数据
摘要
背景
结核病仍然是世界范围内的主要死亡原因。世界上近三分之一的人口感染结核杆菌，每年约有800万人患上活动性结核病，200万人因此死亡。今天的结核病治疗可以追溯到20世纪70年代，是漫长而繁重的，需要至少6个月的多药化疗。耐多药结核病(MDR-TB)的出现以及该感染与艾滋病毒/艾滋病的致命协同作用使情况进一步恶化。全球卫生和慈善组织现在正在呼吁新的药物干预措施，以解决结核病治疗中这些未满足的需求。
方法和发现
在这里，我们报道OPC-67683，一种硝基二氢咪唑衍生物，被筛选出来以帮助对抗结核病治疗中未满足的需求。该化合物是一种真菌酸生物合成抑制剂，无致突变性，对包括耐多药结核病在内的结核病具有强效活性，其体外最低抑制浓度(MIC)范围极低，为0.006 ~ 0.024 μg/ml，体内低剂量具有高效治疗活性。此外，OPC-67683抗生素后对细胞内作用的结果结核分枝杆菌显示该药剂对细胞内也具有高度和剂量依赖性的活性结核分枝杆菌H37Rv在0.1 μg/ml浓度下的活性与一线药物利福平(RFP)在3 μg/ml浓度下的活性相似。与由RFP、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EB)和PZA组成的标准方案相比，OPC-67683与RFP和吡嗪酰胺(PZA)联合表现出明显更快的肺部活结核杆菌根除(至少2个月)。此外，OPC-67683不受肝脏微粒酶的影响，也不影响肝脏微粒酶的活性，这表明OPC-67683可能与包括抗逆转录病毒药物在内的诱导或由细胞色素P450酶代谢的药物联合使用。
引用:Matsumoto M, Hashizume H, Tomishige T, Kawasaki M, Tsubouchi H, Sasaki H，等(2006)一种具有体外和小鼠抗结核作用的硝基-二氢咪唑唑衍生物OPC-67683。公共科学图书馆医学3(11):e466。https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0030466
学术编辑器:Philip Hopewell，加州大学旧金山分校，美利坚合众国
收到:2006年2月20日接受:2006年9月20日;发表:二六年十一月二十八日
版权:©2006 Matsumoto et al。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。
资助:大冢制药是这项研究的唯一资金支持者。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
利益冲突:所有作者都是大冢制药公司的科学家，该公司是OPC-67683的发起人和所有者，也是这些研究的唯一财政支持者。然而，该公司尚未上市交易，作者中没有人拥有或预计不会拥有股票期权。
缩写:BRM，细菌反向突变;菌落形成单位CFU;DMSO(二甲亚砜;EB,乙胺丁醇;HPLC，高效液相色谱;癌症研究所ICR;异烟肼、异烟肼;LTBI，潜伏性结核杆菌感染;耐多药结核病，耐多药结核病;MIC:最低抑菌浓度; PZA, pyrazinamide; RFP, rifampicin; SM, streptomycin; TB, tuberculosis
编者总结
背景。
世界上三分之一的人口感染了疟疾结核分枝杆菌,导致肺结核的细菌。大多数被感染的人都是健康的——这种细菌可以潜伏数年，隐藏在身体的细胞中。然而，每年有800万人患上活动性结核病，这是一种通常影响肺部的慢性疾病，200万人死亡。在20世纪下半叶的大部分时间里，由于20世纪40年代以来开发出的强效抗生素，结核病的发病率一直在下降。tb - 4抗生素的标准治疗方法是每周服用几次，至少持续6个月，以消除任何潜在的感染结核分枝杆菌细菌——在20世纪70年代末被引入，拯救了许多生命。然而，最近，由于艾滋病毒/艾滋病的流行(免疫系统受损的人非常容易感染结核病)和耐多药细菌的出现，根除结核病的努力受到了阻碍。
为什么要做这项研究?
结核病的治疗是漫长而令人不快的，患有耐多药结核病的患者必须使用效果较差、价格更贵、毒性更大的二线药物进行治疗。此外，对于同时感染艾滋病毒和结核病的人，一些抗逆转录病毒药物和抗结核病药物不能同时使用。许多药物要么被肝脏中的酶激活，要么被清除，所以这两类药物的组合有时会改变肝功能，导致临床问题。因此，迫切需要新的、有效的抗结核病药物结核分枝杆菌与现有的药物不同。理想情况下，这些药物应该对MDR有效结核分枝杆菌它们在低剂量下很快起作用，对潜在细菌有活性，对肝脏的影响最小，因此可以用于同时感染艾滋病毒的患者。在这项研究中，研究人员研究了一种名为OPC-67683的化学物质。
研究人员做了什么，发现了什么?
研究人员发现了一种化合物，它可以抑制真菌酸的产生，真菌酸是植物细胞壁的基本成分结核分枝杆菌他们测试了它杀死细菌的能力。然后，他们详细测试了它在抗生素敏感和MDR培养皿中抑制细菌生长的能力结核分枝杆菌以及从病人身上分离出来的病毒。OPC-67683抑制所有这些细菌生长的浓度低于标准结核病治疗中使用的四种抗生素。它还可以杀死隐藏在人体细胞内的细菌，甚至比这些药物更好。接下来，研究人员对感染病毒的小鼠进行治疗结核分枝杆菌与opc - 67683。他们发现，与标准药物相比，它以较低的浓度减少了正常小鼠和免疫功能低下小鼠肺部的细菌数量。此外，当与两种标准药物联合使用时，它将标准药物方案清除肺部细菌所需的时间缩短了两个月。最后，研究人员表明，OPC-67683对代谢抗逆转录病毒药物的肝酶没有影响，相反，OPC-67683的活性不受肝酶的影响。因此，这种药物不太可能在接受抗逆转录病毒药物治疗的HIV患者中引起临床问题或失去疗效。
这些发现意味着什么?
这些来自实验室和动物实验的结果表明，OPC-67683可能满足一种新的抗结核药物的标准。OPC-67683对耐多药结核病有效。它对细胞内结核病也有活性，作者假设这可能与有效治疗潜伏结核病有积极的联系，当与现有的抗结核药物联合使用时，它在动物身上很快起作用。重要的是，它也会禁用结核分枝杆菌以一种独特的方式，似乎对肝脏没有任何重大影响，可能会阻止它与抗逆转录病毒药物联合使用。所有这些临床前的特征现在都需要在人身上进行检查——许多药物在临床前研究中表现良好，但在患者身上却失败了。研究人员写道，鉴于结核病的激增，这些临床研究需要加快，而且OPC-67683需要与传统药物和其他新药联合进行测试，以便尽快找到治疗结核病的最佳新药方案。
介绍
结核病仍是世界范围内导致死亡的主要原因[1]。世界上近三分之一的人口感染结核杆菌，每年约有800万人患上活动性结核病，200万人因此死亡[2]。今天的结核病治疗可以追溯到20世纪70年代，时间长且负担重，需要至少6个月的多药化疗，通常包括在临床观察条件下给予的利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EB)和吡嗪酰胺(PZA)。耐多药结核病(MDR-TB)的出现以及该感染与艾滋病毒/艾滋病的致命协同作用使情况进一步复杂化[3.- - - - - -6]。耐多药结核病患者必须使用含有二线药物的联合治疗，这些二线药物疗效较差，价格较高，毒性更大。结核病与艾滋病毒/艾滋病的致命协同作用，使潜伏结核杆菌感染(LTBI)的艾滋病毒阳性个体发展为活动性结核病的风险增加30至50倍，使结核病成为艾滋病患者的头号杀手[6]。
然而，制药业通常对开发新的、更有效的药物来满足这些需求表现出很少的兴趣，因此，自1966年引入RFP以来，还没有推出具有新的作用机制的抗结核新药。因此，全球卫生和慈善组织现在正在呼吁新的化疗干预措施，以缩短治疗的总时间，提高抗耐多药结核病的疗效，安全地治疗同时感染艾滋病毒/艾滋病的患者，并针对LTBI [6，7]。
我们启动了一个项目，以筛选具有新的结构和机制能够抑制霉酸生物合成的有效抗结核药物，并发现硝基二氢咪唑唑衍生物表现出这种活性。硝基杂环化合物，包括各种5-硝基咪唑和2-硝基咪唑以及5-硝基呋喃，已知对人和动物的各种原生动物和细菌感染有效[8]。然而，这些化合物也被认为通常具有诱变性。cgi - 17341 (图1)，是一种硝基咪唑衍生物，据报道具有抗结核活性[9，10]，但由于其诱变特性，该化合物没有被开发出来。我们通过进行细菌反向突变(BRM)试验，重点研究了具有抗结核活性、无诱变性的新型硝基二氢咪唑唑[11]。在我们之前筛选的化合物中，在2位具有单烷基或双烷基取代基的化合物约95%具有诱变性。然而，在取代基上引入杂原子后，我们能够成功地将诱变率降低到16%。在非诱变衍生物中，我们发现OPC-67683具有有效的抗结核活性。然后，我们进一步评估了OPC-67683，以确定该化合物是否有助于解决结核病治疗未满足的需求。
opc - 67683:R) 2-methyl-6-nitro-2 - {4 - [4 - (4-trifluoromethoxyphenoxy) piperidin-1-yl] phenoxymethyl} 2, 3-dihydroimidazo (2, 1 -b恶唑。
方法
培养基
文化的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌卡介苗在Middlebrook 7H9肉汤(BBL，http://www.bd.com)和Middlebrook 7H11琼脂培养基(BBL)。这两种介质都是根据制造商的说明配制的。
用于体外研究的药物制备
OPC-67683、PA-824和CGI-17341由大冢制药(http://www.otsuka.global.com）;RFP、INH、EB、链霉素(SM)和PZA均购自Sigma (http://www.sigmaaldrich.com)。OPC-67683、RFP、INH、PZA和PA-824分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，用DMSO按2倍稀释倍数连续稀释至所需浓度。将EB和SM溶解在蒸馏水中，用2倍稀释的蒸馏水连续稀释至所需浓度。
体内研究的药物制备
OPC-67683, PA-824, RFP, INH, EB和PZA分别在砂浆中研磨，并使用超声波发生器溶解或悬浮在5%阿拉伯树胶溶液中。然后使用5%阿拉伯胶溶液进行两倍稀释，以调整到所需的浓度。
菌株
结核分枝杆菌ATCC 25618 (H37Rv)，结核分枝杆菌ATCC 35838 (H37Rv-R-R)，结核分枝杆菌ATCC 35822 (H37Rv-H-R)，结核分枝杆菌ATCC 35837 (H37Rv-E-R)结核分枝杆菌ATCC 35820 (H37Rv-S-R)，结核分枝杆菌ATCC 35801 (Erdman)，以及结核分枝杆菌ATCC 35812 (Kurono)购自American Type Culture Collection (http://www.atcc.org)。牛分枝杆菌IID 982 (BCG Tokyo)购自东京大学医学科学研究所。总共67个结核分枝杆菌这项研究中使用的菌株是从日本、缅甸、泰国、柬埔寨、印度尼西亚、越南和中国分离出来的。
BRM测试
BRM测试按照OECD指南471进行沙门氏菌tyiphimuriumTA98, TA100, TA1535和TA1537，以及大肠杆菌WP2uvrA［11]。每个菌株在37°C下使用营养肉汤预培养18小时(Nissui Pharmaceutical;http://www.nissui-pharm.co.jp/index_e.html)。在OD660 nm调整到2.4后，将每种细菌悬液添加到含有指定化合物的试管中，在没有或存在大鼠肝脏微粒体(S9)混合物的情况下。37°C孵育20分钟后，将顶部琼脂添加到每个试管中，将内容物倒入最低必要培养基(Oriental Yeast;http://www.oyc.co.jp/e/index.htm)。37°C孵育48 h后计数回切物数量。
敏感性测试
采用先前报道的程序进行药敏试验[12，13]。将每一种保存在深冰箱中的细菌溶解并调整到大约10个6菌落形成单位(CFU)/ml。用指定的细菌悬液将含有药物的培养皿接种到大约10个6CFU/ml使用多点接种器(Sakuma Seisakusho;http://homepage1.nifty.com/sakuma2000)。每个培养皿在37°C下孵育14 d，分析以确定最低抑菌浓度(MIC)。MIC表达为培养后在琼脂培养基上抑制机体可见生长的最低浓度。
为了评估对临床分离菌株的敏感性，根据国家临床实验室标准委员会推荐的以下标准确定耐药性[14RFP为1.0 μg/ml, INH为1.0 μg/ml, EB为7.5 μg/ml, SM为10 μg/ml。我们计算了90%的敏感菌株被抑制的浓度(MIC90)和95%置信区间采用probit方法。
对真菌酸生物合成的抑制活性
牛分枝杆菌将卡介苗细胞培养液以0.98 ml的体积分配到每个检测管中，然后加入0.01 ml的测试样品溶液或DMSO(载体对照)。然后，0.01毫升的2-14将C乙酸钠盐以1 mCi/管(37 Bq/管)的浓度添加到每管中，然后在37°C下孵育60分钟14收集C标记细胞，2000 × g离心10 min，用2 ml 10%氢氧化钾/甲醇(20%氢氧化钾:甲醇= 1:1,vol/vol)在37℃水解1 h。孵孵期后，加入1 ml 6 M盐酸，轻轻混合。然后加入正己烷5 ml，摇提20 min，分离上相离心(1000 × g 5 min)，取4 ml上相转移到另一管中，100℃干燥。甲基酯化时，加入1 ml苯-甲醇-浓硫酸(10:20:1,vol/vol/vol)，在100°C下培养1 h干燥。然后加入0.2 ml正己烷，混合提取14c标记脂肪酸和真菌酸。提取的脂肪酸和真菌酸亚类被分离到硅胶60 F254薄层板上(薄层色谱板，默克日本;http://www.merck.co.jp/eng/index.html)。将0.01 ml提取的正己烷相涂抹在平板上，并在第一种溶剂(正庚烷-二乙醚-乙酸[94:5:1,vol/vol/vol])中显影至直径4cm，在第二种溶剂(石油醚-乙酸[98:2,vol/vol])中显影至直径8cm。用成像板(BAS-SR, fujifilil;http://www.fujifilm.com)，并按下列程序进行分析:14使用BAS-2500成像系统(Fujifilm)检测c标记脂肪酸和真菌酸。使用Image Gauge软件(Version 2.54)计算每个分枝霉酸亚类的放射性为光刺激发光。
使用SAS软件(R.8.1, SAS Institute;http://www.sas.com)，显示对照百分比的数值，这些数值是由Image Gauge软件(Version 2.54)根据每个光刺激发光的结果自动计算出来的。检验的显著性水平设置为5%。集成电路50用对数变换浓度的线性回归分析计算值(抑制50%所需的浓度)和95%置信区间。
OPC-67683与牛分枝杆菌BCG东京
15 μl14将C OPC-67683 (0.5 mg/ml:1 μCi/μl)加入585 μl的7H9/TN-ADC肉汤或细菌培养液中孵育48 h，孵育后加入2倍体积的乙腈拌匀。裂解液在15,000 rpm下离心5 min，上清液采用高效液相色谱(HPLC)和流动闪烁分析仪分析，确定代谢物模式。在平行实验中，将0.1 ml上清液加入含有5ml闪烁鸡尾酒(Ultima Gold, Perkin Elmer;http://www.perkinelmer.com)。将颗粒悬浮于600 μl 2 M氢氧化钠中，60℃孵育1 h后，取0.1 ml悬浮液加入闪烁鸡尾酒瓶中。使用闪烁计数器(LS5000CE, Beckman;www.beckmancoulter.com http: /)来证实共价结合放射性分子的存在。
OPC-67683和混合后代谢产物结构的测定牛分枝杆菌BCG东京
将75 μl OPC-67683 (0.5 mg/ml)加入到2925 μl 7H9/TN-ADC肉汤中牛分枝杆菌卡介苗东京菌培养，孵育72 h。孵育后，加入2倍体积的乙腈，混合均匀。将裂解液在15000 rpm下离心5 min，然后用LC-MS/MS分析上清液，确定OPC-67683混合产生的检测到的代谢物的结构牛分枝杆菌BCG东京。鉴定的代谢物由大冢制药公司合成，然后将代谢物的片段模式与基于预测结构新合成的另一种化合物的片段模式进行比较。
对细胞内分枝杆菌的活性
用100 ng/ml phorbol 12- myrista13 -acetate (PMA)在rmii -1640培养基中诱导人THP-1单核细胞分化为巨噬细胞，并按1 × 10的比例分布62 d孵育后/ml。用6.88 log接种分化后的巨噬细胞10CFU的结核分枝杆菌H37Rv孵育4 h，用培养基洗涤2次，基本去除非感染菌，再用20 μg/ml SM处理20 h，杀灭剩余存活的胞外菌。细胞中CFU起始计数为6.42 log10CFU。随后用指定的测试化合物处理细胞4小时，然后用新鲜介质洗涤两次以去除添加的测试化合物。再培养68小时后，用0.1% SDS裂解细胞，并在7H11琼脂板上计数活菌，以确定对细胞内分枝杆菌的效力。
结核病小鼠实验模型的血浆水平
用0.05 ml含氯胺酮和xylazine (Ketalar 50 [Sankyo;http://www.sankyo.co.jp/english/Serakutaru2%[拜耳;http://www.bayer.com])/无菌生理盐水溶液= 8:3:9)，经气管内接种0.05 ml细胞悬液(1,010 CFU)感染结核分枝杆菌使用喂药针和微注射器，并在开始给药前放置28 d。指定的化合物溶解或悬浮在5%阿拉伯胶中，然后口服。在乙醚麻醉下，每个时间点的血液样本(约1ml)从腹腔腔后收集到肝素化注射器中。然后将血液样本离心(3000 rpm, 5°C)以提取血浆。将血浆(0.1 ml)与乙腈(0.2 ml)混合用于RFP，与乙醇(0.3 ml)混合用于INH、EB和PZA。对于OPC-67683，将得到的血浆通过0.22-μm过滤器过滤，然后将0.1 ml过滤后的血浆与0.5 ml 0.5 M碳酸盐缓冲液(pH 10)和5ml乙醚混合。摇10分钟后，有机层(4 ml)在40°C下用氮气干燥，用0.2 ml甲醇/水/甲酸(50/50/0.1)溶解。采用HPLC和高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)对样品进行分析。
治疗效果
为了评估OPC-67683的治疗效果，我们设计了三个实验，使用不同的TB小鼠模型，如下所述。在每个实验中，指定的化合物溶解或悬浮在5%阿拉伯胶中，每天口服一次。治疗期结束时，在乙醚麻醉下对小鼠实施安乐死(经腹腔下腔静脉放血)，无菌切除肺。在切除的肺中加入无菌蒸馏水后，用玻璃匀浆机将肺均匀地捣碎，然后用蒸馏水进一步稀释匀浆。然后将每种稀释后的溶液0.1 ml用摊布器涂抹在7H11琼脂板上，制备每个肺匀浆的涂抹板。分散匀浆溶液后，37°C孵育，14 d后计数形成菌落数。
慢性结核病小鼠模型的治疗效果。
为考察OPC-67683的治疗效果并确定其治疗剂量范围，采用肿瘤研究所(ICR)小鼠接种OPC-67683建立慢性结核小鼠实验模型结核分枝杆菌然后每天给药一次OPC-67683、RFP、INH、EB、SM或PZA，持续28天，以检查肺中活菌计数的变化。ICR小鼠静脉接种8.6 × 104CFU的结核分枝杆菌Kurono。28天后，小鼠被分为(n =5/组)采用分层随机化方法，根据每只感染小鼠的体重。然后，每天口服一次测试化合物，持续28天(OPC-67683: 40 - 0.156 mg/kg, RFP: 20 - 1.25 mg/kg, INH: 20 - 1.25 mg/kg, EB: 160 - 20mg /kg, SM: 160 - 20mg /kg, PZA: 320 - 40mg /kg, PA-824: 40 - 1.25 mg/kg[2倍稀释])。CFU计数按上述方法进行。所有肺均用5ml无菌蒸馏水均质。
采用SAS软件(R.8.1)对接种后57天存活至尸检的小鼠肺内活菌数量和接种后29天开始治疗时肺内活菌数量进行统计分析。检验的显著性水平设置为5%。基于肺内活菌计数的对数转换值，采用线性回归分析进行剂量依赖性测试。当剂量依赖性得到确认时，随后进行Williams试验(低尾试验)，当剂量依赖性未得到确认时，随后对每个对照组进行Dunnett试验(双尾试验)。
免疫功能低下小鼠实验性结核模型的治疗效果。
为了研究免疫是否与体内的作用机制有关，我们使用缺乏常规CD4的BALB/c裸鼠进行了实验+和CD8+T细胞。比较了OPC-67683在裸鼠和免疫正常小鼠体内的抗结核活性。BALB/c裸鼠和BALB/c小鼠分别静脉接种2.04 × 104CFU的结核分枝杆菌接种后1 d，小鼠分为(n =5/组)采用分层随机化方法，根据每只感染小鼠的体重。OPC-67683每天口服一次，持续10 d (OPC-67683: 10 - 0.313 mg/kg[2倍稀释])。CFU计数按上述方法进行。所有肺均用5ml无菌蒸馏水均质。
与常规药物联合使用的治疗效果。
对一种包含OPC-67683的新方案进行了评估，并与全球标准方案进行了比较，以确定在慢性结核病实验小鼠模型中缩短治疗持续时间的最佳方案。ICR小鼠在麻醉下气管内接种855 CFU结核分枝杆菌并静置28 d，使动物发展为慢性结核。分组(n =6/组)按每只感染小鼠体重分层随机化方法进行。然后口服OPC-67683、RFP和PZA联合2个月，或RFP、INH、EB和PZA作为强化治疗，再口服OPC-67683和RFP联合2个月或RFP和INH联合4个月作为维持治疗。本实验中使用的剂量使小鼠的血浆水平与人类使用的标准剂量相似:对于RFP，我们使用5 mg/kg;INH为10 mg/kg;EB为100 mg/kg;PZA为100毫克/公斤。我们将OPC-67683的剂量设定为2.5 mg/kg。
标准方案组和载体对照组分别于接种后第29、57、85、113、141、169和177天进行尸检，新方案组分别于接种后第29、57、85、113和141天进行尸检。给药组的每只小鼠在切除的肺中分别加入5ml消毒蒸馏水和2ml消毒蒸馏水后，用玻璃均质器将肺均匀地捣碎，制备肺匀浆。所有对照组的肺匀浆制备方法为:在切除的肺中加入5ml消毒蒸馏水后，用玻璃匀浆器均匀地捣碎肺。将治疗2-6个月后各组肺匀浆样本涂抹在7H11琼脂板上，制备肺匀浆涂片。
采用SAS软件(R.8.1)对接种后存活至尸检的小鼠肺中活菌数量进行统计分析。检验的显著性水平设置为5%。在第57天、第85天、第113天和第141天解剖的小鼠肺中活菌数进行对数转换，使用双尾Dunnett试验将新方案与标准方案进行比较。计算平均值和95%置信区间来评估新方案。
OPC-67683在人和动物肝微粒体中的体外代谢
本研究利用人、大鼠、小鼠、狗、兔和猴肝脏微粒体研究OPC-67683代谢反应产生的代谢物。来自10位捐赠者的人肝微粒体(20 mg/ml)在生物医学研究所人与动物之桥讨论小组(日本千叶)制备[15]。人类肝脏样本合法地从国家疾病研究交流中心(http://www.ndriresource.org/)，透过与人兽之桥讨论小组的国际伙伴关系。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。
以100 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、100 μM OPC-67683、2.5 mM β-NADPH、2.5 mM β-NADH和1 mg/ml微粒体蛋白为培养液，最终孵育量为0.5 ml。将OPC-67683溶解在DMSO中，反应体系中有机溶剂浓度为1% (v/v)。反应在37°C的震荡水浴中进行2 h。用乙腈和乙酸乙酯提取孵卵混合物，用HPLC和LC-ESI-MS/MS分析样品。
OPC-67683对人肝微粒体细胞色素p450介导反应的影响
7-ethoxyresorufinOCYP1A1/2的去乙基酶活性，CYP2A6的香豆素7-羟化酶活性，7-苄氧基间苯磺酸O根据先前的报道，测定了CYP2B6的-脱苄基酶活性、CYP2C8/9的甲苯丁酰胺甲基羟化酶活性、CYP2C19的s -甲苯妥英4 ' -羟化酶活性、CYP2D6的丁呋喃醇1 ' -羟化酶活性、CYP2E1的氯唑唑酮6-羟化酶活性以及CYP3A4的睾酮6β-羟化酶和硝苯地平氧化活性[16]。
0.5 ml含微粒体蛋白(0.1 - 0.5 mg)、0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)、0.1 mM EDTA、nadph生成体系(2.5 mM β-NADP、25 mM葡萄糖-6-磷酸、2单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和10 mM氯化镁)的标准培养混合物，以及含或不含OPC-67683的底物。OPC-67683溶于DMSO中，以5 μl的体积加入孵育。底物溶解在以下溶剂中:7-乙氧基间苯二酚和7-苄氧基间苯二酚在DMSO中;乙醇中的香豆素、呋喃醇和硝苯地平;甲苯磺丁脲、年代-甲醇中的甲苯妥英和睾酮;氯唑嗪酮在1% (w/v)水溶液中。底物溶液以5 μl的体积加入孵育。酶孵育重复进行，并用高效液相色谱法测定代谢物的形成。
本研究对测定方法进行了验证。建立了间苯二酚(0.2 ~ 200 nM，r= 0.9996)， 7-羟基香豆素(0.05-5 μM，r= 0.9998)， 4-羟基甲苯丁酰胺(0.05-10 μM，r= 0.9998)， 4-hydroxymephenytoin (0.025-5 μM，r= 0.9996)， 1 ' -羟基呋喃醇(0.025-5 μM，r= 0.9995)， 6-羟基氯唑嗪酮(0.25 ~ 100 μM，r= 0.9994)， 6β-羟基睾酮(0.03-30 μM，r= 0.9994)，氧化硝苯地平(0.1 ~ 25 μM，r= 0.9998)。
7-乙氧基再吸收素(0.5 μM)、香豆素(2 μM)、7-苄氧基再吸收素(1.5 μM)、甲苯丁酰胺(400 μM)、年代以-甲苯妥英(100 μM)、丁呋喃醇(20 μM)、氯唑嗪酮(100 μM)、睾酮(100 μM)、硝苯地平(50 μM)为底物浓度，测定OPC-67683 (1 ~ 100 μM)存在时的残留活性。底物的浓度近似于K米先前报道的酶值[17]。本研究使用选择性细胞色素P450抑制剂来证实分析的有效性。7, 8-benzoflavone [18]， furafylline [19]， orphenadrine [20.]，槲皮素[21]、磺苯唑[22]，氨氰丙胺[23]、奎尼丁[24]，二乙基二硫代氨基甲酸酯[25]、酮康唑[26]，分别抑制CYP1A1、1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4酶活性。二乙基二硫代氨基甲酸酯也被认为是CYP2A6的特异性抑制剂[18]，本研究证实了该化合物对cyp2a6介导的代谢具有较强的抑制作用。
结果
BRM测试
根据OECD指南471，在没有和存在S9混合物的情况下，使用BRM测试评估了OPC-67683的诱变潜力。如表1， OPC-67683无致突变性。
OPC-67683细菌反向突变试验
敏感性测试
对标准菌株的mic显示在表2．在0.006 ~ 0.012 μg/ml浓度范围内，OPC-67683均能抑制药敏菌和耐药菌的生长结核分枝杆菌．OPC-67683的mic值分别为4 ~ 64、2 ~ 32、128 ~ 256、64 ~ 512、8 ~ 16，比RFP、INH、EB、SM、cg -17341、PA-824低4 ~ 16倍。这些结果表明，OPC-67683对药敏菌株和耐药菌株均具有最强的抗分枝杆菌活性。
OPC-67683体外抗分枝杆菌活性与RFP、INH、EB、SM、cg -17341、PA-824比较
对67株临床分离菌株的抗结核活性进行了评价。麦克风90OPC-67683、RFP、INH、EB和SM的值(范围)分别为0.012 μg/ml (0.006 ~ 0.024 μg/ml)、0.288 μg/ml (0.05 ~ 0.78 μg/ml)、0.099 μg/ml (0.05 ~ 0.78 μg/ml)、3.636 μg/ml (0.78 ~ 6.25 μg/ml)和2.938 μg/ml (0.39 ~ 6.25 μg/ml)。基于这些结果，MIC90OPC-67683分别比RFP、INH、EB和SM低24倍、8倍、303倍和244倍。我们的评估结果表明，OPC-67683抑制了临床分离的药物敏感菌的生长结核分枝杆菌在与标准菌株相同的范围内，并且还显示出对目前使用的抗结核药物RFP、INH、EB或SM耐药的临床分离菌株的活性。这些结果表明，OPC-67683对药物敏感菌株和耐药菌株都表现出抗分枝杆菌活性，并且它与目前使用的任何抗结核药物都没有交叉耐药性。这些数据显示在表3．
麦克风90OPC-67683抗药物敏感和耐药结核分枝杆菌
此外，OPC-67683与目前使用的抗结核药物RFP、INH、EB和SM联合使用的疗效通过棋盘法在体外进行了检验。这些结果显示在表4．结果表明，OPC-676783与任何测试药物联合使用均无拮抗活性。
OPC-67683与现有结核药物对临床分离结核药物的体外协同活性研究结核分枝杆菌
对真菌酸生物合成的抑制活性
14使用BAS-2500成像系统检测c标记脂肪酸和分枝杆菌酸(未发表数据)。自动计算对照中各分枝杆菌酸亚类的百分比50采用SAS软件计算。结果表明，OPC-67683和INH均抑制真菌酸的合成，但两种化合物的作用方式不同:OPC-67683抑制甲氧基和酮基真菌酸的合成，与IC50浓度为0.021 ~ 0.036 μg/ml时，α-真菌酸的合成不受抑制，而INH对所有真菌酸亚类均有抑制作用50取值范围为0.630 ~ 1.851 μg/ml。的集成电路5095%置信区间值示于表5．
集成电路50OPC-67683和INH抑制真菌酸合成
OPC-67683与牛分枝杆菌波士顿咨询公司
与OPC-67683混合后牛分枝杆菌BCG Tokyo，我们只鉴定出一种主要代谢物，并且这种代谢物的洗脱速度比OPC-67683快。然而，将OPC-67683与实验获得的抗OPC-67683混合后，未观察到代谢物牛分枝杆菌卡介苗东京株。这些结果显示在图2A.使用LC-MS/MS分析上清液，以确定所识别的代谢物的结构。我们发现所鉴定的代谢物的质数为490，并预测该结构为去硝基咪唑。然后，我们合成了一种去硝基咪唑唑，并对所识别的代谢物和新合成的化合物进行了产物离子扫描。我们在每个实验中分别观察到200、352、378和406 m/z的产物离子。对主要代谢物的结构分析表明，其结构为与OPC-67683具有相同取代基的去硝基咪唑。中显示MS谱图2B。
(A) 15 μl14将C OPC-67683 (0.5mg/ml: 0.056 μCi/μl)加入585 μl的7H9/TN-ADC肉汤或细菌培养液中孵育48 h，孵育后加入2倍体积的乙腈拌匀。裂解液在15,000 rpm下离心5分钟。采用高效液相色谱法和流动闪烁分析仪对上清液进行分析，确定代谢产物模式。
(B)经鉴定的代谢物(去硝基-咪唑唑)在大冢制药公司合成，然后通过电喷雾电离质谱将代谢物的片段模式与基于预测结构新合成的另一种化合物进行比较。
此外，当我们用放射性OPC-67683处理药敏菌株时，加入乙腈后没有任何放射性恢复。大约20%的总放射性分布到细胞组分中，而在抗opc -67683菌株中没有观察到这种现象。这些数据显示在表6．
opc -67683敏感和耐药分析牛分枝杆菌卡介苗使用无线电标记OPC-67683
人巨噬细胞内分枝杆菌的活性
为了证实OPC-67683抗生素后对细胞内的影响，进行了一项研究结核分枝杆菌并与RFP、INH和PA-824进行比较。OPC-67683显示出对细胞内的高度活性结核分枝杆菌H37Rv在4小时脉冲照射后以剂量依赖的方式。数据显示在图3．OPC-67683在0.1 μg/ml浓度下的细胞内活性与RFP (3 μg/ml)相似，但优于INH和PA-824，后者在4 h脉冲暴露中均表现出较差的活性。这些结果表明，即使与细胞内的细菌接触有限，OPC-67683也可能有效地杀死细胞内的分枝杆菌。
感染细胞与测试化合物孵育4 h，洗涤，37℃培养至68 h，镀于7H11琼脂上，37℃生长16 d后计数菌落。数值代表平均值±S.D (n =3）.
结核病小鼠实验模型的血浆水平
如表7OPC-67683的血药浓度最低，但半衰期最长。C马克斯和AUCt在试验剂量下，小鼠血浆中的RFP、EB和PZA值与临床剂量下的人血浆中的RFP、EB和PZA值相似。C马克斯小鼠血浆中INH的值也与人类相似，但AUCt在小鼠中比在人类中低。这些参数在小鼠和人血浆之间的比较总结在图4C (27- - - - - -29]。
小鼠口服OPC-67683、RFP、INH、EB和PZA的血药浓度结核分枝杆菌Kurono
(A) ICR小鼠静脉接种结核分枝杆菌Kurono。28 d后，试验化合物每日口服一次，持续28 d (OPC-67683: 40-0.156 mg/kg, RFP: 20-1.25 mg/kg, INH: 20-1.25 mg/kg, EB: 160 - 20mg /kg, SM: 160 - 20mg /kg, PZA: 320 - 40mg /kg, PA-824: 40-1.25 mg/kg;2倍稀释)。平均值(n =5)原木10绘制CFU。
(B) BALB/c标准品和裸鼠静脉接种结核分枝杆菌Kurono。从第二天开始，OPC-67683每天口服一次，持续10 d (OPC-67683: 10 - 0.313 mg/kg, 2倍稀释)。柱形表示为均值，SD (n =5)原木10CFU。
(C)用于评估方案的常规药物剂量汇总在此表中。使用血浆设定的剂量马克斯在小鼠结核病模型中达到的效果与在临床剂量下在人类中达到的效果相当。
(D) ICR小鼠气管内接种结核分枝杆菌Kurono。28 d后，用OPC-67683、RFP和PZA (ORZ)或RFP、INH、EB和PZA (RHEZ)联合治疗小鼠2个月(强化治疗)，再用OPC-67683和RFP治疗2个月或用RFP和INH治疗4个月(维持治疗)(OPC-67683: 2.5 mg/kg, RFP: 5 mg/kg, INH: 10 mg/kg, EB: 100 mg/kg, PZA: 100 mg/kg)。平均值和标准差(n =6)原木10绘制CFU。该分数是指在存活的小鼠总数中至少检测到一个菌落的小鼠数量。
治疗效果
慢性结核病小鼠模型的治疗效果。
opc -67683处理组的活菌数量呈剂量依赖性下降，并观察该化合物的治疗效果，并与参考药物进行比较。结果显示在图4一个和表S1．与对照组相比，OPC-67683肺活菌数显著降低的剂量组为0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 mg/kg;RFP为3.5、5、10和20 mg/kg;2.5、5、10和20 mg/kg的INH;EB为160 mg/kg, SM为20、40、80和160 mg/kg;以及80、160和320毫克/公斤的PZA。
OPC-67683、RFP、INH、EB、SM和PZA在该实验小鼠模型中可使CFU降低至少95%的剂量分别为0.625、3.5、5、>160、40和160 mg/kg。
免疫功能低下小鼠实验性结核模型的治疗效果。
这些结果显示在图4B。
opc -67683处理的BALB/c裸鼠和免疫正常小鼠的肺CFU计数呈剂量依赖性降低，在0.313、0.625、1.25和2.5 mg/kg剂量时观察到显著降低。OPC-67683的疗效在两种类型的小鼠中同样出色。
与常规药物联合使用的治疗效果。
将含有OPC-67683的新方案与标准方案的根除率进行比较。含有opc -67683的方案在前3个月内迅速持续降低(图4D).治疗开始3个月后，在6只动物中只检测到一个菌落;4个月时，在6只动物体内均未检测到菌落。相比之下，在标准方案的6个月时，在5只小鼠中有4只检测到菌落。这些结果表明，含有OPC-67683的新方案可以显著缩短至少2个月的治疗时间。
人与动物肝微粒体的体外代谢
本研究利用人和动物肝微粒体研究OPC-67683体外代谢产生的代谢产物，并研究OPC-67683体外影响CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8/9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4底物代谢的能力。结果显示在表8．
OPC-67683对人肝脏CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8/9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4介导反应的影响
HPLC和LC-ESI-MS/MS数据表明，OPC-67683与人、大鼠、小鼠、狗、兔和猴肝脏微粒体的孵育混合物中几乎检测不到主要代谢物。OPC-67683在人、动物肝微粒体体外代谢中稳定。这些结果表明OPC-67683不被CYP酶代谢。
OPC-67683在浓度达到100 μM时，对CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8/9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4活性既无刺激作用，也无抑制作用，表明在预期的治疗浓度下，OPC-67683与其他cypc代谢药物不会产生显著的临床相互作用。
讨论
鉴于目前结核病药物治疗方案的一些缺点，人们对一种新的抗结核病药物抱有许多期望。理想的新药应该是安全的，能够缩短治疗时间，有效对抗耐多药结核病，治疗合并感染艾滋病毒的结核病患者，并有效解决LTBI。我们在开展结核病研究项目时，就考虑到这些期望。
为了缩短治疗时间，我们将研究重点放在寻找更强效的抗结核药物上，因为历史表明，引入更强效的药物可以有效地缩短所需的治疗时间，RFP和PZA的情况就是如此。为了提高抗MDR-TB的疗效，我们筛选了具有新的结构和作用机制的化合物。此外，为了靶向LTBI，我们重点研究了具有抗细胞内活性的化合物结核分枝杆菌．
分枝杆菌是众所周知的富含蜡的细菌，蜡的主要成分是分枝杆菌酸，它只在分枝杆菌中检测到，而在革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌或哺乳动物细胞中检测不到。结核杆菌的基因组研究证实了这种脂质丰富性，显示有近250种不同的酶参与结核杆菌的脂质代谢[30.]。鉴于分枝杆菌中分枝杆菌酸的重要作用，我们寻找一种能够抑制分枝杆菌酸合成并在体外抗结核活性的化合物。我们发现OPC-67683既具有抑制真菌酸生物合成的活性，又具有体外抑制真菌酸的活性结核分枝杆菌包括耐多药结核病在内的许多菌株的低MIC范围表明了这一点。的集成电路50OPC-67683对分枝杆菌酸亚类的抗结核活性较INH低，这与OPC-67683和INH的体外抗结核活性相关。硝基咪唑唑衍生物的抗结核活性与其对霉酸生物合成的抑制活性密切相关[11]。因此，我们得出结论，OPC-67683对分枝杆菌酸合成的抑制活性是一种作用机制，可归因于它至少与INH一样有效地杀死分枝杆菌。
作为结核分枝杆菌它不仅能兼性生长，而且还能作为细胞内生物在受感染宿主的巨噬细胞中生存和繁殖，我们认为重要的是，一种化合物也能够杀死细胞内结核，这种活性应该与缩短治疗时间有关，并且可能是治疗LTBI的重要因素。因此，我们检测了巨噬细胞来源的THP-1细胞对细胞内结核的杀伤活性。在测试的化合物中，OPC-67683表现出最强的杀伤活性。OPC-67683在0.1 μg/ml浓度下的杀伤活性与RFP在3 μg/ml浓度下的杀伤活性相当，优于INH和PA-824。抗生素的细胞内效力通常在体外使用持续暴露来评估，而不是在动物模型中评估，因为它们通常会根据血浆半衰期迅速消除。OPC-67683即使在较短的暴露时间内也能表现出强大的体外杀伤能力。这些结果表明，即使在较短的暴露时间内，OPC-67683也可能对患者的细胞内结核病产生强烈的抗生素活性，这可能是间歇性治疗的优势。
PA-824已被报道为一种前药物，由分枝杆菌代谢为其活性形式[31]。最近，Manjunatha等报道了Rv3547作为PA-824的催化酶，但Rv3547在分枝杆菌中的作用尚不清楚[32]。同样，OPC-67683也需要代谢激活结核分枝杆菌从而发挥抗结核活性。实验分离出的耐opc -67683分枝杆菌不代谢该化合物。我们证实了耐药生物中Rv3547基因的突变，表明Rv3547是激活OPC-67683的关键酶，就像PA-824一样(未发表的数据)。根据Manjunatha等人的说法，PA-824的代谢物尚未被确定。然而，与OPC-67683的主要代谢物产生存在结核分枝杆菌经鉴定为非活性去硝基咪唑。结果表明，Rv3547具有还原硝基残基的能力，OPC-67683与去硝基咪唑之间的中间体可能是活性形式。在将放射性OPC-67683与活的分枝杆菌混合后，近20%的放射性物质没有被回收。相比之下，在治疗耐opc -67683的分枝杆菌后，几乎100%的放射性被恢复。甲硝唑衍生物对幽门螺旋杆菌据报道是由于产生了一种自由基中间体[33]。这一信息暗示了一种可能性，即作为硝基残渣代谢中间体出现的自由基中间体与目标分子共价结合。如果这一假设是正确的，它可以很好地解释OPC-67683对细胞内分枝杆菌的强烈抗生素后作用，这种特性被认为是杀死潜伏结核病的必要条件。
OPC-67683对实验性慢性结核小鼠模型的体内治疗效果进行了评估。在该模型中，与参考化合物相比，OPC-67683表现出最有效的抗结核活性。当OPC-67683剂量为0.313 mg/kg或更高时，肺中活菌数量显著降低。当剂量为0.625 mg/kg时，细菌负荷降低95%。此外，OPC-67683在使用免疫缺陷小鼠建立的TB模型中的疗效与使用标准小鼠相似。
结核病的治疗需要联合治疗，不仅要缩短治疗时间，而且要防止耐药性的发展。因此，我们在体内和体外评估了OPC-67683与目前使用的结核病药物联合使用的效果。OPC-67683在所有测试组合中均不产生拮抗作用，在体外与RFP或EB联合使用时产生部分协同或增效作用。含有OPC-67683、RFP和PZA的联合方案在前3个月内稳定快速地降低了细菌负荷。这些结果表明，含有OPC-67683的新方案可能有效地缩短了临床治疗时间。
多药治疗是一种常见的临床实践，特别是在伴随疾病或条件的患者。然而，只要同时使用两种或两种以上的药物，就存在药物相互作用的可能性。临床上许多药物相互作用是由抑制药物代谢酶(如CYPs)引起的，导致代谢清除减少和对受抑制药物的暴露增加[34- - - - - -36]。利福霉素衍生物如RFP通常诱导CYP3A4酶，显著降低药物本身以及其他CYP3A4中介药物的生物利用度，包括蛋白酶抑制剂，这些药物在治疗艾滋病毒/艾滋病中必不可少[37]。因此，重要的是，一种新的结核病药物不诱导也不受代谢酶的影响。考虑到这一点，我们研究了OPC-67683与代谢酶之间的相互作用。我们的研究结果表明，OPC-67683暴露于人和动物肝微粒体时几乎没有代谢，且在浓度高达100 μM时对CYP酶活性没有诱导、刺激或抑制作用，这表明在预期的治疗浓度下，OPC-67683不会与其他cypp代谢药物(如利福霉素衍生物)产生临床显著的相互作用。这些结果，以及支持在免疫缺陷动物中抗结核活性不降低的数据表明，OPC-67683可能有助于治疗同时感染艾滋病毒/艾滋病的结核病患者。
我们得出的结论是，OPC-67683具有有助于解决结核病化疗中未满足的需求的特性，即缩短治疗时间的需求、抗耐多药结核病的有效性、安全用于艾滋病毒/艾滋病患者的能力以及治疗LTBI的能力。目前正在进行一项早期II期临床研究，以确认该药物对患者的疗效。
此外，全球结核病药物开发联盟的目标是建立一种全新的方案，其中包含新药的最佳组合[38]。这些药物的单独开发和整合通常是连续进行的，每种药物至少需要6年的时间。因此，我们重视尽早评估OPC-67683与常规药物和新药联合使用的效果，以便为建立解决结核病治疗中未满足的需求所需的最佳方案提供必要的数据。
支持信息
表S1。观察各组OPC-67683、RFP、INH、EB、SM、PZA、PA-824对实验性慢性结核模型小鼠治疗4周后肺内活菌计数
https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0030466.st001
(4kb doc)
致谢
我们感谢F. Tabusa和T. Sumida在各自的药物化学和筛选毒理学领域进行的有益讨论和提供的专业知识，感谢H. Ishikawa对使这个结核病药物项目成为现实的不懈支持。我们也感谢许多研究人员，特别是M. Teshima, K. Ohguro, T. Hasegawa, Y. Haraguchi, T. Koga，以及赞助公司大冢制药的其他几名工作人员，他们付出了许多小时的奉献，帮助OPC-67683发展到目前的阶段。我们也感谢V. Lawlor的编辑支持。
作者的贡献
所有列出的作者都积极参与了本手稿中描述的OPC-67683相关的研究。M. Matsumoto建立了筛选所有合成化合物的策略，并通过进行敏感性试验，建立OPC-67683对分枝杆菌酸生物合成的抑制活性，并与H. Hashizume, T. Tomishige和M. Kawasaki合作开展了涉及OPC-67683的所有体内研究，来选择和评估OPC-67683。H. Hashizume负责在小鼠中进行细菌反向突变测试和吸收研究。T. Tomishige在确定OPC-67683的细胞内活性并确认其在免疫抑制动物模型中的效力后进行了研究。M. Kawasaki进行了与作用机制、药敏测试、耐药菌株的实验分离、opc -67683耐药菌株Rv3547基因突变的确认以及代谢物鉴定相关的研究。Tsubouchi和M. Komatsu协调了合成用于选择有效抗结核药物的许多新衍生物的整体活动，并与H. Sasaki一起合成并提供了用于体外和体内评估的衍生物。建立了简便实用的中间体合成方法，可合成多种目标化合物，为大规模动物毒性筛选试验提供了衍生物。佐佐木在合成包括OPC-67683在内的各种化合物方面发挥了主要作用。Y. Shimokawa负责药物相互作用研究。
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