介绍

传染病的死亡率仍然是一个重大的负担,尤其是在低收入和中等收入国家。在一个日益全球化的世界,人类倾向于自由流动的连续等人类病原体的传播结核分枝杆菌(Mtb),它仍然是最具破坏性的病原体之一[1],[2]。检测这种传播,了解疾病的动态,优化和开发结核病(TB)控制策略,准确跟踪病原体传播的外部主机人口的重要性[3]。为此,已经建立了各种应变输入方法和分子流行病学研究中使用。

关于百慕大,最常使用三种可靠的输入方法:6110年RFLP(限制片段长度多态性)[4]spoligotyping(空隙回文重复;CRISPRs)[5]和MIRU-VNTR(分枝杆菌点缀重复unit-variable串联重复序列的数量)打字[6]24个位点。这些方法已经成功地应用于各种研究问题,例如,调查实验室交叉污染、疫情调查,以人口为基础的分析,最近在大都市设置或遍及全国的传播[7]- - - - - -[9]。我们利用基因分型研究结核分枝杆菌的流行病学纵向以人群为基础的研究在汉堡和周边国家石勒苏益格-荷尔斯泰因州的城邦[8],[10],[11]。然而,尽管是6110年实际传播动力学的DNA指纹图谱显示有趣的方面,我们发现,只有大约50%的结果簇可以通过接触者追踪记录传输确认链接([8]未公开的数据)。几个原因可以解释,在短暂的接触可能会传播或高危人群(如人口无家可归或酒精),导致流行病学联系的情况下是很难建立基于病人的采访。

此外,尽管这些打字技术目标尤其是多态基因目标,他们询问不到1%的基因组,因此本质上限制歧视性的权力。因此,他们不能最优检测并解决最近的传播链[12],[13]。这种限制可以克服下一代应用程序的全基因组测序(WGS) genome-based流行病学[14]。WGS可以提供全面的遗传信息包括所有可能的基因目标、耐药性以及额外的有价值的信息,致病因素和基因组进化。持续技术发展迅速降低成本,WGS有潜力成为诊断和病原体的终极工具打字,并显著增强分子诊断在临床微生物学的影响[15]。尽管WGS-based Mtb的潜在的基因已经开始探索[12],[13],[16]准确地跟踪特定的爆发潜力,其精确克隆仍然是未定义的。

来解决这个问题,我们评估WGS-based跟踪连续多用于结核分枝杆菌的传播在都市环境中,和精确校准结核分枝杆菌的基因组的短期进化遵循其克隆扩张超过十年。首次检测到的应变在纵向的分子流行病学研究,我们在1997年开始在汉堡[10]。初步分析显示,2004年菌株主要是在当地一家酒吧和相关的高危人群,如酒精和无家可归的人[10]。值得注意的是,与其他相关疫情从这家喝到那家,没有超级撒布机识别来源病例。相反,它是酒吧环境高周转率偶尔游客(包括无家可归的人从邻近的旅馆),支持连续,酒精个人长期应变的传播没有艾滋病毒合并感染的影响。虽然汉堡公共卫生办公室做出了相当大的努力来解决疫情和酒吧在2006年关闭,压力在汉堡和石勒苏益格-荷尔斯泰因州继续扩散,最终导致86年传输到2010年底。

在这项研究中,我们进行的WGS 86隔离揭示集群应变传播的模式由传统的基因分型。我们测试是否WGS-based类型将提供一个更高的分辨率比传统类型的爆发,并更好的适应其时空分布和可用的接触者追踪数据。也被用来测量获得的数据的结核分枝杆菌基因组的变化水平明确的传播链,作为校准的关键参数WGS未来genome-based分子流行病学数据。

方法

结果

汉堡在城邦以人群为基础的流行病学研究涉及大约2000名患者进行了超过14 y,我们确定了异常引起的大型集群应变的哈勒姆家族通过使用经典应变打字,最初是基于6110年DNA指纹图谱,后来证实了24-locus MIRU-VNTR打字(见方法和图S1)。这个集群还包括病例石勒苏益格-荷尔斯泰因州的邻近的联邦国家,共有86名患者。详细描述的第一个集群38例观察2004发表之前[10]。所有86名患者的特点所示表1。70(81.4%)的男性和86例由16名女性与药物敏感结核病。只有19个外国出生;剩下的(77.9%)出生在德国,拥有德国国籍。

古典输入数据不与空间分布情况和接触者追踪数据,显示多个源的参与情况。这些情况似乎是几个独立的传动链的一部分,没有区分6110年打字或24-locus MIRU-VNTR输入(图S1)[10]。因此,我们评估是否WGS-based允许更好的解决这个集群和pcr分析流行病学数据的相关性。

在WGS数据的分析,单核苷酸多态性和小删除细分86集群分离株的53%。总的来说,我们发现85个snp个人爆发之间的隔离,这都是由Sanger测序验证(表S1)。这验证了严格的阈值我们选择多态性频率和基因组覆盖率排除假阳性(见方法)。七个snp识别外的编码序列。剩余的78多态性可分为47个非同义和31同义snp。总的来说,大部分的snp是非同义(55%),表明结核分枝杆菌的清爽净化选择在短的时间内,如前所报道[12]。

详细的人口结构和精确的哈勒姆应变传播从1997年到今天可以可视化的最小生成树基于对齐85验证单核苷酸多态性(图1和S2A)。WGS披露的存在不同基因型由1997年11个snp,指示错误的集群由古典的pcr分离从第一年。

隔离被细分为36单例具有独特的SNP概要文件和七个集群,包括从2 - 24隔离。大多数隔离(n= 72,84%)分组在一个分支,我们称之为“汉堡克隆”(图1)。的汉堡克隆在1998年首次分离,然后生成几个集群(包括最大的一个,24隔离),并不断孤立,直到最后的研究(图S2A)。相比之下,克隆无关汉堡少克隆扩张,导致只有一个集群有两个隔离。2002年之后,他们停止传播。此外,在2006年汉堡石勒苏益格-荷尔斯泰因州首次克隆传播,在基尔。独立,石勒苏益格-荷尔斯泰因州的第二大溢出发生在2010年,在Pinneberg。这两个事件是解决SNP-based树和检测不同的小删除特定于每个事件(图开通)。

这些数据显示,WGS-based分析解决了86隔离歧视性的水平远高于古典基因分型,,,另外,按照时间和空间扩张模式。然后我们考虑这是否高分辨率与接触者追踪数据和确定的变化观察水平证实了传输链。接触者追踪显示明确的传播之间的联系31例(33%),可组装成八个不同的链(图2)。高比例的菌株(19日31日的61%),接受了至少一个人际传播没有SNP差异在严格的条件下我们调用用于变体。剩下的39% (n= 12)显示不同最多由三个单核苷酸多态性(SNP概要文件图2),从而定义一个最大程度的基因组变异之间的隔离从确认传输链。

基于86年观察到的序列变异积累Mtb反映基因组克隆扩张至少14 y (图S3上半部分),我们确定一个时间尺度的演变Mtb的自然宿主。Coalescence-based分析估计核苷酸替代率为1×10⁻⁷每年每核苷酸替换站点(95%置信区间,0.6×10⁻⁷1.5×10⁻⁷),即。,approximately 0.4 mutations per Mtb genome per year. When analyses were rerun on datasets with sampling dates permutated across isolates, divergence dates were much older and credible intervals much larger (图S3中间面板),显示我们的率的计算是基于一个真正的时间信号序列中的数据。率的计算也支持由一个线性回归root-to-tip距离最大似然树对隔离(日期图S3较低的面板)。

WGS分析显示优惠扩张的一个特定的克隆(即。,汉堡克隆)患者人群(图3一)。因此,我们试图计算出明显相对生殖健康的克隆。为此,我们做了一个近似的病例数代表估计每年的平均数量的后代生存的特定基因型或血统。值得注意的是,这两个汉堡克隆和无关的菌株表现出线性增长随着时间(图3 b)。然而,他们的斜坡上显著不同(图3 b)。根据两个斜坡的比例,明显不太成功的相对健康压力大约是两倍低(0.462)相比汉堡克隆。评估是否这些观察到的传播行为的差异可能是由于社会环境的差异各自的指数的病人,我们进行了深入调查,所有病人的社会背景特征基于设计良好的接触者追踪方法使用标准,实地问卷调查(见方法)。我们发现病人感染了汉堡克隆或无关的菌株没有按年龄差异,艾滋病毒感染、药物滥用、无家可归、或社会环境(最后以不稳定的家庭和酗酒;看到表1)。因此,我们没有确定对比社会或环境参数,将显然支持优先传输特定的克隆。总的来说,76%的患者受到疫情影响可以被认为属于同一环境(图3 c;表S2)。总共只有五个病人56 - 7%的患者感染了汉堡clone-were艾滋病毒阳性;然而,汉堡克隆开始传播的艾滋病毒阳性的患者群。最重要的是,在第一个2 y(1997和1998)所有的病人可以分配给相同的社会环境中在汉堡。

充分描述的基因背景优先传送汉堡克隆,我们完成了它的一个孤立的全基因组序列,生成指定应变7199/99,手工打造的基因组注释(图S4),使用结核分枝杆菌菌株H37Rv作为参考。H37Rv相比,基因组的7199/99略大(4421197个基点)。成对全基因组比对H37Rv应变的7199/99,和测序隔离F11 CDC1551[23],[24]透露,大规模基因组重组,主要因为转位因子(42%)和PPE / PE_PGRS基因(38%;表2)。少量的多态性影响编码区域,例如,损失的esxR(Rv3019c)和esx(Rv3020c),或由一个单核苷酸缺失mmpl2(Rv0507)。这个删除截断了mmpl2,这是一种跨膜蛋白家族中的一员;编码的一些地区可能参与脂肪酸运输[25]。然而,这些变化都是在86年爆发隔离,从而突显出基因组单核苷酸多态性在推动进化的重要角色在传输过程中。

讨论

我们的临床流行病学研究表明,WGS-based类型提供了有关决议大,纵向Mtb爆发比经典的基因更有效得多。Genome-based更好的接触者追踪信息和时空分析相关的病原体的传播模式。此外,我们可以确定一个时间尺度的结核分枝杆菌的进化在克隆扩张超过十年,80年人口>患者。我们估计的最大变异三个单核苷酸多态性在明确的人际传播活动作为解释的基准WGS未来genome-based分子流行病学数据。

结核病监测的效率依赖于准确的检测能力爆发在社区和跟踪正在进行的传输链,这需要临床分离株的鉴定与高歧视性的权力,在应变水平[9]。古典基因分型技术现在已经使用了超过20 y协助结核病监测。然而,它们的价值为准确界定传输链或图表特定菌株的传播已经被最近质疑genome-based分析[12],[13]。我们表明,与相同的隔离6110年由多达130个snp模式不同,不支持直接传播[12]。

与经典6110年DNA指纹图谱和24-locus MIRU-VNTR打字、基因组测序确定一个特定的克隆,命名为“汉堡克隆”,主要研究了疫情的病原体在汉堡和石勒苏益格-荷尔斯泰因州。此外,全基因组多态性透露几个集群内的爆发和接触者追踪相关数据和已知的时空扩散到石勒苏益格-荷尔斯泰因州在两个独立的情况下,所看到的两个截然不同的集群(见图S2)。重要的是,准确界定这些传动链是几乎不可能单独使用古典接触者追踪,没有回顾指导基于WGS数据,大多数病人(见图3和表1)与社会经济条件有利于向未知的接触传播[26]。我们的数据显示,所显示先前的调查[13]的力量WGS-based molecular-guided多用于结核病监测和控制,即使在有问题的设置。

额外工作的一项重大发现是,当全基因组变异发现疫情中分离出足够高的爆发来解决,明确的传播链的全基因组变异水平很低,限制在不超过三个单核苷酸多态性。从更具体的角度来看,这一结果显然不同于已知的只有其他类似研究,由Gardy和同事[13]。这些作者分析了32隔离从疫情仍在不列颠哥伦比亚省,发现他们所有人(包括流行病学有直接联系的那些)相隔至少18个snp。然而,许多这些snp在重复DNA被发现等地区的PPE / PE_PGRS基因家族和元素(40%),这通常是很难与短内容映射和分析测序技术[27]。同样,最初这些地区纳入自己的分析建议更多的snp,但没有发现的变异在这些地区被后续Sanger测序证实。因此,我们的研究结果还定义(即基因组的一部分。,excluding repetitive regions) that can be interrogated with a minimal risk of false positive detection of variation, which is an essential parameter to control when analyzing strains that are intrinsically closely related in a clonal outbreak.

我们的数据揭示了时间积累结核分枝杆菌的基因组变异传播在其自然人类宿主人口。这表明Mtb的发展大约10倍比耐甲氧西林的更慢金黄色葡萄球菌[22],[28],[29]。考虑最近确定猕猴模型中的结核分枝杆菌变异率为2.5×10⁻¹⁰每一代,无论疾病状态[30]结核分枝杆菌的替换率表明,平均世代时间22 h(95%置信区间,13 h 33 h),或每年400代。有趣的是,这些估计非常接近翻倍增长之前测量在实验室在营养丰富的文化条件[31]。基于测量的替代率,我们估计的最近共同祖先汉堡在1995年克隆存在(95%置信区间,1993年至1997年),因此几年爆发之前被发现。但是我们注意到,实际的世代时间可能会更短在人口自然比表示,作为我们的进化速率的估计不包括一个未知突变的比例可能远离人口通过选择和漂移超过14 y[32]。

最后一个有趣的发现揭示了我们是WGS-based分析汉堡克隆导致增加病例数,包括几个集群,相比其他克隆,表明更有效的传播很长一段时间。鉴于细菌之间的复杂的相互作用、人类和环境因素影响结核病传播,几种解释可能占这种不均匀膨胀,社会环境等因素,或接触的强度和持续时间,或特征,来源情况[33],[34]。结核分枝杆菌超级撒布机的存在会加速传播[13]。值得注意的是,我们并没有发现在统计上有显著差异的社会环境特征的病人之间汉堡克隆组和病人感染其他隔离表1)。病人组主要由个人与一个酒鬼和无家可归的环境,很早就已经发现,接近爆发疫情[26]。虽然某个超级机引起的可能性较大的集群中发现WGS-based树(参见第一年图1)不能被排除在外,不支持这一假设的事实,即使这最大的集群由至少四个明确的独立的传动链。这样单一的参与(超级)撒布机疫情的爆发也会很难协调的线性增加病例数随时间的观察汉堡克隆和非汉堡克隆组(见图3)。因此,我们假设增加的情况下造成的汉堡克隆可能会导致一些小型基因变化之前积累了最初的传播(六个snp,其中3例非同义,因此可能有功能的后果在蛋白质水平),这可能加强这种克隆的健身。然而,这个假设很难证明,甚至使用可用的实验感染模型[35],[36]。

总之,我们的研究表明潜在的WGS改善molecular-guided结核病监测和控制。我们设想,其进步的有效实施将不断加速的测序成本,减少广泛分布的所谓台式基因组测序[37]和即将到来的生物信息学的发展,促进快速和相关的解释结果数据在公共卫生和医疗环境。

支持信息

确认

我们感谢美国埃勒斯医生在批判阅读。此外,我们感谢t . Ubben Radzio, t . Struwe-Sonnenschein, j . Zallet技术援助。