数据
摘要
方法和结果
我们分析了74例IPF患者和53例对照组血浆中49种蛋白的浓度。我们鉴定了5种蛋白- mmp7、MMP1、MMP8、IGFBP1和tnfrsf1a的组合特征，其敏感性为98.6%(95%可信区间[CI] 92.7%-100%)，特异性为98.1%(95%可信区间[CI] 89.9%-100%)，足以将患者与对照组区分开来。IPF患者的肺组织和支气管肺泡灌洗液中也可见MMP1和MMP7的增加。MMP7没有MMP1血浆浓度和增加慢性阻塞性肺疾病患者或结节病和杰出的IPF亚急性或慢性过敏性肺炎相比,这种疾病可能模仿IPF,敏感性为96.3%(95%可信区间81.0% - -100%)和特异性为87.2%(95%可信区间72.6% - -95.7%)。我们在一个由IPF、家族性肺纤维化、亚临床间质性肺疾病(ILD)患者以及对照个体组成的独立验证队列中验证了我们的结果。在该队列中，IPF患者的MMP7和MMP1浓度明显高于对照组。此外，亚临床ILD患者MMP7浓度升高，并与预测强迫肺活量百分比(FVC%)和预测一氧化碳扩散能力百分比(DL)呈负相关一氧化碳%).
引用:Rosas IO，Richards TJ，Konishi K，Zhang Y，Gibson K，Lokshin AE，et al.（2008）MMP1和MMP7作为特发性肺纤维化的潜在外周血生物标记物。《公共科学图书馆·医学》5（4）：e93。https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0050093
学术编辑器:Peter Barnes，全国心脏和龙学院，英国
收到:2007年7月26日;认可的：2008年3月13日;发表:2008年4月29日
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用公共领域声明的条款发布，该声明规定，一旦进入公共领域，任何人都可以自由复制、发布、传播、修改、建立或以其他方式用于任何合法目的。
资金：NK、KG、TJR、YZ、JD、KOL和MS得到了美国国立卫生研究院(NIH) HL073745、HL0793941、HL0894932和西蒙斯家族的慷慨捐赠的支持。IOR、SDM和BRG由美国国家心肺血液研究所(NHLBI)内部研究部门支持。MS和AP由Universidad Nacional Autónoma de México Grant SDI.PTID.05.6支持。资助机构未参与研究设计、数据收集、解释或本手稿的准备工作。
利益冲突:NK是百健艾迪(Biogen Idec)和森托科(Centocor)为基因组和蛋白质组生物标志物的发现和验证提供的研究者发起的研究资助的获得者。本文中的数据并不是由这些基金资助的。作为顾问，FS从葛兰素史克(GSK)和阿斯利康(Astra-Zeneca)获得了不到1万美元。其他所有作者都宣称没有相互竞争的利益。
缩写：BAL，Bronchoalveolar灌洗;购物车，分类和回归树;CI，置信区间;COPD，慢性阻塞性肺病;DLCO％，预测一氧化碳漫射能力百分比;FVC％，百分比预测强制生命能力;HP，过敏肺炎;HRCT，高分辨率计算断层扫描;ILD，间质肺病;IPF，特发性肺纤维化; MMP, matrix metalloprotease; NSIP, nonspecific interstitial pneumonia; ROC, receiver operating characteristic curve; SAM, significance analysis of microarrays
编者总结
背景。
特发性肺纤维化(IPF)是一种严重的疾病，其原因不明，肺部进行性瘢痕或增厚。健康的人通过嘴或鼻子吸入空气，然后沿着气管进入肺部的气道。每个气道都有许多小分支，其末端是肺泡，肺泡是由毛细血管包围的薄壁小气囊。当空气到达肺泡时，其中的氧气进入血液，并被带到身体的器官，以保持它们的工作。在IPF中，肺泡及其周围的空间(“间质”区域)逐渐变得疤痕和增厚，从而阻止氧气进入血流。当只有一小部分肺部有瘢痕时，IPF可能不会引起任何症状。但是，随着更多的肺受损，IPF最终会导致呼吸困难，即使在休息时也是如此。尽管类固醇和抑制人体免疫系统的药物经常被用来试图减缓IPF的发展，但目前还没有有效的治疗方法。平均而言，半数IPF患者在确诊后三年内死亡，通常死于呼吸或心脏衰竭。
为什么要做这项研究？
IPF很难诊断，因为有许多肺部疾病都有类似的症状，包括许多其他间质性肺部疾病。目前，医生只能通过反复检测患者的肺功能或多次做胸部x光检查来跟踪IPF的进展。如果能够确定血液中的蛋白质水平表明疾病活动(所谓的“外周血生物标记物”)，就会更容易诊断和监测患者。此外，这些生物标志物的鉴定可能为IPF的治疗提供新的药物靶点。在这项研究中，研究人员使用“多重分析”系统同时测量患者血液样本中几种蛋白质的水平，以寻找IPF中的外周血生物标志物。
研究人员做了什么并找到了什么？
研究人员测量了74名IPF患者和53名健康人（对照组）的49种血浆蛋白（血浆是血液的流体部分）的水平，并使用一种称为“递归分割”的技术定义了一种五种蛋白质信号，将患者与未受影响的研究参与者区分开来（对照组）。基质金属蛋白酶7（MMP7）和MMP1这两种血浆蛋白水平在IPF患者中比对照组升高最多，是这一特征的关键成分。在支气管肺泡灌洗样本（用盐水冲洗肺部获得的液体）和IPF患者肺组织样本中，MMP7和MMP1的浓度高于从健康个体中采集的类似样本。IPF患者的MMP7和MMP1血浆浓度显著高于超敏性肺炎（一种类似IPF的间质性肺病）患者，但在慢性阻塞性肺病或结节病（另外两种肺病）患者中没有升高。在一个独立的验证组中，患有IPF和家族性肺纤维化的患者血浆MMP7和MMP1浓度升高，这与他们疾病的严重程度相关。此外，MMP7浓度在家族性肺纤维化患者的近亲中升高，这些患者的肺功能测试正常，但有一些肺瘢痕。
这些发现意味着什么?
这些发现为IPF的血液蛋白特征提供了证据，提示MMP1和MMP7可能是IPF的有用生物标志物。这两种基质金属蛋白酶以前曾被认为参与了IPF的发展。然而，可能还需要做更多的工作来证实MMP7和MMP1的血浆浓度升高对IPF是特异性的，因为这些标志物可能无法将IPF与其他间质性肺疾病区分开来。
介绍
特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性纤维化间质性肺病（ILD），中位生存期为2.5–3年，目前可用的药物治疗基本上不受影响[1.］．该病的特点是肺泡上皮细胞损伤和活化，成纤维细胞/肌成纤维细胞灶形成，细胞外基质在肺实质中过度积聚。最近的研究使用高通量基因组技术分析来自IPF患者或转基因动物的样本，突出了疾病相关途径的复杂性(在[2.–4.])。虽然这些研究提高了对肺纤维化分子机制的理解，但它们并没有很好地转化到临床领域。
外周血生物标志物的识别可以促进IPF患者的诊断和随访，以及新的治疗干预措施的实施。目前，诊断IPF可能需要对非典型临床表现或高分辨率计算机断层扫描(HRCT)的患者进行手术肺活检。IPF患者经常通过一系列的肺生理测量和反复的x线检查进行评估。这些研究提供了疾病程度的一般评估，但没有提供关于疾病在分子水平上活动的信息。较高的血清表面活性剂蛋白浓度[5.], KL-6 [6.]，fasl [7.], CCL-2 [8.]，α-防御素[9]，最近是SPP1[10.已曾在具有IPF和其他ILD的患者中报道，但大多数这些研究的大小适度，并仅同时测定单个或几种蛋白质标记物。
在这项研究中，我们使用多分析物蛋白分析系统同时测量49种血浆蛋白的浓度，包括细胞因子、趋化因子、生长和血管生成因子、基质金属蛋白酶（MMPs）和由IPF患者和健康对照组组成的衍生队列中的凋亡标记物。我们鉴定了五种蛋白质的组合特征；其中，我们测量了两种金属蛋白酶MMP7和MMP1在其他慢性肺部疾病中的浓度，并将其与IPF患者中观察到的水平进行比较。最后，在一个独立的验证队列中测试MMP7和MMP1作为IPF外周血生物标记物的潜在作用。
方法
有关本研究中使用的方法的详细描述，请参见文本S1．
初始IPF推导队列
本研究包括匹兹堡大学医疗中心评估了74名IPF患者。在公布标准的基础上建立了IPF的诊断[11.]，以及临床指示时的外科肺活检[12.)(见文本S1）.通过Simmons Center数据库获得临床数据。吸烟状态定义如前所述[13.］．53个对照个体从肺区样本采集中心获得。基线人口统计信息详见表1．预测强制急性能力（FVC％）IPF患者的平均值为61.9±20.8;平均百分比预测一氧化碳漫射能力（DL一氧化碳%)为42.1±17.4。
慢性阻塞性肺疾病
匹兹堡大学(University of Pittsburgh)评估的73例慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的血浆样本可用于本研究。个体在检查时临床稳定，接触烟草至少10包年，且没有风湿性、感染性或其他系统性炎症的临床诊断。如前所述，使用GOLD分类测量疾病严重程度[14.］．COPD队列包括13例GOLD 0-I级患者、21例GOLD II级患者和39例GOLD III-IV级患者。
结节病
匹兹堡大学医学中心对47例结节病患者的血浆样本进行了检测。有肺病的病人(N= 29)显示平均FVC%为76.7±22.1，平均DL一氧化碳％72.9±25.5。根据美国胸部社会和欧洲呼吸道学协会标准确定疾病的诊断和分期，如前所述[188bet官网地址15.,16.］．
过敏性肺炎
41例亚急性/慢性超敏性肺炎(HP)患者和34例IPF患者的血清样本均来自墨西哥国家呼吸研究所(Instituto Nacional de Enfermedades respiratory)。IPF和HP的诊断以前在该队列中有过描述[17.,18.］．简单地说，HP患者表现出以下特点:(a)有禽类接触史，血清抗禽类抗原抗体阳性;(b) ILD的临床和功能特点;(c) HRCT示弥漫性小叶中央界限不清的小结节，磨玻璃衰减，局灶性气陷，轻度至中度纤维化改变;(d)支气管肺泡灌洗液中淋巴细胞含量大于35%。44%的患者接受了手术肺活检;所有病例的肺组织学均符合HP诊断。HP的平均FVC%为60.3±15.3,IPF的平均FVC%为59.1±17.2。
独立验证组
来自20名对照个体、8名亚临床特发性ILD患者、16名家族性肺纤维化患者和9名散发性IPF患者的血清样本，在美国国立卫生研究院(NIH)的Warren Grant Magnuson临床中心进行了评估，可用于本研究。亚临床疾病患者为家族性肺纤维化患者的一级亲属;他们无症状，肺功能检查正常，但HRCT结果与早期ILD一致。家族性肺纤维化的定义如前所述[19.]. 正常志愿者作为对照。
这些队列之前已经被我们描述过[20.,21.］．简而言之，散发性IPF和家族性肺纤维化患者的平均FVC％值分别为59.4±19.7和75.7±16.7。使用HRCT早期无症状患者诊断出八名家族肺纤维化患者[21.];平均FVC%为101.3±10.1。所有组的性别、年龄、种族和吸烟状况均列于表2.．
验证队列患者特征
通过匹兹堡健康科学组织库大学获得微阵列分析的肺组织样本，如前所述[22.]. 23例标本取自接受肺移植的IPF患者的活检手术残余物或移植肺，14例对照正常肺组织取自肺癌切除标本的正常组织学无病边缘。IPF的形态学诊断基于典型的显微镜检查结果，与常见的间质性肺炎一致[12.,23.］．所有患者均符合美国胸科学会和欧洲呼吸学会制定的IPF诊断标准[188bet官网地址11.］．
所有的研究都是由匹兹堡大学的机构审查委员会、国家心脏、肺和血液研究所或墨西哥国家呼吸疾病研究所批准的。所有患者均获得知情同意。
落下帷幕
如前所述，作为诊断过程的一部分，BAL是通过柔性纤维支气管镜进行的[18.,22.,24.］．上清置于−70℃保存至使用。22例IPF患者(年龄62.2±7.2岁)和10例正常对照(年龄41.5±5岁)的BAL样本可供本研究使用。
多元分析
根据适当的制造商协议(Invitrogen和R&D Systems)，使用Luminex xMAP技术(Luminex Corporation)以96孔微孔板形式进行检测，如前所述[25.]而且文本S1．
珠基免疫分析
采用34层检测IL1A、IL1RA、IL1B、IL2、IL2R、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL10、IL12B、IL13、IL15、IL17、TNFA、IFNA、IFNG、GMCSF、EGF、VEGF、GCSF、FGF2、HGF、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、TNFRS1A、TNFRS1B和TRAIL-R2 (Invitrogen公司)。MMP检测包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12和MMP13 (R&D Systems)。
FAS, EGFR, FASL, Cyfra 21-1 (CKRT19片段)，IGFBP1和KLK10的检测是在我们的匹兹堡Luminex核心设施开发的。这些分析方法如所述进行了验证[25.］．
寡核苷酸微阵列实验
详细资料请参阅文本S1．简单地说，使用总RNA作为合成cDNA的模板，由阵列制造商(安捷伦技术)推荐。cDNA作为模板生成cy3标记的cRNA，用于安捷伦全人类基因组4X 44K多包阵列(安捷伦技术)杂交。杂交、扫描和特征提取后，数据文件导入微阵列数据库，并使用SOURCE (http://genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/SMD/source/sourceSearch）然后使用循环黄土归一化[26.］．差异表达基因通过显著微阵列分析(SAM)鉴定[27.］．通过其基因符号鉴定对应于49个蛋白标记物的探针。提取对应于这些标志物的探针的表达水平。在冗余探针的情况下，选择具有最高表达级别和最低Q值的那些呈现。
统计分析
当浓度变化至少为25%且具有统计学意义时，则认为蛋白表达差异P< 0.05经多次测试修正。数据以均数±标准偏差报告。使用Wilcoxon秩和检验来识别潜在的生物标志物，以单因素区分IPF样本与对照组。对于多次测试，使用Bonferroni方法将家族级错误率控制在5%。数据分析使用R语言进行统计计算(http://www.r-project.org/）[28.］．使用分类和回归树(CART)方法确定外周血生物标志物的潜在组合，可用于区分IPF与对照。CART是使用递归分区的rpart包执行的。使用ROCR软件包评估分类性能(http://rocr.bioinf.mpi-sb.mpg.de/）.对于寡核苷酸阵列数据分析，我们应用了SAM [27.］．数据可视化和聚类使用genome (http://genomica.weizmann.ac.il/index.html.）[29.和Spotfire决策网站9 (TIBCO)。
结果
血浆蛋白在衍生队列中将IPF患者与对照组区分开来
分析的49个标记中，48个在血浆中检测到(图1一个);单变量分析确定了IPF中与对照组相比差异表达的12个蛋白(表3）.5个MMPs (MMP7、MMP1、MMP3、MMP8、MMP9)、2个趋化因子(CXCL10、CCL11)、FAS、IL12B和可溶性TNF受体(TNFRSF1A、TNFRSF1B)显著过表达;与对照组相比，IPF患者血浆中AGER显著低表达。MMP7和MMP1在IPF发病机制中发挥作用，是单变量分析中排名靠前的蛋白质(表3）.当年龄、性别或吸烟状况受到统计控制时，显著差异仍然存在。
(A) IPF和对照组患者血浆中测量的蛋白热图。列,个别病人;行,蛋白质。每个蛋白水平除以所有患者相同蛋白的几何平均值，并以2为基础进行转换。增加黄色的阴影，增加;紫色的阴影增加，减少;灰色,不变。利用基因组对蛋白质进行聚类。红色垂线表示IPF中蛋白簇增加;绿色垂线表示IPF中蛋白簇减少。
(B)将CART得到的分类树应用于IPF患者和对照组血浆蛋白浓度数据。蓝色方框将终端节点标识为控件;红色框表示IPF。所有计数都被列为控制/IPF。浓度为ng/ml。在MMP7浓度高而MMP1浓度低的亚组(14份IPF样本，5份对照样本)中，IGFBP1和TNFRSF1A的分裂改善了分类，而在MMP7浓度低的亚组中，MMP8改善了分类。
（c）使用五个标记中的每一个或其组合的ROC曲线将样本分类为IPF或控制。令人敏感，或真正的阳性率，绘制在Y-轴和假阳性率或1 -特异性x-轴心国。每个ROC曲线下的面积等于Mann-Whitney的分子U-统计比较IPF和对照样品之间的标记物分布。标记为“Combined”的品红行用于使用所有五个标记的组合分类器。45°的同一性线表示一个标记，其表现并不优于通过投掷均匀硬币将样本分类为IPF或控制样本。
将IPF与对照区分的血浆蛋白质
为了确定这些血浆蛋白组合是否能正确地对IPF患者进行分类，我们对全部49个标志物进行了递归划分，发现血浆蛋白谱可以清楚地将IPF患者与正常对照组区分开来。CART分析显示，MMP7和MMP1除了是两个最重要的生物标志物外，还是组合分类器的关键组成部分，该组合分类器还包括MMP8、IGFBP-1和TNFRS1A (图1B).分类器的敏感性和特异性分别为98.6%(95%置信区间[CI] 92.7%-100%)和98.1% (95% CI 89.9%-100%)。高浓度MMP7单独(≥1.99 ng/ml)能正确地将74例IPF患者中的69例(93.2%)区分为IPF，但将5个正常样本错误地划分为IPF，将5个IPF样本错误地划分为对照组，而高浓度MMP7(≥1.99 ng/ml)和MMP1(≥2.15 ng/ml)合并排除所有对照组。因此，结合MMP7和MMP1的高浓度可以区分IPF患者与对照组。接收机工作特性曲线(roc) (图1c）确认MMP7是最好的单变量分类器，尽管五个标记的组合更好地表现出稍微更好（图1C)，以及MMP7和MMP1的组合(未发表的数据)。
IPF患者肺液和BAL液中MMP7和MMP1升高
为了确定外周血蛋白浓度的差异是否反映了肺中基因表达的差异，我们使用寡核苷酸微阵列分析了23例IPF和14例对照肺中的基因表达模式(图2A). CART血浆信号中的五种血浆蛋白(图1B)，与对照组相比，只有MMP7和MMP1基因在IPF肺中显著过表达(两个基因的SAM Q值均为0;分别为7.3倍和15.7倍)。IPF患者血浆中其他10种显著不同的蛋白质(表3)MMP3、AGR和IL12B的基因在IPF肺中也有显著差异表达(图2一个)。
(A)使用编码IPF肺中49种蛋白标记物的基因表达微阵列测量的平均基因表达水平(对数尺度)(Y-轴)与对照肺(x设在)。有色方块(黑色或红色)是编码蛋白质的基因，这些蛋白质在血浆中发生了显著变化。红色方块表示在基因表达数据中发生显著变化(SAM Q值<5%)的基因，并编码外周血中测量的蛋白质。绿色斜线表示两倍变化。
（B和C）MMP7（B）和MMP1（C）浓度（Ng / mL）是显着的（P< 0.00001和P= 0.018) IPF患者BAL液(N=22）与对照组相比(N= 10).
为了确定MMP7和MMP1蛋白是否分泌到肺泡微环境中，我们测量了22例IPF患者和10例对照组患者的BAL中MMP7和MMP1蛋白的浓度。IPF患者的MMP7和MMP1 BAL浓度明显高于对照组(P< 0.00001和P分别= 0.018）（图2B和2.C).因此，肺微环境中MMP7和MMP1水平升高是外周血中MMP7和MMP1浓度升高的最可能来源。
COPD或结节病患者的MMP7和MMP1没有增加
为了确定MMP7和MMP1的浓度是否在其他常见的慢性肺疾病中增加，我们测量了患有结节病或COPD的患者的血浆浓度。将47例患者分层分层，具有实质肺病的证据（第2阶段或更高;N= 29)，无肺实质受累者(N= 18)。所示图3， MMP7的血浆浓度无显著差异(P= 0.78) (图3A） 或MMP1(P= 0.27) (图3b）与对照相比，在有或没有肺异常的结节病组之间。COPD参与者被黄金课程分组，进入0-I（N= 13, ii (N= 21）和III-IV（N= 39)。MMP7的血药浓度无显著差异(P= 0.21)或MMP1 (P=0.85）在按黄金等级分层的COPD患者组之间(图3A和3.分别为B)。
IPF患者MMP7 (A)和MMP1 (B)的浓度(ng/ml)显著升高(N= 74;P< 0.00001和P= 0.018)，与对照组(N= 53)，但结节病(N= 47;P= 0.78,P= 0.28)，与对照组(N= 53）或COPD（N= 73;P= 0.21和0.85，按GOLD分级为0-I、II和III-IV)。
IPF患者血清MMP7和MMP1明显高于HP患者
为了确定MMP7和MMP1的外周血浓度是否能区分IPF和其他常见形式的ILD，我们测量了41例HP患者和34例IPF患者的MMP7和MMP1水平。单变量，MMP7的血清浓度(P= 0.01)及MMP1 (P< 0.001) IPF显著高于HP;MMP1和MMP7的fold变化分别为2.3和1.31 (图4A和4.B)。
IPF患者的血液中MMP7（A）和MMP1（B）的浓度（Ng / ml）显着高（N= 34)，而HP患者(N= 41)。
(C) IPF样本中平均基因表达水平(对数尺度)(Y-轴)与HP (x-轴)，由基因表达微阵列测量。灰色的圆圈代表所有基因;红色圆圈，MMP1和MMP7。绿色斜线表示两倍变化。
(D)血清MMP7组合(Y-轴）和MMP1浓度(x-轴）在IPF（闭合圆）和HP患者（开放圆）中。角点表示根据MMP1和MMP7浓度，正预测值（PPV）和负预测值（NPV）之间的权衡对于排除IPF（蓝色）或结论IPF（红色）是最佳的。
（e）使用MMP1或MMP7或其组合的ROC曲线将样本分类为IPF或HP。令人敏感，或真正的阳性率，绘制在Y-轴和假阳性率或1 -特异性x设在。45°的同一性线表示一个标记，其表现并不优于通过投掷均匀硬币将样本分类为IPF或HP。
在对先前发表的比较IPF和HP患者肺组织基因表达的DNA微阵列数据集的再分析中也观察到了类似的结果[18.］．在这种再分析中，与HP（假发现率[FDR] <5％）相比，IPF中的MMP7和MMP1水平显着较高，然而，如在外周血中观察到的，与增加的增加时，MMP7水平的变化是中等的mmp1（图4C)。
血清MMP1和MMP7浓度的组合有积极的预测的值确定一个病人IPF从91% (MMP7 > 2.6 ng / ml, MMP1 > 8.9 ng / ml)为66%,和消极的预测价值(排除IPF)从96% (MMP7 < 2.9 ng / ml和MMP1 > 3.5 ng / ml)到70% (图4D).此外，高MMP7和高MMP1外周血浓度联合区分IPF和HP的敏感性为96.3% (95% CI 81.0%-100%)和87.2% (95% CI 72.6%-95.7%) (图4E） ，进一步支持MMP1与MMP7的结合将IPF与HP区分开来。
在一个独立验证队列中，MMP7和MMP1在血清中显著升高
为了验证我们的发现，我们在一个独立验证队列中测量了MMP7和MMP1的浓度，该队列包括IPF、家族性肺纤维化或亚临床间质性肺病患者和对照个体。这个群体最近被我们[21.]. 尽管在血清中而不是血浆中测量了MMP7和MMP1的浓度，但与对照组相比，肺纤维化患者的MMP7和MMP1的浓度显著升高(P< 0.001和P分别为= 0.01)。值得注意的是，亚临床ILD患者血清MMP7浓度明显高于对照组(P= 0.019)，与IPF完全发作患者相比显著降低(P<0.0001）（图5A)，提示MMP7可能作为疾病进展的生物标志物。家族性和散发性IPF患者之间MMP7浓度没有显著差异，这与Yang等人的研究结果一致[30.］．
（a）暗实线显示每组中的中值浓度。盒子界定的四分位数范围（IR）或中间50％的浓度。数据在日志基数2比例上表示。
(B)验证队列中使用MMP1或MMP7或它们的组合将样本分类为IPF(散发性或家族性)或对照的ROC曲线。
(C和D)血清MMP7浓度与FVC% (C)和DL降低中度相关一氧化碳%（D）。线性回归和95%置信区间与MMP7浓度（ng/ml）与FVC%和DLCO%呈负相关*P<0.05，**P<0.01，以及***P< 0.001。
在该队列中，MMP1浓度升高和MMP7浓度升高可以以89.2%的敏感性(95% CI 71.8%-91.7%)和95.0%的特异性(95% CI 75.1%-99.9%)将IPF与对照组区分开来，支持我们的衍生队列研究结果(图5B)。
讨论
总的来说，据我们所知，我们的研究首次证明了IPF患者外周血蛋白特征。MMP7和MMP1，这两种基质金属蛋白酶先前与IPF发病机制有关[31]，在IPF患者的血浆，血清，BAL流体和肺组织中显着增加，表明外周血中的MMP7和MMP1水平呈现出表征IPF肺泡微环境的病理变化。组合使用，MMP1和MMP7的血液水平可以区分IPF患者，这些慢性肺病包括HP，一种常见的间质性肺炎，有时可以与IPF无法区分[32–34］．亚临床家族性肺纤维化患者MMP7血药浓度升高，且较高的MMP7水平与疾病严重程度相关。综上所见，我们的发现支持使用MMP1和MMP7作为IPF生物标志物，并建议它们在诊断、早期检测和疾病进展监测中的作用应进一步研究。
IPF患者血液中12种蛋白中有多种MMPs显著升高。MMPs的作用在IPF中得到了深入的研究和讨论[35］．虽然基质蛋白酶在调节上皮细胞对损伤的异常反应、成纤维细胞增殖、细胞外基质积累和异常组织重塑方面有多种不同的作用，但共识是，基质降解酶家族参与了疾病发病机制[31,36–40］．本研究中排名靠前的两个蛋白是已知在IPF肺中活化的肺泡上皮中显著过表达的MMPs。MMP1是一种基质金属蛋白酶，主要降解纤维胶原，在正常情况下很少表达，但在IPF肺的反应性肺泡上皮细胞中高度过表达[39］．MMP7，一种具有多种局部炎症调节作用的基质金属蛋白酶[41,42]，也在IPF的肺泡上皮细胞中高度上调[39,43］．此外，MMP7敲除小鼠相对保护来自Bleomycin诱导的纤维化[39提示MMP7在IPF中可能具有促纤维化作用。在上述背景下，我们的研究结果强烈表明，IPF肺中活化的上皮细胞可能是外周血MMP1和MMP7浓度升高的来源，因此支持将它们作为疾病检测和进展的生物标志物。
我们的数据显示，COPD(一种慢性进行性肺病)和结节病(一种慢性肉芽肿性ILD)患者外周血MMP7或MMP1浓度均未显著升高。此外，外周血MMP1浓度升高，在MMP7浓度升高的情况下，可将IPF与HP区分开来。MMP7基因表达的一个类似的趋势,可以发现在肺部的IPF患者和惠普,进一步支持了这种观点,即MMP7和外围血药浓度的变化可以反映肺癌基因环境,构成一个特定疾病的信号。这一发现在临床上可能非常重要，因为亚急性HP经常被误诊为特发性非特异性间质性肺炎(NSIP)，而慢性晚期HP与IPF无法区分[32–34］．事实上，最近的研究表明，在慢性鼠核疫苗中观察到的组织病理学和HRCT异常通常与通常的间质肺炎（UIP）重叠，这代表了对这些条件的鉴别诊断的重要挑战[33,34,44］．因此，IPF中观察到的外周血MMP7和MMP1浓度升高并非由于慢性肺病的全身应激反应，并可将COPD、结节病和HP与IPF区分开。虽然现阶段我们不主张仅依靠外周血MMP7和MMP1浓度来区分IPF与HP、结节病或难度较小的COPD鉴别诊断，但知道这些浓度可能会影响临床决策。
我们没有将IPF与其他特发性间质性肺炎(如NSIP)进行比较。我们的数据中没有任何东西表明我们可以利用MMP7和MMP1外周血浓度来区分IPF和这些疾病。事实上，在亚临床ILD患者中发现的MMP7升高可能表明这种升高可能存在于其他特发性ILD中。此外，IPF和NSIP的基因表达模式极为相似[30.,45]，最近也发现IPF和NSIP患者的BAL MMP7水平相似[46］．这些研究的主要局限性是NSIP病例数量少，因为孤立的NSIP非常罕见。因此，我们的结果应该鼓励建立多中心采集的ILD患者外周血样本，有足够的力量来确定NSIP和IPF是否在外周血蛋白表达上存在差异。
与其他研究相比，我们分析的主要属性包括衍生队列的规模相对较大，在IPF患者队列中检测到大量蛋白质，外周血生物标记物水平与其在肺和BAL中的基因表达水平的比较，与其他慢性肺部疾病的多个相对较大的对照人群进行比较，以确定我们发现的特异性，并在独立验证队列中验证我们的初始结果。我们的验证队列的一个独特特征是，它包含亚临床ILD患者，这些患者是家族性IPF患者的无症状一级亲属。这些患者有早期ILD的HRCT表现，但没有肺功能异常、咳嗽或呼吸困难[19.,21.］．对该队列样本的分析使我们能够证明，MMP7浓度在早期亚临床肺病患者中显著较高，提示MMP7可能是早期无症状ILD的一个标志物。外周血MMP7浓度也与肺功能测试相关，肺功能测试是疾病严重程度的替代指标，因此可能反映IPF中肺重塑的分子机制[31］．当然，不同平台和不同样本类型的使用限制了我们在现阶段设置特定疾病MMP浓度阈值的能力。然而，我们在不同样本类型和多个队列中的结果的可重复性和一致性表明，这样的阈值可以而且应该确定。
总之，在这项研究中，我们第一次报道了我们所知的局限于肺的疾病中外周血蛋白标记的存在。这一特征由MMPs、TNF受体和一些趋化因子组成。我们的数据表明，外周血中这两种标志物(MMP1和MMP7)的增加也在肺中观察到，可能与IPF有关。我们在一个独立的验证队列中验证了我们的观察结果，表明MMP7与疾病严重程度相关，并且在亚临床ILD患者中增加。虽然其他研究将确定该蛋白标记在临床实践中的价值，但我们的结果支持外周血蛋白作为器官限制疾病(如IPF)的生物标志物的潜在价值。如果经过验证，这些生物标记物有可能极大地促进IPF新疗法的引入，并深刻地影响这些患者的治疗。
支持信息
加入数据
Entrez基因id (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)，本文讨论的蛋白有:AGER, 177;CCL11, 6356;CXCL10, 3627;IL12B, 3593;IGFBP1, 3484;可以,4312;MMP3, 4314;MMP7, 4316;MMP8, 4317;MMP9, 5318; TNFRSF1A, 7132; TNFRSF1B, 7133.
致谢
作者希望感谢L. Chensny，A.Marrangoni，K. Johnson和M. Bisceglia在加工样品和D. Plaskon来维护数据库的帮助下。A. Choi，J. Moss，E. Feingold和J. Lee提供了有用的讨论和建议。未经Simmons中心患者和肺部关键护理医学分支的合作，本研究将无法实现。
作者的贡献
IOR有助于招募和分析验证队列、数据分析、研究的概念和设计、数据分析和手稿准备。TJR为项目概念化、数据分析、统计和论文初稿的撰写做出了贡献。KK有助于微阵列数据的生成和分析，研究的概念化和手稿的生成。YZ为样品收集和方案开发、数据分析和手稿生成做出了贡献。KG有助于参与者招募、诊断和确定结节病队列以及衍生队列、方案制定、实验规划和手稿准备。AEL有助于Luminex数据生成，包括定制分析和数据分析。KOL有助于衍生队列的参与者招募和诊断确定、方案制定和手稿准备。JC有助于HP队列的参与者招募和诊断确定、ELISA测定、数据分析和手稿准备。SDM有助于参与者招募和确认验证队列的诊断、方案开发和手稿准备。AP对数据分析和手稿准备做出了贡献。 FS contributed to participant recruitment and diagnosis ascertainment of the COPD cohort, protocol development, and manuscript preparation. JD contributed to conceptualization of proposed studies, diagnosis ascertainment of the derivation cohort, data analysis, and manuscript preparation. MS contributed to participant recruitment and diagnosis ascertainment of all Mexican patient cohorts, planning of the study, preparation of early drafts, and manuscript development. BRG contributed to design and conceptualization of the research project, participant recruitment and diagnosis ascertainment of the validation cohort, protocol development, and manuscript preparation. NK contributed to design and conceptualization of the research project, analysis of all data including gene expression and protein measurements, paper writing, and manuscript submission.
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