介绍

肺纤维化可因多种原因,包括肺损伤、环境吸入粒子和毒素,化疗,系统性自身免疫性疾病,或作为特发性实体形式的特发性间质性肺炎(IIP)[1]- - - - - -[4]。特发性肺纤维化(IPF),最常见的IIP,代表了一种进步和致命的障碍与未解决的发病机理和反应迟钝,目前可用的治疗方法[5]。正常的肺结构的畸变IPF temporo-spatially异构组织学是显而易见的,包括正常的实质、温和的间质炎症由于单核细胞浸润,隔有牙龈成纤维细胞灶纤维化,形成蜂窝状[6],[7]。

纤维母细胞病灶代表IPF的病灶,激活myofibroblasts构成总量时,促进ECM过度沉积[7]。纤维母细胞的发生焦点代表一个重要的预后因素,因为它们的数量已经在IPF与生存相关[8]。纤维母细胞病灶发生在牙龈层,接近肺泡上皮细胞损伤和修复领域,表明受损epithelial-mesenchymal相声有助于IPF的病理学[8],[9]。事实上,它也承认,重复的伤害和后续修复肺泡上皮II型(ATII)细胞,炎症的存在与否,是一个关键的IPF发病机理,导致异常生长因子激活及延续纤维化的转换[10]。尽管一些可溶性介质,如转化生长因子(TGF) -β1或白介素(IL) 1β,一直在IPF指定一个明确的致病作用,实验模型(9、10),治疗选择中和他们的活动尚未成功的在临床使用。

Wnt家庭是一个大家庭的高度保守的分泌生长因子的关键器官发展,器官衰竭过程通常重现。最好的Wnt信号通路是β-catenin-dependent特征,或规范,Wnt信号通路[11]- - - - - -[13]。这里,在缺乏活跃的Wnt配体,β-catenin由与轴蛋白磷酸化的互动,观察腺上皮增生息肉病杆菌(APC),和糖原合酶激酶(Gsk) 3β,随后和退化。在Wnt配体的存在,两种截然不同的膜受体,使卷曲的(Fzd)或低密度脂蛋白受体相关蛋白(含)5和6,在配体激活绑定。详细,Wnt刺激导致Lrp6 Gsk-3β和酪蛋白激酶的磷酸化γ在其胞质区域,导致轴蛋白的招聘。随后,β-catenin磷酸化减毒,其降解抑制,和积累β-catenin经历核易位,调节目标基因表达与成员的互动T-cell-specific转录因子/淋巴enhancer-binding (Tcf (Lef)家庭因素[11],[12]。

重要的是,增加核β-catenin染色最近被报道在IPF组织部分[14],表明增加Wnt信号。此外,无偏微阵列屏幕也显示增加的Wnt目标基因的表达,如基质金属蛋白酶7 (Mmp),或分泌frizzled-related蛋白质在IPF (Sfrp) 2[15]- - - - - -[17]。因此,我们假设在IPF规范Wnt信号异常激活,关键技术发展活跃的项目在这种慢性疾病。为此,我们实现我们的目标说明表达,本地化和IPF Wnt /β-catenin通路的活动。

结果

最初,我们试图量化mRNA的表达规范Wnt /β-catenin信号组件移植捐赠者和IPF患者的肺组织样本中使用实时定量rt - pcr (q)。中所描绘的一样图1一个,规范Wnt配体不定地表达人类的肺。Wnt1 2、3和7 b在相似的水平在正常肺组织中都有表达,虽然Wnt10b只是小小的表达。在IPF肺标本Wnt1 7 b,和10 b mRNA水平显著调节(log-fold改变为1.19±0.43,1.05±0.43,1.58±0.59,分别),而Wnt3a显著下调(log-fold改变−1.93±0.65)(图1一个)。

接下来,我们分析了常见的Wnt受体和共受体的表达。所示图1 b、最丰富的受体在人类肺癌Fzd1和4,和共同受体Lrp5 6,但是他们的表现在控制和IPF相似的肺。有趣的是,Fzd2和3表示在低水平控制以及IPF肺,但显著增加在IPF (log-fold改变1.04±0.24,1.41±0.31,分别)(图1 b)。

主要规范Wnt信号传感器Gsk-3β和β-catenin都表示在正常和纤维化肺组织,显著增加表达的β-catenin IPF (log-fold改变0.98±0.28)(图1 c)。除了Tcf1, Tcf / Lef家族的所有成员的转录因子表达在正常和纤维化肺组织。Lef1显著调节在IPF (log-fold改变0.85±0.34)(图1 c)。

我们接着本地化细胞类型的能力Wnt配体分泌,通过免疫组织化学方法作为评估Wnt1和配体3,和细胞类型的能力Wnt信号,通过免疫组织化学方法评估的β-catenin Gsk-3β,捐赠者和IPF肺组织(图2,3,4,5)。Wnt1表达主要是在支气管和肺泡上皮,与强大的肺泡上皮染色II型(ATII)细胞(图2)。此外,Wnt1表达于血管平滑肌细胞(图2 a,上部面板)。在IPF (图2 b),在增生性ATII Wnt1染色观察细胞和支气管上皮细胞。一个顶端的染色模式Wnt1在IPF观察支气管上皮细胞中,建议增加Wnt1的分泌。有趣的是,Wnt1表达的也是在IPF组织内皮细胞(图2 b中,较低的面板中,箭头)。Wnt3a蛋白表达主要是在ATII发现细胞(图3 a, b,较低的面板)和选定的支气管上皮细胞纤毛(图3 a、b上面板)捐赠以及IPF的肺部组织。

然后我们分析蛋白表达模式的β-catenin和Gsk-3β(图4和5分别)。强大的膜和细胞质β-catenin表达式在支气管上皮和ATII细胞,以及供体肺组织内皮细胞(图4中,箭头)。重要的是,在IPFβ-catenin表达式在细胞质膜和增强,明确核染色观察单个细胞(图4 b中,箭头)。强β-catenin表达在细胞增生性ATII注意到,特别是在地区bronchiolization (图4 b),如通过免疫组织化学方法评估。β-catenin Gsk-3β显示一个非常相似的表达模式,主要在支气管上皮和ATII细胞染色,以及供体肺组织内皮细胞(图5 a,箭头)。在IPF肺,激烈的染色观察支气管上皮增生性ATII基底细胞(图5 b)。综上所述,Wnt /β-catenin系统在很大程度上是表达在支气管和肺泡上皮细胞在正常和IPF组织。

进一步证实了这些结果,我们量化特异性基因表达Wnt /β-catenin信号组件的主要人类ATII细胞和成纤维细胞来源于IPF患者或移植捐赠者,使用中存在(图6)。中所描绘的一样图6,我们观察到mRNA的表达增加Wnt7b 10 b ATII细胞IPF患者。Wnt3a IPF ATII细胞中表达下调,而Wnt1水平保持不变。此外,我们观察到显著增加受体Fzd3 mRNA水平和细胞内信号分子Gsk-3β,β-catenin, Lef1 IPF ATII细胞(图6 b、6 c分别)。有趣的是,我们经常观察到的高表达水平的这些组件在初级ATII细胞与成纤维细胞(数据未显示),从而证实了我们的定位分析。总之,这些数据显示所有必需的表达Wnt组件在肺,及其重要的upregulation IPF,主要在支气管和肺泡上皮细胞。

准确地评估,是否在IPF /β-catenin Wnt信号通路被激活,我们进行免疫印迹分析phospho-Gsk-3βphospho-Lrp6,β-catenin。提出了在图7我们观察磷酸化的增加,在IPF Gsk-3βLrp6,。这是符合β-catenin总额的增加表达(图7),表明激活Wnt /β-catenin信号。接下来,我们分析了良好的Wnt目标基因的表达纤连蛋白(Fn) 1,基质金属蛋白酶7 (Mmp),细胞周期蛋白D1在IPF肺。中所描绘的一样图7 b目标,所有这些Wnt基因调节IPF肺样本,与移植捐赠样本。

然后我们试图调查生物效应引起Wnt配体的主要细胞类型参与IPF发病机理。为此,我们评估增殖,以及(myo)激活成纤维细胞和胶原蛋白沉积在A549肺上皮细胞和NIH-3T3成纤维细胞,分别。使用Tcf / Lef-driven报告基因分析,我们首先证明了Wnt3a规范化Wnt /β-catenin响应引起的,而Wnt7a没有(褶皱诱导8.96±1.59,0.89±0.09 Wnt3a和Wnt7a分别;图8)。此外,Wnt3a刺激导致了强烈的A549细胞增殖增加(268×10³×28±10³和119×10³±16×10³分别为Wnt3a和控制;图8 b)。

Wnt3a导致显著诱导Wnt目标基因的细胞周期蛋白D1和myofibroblast激活标记平滑肌肌动蛋白(Acta2)和fibroblast-specific蛋白质(Fsp) 1,作为评估中存在的Wnt3a——或者vehicle-treated成纤维细胞(图9)。与此同时增加胶原蛋白生产、评估Sircol化验,Wnt3a,类似的水平由于TGF-β1治疗(褶皱诱导3.07±0.3,2.6±0.2 Wnt3a和TGF-β1分别;图9 b)。这证实了I型胶原蛋白的免疫荧光染色成纤维细胞,证明增加胶原蛋白染色,以应对Wnt3a (图9 c)。相比之下,Wnt3a治疗并不影响成纤维细胞增殖(数据未显示),这表明Wnt配体特异性的方式引出profibrotic影响居民肺细胞。

讨论

IPF是最常见的特发性间质性肺炎。IPF展品目前治疗预后不良,反应迟钝,反映了我们有限的理解的基本机制和介质与进步的发病机理和致命的疾病[4],[5]。从历史上看,炎症过程被认为代表IPF的主要触发启动和进展。这种观点最近被质疑,由于无能IPF的抗炎治疗[10]。主要IPF目前讨论的关键病理生理事件包括重复性肺泡上皮细胞损伤,炎症的存在与否,受损epithelial-mesenchymal相声,随后myofibroblast激活成纤维细胞[10],[18]- - - - - -[20]。这些机制被激活异常的信号分子介导,驱动纤维化的过程,如TGF-β、IGF, PDGF或TNF-α[9],[20]。

的Wnt信号系统在这方面特别感兴趣,因为它构成发展活跃的途径,重新激活在慢性疾病病理组织重构的特征[11]- - - - - -[13],[21],[22]。无偏微阵列屏幕最近透露Wnt目标基因的过度表达,包括Wnt-induced信号通路蛋白(缕)1、基质金属蛋白酶7 (Mmp),或分泌frizzled-related蛋白质(Sfrp) 2、IPF肺[16],[17],[22]。此外,最近的一项研究局部β-catenin染色ATII的细胞核和IPF肺间质成纤维细胞[14]Wnt信号,暗示激活[23]。因此,我们假设在我们的研究中,规范化Wnt信号激活IPF肺,特别是在增生性ATII细胞,从而导致IPF疾病发展和进展。虽然这尚未yopougon成人肺、规范/β-catenin Wnt信号是已知的在肺癌发展起着关键作用,随着肺上皮特异性删除β-catenin防止远的形成,而不是近端航空公司[24]。此外,上皮细胞结构上的具体表现活跃β-catenin导致上皮细胞发育不良和异常上皮分化的老鼠[25]。

为此,我们进行了一个综合分析规范Wnt信号组件的信使rna和蛋白质水平,评估表达式,本地化,以及Wnt活性配体、受体、细胞内信号分子在IPF。我们证明所有的组成部分都是表达在人类肺癌,特别是局部肺泡和支气管上皮的正常,证明以及IPF肺中存在和免疫组织化学。肺匀浆以及Wnt配体和受体的特异性分析表明增加Wnt配体(比较的表达式图1和6),除了Wnt1。虽然IPF Wnt1增加肺匀浆,但不是IPF ATII监管的细胞,表明其他细胞类型,包括支气管上皮细胞或内皮细胞(图2),可以作为在IPF Wnt1表达的主要来源。

类似于Wnt配体,Gsk-3β和β-catenin增生性ATII细胞和细支气管上皮细胞中高度表达在IPF bronchiolization遗址。这表明,Wnt信号,驱动肺动脉以外上皮细胞上皮细胞增生[13]可能调节ATII细胞增生,增加了IPF的支气管上皮细胞增殖。连同我们的观察,Wnt配体主要是由肺上皮细胞分泌,这表明Wnt信号在成人肺启动上皮和自分泌和旁分泌的方式作用于上皮和间充质细胞,分别。虽然这被低估了的正常和病变的成人肺,它代表一个证据确凿的途径积极发展中肺[23]。

我们目前了解的功能相关性Wnt信号在肺上皮细胞在很大程度上是源自转基因动物模型。如果删除小鼠同源重组,Wnt5a不足导致远端航空公司的过度膨胀和抑制肺成熟,伴随着扩大intersaccular间隙隔间[26]。同样,Wnt7b围产期死亡原因的损失由于呼吸衰竭,随后的间叶细胞生长和血管发育受损,是由于有缺陷的气道上皮细胞自分泌和旁分泌Wnt信号[27]。在这里,我们也报告,Wnt配体诱导肺上皮细胞增殖和成纤维细胞激活和胶原蛋白合成(图8,9)。这些观察结果进一步支持适当监管的重要性Wnt信号正常epithelial-mesenchymal交互,并强调Wnt信号特异表达的影响疾病的特点是一个障碍,比如IPF。

在这项研究中,我们使用重组Wnt3a评估规范的功能影响Wnt信号在上皮细胞和成纤维细胞。当我们观察到的表达下降Wnt3a IPF匀浆和ATII细胞(图1和6),我们继续Wnt3a有以下原因:首先,Wnt3a一再报道强有力地刺激β-catenin-dependent Wnt信号体外[28],已经被公认为Wnt配体在体外刺激[11]。第二,Wnt3a是为数不多的Wnt配体可用在活跃和重组形式。其他Wnt配体中使用在体外研究,如Wnt1,通常由病毒转导中,或提供的形式条件媒体收获Wnt1 overexpressing细胞系[29],[30]。当我们试图定义规范Wnt信号时间的影响在我们的研究中,因此,我们选择继续Wnt3a刺激。

本研究的关键问题之一是是否不同的Wnt亚型,如Wnt1 Wnt3a,能够产生不同的影响,或者他们是否仅仅是不同时空的方式表达了肺部引起不同的表型,如果删除老鼠。一般来说,一个特定的生物效应引起的Wnt配体接触取决于不同的Wnt受体和信号分子的表达,不同的ECM glypicans等分子,但也存在Wnt抑制剂,如Dickkopfs、分泌卷曲的受体蛋白质,或Wnt抑制因子[31],[32]。第二,不同的Wnt配体的亲和力不同的特异性受体亚型已被证明编码信号[32]- - - - - -[34]。第三,Wnt /β-catenin之间的串扰信号与其他途径,如TGF-β通路,可能引起组织细胞类型特异的相关性的影响,IPF。最近感兴趣的,它表明,Wnt /β-catenin信号化合物轴蛋白和GSK-3影响TGF-β信号通过控制Smad3蛋白质的稳定性[35]。

我们还演示了IPF的β-catenin水平增加,这主要是局部支气管上皮增生性ATII细胞。相比之前的调查呈现增加核β-catenin在支气管上皮和ATII细胞染色,以及间质成纤维细胞[14],我们没有观察到广泛的核染色β-catenin使用免疫组织化学的研究。这可能是由于不同的抗体或组织准备在这两个研究中,但此外表明,Wnt激活在IPF比此前认为的更加微妙。这也表明,只有少数细胞在上皮细胞β-catenin内容负责Wnt信号,而大多数β-catenin分子内存在胞质和联系人信息[36],[37]。因此,生成更全面而简洁的IPF Wnt信号活动,我们试图把Wnt信号的表达和定位分析组件,搭配磷酸化Lrp6 Gsk-3β,分析与定量Wnt目标基因的表达分析。

总之,我们报告增加功能在IPF Wnt信号,记录的增加磷酸化Lrp6 Gsk-3β,最近被证实存在的最敏感指标Wnt在组织的部分活动[38],[39]。我们还观察到增加Wnt目标基因的表达细胞周期蛋白D1, Mmp 7,纤连蛋白1。特别是,Mmp 7、纤粘连蛋白1最近被分配一个诱发肺纤维化作用并显示在间质成纤维细胞和ATII细胞表达[40],[41]。Wnt信号通路存在可能因此小说致病性系统重新启动在慢性组织重塑IPF的观察[22]。在这项研究中,指出Wnt配体分泌特异性的方式,但许多相邻的细胞类型,从而修改Wnt配体活动细胞陷阱。未来在体外和在活的有机体内研究无疑会更加在IPF底层Wnt激活机械原理,及其治疗灯是否将作为一个合适的这种毁灭性疾病的治疗工具。

材料和方法

确认

我们感谢西蒙·贝克和优秀的技术援助,安德烈亚斯扬沃尔特Klepetko维也纳大学医院提供肺组织,所有的成员Eickelberg实验室刺激讨论。