和表面标志物差异(图S4）建议他们确实代表了独特的CD11C⁺细胞的子集。

下载：

图2。CD103的累进积累⁺直流和CD11b^你好流行性感冒感染小鼠肺引流淋巴结中的DC

（a）CD11C的积累^你好MHC II.^你好流感感染后MLN中的DC。总CD11C的代表⁺在指定的日子P.I处，流感感染小鼠MLN中的细胞。显示。（b）在流感传染性小鼠MLN中的三个主要DC子集的积累。CD103⁺DC（CD11C.^你好MHC II.^你好CD103⁺CD11B.^{+ /−}，第i组），CD11B^你好DC（CD11C.^你好MHC II.^你好CD103⁻CD11B.^你好，二世）和GR-1⁺modc（CD11C.^loMHC II.^loCD103⁻GR-1⁺CD11B.^你好，III组在D3 P.I的MLN中高度表示。（右侧面板）与未感染的动物（左侧面板）相比（见门控策略图。S2）.(C) d3 p.i时流感感染小鼠MLN中DC亚群的表型特征。CD103表面标记表达⁺DC(组I，灰色)，CD11b^你好DC（II组，白色）和GR-1⁺感染（d3 p.i.）小鼠的MLN中鉴定的MoDC（III组，黑色）在用指定的单克隆抗体染色后进行检查。垂直线（|）表示同型匹配对照抗体表面染色的中值。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.g002.

高水平MHC分子和共刺激配体的表达，成熟DC的特征[1]，由CD103⁺和CD11b.^你好直流(图2 c）将使它们候选人能够成为幼稚病毒特异性T细胞的有效APC。感兴趣的是，排水MLN中的这两个DC子集还表达了CD8α（和β）（无花果。2摄氏度那S4A，而没有描述)。然而，与驻留淋巴结的CD8αα不同⁺组成了这个分子(图S4A），分析感染淋巴细胞缺陷的淋巴结DC子集的伴侣研究^−−/提示这两种MHC II显示的CD8α^你好DC子集最有可能获得从通过Trogocytosis的排水MLN内的T细胞获得CD8α/β异二聚体（［29］那[30]，而没有描述)。

CD103的来源⁺和CD11b.^你好呼吸道流感病毒感染时引流MLN中的DC亚群

自从MHC II以来^你好CD103⁺和CD11b.^你好在正常和感染的肺中存在RDC以及莫德公司，DC在MLN排出感染肺部的相同表型的积累最小可能反映了这些DC子集从肺部的加速迁移到排出的节点上感染而不是从骨髓募集到骨髓到MLN或者的DC祖细胞德诺维CD103的分化和成熟⁻CD11B.^{lo /地中海}LN-驻留DC在感染时进入这些相应的DC子集。确定肺部驻留RDC和这些MHC II之间的潜在联系^你好DC在感染期间累积在MLN中，首先检查了I.N.在D2 p.I时施用可溶性FITC-OVA。在MLN 24小时内的DC子集显示荧光蛋白质。我们选择该时间框架用于标记的抗原给药和细胞分析，因为这一时间框架与这两个MHC II的快速积累一致^你好MLN中的DC子集(见下文)。因此，在这24小时的时间框架内，受感染肺部的细胞(包括RDC亚群)将有足够的时间吸收抗原，然后从受感染肺部迁移到MLN。我们发现两个MHC II^你好DC子集，CD103⁺（44％，图3A - I）和CD11b.^你好(31%,图3A - II）DC，和GR-1⁺modc（53％，图3A - III）是FITC.⁺，这与这些DC人群可能的肺起源相一致。值得注意的是，FITC-Ova共聚焦图像⁺细胞中发现FITC-Ova蛋白定位于细胞内细胞器(图。S5），指示Endo / Phagocytosis，而不是弥漫性细胞表面结合，因此与RDC通过Endo / Phagocytiss在从肺部迁移到MLN之前通过Endo / Phagocytiss直接占用FitC-OVA的概念。

下载：

图3。流感感染小鼠MLN中DC亚群的来源。

(A和B)通过肺驻留的DC获得并运输FITC-Ova (A)或病毒蛋白(B)到感染小鼠的MLN中。(A)将荧光(FITC)标记或未标记的Ova蛋白在d2 p.i.时注入流感感染小鼠体内。一天后，检测注入卵的感染小鼠MLN中的DC亚群，以检测FITC-Ova的摄取(%)。(B)具体百分比NP⁺D3 P.I的MLN中的DC子集。在细胞内染色后检查病毒核蛋白（NP）。（c）检测感染小鼠MLN中DC子集的局部增殖。从I.N的MLN隔离的DC。在d3 p.i被感染小鼠。细胞内染色用于核抗原Ki-67。CD8上的KI-67染色⁺在D7 P.I的来自MLN感染的小鼠中分离的T细胞。被描绘为阳性控制。（d和e）CD11b的积累^你好直流和CD103⁺DC在被感染小鼠的MLN中需要在肺中存在相应的对应物。(D) Naïve DTR小鼠腹腔注射DTx(下面板)或单独注射载体(上面板)，耗尽CD11c⁺肺中的RDC子集被检查48小时后（N> 5）。（e）在D3 P.I中鉴定了流感感染小鼠MLN中的DC子集。在DTR小鼠中I.N.给予感染前一天的DTX或PBS（N> 10）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.g003.

在伴侣实验中，我们确定了在MLN中发现的任何这些DC群体是否通过基于流动的分析显示流感核蛋白（NP）的细胞内表达。该分析显示CD103⁺DC是MLN中的主要感染 - NP表达 - 细胞类型（图3 b）.这与我们最近发表的研究结果一致[31]那个CD103.⁺RDC子集最容易受到流感感染的影响体内和在体外．虽然在CD103中流感NP表达呈弥漫性胞内模式(胞浆和核)⁺d3 p.i.处来自MLN的DC模拟了这种病毒蛋白在CD103中的表达谱⁺RDC直接感染了体外（图。S5)，NP⁺细胞只代表CD103的一小部分⁺从排水节点隔离的DC。我们不能排除大多数CD103的可能性⁺MLN中的DC可能在RDC迁移到引流淋巴结之前从呼吸道感染细胞中获得了流感病毒抗原，包括NP。我们进一步确定了三个主要DC亚群的积累，特别是MHC II^你好CD103⁺和CD11b.^你好受感染动物MLN中的DC不是由于近期局部细胞增殖，因为根据核抗原Ki-67(近期细胞增殖的标记物)的表达，这些DC亚群中只有不到5%的人近期发生了细胞分裂[32]（图3 c）;在感染的前3天持续给药胸苷激酶类似物BrdU可导致部分(<30%)CD103⁺和CD11b.^你好DC掺入DNA（图S6A）.

更直接确定肺居住的CD103的贡献⁺和CD11b.^你好为了应对呼吸道病毒感染，我们利用表达非人类灵长类白喉毒素（DTx）受体（DTR）的转基因（tg）小鼠，该受体由小鼠CD11c启动子驱动[33]．向DTR小鼠施用DTX导致毒素剂量和CD11C表达水平依赖性CD11C耗尽⁺DC与CD11C.^你好细胞对最低剂量的毒素最敏感。我们发现，在i.n.流感感染之前，局部(i.n.)给予DTR小鼠低剂量的DTx，可优先消除两种CD11c^你好DC亚群，MHC II^你好CD103⁺和CD11b.^你好来自呼吸道的RDC（图3 d）还抑制了CD103的积累⁺和CD11b.^你好感染后MLN中的DC子集，只对GR-1的影响很大⁺modc累积（图3 e和图S6B）.注意，高剂量I.N.DTX管理导致这两个CD11C的耗尽^你好RDC子集以及来自DTR小鼠的肺的MORDC以及来自MLN的LN DC的部分耗尽（未示出）。

这些发现表明CD103来源于肺⁺和CD11b.^你好通过使用CCR7的研究进一步支持在MLN中累积的DC子集^−−/老鼠。趋化因子受体CCR7在DC从外周部位向淋巴器官迁移中起着重要作用[5]那[6]并被CD103表达⁺和CD11b.^你好DC子集，但不是Gr-1⁺Modc在排出的MLN的感染小鼠中（图2 c）.CCR7^−−/小鼠表现出肺内CD103正常成分⁺和CD11b.^你好RDC（[34]但这两个DC子集(不像Gr-1)⁺在流感感染ccr7缺陷小鼠的MLN中，MoDC未能积聚(图S6 C，D）.综上所述，这些数据表明CD103的积累⁺和CD11b.^你好流感感染小鼠MLN中的DC主要(如果不完全)是由感染诱导的肺中相应细胞的迁移所致，而不是通过循环的DC祖细胞募集或MLN中驻留细胞的增殖扩张/转化。

移民呼吸直流积聚和抗原输送到呼吸病毒感染期间的抗原输送

鉴于上述结果将肺部视为CD103的起源部位⁺和CD11b.^你好DC亚群在流感感染小鼠的引流MLN中积累(以及至少部分Gr-1)⁺MoDC MLN),它是研究感兴趣的这些不同的直流子集的积累动力学MLN,作为建立的基础,如果一个或多个直流子集可能发挥关键作用的抗原和/或交付演示MLN的适应性免疫细胞反应(见下文)。为此，我们列举了在i.n.流感病毒感染之前和之后在MLN中出现的这3个DC亚群的数量。中观察到图4a和b，每个DC亚群在MLN中积累DC的时间过程是不同的。而MLN中每个DC亚群的初始数量在d1-2 pi之间增加(图4 b），它们在峰值积累的日子里有所不同，CD103⁺和CD11b.^你好DC分别在d3和6pi处达到峰值。后者在MLN中以更高的幅度积累，令人想起CD103的速度⁺和CD11b.^你好早期感染时DC在肺部积聚(d1 - 3 p.i.，图1 c). 这两个DC亚群的数量在峰值累积后逐渐减少，但在1.5–2周p.i.的时间内保持在相对较高的水平。另一方面，Gr-1的累积更为强劲⁺在d4 p.i.时，出现峰值。Gr-1在达到峰值后逐渐下降⁺MODC由2个WKS P.I最小可检测到。我们还在MLN中的这三个DC子集检查了流感NP的表达动力学（图4摄氏度）.NP.⁺细胞主要局限于这种CD103⁺CD103的DC子集和NP的表达⁺DC亚群在感染早期最显著，即d2 p.i. NP时最大⁺感染第5天后，在MLN中未检测到DC(未描述)。

下载：

图4。甲型流感型小鼠MLN中三个主要DC子集积累的动力学。

(A和B)小鼠感染流感，在不同的日子p.i.， Gr-1⁺CD11b MoDC(□)^你好DC(⋄)和CD103⁺在感染小鼠的MLN中鉴定出DC (xˆ)(见图。S2）并列举（a）。来自D0-2 P.I的MLN中累积的DC子集的大小。在（a）中膨胀（b）（平均值±sd; n = 4-8只小鼠/组）。（c）NP积累的动力学⁺DC亚群在流感感染小鼠的MLN d1至d5 p.i， % NP⁺DC子集- Gr-1⁺CD11b MoDC(□)^你好直流电(⋄), 和CD103⁺DC（xˆ）–用不相关的单克隆抗体减去非特异性染色后表示（平均值±SD；N = 4-5只小鼠/组）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.g004

CD103⁺和CD11b.^你好RDC是激活抗原特异性naïve CD8所必需的⁺在MLN中的T细胞

gr-1⁺Mordc是流感感染的肺部和排出MLN中最丰富的RDC人群，因此预期将通过病毒抗原递送至DC居民的病毒抗原输送在MLN中激活抗原特异性T细胞中最突出的作用在MLN和/或直接作为APC作用。然而，因为它们表达了高水平的MHC分子和刺激性配体，以及它们在CD103中占据感染呼吸道中的抗原的能力⁺和CD11b.^你好RDC也有潜力作为APC迁移到排水MLN (图2 c）.确定肺部居民CD103的贡献⁺和/或CD11b^你好rdc归纳一个体内在流感感染后引流MLN的适应性免疫反应中，我们检测了CD103消除的影响⁺和CD11b.^你好来自呼吸道的RDC对病毒特异性NaïveCD8的活化和增殖⁺DTR模型中的T细胞。

NaïveCSFE染料标记的流感血凝素（HA）特异性克隆4（CL-4）TCR TG CD8⁺将T细胞转移到DTR受体中，按照低剂量I.N以24小时间隔顺序地依次。管理DTX以选择性地消除这两个RDC子集，然后是I.N.流感感染。如前所述[8]那[35]，并在此处演示(图S7），在野生型对照（PBS处理）DTR小鼠感染的第3天和第4天之间，在MLN之间剧烈转化的CSFE标记的CH-4 T细胞剧烈转化的CL-4 T细胞（图5a，b）.相比之下，2 CD11c的消融^你好MHC II.^你好RDC亚群导致CD8几乎完全缺失⁺T细胞在引流MLN中的增殖/扩张(图5a，b）.由于naïve CL-4 T细胞在经DTx处理的经静脉途径感染流感病毒的DTR受体的MLN中大量增殖(图5c，d)， DTx进入呼吸道对CD11c总量无显著影响⁺在48小时后，MLN中的细胞在DTX治疗后（未描述）。

下载：

图5。的CD11b^你好和CD103⁺诱导病毒特异性CD8的最佳增殖扩张需要RDC子集⁺T细胞响应呼吸道流感病毒感染体内．

（a-d）咽部栖息的CD11b^你好和CD103⁺感染前DC亚群导致几乎没有病毒特异性naïve CL-4 CD8⁺T细胞增殖响应呼吸道（A和B），但不是静脉内（C和D），流感病毒感染。以下CFSE标记的CL-4 CD8⁺将T细胞转移到DTR小鼠体内，在感染前一天给予DTx(或PBS)。四(i.n)或3(注射)病毒感染后数天,部门档案CL-4 T细胞(或C)和总数量的复苏CL-4 T细胞在B和D(左)和总细胞结构在B和D(右)感染MLN的DTR老鼠决定(平均数±标准差;n = 4 - 6)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.g005.

在使用染料标记的CCR7的研究中，这些迁移RDC亚群中的一个或两个在T细胞激活中的关键作用被进一步证实^+/+CL-4 T细胞转移到CCR7中^−−/收件人。我之后感染，CCR7缺陷小鼠的MLN中CL-4 T细胞的显着降低了增殖膨胀（图S8A)肺内CD103⁺和CD11b.^你好DC不能响应病毒感染而移出呼吸道（图S6 C，D）.由于次级淋巴器官的结构，例如，淋巴结，在CCR7缺陷小鼠中异常，降低CD8⁺这些动物的MLN中的T细胞增殖可能是由于naïve T细胞和驻留淋巴结的DC之间相互作用的缺陷造成的。为了评估这种可能性，我们检测了naïve TCR转基因CD8细胞的能力⁺T细胞在i.v之后在MLN中响应。施用传染性流感病毒。静脉内途径的流感感染不影响CCR7竞争力CL-4 CD8的增殖扩张⁺ccr7缺陷宿主MLN中的T细胞(图S8B），表明没有CCR7受体不会改变LNDC与并激活NaïveCD8的能力⁺T细胞，至少在静脉内病毒感染的条件下。

移民CD103⁺和CD11b.^你好MLN中的RDC在其刺激幼稚病毒特异性CD8的激活和分化的能力方面不同⁺T细胞变成效应T细胞

上述发现涉及一个或两个移民RDC子集发现呼吸道病毒感染后的MLN抗病毒T细胞反应的诱导的关键可能通过他们的运输能力的病毒抗原排水MLN并可能直接作为幼稚T细胞的APC。为了更好地定义这些迁移的RDC亚群以及在感染后抗原呈交给naïve T细胞的MLN中发现的其他DC亚群的作用，我们首先分离(在机械淋巴结中断后)主要的CD11c⁺DC群体（即，主要是CD103⁺DC，CD11B.^你好DC，GR-1⁺MoDC和少量的B220⁺PDC）来自D3 P.I的流感感染小鼠的MLN。（图S9）.我们将这些DC亚群与csfe标记的流感ha特异性naïve TCR tg CD8共培养⁺还是CD4⁺T细胞评估这些LN衍生的DC子集的能力，以驱动NaïveT细胞激活/分化。

我们发现B220⁺pDC无法激活幼稚的CD4⁺或CD8⁺T细胞。相比之下，占主导地位的Gr-1⁺modc可以刺激天真CD4⁺T细胞，尽管适度的程度和CD8⁺T细胞最小值（图6）.然而，pDC和Gr-1⁺modc可以触发TG CD8⁺T细胞增殖与预处理的表位肽(图S10）.相比之下，CD103⁺或CD11b^你好从感染的小鼠MLN分离的DC可以支持CD4⁺T细胞活化，增殖扩张(图6 A、B）分化为效应细胞因子产生细胞（图S11)，效率相当。然而，这两个DC亚群在触发naïve CD8的能力上存在差异⁺T细胞激活和扩张。虽然DC子集可以激活天真CD8⁺T细胞，CD103⁺DC激活了更大比例的naïve CD8⁺T细胞（图6)，并触发了比CD11b更广泛的扩张和应答T细胞的恢复^你好直流(图6 b）.这是naïve CD8的效率差异⁺当检测应答T细胞的分化状态时，两个DC亚群对T细胞的刺激也很明显。在应答CD8时，溶细胞T淋巴细胞效应分子，颗粒酶B和干扰素-γ的表达，但TNF-α的表达优先升高⁺T细胞由CD103刺激⁺直流(图6 c）.

下载：

图6。气道衍生的移民CD103⁺炎症MLN中的DC在将流感病毒抗原提呈或交叉提呈naïve CD8上具有优势⁺T细胞。

(A-C)感染动物MLN中DC亚群刺激naïve或CD8的效率⁺还是CD4⁺鼻内感染传染性流感病毒后的T细胞。从3 d前感染流感病毒的小鼠MLN中分离的DC亚群与cfse标记的ha特异性naïve TCR tg CD8共培养⁺还是CD4⁺T细胞4天。存活CD8的增殖情况(A)或总恢复情况(B)⁺还是CD4⁺示出了由MLN衍生的DC子集刺激的T细胞（平均值±SD; n = 5）。CD8的效应函数⁺T淋巴细胞被CD11b刺激^你好DC或CD103⁺DC在D4共培养（C）中检查。（d）MLN中DC子集的效率刺激NaïveCD8⁺还是CD4⁺鼻内施用非传染性流感病毒藻酸盐后T细胞。从MLN的小鼠MLN分离的DC子集接种3d与灭活的流感病毒一起接种了3d，用CFSE标记的HA特异性NaïveTCR TG CD8共培养⁺还是CD4⁺T细胞培养4天。描述了T细胞亚群增殖特征的代表（n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.g006.

CD8αα⁺先前已据报道，LNDC是刺激流感特异性幼稚CD8的重要APC⁺通过移植到MIGRANT RDC递送到MLN的病毒抗原的摄取和呈递的T细胞[7]．CD103的消除⁺和CD11b.^你好来自呼吸道的RDC（通过I.N.DTX给药）或这些RDC的无法迁移到MLN的（CCR7缺乏）将导致病毒抗原输送到MLN的失败，并且由于CD8αα无法变化⁺LNDC捕获病毒抗原并激活NaïveCD8⁺T细胞。当CD8αα⁺d3 pi从引流MLN中分离出LNDC，从CD103中分离出LNDC⁺和CD11b.^你好移民RDC（也是CD8α⁺，尽管水平较低)，与两种转移性CD11c相比^你好MHC II.^你好在亚群中，该LNDC亚群仅表现出与迁移Gr-1相当的适度抗原呈递活性⁺modc（图。S12A)，但当肽脉冲时可能出现(图。S12B.）.

某些DC亚群似乎专门吸收非感染性抗原材料，沿着MHC I类呈递途径加工和呈递这些抗原到naïve CD8⁺T细胞通过“交叉呈现”[36]那[37]那[38]．交叉提呈机制被认为是允许抗原(如可溶性蛋白、病毒等不感染DC的抗原)和肿瘤细胞抗原刺激CD8的机制⁺T细胞反应[38]．为了通过移民RDC调查流感病毒的交叉呈递，我们将非传染性完整的流感病毒群岛病毒疫苗疫苗引入肺部。路线并检查从供体处理的疫苗MLN疫苗中分离的DC子集的容量直接刺激体外病毒特异性天真CD4⁺和CD8.⁺T细胞。我们发现，类似于传染性病毒，不传染病毒，并呈现给幼稚CD4⁺CD11b的T细胞^你好DC和CD103⁺效率相当的直流电源(图6 d）.相比之下，CD103⁺DC优先(如果不是唯一的)呈现来自体内气道加工非传染性病毒群落到NaïveCD8⁺并触发T细胞增殖(图6 d）.

讨论

在粘膜表面或皮肤等外周身体部位发现的DC不是一个统一的群体，而是作为不同的细胞亚群存在，某些细胞表面标记物的表达不同。虽然这些DC亚群差异的功能意义尚不清楚，但不同的DC亚群被认为在先天性和适应性免疫应答的诱导和表达中发挥着不同的作用[1]那[39]．在这份报告中，我们证明了小鼠呼吸道中两个不同的DC亚群显示CD103⁺CD11B.^{+ /−}（CD103.⁺）和CD103⁻CD11B.^你好（CD11B.^你好）细胞表面表型是呈递细胞的主要抗原，其占据病毒抗原并迁移到排出的MLN以引发适应性T细胞对流感病毒感染的诱导。有趣的是，虽然RDC子集都可以刺激流感特定的CD4⁺T细胞应对效率相当，只有移民CD103⁺RDC亚群(当从病毒感染动物的MLN中分离时)能够促进naïve抗原特异性CD8的广泛增殖和充分分化⁺T细胞进入效应细胞。重要的是，这个CD103⁺RDC子集是唯一能够有效地捕获给呼吸道和呈现的非传染性流感病毒的细胞类型体内将抗原加工抗原对甲型流感特异性CD8⁺在MLN中的T细胞。因此，该RDC子集的能力可以是唯一的，其能够在进入呼吸道中的病毒感染细胞进入进入呼吸道的呼吸道和病毒抗原的“交叉呈现”至CD8 + T细胞的能力是独特的。

正如这里和其他地方所证明的[18]那[19]那[40]，可以在正常/非发炎的小鼠呼吸道中鉴定RDC的几个不同亚群（如细胞表面标记表达）。这些子集中的两个，CD103⁺和CD11b.^你好DC，在LN排出较低呼吸道的LN中最小值，但CD103⁺和CD11b.^你好DC在I.N的MLN中积累显着积累。流感感染。CD103的节奏⁺和CD11b.^你好DC的积累，即发病时间为p.i.的1 - 2天，与先前报道的naïve CD8的激活速度相一致⁺亚致死流感感染后MLN中的T细胞活化[7]那[8]提示CD103的积累可能有作用⁺和CD11b.^你好在MLN中的T细胞激活中的DC。至少3个机制可以考虑响应于呼吸道感染的MLN中这些DC子集的积累;1. CD103的迁移⁺和CD11b.^你好RDC从呼吸道到MLN的响应感染;2.响应感染的循环到MLN中的血型直流祖细胞的动员;3.响应于感染的LN驻地DC采集这些细胞表面标记。

本报告中描述的多种证据表明CD103⁺和CD11b.^你好在MLN中累积的DC是呼吸道中的呼吸道的确实移植RDC，响应于病毒感染。除了引入呼吸道中的染料和/或标记的抗原的MLN中的DC检测标准技术以及引入呼吸道的标准技术[7]那[23]那[41]通过BRDU摄取和KI-67表达评估近期细胞划分，所述呼吸道源的末端分化细胞作为这些DC在MLN中积累的这些DC的来源，我们无法抑制这两种DC子集的积累通过阻断CD62L（未描述） - 从循环到次级淋巴器官的DC迁移的关键粘附分子[9]那[11]那[42]．更重要的是，我们发现DTR小鼠选择性消融CD11c^你好CD103⁺和CD11b.^你好RDC子集通过低剂量DTX给药在呼吸道病毒感染时对呼吸道进行选择性地抑制CD103的积累⁺和CD11b.^你好感染后MLN中的DC。与DTR小鼠的结果一致，CCR7^−−/小鼠，具有CD103的正常组件⁺和CD11b.^你好DC在呼吸道中，需要CCR7与活性DC的相互作用，其趋化因子配体用于有效地迁移到DLN[5]那[34]那[43]，也未能积累CD103⁺和CD11b.^你好DC在发炎的MLN中。在这方面，特别值得注意的是，CD103的大幅减弱迁移⁺和CD11b.^你好由于耗尽(DTx治疗)或对趋化刺激缺乏反应(CCR7)， MLN对呼吸道病毒感染反应的RDC^−−/小鼠）也导致NaïveCD8显着降低⁺在MLN中的T细胞激活。

尽管许多研究已经研究了惰性抗原和感染因子引入呼吸道对呼吸道和LN DC特性和诱导适应性免疫反应功能的影响[7]那[41]那[44]那[45]那[46]，呼吸道衍生和LN驻留DC在驱动T细胞对呼吸道抗原或病原体中的相对贡献难以定义。实际上，存在引人注目的证据表明移民RDC可以主要在抗原输送和输送到LN驻留DC中，这反过来又称诱导适应性T细胞免疫应答的诱导[22]那[41]那[44]那[45]．我们对DTx消融RDC亚群的影响以及CCR7缺失对MLN中DC积累和T细胞激活的影响的研究结果，可以简单地反映CD11c迁移的作用^你好CD103⁺和CD11b.^你好RDC在抗原转运中的作用。然而，直接分析从感染动物的MLN中分离的DC亚群在未感染CD8时的能力⁺T细胞激活（D3 P.I.）以支持NaïveCD8⁺和CD4⁺T细胞活化显示CD103迁移⁺和CD11b.^你好从MLN中分离的RDC在刺激幼稚T细胞方面最有效。移民Gr-1⁺MoRDC在每个细胞的基础上刺激幼稚T细胞的效率要低得多，特别是naïve CD8⁺T细胞。然而，这些细胞是进入引流MLN的主要迁移RDC子集，可以刺激naïve CD4⁺效率适中的T细胞。尽管Gr-1⁺在几个模型中，MoDC被认为是naïve T细胞活化的重要APC[12]那[13]那[14]我们关于低剂量i.n.DTx给药（以及CCR7缺乏）对感染期间这些炎症DC的数量和迁移到MLN的影响的研究结果表明，这些细胞在自然病毒感染期间至少在呼吸道中作为APC发挥次要作用。

我们解放CD8αα的能力⁺MLN中大量的LNDC严重依赖于LN中断和DC隔离的方法。使用酶处理破坏的MLN，我们从d3 p.i.引流MLN中分离出足够数量的这些细胞，以检测naïve CD8的抗原提呈活性⁺被另外两个CD8α污染最小的T细胞⁺MLN中的DC子集（即移民CD103⁺和CD11b.^你好RDC）。我们发现类似于移民GR-1⁺MoDC CD8αα⁺LNDC具有适度的抗原呈现能力。我们不能排除一小部分LNCD8αα的可能性⁺DC在D3 P.I上上调MHC II.并且包括在MHC II的分类群体中^你好移民rdc。因此，这种CD8αα的亚群⁺DC可能具有像CD11b一样的强抗原提呈能力^你好RDC。虽然我们的结果不排除CD8αα的重要作用⁺Belz等人的研究表明，LNDC在naïve T细胞抗原呈递中存在。[7]我们的研究结果表明移民RDC，特别是CD103的主要作用⁺RDC，作为NaïveD8T细胞的主要APC，响应呼吸道病毒感染。贝尔斯et的上述研究。al。在甲型流感模型中，响应流感感染而证明LN驻留CD8αdC以及作为APC的移民直流，但是，鉴定了移民RDC的性质。我们的研究不排除移民RDC - CD103的任何一个或两个子集⁺和CD11b.^你好- 在迁移到MLN时可以将病毒抗原转移到LN驻留DC。虽然我们没有观察到淋巴结居民CD8αα的有效抗原呈现⁺DC后流感感染后，病毒菌株，接种剂量，DC分离方法等因素无疑可以解释美国和其他研究人员观察到的DC的表型和APC活性的差异。值得注意的是，我们的调查结果也补充了最近的报告[47]其中朗吉琳(Lg)⁺RDC被证明有助于CD8 T细胞对流感感染的反应。我们和其他人已经观察到CD103⁺RDC也是Lg⁺[19]那[48](T. Kim和T. Braciale，未发表的观察)。此外，我们的研究表明CD11b^你好RDC不仅用作Naïve抗病毒CD4的有效APC⁺T细胞，但也可能有助于抗病毒CD8的诱导⁺虽然T细胞的反应效率较低。目前尚不清楚这两个RDC亚群如何相互作用，协调CD8/CD4 T细胞对呼吸道病毒感染的反应。

的CD103⁺和CD11b.^你好RDC不仅在其解剖定位中不同，而且显着不同，但在它们将病毒抗原呈现出幼稚CD8的容量中⁺T细胞。我们的观察最清楚地证明了这一点，只有CD103⁺MLN中的RDC子集可以有效地捕获，处理和呈现为NaïveCD8⁺T细胞非传染性病毒抗原（病毒粒）引入呼吸道。由于这种RDC子集在肺中的这种RDC子集不表达与DC相关的标记，例如用于交叉呈现，例如，CD8α.[25]那[26]甘露糖受体[49],而不是描述)。然而，CD103的密切联系⁺RDC子集与粘膜上皮[19]将使这些细胞理想地适合于优先样品在粘膜上皮表面上引入的非复制（可溶性或颗粒状）抗原。

我们能够检测到从感染小鼠的MLN中分离出来的迁移RDC中流感NP的表达，这表明在MLN中发现的迁移RDC中有一部分是病毒感染的。我们从未感染的肺中分离出RDC[31]移民CD103⁺RDC子集最容易感染。如上所述，移民CD103⁺RDC比CD11b更有效^你好RDC触发CD8⁺在病毒感染期间，T细胞活化/增殖和驱动效应T细胞分化。然而，我们不能断定这增加了CD103的有效性⁺RDC作为APC与它们的感染性直接相关，即RDC的直接感染增强了它们作为naïve CD8的APC的效力⁺T细胞。只有一小部分CD103⁺节点中的RDC被感染。由于这种DC亚群似乎拾取、加工和呈现外源性病毒抗原(图6 d）天真CD8⁺T细胞，多数移民CD103⁺RDC，即NP⁻，可能(或确实可能)通过在转移到MLN之前从感染肺部的病毒感染细胞中摄取病毒抗原来发挥APC的功能。同样的CD103的能力⁺RDC优先刺激naïve CD8⁺T细胞不太可能与呼吸道中该RDC子集的定位直接相关及其病毒抗原的可及性，因为CD103都是CD103⁺和CD11b.^你好RDC可以在呼吸道和有效存在的情况下捕获通过自然感染或疫苗安装产生的病毒抗原体内将抗原加工到天真CD4⁺T细胞。相反，CD103的效率更高⁺RDC亚群用于交叉呈递颗粒状病毒抗原疫苗或(如最近报道的)引入呼吸道的可溶性蛋白[22]以及自然感染期间产生的病毒抗原，最有可能反映CD103选择性地提高I类呈递途径成分的表达⁺RDC和/或该RDC亚群对MHC I类分子加工抗原的摄取、加工和传递的独特适应性[49]那[50]（T. Kim和T. Braciale，准备稿件）。虽然加工肽/ MHC I复杂地层效率的差异并因此通过这2个RDC子集传递给TCR的信号的强度可以解释CD103的能力⁺RDC更有效地推动CD8的发展⁺T细胞效应函数，我们相信CD103⁺和CD11b.^你好RDC子集还可以在它们提供驱动CD8所需的附件信号的容量中不同⁺T效应细胞分化。

的CD103⁺和CD11b.^你好RDC继续在MLN中增加数量，最多5天P.I.并行，有一个相应的大涌入GR-1⁺modc。这些CD11C.^loF4 / 80.⁺MHC II.^loDC在正常呼吸道和MLN中呈最低水平。它们可能来自循环的Gr-1⁺单核细胞祖细胞进入呼吸道以应对感染。这些Gr-1⁺正如这里所展示的，可以捕获抗原，然后通过ccr7独立的机制迁移到MLN的MoDC已经被报道作为APC[12]那[13]那[14]那[51]．这些移民GR-1⁺然而，MORN中的MODC出现，以具有将病毒抗原呈现至T细胞的最小能力，并且仅适用于CD4⁺T细胞。在MLN中，所有这3个迁移的RDC种群的数量都可以检测到至少d10 p.i。由于MLN中的DC刺激naïve T细胞的能力被d10 p.i显著降低。[7]（T. Kim和T. Braciale，稿件制备），在病毒间隙后MLN中这些移民RDC数量升高的原因[52]仍有待确定，尽管它们可能在内存T细胞生成中发挥作用[53]那[54]（kim和braciale，准备稿件）。

总之，我们已经证明了几个不同的RDC亚群在应对流感病毒感染时迁移到引流呼吸道的LN。我们的结果表明，抗原提呈能力主要存在于迁移的RDC中，而且只有2个迁移的RDC亚群(即CD103)⁺和CD11b.^你好DC)可有效激活naïve抗原特异性T细胞在MLN响应感染。CD103的能力⁺RDC子集优先将抗原呈现给CD8⁺在感染期间和病毒疫苗滴注到呼吸道中的T细胞，随着该RDC粘膜内的该RDC子集的定位，使得该DC驻留在呼吸道疾病的研究中进一步分析的潜在重要的候选细胞类型，以进一步分析粘膜疫苗开发。

材料和方法

老鼠

雌性Balb / c小鼠（H-2^D.）从Taconic Farms（Germantown，NY）购买。在鼠CD11C-启动子的控制下表达非人类动物毒性白喉毒素受体（DTR）的转基因（TG）小鼠（C.FVB-TG^{ITGAX-DTR / EGFP}57LAN / J，H-2^D.克隆4 (Cl-4) TCR Tg小鼠(H-2^D.）从杰克逊实验室（Bar Harbor，Me）获得。Thy-1.2 Cl-4 TCR TG小鼠（H-2^D.）来自R.W. Dutton博士（Trudeau Institute，Saranac Lake，NY）的慷慨礼物。Thy-1.2 TS1 TCR TG小鼠（I-A / E.^D.)由A博士提供。卡顿（威斯塔研究所，宾夕法尼亚州）。缺乏趋化因子受体CCR7（CCR7）的小鼠^−−/)已被描述[5]并由C. Rose博士(弗吉尼亚大学，VA)提供。这些小鼠在无菌环境中繁殖和饲养，并在9-13周龄时进行所有实验。删除CD11c⁺细胞，将DTR TG小鼠注射I.N.用DTX（30ng /60μlPBS，Sigma）。所有动物实验均按照弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会批准的议定书进行。

小鼠感染

型流感病毒，A / PR / 8/34（H1N1），如前所述在第10天鸡胚腺体腺体腔内生长[8]．用350粒卵感染剂量(EID)在50µl内感染小鼠，用1.7×10经尾静脉滴注500µl^7.开斋节。如前所述，用紫外线交联法制备了传染性流感病毒的灭活[55]．在紫外线暴露于病毒悬浮液之后，样品连续10倍稀释，并在MDCK细胞中使用斑块测定法测定感染性。非传染性病毒送达I.N.在50μl的1.7ng / ml下。

鼻内灌注fitc -卵清蛋白

给予小鼠I.N.FitC缀合的卵烧（FITC-OVA，1mgIn100μL，Molemular探针，丁烯，或）或未标记的OVA（1mgIn100μL，Sigma）作为对照。通过流式细胞术后1小时，在滴注后1小时评估在未感染的小鼠中的肺细胞的FITC-OVA的量，并与未标记的OVA相比。在感染的小鼠中，Fitc-OVA或OVA蛋白是I.N.在D2 P.I灌输。菲特⁺在24小时后检查肺排出的MLN或脾脏中的细胞。

组织白细胞的制备

酶法消化后肺单细胞悬液的制备在别处有描述[27]．简而言之，处死小鼠，通过用5mL无菌PBS通过心脏的右心室灌注肺，以除去来自肺脉管系统的血管内细胞库。将组织切碎，然后在37℃下在IMDM（Invitrogen，Gaithersburg，MD）中，在183 u / ml II / ml II型胶原酶（Worthington，Lakewood，NJ）中消化30-40分钟。之后，肺组织通过电线筛网通过。通过没有酶促消化的70μm细胞过滤器（BD）捣碎，制备来自LN和脾脏的单细胞悬浮液。使用氯化铵裂解细胞悬浮液中的红细胞（RBC）。洗涤细胞并重新悬浮在含有1×PBS，2％FBS，10mM EDTA和0.01％NaN的FACS缓冲液中_3.或含有1× PBS, 2% FBS和10 mM EDTA的MACS缓冲液用于分选。用台班蓝染料排除死细胞后，用血球计计数悬浮液中的活有核细胞。

T细胞和直流隔离

对于CD8.⁺还是CD4⁺T细胞分离，根据制造商的协议（Miltenyi Biotec），使用CD8或CD4 T细胞分离试剂盒分离来自脾脏的细胞悬浮液。对于来自LN的直流分离（n = 30-35只小鼠/分拣），CD11C⁺使用MACS细胞分选机（Miltenyi Biotec）的特异性mAb（FTIC缀合的mAb）的混合物（FTIC缀合的MAb）的混合物孵育后培养的阴性选择富含细胞的富含细胞。将富集的人群用特定于i-a的鸡尾酒染色^D.，CD103，CD11C，B220和CD11b并分类为CD11C⁺B220⁺MHC II.^低(pDC), CD11c⁺B220⁻CD11B.^你好MHC II.^㈡(Gr-1⁺MoDC), CD11⁺B220⁻MHC II.^你好CD11B.⁺CD103⁻（CD11B.^你好直流)或CD11c⁺B220⁻MHC II.^你好CD103⁺（CD103.⁺DC)(见图S9）通过流式细胞仪在流式细胞术核心设施（弗吉尼亚大学）的Facsvantage Se Turbo分选仪。

在体外DC：T细胞共同培养物

用于DC:T细胞培养的培养基为RPMI 1640，其中添加10%热灭活FCS、1%丙酮酸钠、2 mM l -葡萄糖、20 mM HEPES、5 mM β-巯基乙醇和100µg/ml庆大霉素(均来自Invitrogen公司)。DC:T细胞培养，1×10^4.DCs和1×10^5.T细胞在96孔圆底板(康宁)中200µl培养，在RPMI 1640培养基中37℃孵育4天。将分离的DC与1µM蛋白(HA)孵育，制备多肽包被DC_533–541）在37℃下为1小时，然后在用T细胞共培养之前去除2×洗涤以除去任何游离肽。

收养转移

纯化脾原始CL-4 Tg CD8⁺用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE;分子探针，eugene或）标记T细胞，如前所述[8]．总共1-5×10^6.CFSE-labeled CD8⁺T细胞是i.v.注射到你错配的Congenic小鼠的尾静脉中。以后用流感病毒感染受体小鼠。

抗体

以下单克隆抗体(mAb)购自BD- biosciences (BD) (San Diego, CA)或eBiosciences (eBio) (San Diego, CA)(除非声明)，偶联到FITC, PE, PE- cy7, PerCP-Cy5.5, APC, APC- alexa740或Biotin: MHC II类(I-A^D.，AMS-32-1），MHC级I（H-2K^D.，SF1-1.1），GR-1（RB6-8C5），TCRβ（H57-597），CD1D（1B1），CD4（L3T4），CD8α（53-6.7），CD11a（2D7），CD11b（M1 / 70）那CD11C.（HL3), CD19 (1D3), CD40 (3/23), CD43 (S7), CD43 (1B11), CD45 (30-F11), B220 or CD45R (RA3-6B2), CD80 (16-10A1), CD83 (Michel 17), CD86 (GL-1), CD115 (AFS98), DX5 (HMα2), B7-H1 (MIH5), B7-DC (TY25), β7 integrin (M293), ICOSL or B7-H2 (HK5.3), Granzyme B (GB12, Caltag), IFN-γ (XMG1.2), TNF-α (MP6-XT22), IL-4 (BVD4-1D11), IL-10 (JES5-16E3),Ki-67 (MOPC-21), CCR7 (EBI-1), SiglecF (E50-2440), F4/80 (Cl:A3, Caltag), CD103-Alexa-Fluor-647 (2E7, Biolegend, San Diego, CA), mPDCA (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), isotype control antibodies. Anti-mouse CD16/32 used for Fc receptor blocking was isolated and purified in our laboratory. For biotinylated mAbs, samples were incubated with streptavidin (SA)-RPE, SA-APC or SA-APC-Cy7.

流式细胞术分析和细胞内染色

用2.4g 2封闭细胞悬浮液，然后用特定的mAb或同种型对照孵育25分钟。对于表面标记染色，细胞在面部溶液（BD）中固定。用于细胞内细胞因子染色，从而获得的细胞在体外用合成肽孵育4-5小时的培养物（HA_533–541）对于CD8.⁺T细胞与thy不匹配的脾细胞作为额外的APC，或使用50 ng/ml PMA和750 ng/ml碘霉素(均来自Sigma)作为CD4⁺在37℃下在组织培养箱中存在蒙塞蛋白（BD）的T细胞。在表面染色25分钟后，在相应的荧光标记的抗体混合物中，细胞被重悬于Cytofix / cytoperm溶液（BD）中，并且根据制造商的方案进行细胞内细胞因子染色。在表面染色后直接检测颗粒酶B.对于核衣壳（NP）病毒蛋白，小鼠单克隆抗NP抗体（克隆H16，来自Walter Gerhard博士，Wistar Institute，Pa）的鉴定，根据制造商的指示并用于细胞内染色NP。对于KI-67染色，表面染色的细胞最初在1×结构溶液中固定，然后在室温（RT）下使用1×PUMI II溶液（BD）渗透15分钟。将固定/渗透细胞与PE标记的抗KI-67或同种型匹配的MAb（Bd）温育在室温下另外30分钟。在Facscalibur或Facscanto流式细胞仪（BD，山景，CA）上进行流式细胞术，并使用Flowjo（树星）分析数据。

BrdU标记和检测

通过I.P给予1mg /250μlBrdu的小鼠。流感病毒感染当天注射，并在日常变化中连续喂食饮用水（0.4mg / ml）。制备组织细胞用于细胞表面抗体AB标记，并根据制造商的说明书（BD）使用BD Fastimmune Brdu试剂盒进行Brdu染色。

统计数据

一个双尾未配对的学生T.测试用于分析组之间平均值的差异。使用GraphPad Prism3软件程序进行Macintosh进行这些统计分析。所有结果都表示为平均值±SD。P <0.05的值被认为是统计学意义。

支持信息

图S1。

正常肺中CD11c +细胞的表征。（a）基于流式细胞术的RDC亚群的分类。肺悬浮液中的造血原始细胞（面板A）鉴定为CD45 +（面板B）。在CD11C +细胞（面板C）中，排除高度自动荧光肺泡巨噬细胞（AM）[SSCHIMHC II-（PA1S D）]和B220 +血浆致细胞DC（PDC - MPDCA-1 + GR-1 +，面板E）进一步分析。剩余的肺白细胞进一步分为三个子集;CD103 + RDC（面板F），CD103-CD11BHIMHC II +/-（MODC，Panel G）和CD103-CD11BHIMHC IIHI（CD11BHI RDC，Panel H）。（b）鉴定肺部。来自正常肺的单细胞悬浮液用特异于CD45，CD11C，SigleCF和MHC II特异的MAb鸡尾酒。将CD45 + CD11C +细胞用于SIGECF表达（顶板）和SSC特性（底板）以及MHC II表达。 (C) Diagrams depicting the cellular composition of the CD11c+ cells in the single cell lung suspensions (mean±SD; n = 5). (D) Surface marker expression on subsets of RDC. Lung-residing DC subsets – CD103+ RDC (top), CD11bhi RDC (middle), and MoRDC (bottom) – are examined at d0 (open) or d2 p.i. (gray) for surface expression of various markers tested. Vertical lines (□) indicate the median values of isotype-matched control antibodies (black) for surface marker staining.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S001

气管无名动脉瘘管的(18.84 MB)

图S2。

识别MLN引流肺中DC亚群的策略。(A-C)确定未感染或流感感染小鼠MLN中DC亚群的门控策略从未感染(A列)或i.n.感染野生型(wt, B列)或B细胞缺陷(C列)小鼠的MLN中分离的总白细胞，在d3 p.i.用特异性TCRβ、CD11c、CD11b、B220、CD103和MHC II的单克隆抗体鸡尾酒染色。T细胞首先识别CD11c+细胞(第i行)。随后，TCRβ-CD11c+细胞(第ii行)进一步分析B220和MHC ii的表达。TCRβ-CD11c+B220−细胞(排iii)进一步检测CD11b和MHC II的表达，将它们分为两组:MHC II−/lo和MHC IIhi(排iv)。MHC II−/lo部分的细胞可分为Gr-1+ MoDC(组III)和Gr-1−MoDC(组v)。最后，根据CD103和CD11b的表达，将高表达MHC II的细胞进一步分为两个亚组;CD11bhiCD103−识别为“CD11bhi DC”(组II)， CD11b+/−CD103+细胞为“CD103+ DC”(组I)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S002

气管无名动脉瘘管的(11.48 MB)

图S3。

ln -驻留CD8αα+ DC的鉴定及表型特征。如前所述，在感染流感病毒后的指示天，经酶解从感染小鼠的MLN中释放出总LN细胞[2]那[7]．用特异于CD11C，CD11B，CD103，CD8α和MHC II（A）或辅助表面标记物（B）的混合物染色释放的单细胞悬浮液。（a）检查CD11chimHC IIINT（R1）以表达CD8α和CD11b。在未感染和受感染的动物的节点中鉴定了代表正品LN驻留CD8α+ DC子集的R1栅极的CD8αHI群。还检查了CD11CMED-HIIHI（R2），用于表达CD8α和CD11b或CD103和CD11b。值得注意的是，随着感染的进展（比较3 dpi至0 dpi，逐渐增加，表达CD103 +和CD11bhi DC子集的CD8α逐渐增加（比较3 dpi至0 dpi）。（b）CD8αα+ LNDC表达较高水平的CD8α和CD11c，CD80，CD83，CD86，B7-H1，B7-DC和MHC II的CD80，CD83，CD86，B7-H1，B7-DC和MHC II的CD103 +或CD11BHI DC在分析时分析D.3.p.i.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S003

（5.31 MB TIF）

图S4。

感染小鼠MLN中DC子集的形态学和表型特征。D3 P.I在流感感染小鼠MLN中累积的DC子集。被识别如下图S2用所示的MAb染色后，检查其大小（FSC），细胞内复杂性（SSC）和表面制造机表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S004

气管无名动脉瘘管的(2.76 MB)

图S5。

体内和体内感染CD103 + RDC的活性病毒核蛋白合成。（a）CD103 + RDC是从未感染的肺部分选的单细胞，并在体外与A / PR / 8孵育1小时。在额外的18小时孵育后，固定CD103 + RDC并检查共聚焦显微镜下的MHC II（绿色，左）和病毒NP（红色，右）的细胞内表达。（b）给出A / PR / 8感染的小鼠I.N.在d2 p.i的FITC-OVA。和MLN在D3 P.I中切除。并冷冻免疫荧光研究。通过流式细胞术鉴定MLN中的移民CD103 + RDC（NP +和FITC-OVA +）（参见图3a和b)，并在共聚焦显微镜下检测细胞内NP(红色)表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S005

气管无名动脉瘘管的(12.15 MB)

图S6。

CD11bhi DC和CD103+ DC在流感感染小鼠MLN中的积累是由于相应的对应物在肺中迁移的结果，并依赖于CCR7。(A)感染小鼠MLN中DC亚群的细胞分裂史。小鼠感染流感病毒后，在感染第3天饮水中给予BrdU(不含BrdU的灰色对照)。MLN中BrdU+ DC亚群的代表性分析显示(n = 4)。(B)肺内CD11bhi和CD103+ RDC是流感感染小鼠MLN中相应DC亚群积累的必要条件。DTR小鼠在感染流感病毒前一天注射DTx或PBS。在d3 pi .，在感染小鼠的MLN中发现DC亚群(见图4 e），并描绘了感染的DTR小鼠MLN中的DC子集和总细胞的绝对数量（平均值±SD; n = 4-8只小鼠/组）。（C和D）CCR7缺陷小鼠未能显示CD11BHI DC和CD103 + DC，但不是GR-1 + MODC，在流感感染的小鼠中的累积。CCR7 + / +或CCR7 - / - 小鼠I.N.在感染小鼠MLN中的累积直流亚群中检查较早的感染3d的3d。描绘了感染小鼠MLN中的鉴定（c）和DC子集的数量和总细胞（d）（平均值±sd; n = 3-5只小鼠）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S006

气管无名动脉瘘管的(12.90 MB)

图S7。

在感染小鼠MLN中的抗原特异性幼稚CD8 + T细胞增殖的速度。小鼠（Thy1.1）接受CFSE标记的Thy1.2 Cl-4 CD8 + T细胞是I.N.用流感病毒感染并检查在MLN的MLN中的NaïveCl-4 CD8 + T细胞的增殖型（CFSE内容物的稀释含量）。显示的数据在Thy1.2 + CD8 + T细胞上栅。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S007

气管无名动脉瘘管的(0.36 MB)

图S8。

ccr7缺陷小鼠在支持ccr7活性naïve CL-4 tg CD8+ T细胞增殖时受损。(A) CCR7−/−小鼠(Thy1.2)接种CFSE标记的Thy1.1 CCR7+/+ CL-4 CD8+ T细胞4天前感染CCR7−/−小鼠(Thy1.2)，并检测MLN中未接种的CL-4 CD8+ T细胞中CFSE含量的扩增和稀释程度。所示数据是针对Thy1.1+ CD8+ T细胞的门控，并描述了3个独立实验的代表。(B)当流感病毒通过静脉途径传递时，宿主LNDC上的CCR7缺陷显示出与CCR7+/+ LNDC相比激活CCR7受体naive CD8 T细胞的能力。WT或CCR7−/−小鼠给予cfse标记的Thy-mismatched CCR7+/+ A/PR/8 HA-specific TCR tg naive CD8 T细胞，24小时后经静脉途径感染A/PR/8。d3 p.i检测mln和脾脏中ha特异性CD8 T细胞的分裂和增殖情况。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S008

（3.05 MB TIF）

图S9。

感染小鼠MLN中DC子集的4路细胞分选。（A-D）单细胞由I.N的MLN制备。用流感病毒前3天感染老鼠。通过如下所述，使用指向TCRβ，CD19或DX5的磁珠的磁性珠粒耗尽来自MLN，T，B和NK细胞的总白细胞的CD11C +细胞。材料和方法. 用CD11c、B220、CD11b、CD103或MHC II特异性单克隆抗体混合物对含有富集CD11c+细胞的所得部分进行表面染色，并进行基于FACS的四向细胞分选。DC通过CD11c表达进行鉴定。CD11c+细胞最初显示为B220与MHC II，用于识别B220+pDC（A）。然后显示B220-CD11c+细胞的CD11b与MHC II，根据MHC II表达水平，这导致两个不同的群体；CD11bhiMHC IIlo与CD11blo hiMHC IIhi细胞。前者主要由Gr-1+DC组成（参见图。S2)，并分类为Gr-1+ MoDC (B)。随后，根据CD103表达进一步将MHC IIhi细胞分为两组;CD103−直流(C)和CD103 +直流(D)。MHC IIhiCD103−细胞也基本上CD11bhi CD11bhi直流(C)和排序。排序细胞的纯度是由流式细胞术使用各自post-sorted DC的子集,从而导致超过97%的同质性实验(右面板)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S009

（5.38 MB TIF）

图S10。

通过肽脉冲刺激的Cl-4 CD8 + T细胞的增殖型PDC或GR-1 + MODC。（A和B）B220 + PDC（A）或GR-1 + MODC（B）将3天从传染性流感病毒前面的感染小鼠的MLN分类，并用HA533-541肽（开放）或未治疗（填充）1小时。然后将Pdc或GR-1 + ModC与培养物中的CFSE标记的Na 4 Cl-4 CD8 + T细胞共培养。第4天通过流式细胞术检查Cl-4 CD8 + T细胞中CFSE内容物的稀释。描述了3个独立实验的代表。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S010

（1.34 MB TIF）

图S11。

CD11bhi或CD103+ DC亚群刺激CD4+ T细胞产生的效应细胞因子(A-C)将早于感染流感病毒3天的i.n.小鼠MLN中的CD11bhi DC(上图)和CD103+ DC(下图)与cfse标记的ha特异性naïve TCR tg TS1 CD4+ T细胞共培养。4天后，在莫能菌素存在下，PMA/离子霉素刺激CD4+ T细胞4小时，并在细胞内染色观察IFN-γ (A)、IL-4 (B)或IL-10 (C)分泌情况。描述了3个独立实验的代表。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S011

气管无名动脉瘘管的(2.01 MB)

图S12。

CD8αα+ LNDC在刺激Naïve病毒特异性CD8 + T细胞时比移民CD103 +和CD11BHI RDC效率低。（A) The indicated DC subsets were isolated, after enzymatic treatments, from the MLN of mice infected 3 d earlier with influenza virus (A/PR/8) [i.e., Gr-1+ MoDC (i), LN-resident CD8αα+ DC (ii), CD11bhi DC (iii) and CD103+ DC (iv)]. The DC subsets were co-cultured with CFSE-labeled HA533–541 (A/PR/8/34)-specific naïve TCR tg CD8+ T cells (Cl-4) for 4 days. Proliferation profile and total recovery (see inserts) of viable CD8+ T cells stimulated by the MLN-derived DC subsets are depicted. (B) As a control in companion experiments, the DC subsets used in (A) were pulsed with HA210–219 (A/JAPAN/57) and were subsequently co-cultured for 4 days with CFSE-labeled HA 210–219-specific naïve TCR tg CD8+ T cells (Demi-4). These CD8+ TCR tg T cells do not cross-react with the A/PR/8/34 hemagglutinin.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004204.S012

（7.09 MB TIF）

致谢

我们感谢S. Gill寻求编辑手稿和Braciale实验室的成员以获得有用的讨论。

作者的贡献

构思设计实验:TSK TJB。完成实验:TSK。分析数据:TSK TJB。提供试剂/材料/分析工具:TJB。撰写论文:TSK TJB。

参考

1.Banchereau J，Steinman RM（1998）树突细胞和免疫力的控制。自然392：245-252。
- 查看文章
- 谷歌学术
2.Henri S, Vremec D, Kamath A, Waithman J, Williams S, et al.(2001)小鼠淋巴结的树突状细胞群。J Immunol 167: 741-748。
- 查看文章
- 谷歌学术
3.Villadangos JA, Heath WR(2005)脾脏和淋巴结树突状细胞的生命周期、迁移和抗原呈递功能:Langerhans细胞范式的局限性。Semin Immunol 17: 262-272。
- 查看文章
- 谷歌学术
4.努力乐队Pa，upham jw，Holt Pg（2003）气道树突细胞：呼吸道免疫稳态和免疫的协调人。APMIS 111：741-755。
- 查看文章
- 谷歌学术
5.Forster R，Schubel A，Breitfeld D，Kremmer E，Renner-Muller I等。（1999）CCR7通过建立次级淋巴结器官中的官能微环境坐标坐标。细胞99：23-33。
- 查看文章
- 谷歌学术
6.Sallusto F，Lanzavecchia A（2000）通过分析趋化因子受体表达来了解树突细胞和T淋巴细胞流量。免疫型Rev 177：134-140。
- 查看文章
- 谷歌学术
7。Belz GT, Smith CM, Kleinert L, Reading P, Brooks A，等(2004)肺感染病毒后，不同的迁移和非迁移树突状细胞群参与MHC i类限制性抗原呈递。美国国立科学院科学研究所101:8670-8675。
- 查看文章
- 谷歌学术
8。Lawrence CW, Braciale TJ(2004)肺流感病毒感染过程中未感染的病毒特异性CD8+ T细胞的活化、分化和迁移。J Immunol 173: 1209-1218。
- 查看文章
- 谷歌学术
9。Diacovo TG，Blasius AL，Mak TW，Cella M，Colonna M（2005）控制干扰素产生细胞募集到淋巴结的粘附机制。J Exp Med 202:687–696。
- 查看文章
- 谷歌学术
10.Yoneyama H，Matsuno K，Toda E，Nishiwaki T，Matsuo n等。（2005）血浆纤维素DCS有助于淋巴结DC诱导抗HSV CTL。J Exp Med 202：425-435。
- 查看文章
- 谷歌学术
11.Martin P，Ruiz SR，del Hoyo GM，Anjuere F，Vargas HH等（2002年）小鼠乳腺肿瘤病毒感染期间，淋巴结树突状细胞数量的显著增加是通过依赖CD62L的血源性DC募集发生的。血液99:1282-1288。
- 查看文章
- 谷歌学术
12.Leon B, Lopez-Bravo M, Ardavin C(2007)感染部位形成的单核细胞来源的树突状细胞控制对利什曼原虫的保护性T辅助细胞1的诱导。免疫26日:519 - 531。
- 查看文章
- 谷歌学术
13.Randolph GJ，Inaba K，Robbiani DF，Steinman RM，Muller Wa（1999）将吞噬单核细胞分化到体内淋巴结树突细胞中。豁免权11：753-761。
- 查看文章
- 谷歌学术
14.Le Borgne M，Etchart N，Goubier A，Lira SA，Sirard JC等。（2006）通过CCR6 / CCL20迅速募集成上皮组织的树突细胞负责体内CD8 + T细胞的杂交。免疫24：191-201。
- 查看文章
- 谷歌学术
15.den Haan JM, Lehar SM, Bevan MJ (2000) CD8(+)而不是CD8(−)树突状细胞交叉素细胞毒性T细胞。J Exp Med 192: 1685-1696。
- 查看文章
- 谷歌学术
16.Pooley JL, Heath WR, Shortman K(2001)前沿研究:静脉可溶性抗原通过CD8−树突状细胞呈现给CD4 T细胞，而通过CD8+树突状细胞交叉呈现给CD8 T细胞。J Immunol 166: 5327-5330。
- 查看文章
- 谷歌学术
17。(2003)令人屏息:树突状细胞在哮喘发病机制中的作用。Nat Rev Immunol 3:994 - 1003。
- 查看文章
- 谷歌学术
18。von Garnier C, Filgueira L, Wikstrom M, Smith M, Thomas JA, et al.(2005)解剖位置决定了树突状细胞和其他apc在呼吸道的分布和功能。中国免疫学杂志(英文版)
- 查看文章
- 谷歌学术
19。song SS, Fu SM, Rose CE Jr, Gaskin F, Ju ST, et al.(2006)表达Langerin和紧密连接蛋白的肺CD103 (alpha)-beta7整合素阳性上皮树突状细胞群。J Immunol 176: 2161-2172。
- 查看文章
- 谷歌学术
20。Wikstrom ME，Stumbles PA（2007）小鼠呼吸道树突状细胞亚群和吸入抗原的免疫命运。免疫细胞生物学85:182–188。
- 查看文章
- 谷歌学术
21。Beaty SR，Rose Ce JR，Sung SS（2007）肺结气肺CD11bhigh树突细胞和过敏性肺炎的不同和有效的趋化因子。J免疫素178：1882-1895。
- 查看文章
- 谷歌学术
22.Del Rio Ml，Rodriguez-Barbosa Ji，Kremmer E，Forster R（2007）CD103和CD103 +支气管淋巴结树突树突树突细胞专门用于呈现和交叉向CD4 +和CD8 + T细胞呈现无害的抗原。J免疫素178：6861-6866。
- 查看文章
- 谷歌学术
23.Legge KL, Braciale TJ(2003)呼吸道树突状细胞向区域淋巴结的加速迁移仅限于肺部感染的早期。免疫18:265 - 277。
- 查看文章
- 谷歌学术
24.CD4效应T细胞亚群在流感反应中的异质性、迁移和功能。J Exp Med 196: 957-968。
- 查看文章
- 谷歌学术
25.Allan Rs，Smith Cm，Belz Gt，van Lint Al，Wakim LM等。（2003）CD8Alpha +树突细胞诱导的表皮病毒免疫，但不是朗格汉斯细胞。科学301：1925-1928。
- 查看文章
- 谷歌学术
26.Allan Rs，Waithman J，Bedoui S，Jones Cm，Villadangos Ja，等。（2006）迁移的树突细胞转移抗原对淋巴结 - 常规树突细胞群进行有效CTL引发。免疫25：153-162。
- 查看文章
- 谷歌学术
27.史蒂文斯WW，金TS，Pujanauski LM，Hao X，Braciale TJ（2007）通过流式细胞术检测鼠呼吸道中嗜酸性粒细胞的检测和定量。J免疫酚方法327：63-74。
- 查看文章
- 谷歌学术
28.Vermaelen K，Pauwels R（2004）通过流式细胞仪评估小鼠肺树突状细胞和巨噬细胞群的准确和简单地辨别：方法论和新见解。cytometry a 61：170-177。
- 查看文章
- 谷歌学术
29。Moron G，Rueda P，Casal I，Leclerc C（2002）CD8alpha-CD11b+树突状细胞向CD8+T细胞呈现外源性病毒样颗粒，随后表达CD8alpha和CD205分子。医学杂志195:1233-1245。
- 查看文章
- 谷歌学术
30.什么是trogocytosis，它的目的是什么?Nat Immunol 4: 815。
- 查看文章
- 谷歌学术
31。(1)呼吸道树突状细胞亚群对流感病毒感染的应答差异。J病毒82:4908-4919。
- 查看文章
- 谷歌学术
32。刘k，kekow c，liu x，yao k，hoh j等。（2007）小鼠外周淋巴结器中树突细胞的起源。NAT IMMUNOL 8：578-583。
- 查看文章
- 谷歌学术
33.Jung S, Unutmaz D, Wong P, Sano G, De los Santos K, et al.(2002)体内CD11c(+)树突状细胞耗损通过外源性细胞相关抗原消除CD8(+) T细胞的启动。免疫17:211 - 220。
- 查看文章
- 谷歌学术
34.Hintzen G，Ohl L，Del Rio Ml，Rodriguez-Barbosa Ji，Pabst O，等。（2006）对无害吸入抗原的耐受性诱导CCR7依赖性树突细胞介导的支气管淋巴结的抗原输送。J免疫素177：7346-7354。
- 查看文章
- 谷歌学术
35.Yoon H, Legge KL, Sung SS, Braciale TJ(2007)肺病毒感染后引流淋巴结中CD8+ T细胞的连续激活。J Immunol 179: 391-399。
- 查看文章
- 谷歌学术
36.BEVAN MJ（1976）在体内引发期间在细胞毒性T细胞水平下在H-2不同刺激细胞上引入的次次抗原。J免疫素117：2233-2238。
- 查看文章
- 谷歌学术
37.Carbone FR, Bevan MJ (1990) i类限制在体内加工和呈现外源性细胞相关抗原。J Exp Med 171: 377-387。
- 查看文章
- 谷歌学术
38.病毒免疫与自我耐受的交叉表现。Nat Rev Immunol 1:26 - 134。
- 查看文章
- 谷歌学术
39.Villadangos Ja，Schnorrer P（2007）体内树突细胞亚群的内在和合作抗原呈现功能。NAT Rev Immunol 7：543-555。
- 查看文章
- 谷歌学术
40.Grayson MH（2006）肺树突状细胞与炎症反应。安过敏性哮喘免疫96:643-651。测验652-643678。
- 查看文章
- 谷歌学术
41.Vermaelen Ky，Carro-Muino I，Lambrecht Bn，Pauwels Ra（2001）特定的迁移树突细胞从气道到胸腔淋巴结的急流抗原。J Exp Med 193：51-60。
- 查看文章
- 谷歌学术
42。Yoneyama H，Matsuno K，Zhang Y，Nishiwaki T，Kitabatake M，et al.（2004）浆细胞样树突状细胞前体通过高内皮微静脉招募到炎症淋巴结的证据。国际免疫组织16:915–928。
- 查看文章
- 谷歌学术
43。次级淋巴器官中的Cyster JG（1999）趋化因子和细胞迁移。科学286：2098-2102。
- 查看文章
- 谷歌学术
44。McWilliam As，Nelson D，Thomas Ja，Holt PG（1994）快速的树突式细胞招聘是粘膜表面的急性炎症反应的标志。J Exp Med 179：1331-1336。
- 查看文章
- 谷歌学术
45。夏W，PINTO CE，Kradin RL（1995）IA +树突状细胞的抗原呈递活动在通过可溶性抗原的气道攻击后动态地从肺到淋巴结。J Exp Med 181：1275-1283。
- 查看文章
- 谷歌学术
46.Belz GT, Bedoui S, Kupresanin F, Carbone FR, Heath WR(2007)组织来源的树突状细胞对记忆性CD8+ T细胞的最小激活有利于对原始CD8+ T细胞的刺激。Nat Immunol 8: 1060-1066。
- 查看文章
- 谷歌学术
47.Geurtsvankessel Ch，Willart Ma，Van Rijt Ls，Muskens F，Kool M等。（2008）来自肺部流感病毒的清除取决于迁移的Langerin + CD11b-但不是血浆胸腺细胞树突细胞。J Exp Med 205：1621-1634。
- 查看文章
- 谷歌学术
48.Bursch LS, Wang L, Igyarto B, Kissenpfennig A, Malissen B, et al.(2007)一种新的Langerin+树突状细胞群的鉴定。J Exp Med 204: 3147-3156。
- 查看文章
- 谷歌学术
49.Burgdorf S，Kautz A，Bohnert V，Kurts C（2007）Kurts C（2007）CD4和CD8 T细胞活化中的抗原摄取和细胞内路由的明显途径。科学316：612-616。
- 查看文章
- 谷歌学术
50。Dudziak D, Kamphorst AO, Heidkamp GF, Buchholz VR, Trumpfheller C, et al.(2007)体内树突状细胞亚群的差异抗原加工。科学315:107 - 111。
- 查看文章
- 谷歌学术
51。Serbina NV，Salazar-Mather TP，Biron Ca，Kuziel WA，Pamer Eg（2003）TNF / Inos-生成的树突状细胞介导针对细菌感染的先天免疫防御。免疫19：59-70。
- 查看文章
- 谷歌学术
52。Lawrence CW, Ream RM, Braciale TJ(2005)原发性肺部流感病毒感染过程中CD8+ T细胞的频率、特异性和扩增位点。J Immunol 174: 5332-5340。
- 查看文章
- 谷歌学术
53。Jelley-Gibbs DM，棕色DM，DIBBLE JP，Haynes L，Eaton Sm，等。（2005）意外的较长的流感抗原呈递促进CD4 T细胞记忆产生。J Exp Med 202：697-706。
- 查看文章
- 谷歌学术
54。Zammit DJ，Turner DL，Klonowski Kd，Lefrancois L，Cauley LS（2006）流感病毒感染后残留的抗原介绍影响了CD8 T细胞激活和迁移。免疫24：439-449。
- 查看文章
- 谷歌学术
55。Geiss GK，MC，Bumgarner Re，Hammersmark E，Cunningham D等人。（2001）流感病毒对细胞途径对细胞途径的全局影响是由复制依赖和依赖事件的介导的。J Virol 75：4321-4331。
- 查看文章
- 谷歌学术