广告

  • 加载指标

188滚球软件

同行评议

研究文章

的多重角色和互动Tbx4而且Tbx5呼吸系统的发展

摘要

呼吸系统的正常发育对生存至关重要，它受多种基因和信号通路的调控。这两个Tbx4而且Tbx5在发育中的肺和气管的间充质中表达;而且，尽管已知上皮细胞中需要多个基因，但在间充质中只有fgf被很好地研究过。在这项研究中，我们调查了Tbx4而且Tbx5利用条件突变等位基因和两种不同的Cre重组酶转基因系在肺和气管发育中的作用。的损失Tbx5导致单侧肺芽规格丧失和气管规格缺失的器官培养。基因缺失的突变体Tbx4而且Tbx5在妊娠中期显示肺分支严重减少。与此缺陷相一致的是间充质标记的表达Wnt2而且Fgf10，以及Fgf10靶基因Bmp4而且Spry2，在上皮细胞中被下调。肺分支停止体外当Tbx4而且Tbx5两者都完全缺乏。Lung-specificTbx4杂合的;Tbx5条件性空鼠出生后不久因呼吸窘迫而死亡。这些幼犬的肺很小，气管/支气管软骨环出现严重破坏。Sox9是软骨形成的主要调节剂，在气管中表达;但间充质细胞不能凝结，因此在出生时不能正常发育软骨。Tbx4；Tbx5双杂合突变体显示肺分支减少和气管软骨环减少，提示遗传相互作用。最后，我们证明了这一点Tbx4而且Tbx5相互作用Fgf10在肺生长和分支过程中，而不是在气管/支气管软骨发育过程中。

作者总结

哺乳动物呼吸系统发育不良可导致气管、支气管或肺部畸形，在出生时或出生后造成严重后果。使用老鼠基因的研究已经开始揭示指导呼吸系统发育的复杂调节机制，但对这些机制的破坏如何导致畸形的理解还远远没有完成。在这项研究中，我们分析了两个t盒转录因子的作用，Tbx4而且Tbx5在呼吸系统发育的三个重要过程中:肺和气管原基的具体化，气道的生长和分支形成肺，以及气管和支气管的软骨环的形成。在没有Tbx5在美国，只指定了一个肺，而没有气管。这两个Tbx4而且Tbx5通过控制分泌生长因子的表达来调节肺分支的过程Fgf10以及激活Fgf10信号。都在气管里Tbx4而且Tbx5对细胞凝结形成软骨环很重要，尽管这是由一个不涉及Fgf10的独特途径调控的。

引用:阿ora R, Metzger RJ, Papaioannou VE (2012)Tbx4而且Tbx5呼吸系统的发展PLoS Genet 8(8): e1002866。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866

编辑器:Gregory S. Barsh，美国斯坦福大学医学院

收到:2012年2月7日;接受:2012年6月12日;发表:2012年8月2日

版权:©2012阿罗拉等人。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

资助:这项工作得到了尤尼斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康和人类发展研究所的Grant R37HD033082(给VEP)的支持。rj得到了加州大学旧金山分校突破性生物医学研究项目的支持，该项目部分由桑德勒基金会资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决定或稿件准备方面没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

呼吸系统的发展代表了一种进化标志，使脊椎动物能够在陆地上利用空气作为氧气来源生存。由于哺乳动物的胚胎生存离不开呼吸系统，呼吸系统的发育缺陷在出生时或出生后就显现出来。事实上，人类呼吸系统的异常发育与多种疾病相关，如气管/支气管闭锁、气管食管瘘、支气管源性囊肿、肺/大叶闭锁和肺发育不全[1]．因此，了解呼吸系统发育的遗传基础是重要的。

在小鼠胚胎中，内胚层前肠管由来自外侧板中胚层的信号形成模式，导致胚胎日(E) 9.0 (19-24 somites)肺和气管的规范。Nkx2.1已被确定为肺内胚层规格的最早标志。在E9.25(25-28节)，初代肺芽出现为前肠腹侧外包，由气管原基腹侧连接。肺芽向腹后方向生长，并继续拉长，直到E11.5。肺芽的连接点被认为是气管管的起源，气管管由E11.5从食管尾向颅方向分离[２]，[3]．在小鼠中，左肺芽保持单叶，右肺芽形成4个叶——颅叶、内侧叶、尾叶和副叶[２]．气道从E11.5开始呈典型的分支模式[4]；肺泡发育成熟较晚。

参与不同信号通路的基因，包括Wnt2，Fgf10，Bmp4，嘘和维甲酸合成基因，已被证明在肺规格和分支形成中发挥重要作用。两者都完全没有Wnt2而且Wnt2b在前肠上皮周围的间充质中，或前肠上皮中β-连环蛋白的缺失导致肺原基规格的丧失Nkx2.1表达式［5］- - - - - -[7]．胚胎的缺乏Fgf10，通常在上皮分支尖周围的间充质中表达，形成短的气管，但没有肺［8］，[9]．抑制上皮细胞Bmp4信号的过度表达Xnoggin导致肺体积减小，肺叶形状不规则[10]．嘘无突变小鼠由于分支严重的分支缺陷，只有一个发育不全的肺囊[11]．另外，条件失活嘘在肺上皮细胞导致形成发育不良的肺，周围小管的分支减少[12]．视黄酸受体(RAR) α和RAR β2双缺失突变体表现为左肺发育不全和右肺发育不良(E18.5)[13]．因此，在间充质和上皮中表达的基因对于正确的肺芽规格和分支是必不可少的。

E11.5后，气管背侧周围的间充质分化为气管平滑肌。间充质:围绕气管腹侧和主茎支气管段外侧的间充质，分化成由软骨细胞组成的C形环。气管腹侧软骨是由间充质凝结的细胞迁移形成的[14]．Sox9是否被认为是间充质凝结和软骨细胞分化的重要调节因子[15]，[16]．在软骨细胞培养中已经证明除了Sox9， FGF2, Igf1, Tgfβ2和Bmp2促进软骨细胞的形成[14]，[17]．一些基因突变，包括嘘，Sox2维甲酸合成基因和Fgf信号通路基因已被证明影响软骨环的形成[11]- - - - - -[13]，［18］- - - - - -[21]．Fgf10突变体形成部分气管管，尽管肺形成失败［8］，[9]．最近的证据表明Fgf10导致气管环形成的缺陷和过度表达Fgf10在E11.5和E13.5之间通过改变的周期性表达来破坏气管环嘘在气管里[22]．

t箱转录因子基因在胚胎发育过程中非常重要。该基因家族的所有成员都包含一个保守的dna结合T-box结构域，该结构域与一个保守序列，即T-box结合元件结合，以激活或抑制特定目标基因的转录[23]．所有Tbx2亚家族基因，Tbx2，Tbx3，Tbx4而且Tbx5在发育中的鸡肺芽和气管中表达在15-21阶段[24]．在老鼠身上，Tbx1表达于肺上皮细胞E12.5，Tbx2而且Tbx3在E11.5表达于肺间质中，Tbx4而且Tbx5在E12.5及之后在肺和气管间质中表达[25]．Tbx1纯合无突变体出生时因严重心脏缺陷而死亡;肺部从未完全充气［26］但是肺的发育还没有进一步的研究。在Tbx4纯合子突变体形成肺芽，但胚胎在E10.5时死亡，原因是尿囊发育失败，随后缺乏绒毛膜-尿囊融合，导致胎盘发育不足[27]．Tbx5由于心脏发育缺陷，突变体在E10左右死亡[28]；肺的发育以前没有被研究过。两者的反义寡核苷酸损耗Tbx4而且Tbx5，但不是Tbx2而且Tbx3在肺器官培养中，可抑制分支和损失Fgf10表达式[29]说明这些因素在肺分支中起作用。在鸡胚中，干扰与Tbx4功能减少Fgf10表达于肺间质并抑制肺芽的形成。异位表达Tbx4导致异位表达Fgf10而且Nkx2.1在食道形成肺芽。此外，异位表达Tbx4在气管和食道之间的边界会导致这两个结构缺乏分离，导致气管食道瘘［30］．在人类中,Tbx5突变导致霍尔特奥拉姆综合征，其特征是心脏和前肢异常。一个单一的从头突变TBX5是否与右肺发育不全有关［31］．

研究…的作用Tbx4而且Tbx5在小鼠的肺和气管发育中，我们利用条件等位基因来绕过早期胚胎的致命性。我们研究了三个不同的过程，即1)肺芽和气管规格，2)肺分支形态发生，3)气管/支气管软骨形成。我们发现在发育的早期阶段，Tbx5对肺芽和气管的发育很重要。规范后,Tbx4而且Tbx5肺生长与分支相互作用，分支的调节依赖于此Fgf10信号。此外,Tbx4而且Tbx5相互作用形成间充质凝聚，最终形成独立的气管/支气管软骨环Fgf10信号。

结果

的表达Tbx4而且Tbx5在发育中的肺和气管中

Tbx5表达式首先使用原位在肺和气管原基间充质中，杂交(ISH)在E9.0(24个体)，并发Nkx2.1在腹前肠上皮的表达(图1 a-1d)．这两个基因的前表达范围与第三咽袋的后表达范围一致(图中红色箭头所示)图1A、1B)．Tbx4在几个小时后E9.25(28个体细胞)首次出现时，在肺芽中检测到的表达类似于Tbx5（图1E, 1F)．Tbx4而且Tbx5在整个肺间质中表达E11.5、E13.5和E15.5，但在上皮中不表达(图1 g-1l）[25]．

缩略图
下载:
图1所示。的表达Tbx4而且Tbx5在发育中的肺和气管中。

(1)Tbx4而且Tbx5用ISH分析肺组织的表达。Tbx5在E9.0 (B,D)首次表达时，肺原基发生特异化，如Nkx2.1表达式(A, C)。红色箭头指向第三咽袋的后部，它标志着两种表达域的前方Nkx2.1而且Tbx5．右侧视图(A,B)，腹侧视图(C,D)。Tbx4首先在E9.5和Tbx5在新形成的肺芽(E,F)。在全肺支架中E11.5 (G,H)， E13.5 (I,J)和冷冻切片中E15.5 (K,L)的肺间质中均可见表达。(m)Tbx4而且Tbx5用ISH分析气管内的表达。Tbx4而且Tbx5在E13.5的气管间质(m)中表达(m, m '，N,N ')，但在上皮(e)或间皮(箭头)中不表达。全髋关节置换术后切开气管的尾部视图(M-P)。冷冻切片上的ISH (M ' -P ')。在E13.5,Sox9表达于腹侧间充质(O,O’)和SM22α在气管背侧(P,P’)表达。D-dorsal;V-ventral;r;我离开。在E15.5,Tbx4而且Tbx5在凝结软骨间质周围和软骨间质内表达(Q,R)。Sox9表示为软骨凝结环(S)。星号表示软骨凝结区域。(Q)和(S)中的插图显示E15.5矢状面冰冻切片的ISHTbx4而且Sox9分别调查。比例尺代表50 μ m。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g001

这两个Tbx4而且Tbx5显示了发育中的气管的动态表达模式。在E11.5和E13.5，这两个基因在气管上皮周围的间充质中表达，但被上皮细胞和最外层间皮(图1G, 1H, 1M, 1M '， 1N, 1N ')．在这些阶段，Tbx4而且Tbx5在气管腹侧细胞中也表达Sox9（图1O, 1O '）［32］在气管背侧细胞中也有表达SM22α（图1P, 1P '）[33]．在腹侧间质E15.5处，Tbx4而且Tbx5表达仅限于软骨凝结物之间的间充质(图1Q, 1R的模式与…的模式互补Sox9，在此阶段仅限于凝结软骨环的间充质(图1年代)．

条件等位基因重组的效率

本研究中使用的胚胎的基因型和相应的描述性缩写命名方法见表1．用PCR基因分型检测条件等位基因的重组效率。用于携带他莫西芬诱导剂的胚胎克里尔在E9.0时将8 mg他莫西芬注射到怀孕的雌性动物体内，在E12.5时解剖胚胎。分析了卵黄囊作为整个胚胎重组的估计。的两个等位基因Tbx4fl / fl在此剂量的他莫西芬作用下，胚胎在E12.5处完全重组产生突变等位基因(图S1A)，但单个的floxed等位基因Tbx5fl / +胚胎只是部分重组为突变形式(图S1E)．在E9.0中，剂量高于8毫克的他莫西芬会导致流产。E8.5注射7 mg他莫昔芬，完全重组Tbx4fl等位基因(图印地)和单曲Tbx5fl等位基因(图S1F)在E13.5获得。

缩略图
下载:
表1。不同的等位基因组合和描述性命名法。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.t001

在肺芽培养中，1 μ M 4-OH他莫西芬的浓度产生了几乎完全的重组Tbx4fl24小时后的等位基因(图就是S1C)而Tbx5fl等位基因仅部分重组(图S1G)．在培养4天后，几乎完全重组了所有的floxed等位基因(图S1D, S1H)．这些数据表明Tbx5fl等位基因的重组效率比等位基因低Tbx4fl等位基因。因此，我们假设可能存在Tbx5的残留活性Tbx5fl基因中的等位基因在活的有机体内实验，即使有克里尔而且Tbx4cre等位基因。

早期损失Tbx5，但不是Tbx4，导致单侧肺芽规格丧失和气管规格缺失

探讨的作用Tbx4而且Tbx5在肺和气管规格的早期阶段，前肠培养[34]与Nkx2.1作为规范的标志。这体外该技术允许在培养中分析突变体，避免了胚胎早期的致死率Tbx4由于尿囊缺陷和纯合子突变体Tbx5纯合突变体由于心脏缺陷。当前肠和周围组织在E8.75(8-16个节点)分离时，前肠管缺失Nkx2.1表达和肺芽不存在[6]．培养3 - 4天后，肺芽和气管已经形成Nkx2.1表达式(图2A, 2D, 2G)．Nkx2.1也在此阶段的甲状腺原基中表达(图2 d-2i而且[35])．的表达Tbx4而且Tbx5对照组前肠培养4 d (图2B、2C)．E8.5胚胎的前肠在4-羟基(OH)他莫西芬存在下培养并分析Nkx2.1表达式。减少Tbx5孤独导致缺乏Nkx2.1培养3或4天后，其中一个肺芽的表达(图2E和2H提示单侧肺芽规格丧失。删除Tbx4单独服用没有影响Nkx2.1培养3天后表达(数据未显示)并取出Tbx4除了Tbx5并没有加剧Tbx5表型(图2F, 2I)．因此,Tbx5但不是Tbx4对肺芽的双侧规范重要吗体外．Wnt2而且Wnt2b，呼吸原基规范所必需的基因［5］，在条件条件下进行分析Tbx5零前肠。Wnt2表达减少(图2J, 2K),Wnt2b表情缺失(图2L, 2M)暗示Tbx5位于这些基因的上游，在调节规范的过程中。

缩略图
下载:
图2。早期损失Tbx5导致肺芽和气管畸形。

(A-I)前肠在8-16个体期分离，培养后用ISH分析。Nkx2.1(一),Tbx4(B)和Tbx5(C)在对照培养中证实了肺芽(箭头)和气管原基(黄色箭头)的表达。切除Tbx5使用4-OH他莫西芬在条件无效前肠克里尔导致的损失Nkx2.13 (E)或4天(H)时肺芽中的表达。条件双空(F,I)携带克里尔表现出与条件句相似的表现型Tbx5null，建议额外删除Tbx4不会加剧表现型。Nkx2.1条件型前肠管无表达Tbx5与对照组(D,G)相比，在培养3或4天后(黄色箭头在E,F,H,I)为零和条件双零前肠。有条件的Tbx5null显示减少Wnt2的表达式(K)和缺失Wnt2b与对照组(J,L)相比，在发育中的肺芽中表达(M)。黑色箭头(J)指向Wnt2表情在心里控制着。ht、心脏;甲状腺原基。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g002

关于气管规格，Nkx2.1培养3 ~ 4天后，缺失胚胎前肠管未见表达Tbx5(箭头图2E, 2H)表明气管规格的缺失Tbx5．附加损失Tbx4等位基因不改变表型(图2F, 2I)，支持一个角色Tbx5在气管的规格上，独立于Tbx4．

肺分支受到严重影响的损失Tbx4而且Tbx5

分析损失的影响Tbx4而且Tbx5关于肺分支在活的有机体内我们使用了他莫西芬诱导剂克里尔转基因。他莫西芬在E8.75 (8-16 somites)注射，足够晚到可以绕过致命性，但远在肺分支开始之前。胚胎与克里尔和不同的组合Tbx4fl而且Tbx5fl在E12.5和E13.5位点检测等位基因。有条件的Tbx4缺失肺在E12.5时与对照组相似，但在E13.5时分支尖较少(图3A, 3B, 3E, 3F)．有条件的Tbx4; Tbx5双杂合子肺(图3 c)的体型较小，分枝尖端也比条件型少Tbx4E13.5处无肺(图3 b)但在发育上更先进(图3E, 3F)比有条件的Tbx4零;Tbx5杂合子肺(图3 d)，它们是严重弱智的。条件组右肺裂片破坏Tbx4零;Tbx5杂合子肺:副叶缺失，只存在原始的头叶和内侧叶(图3 h)．裂片有融合的外观(图3 h”)表明分离的失败。组织学上，除了整体尺寸缩小外，没有明显的结构缺陷(图3G, 3G '， 3H, 3H ')．

缩略图
下载:
图3。的损失Tbx4而且Tbx5导致出生时肺分支减少和致命性。

(a ')Tbx4fl而且Tbx5fl等位基因被切除克里尔在E8.75注射他莫西芬，并在不同时间点解剖肺。的损失Tbx4单独或同时使用Tbx4而且Tbx5导致E13.5的肺发育不良(A-D)。在E12.5 (E)和E13.5 (F)对不同基因型的E-钙粘蛋白染色后，对分支尖的数量进行定量。组织学切片上的H和E显示，条件组在E12.5时肺大小减小Tbx4零;Tbx5杂合子肺(G,H，)。(G’)和(H’)分别是(G)和(H)中方框区域的放大视图。黑色箭头表示对照组右肺肺叶之间的分离(G’)，突变体右肺肺叶之间的分离缺失(H’)。(我)Tbx4cre用于肺和气管特异性切除Tbx4fl而且Tbx5fl等位基因。Tbx4cre在大部分气管间充质细胞(I)和肺间充质细胞(J)中表达R26RlacZ记者表达在E13.5。Lung-specificTbx4杂合的;Tbx5无肺在E13.5 (K,L)和出生时(N,O)表现为发育不良。对照肺和肺特异性分支尖的数量Tbx4杂合的;Tbx5空白肺，在箱形图(M)中标记为实验性肺，在E13.5时有显著差异。绿色的方框包含50%的值;中位数用方框中的水平线表示;条形代表5th和95年th百分位数。切片H & E染色显示对照组(P)和突变体(Q)出生时的肺形态。比例尺代表100 μ m。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g003

有条件的Tbx4零;Tbx5杂合突变体在E13.5之后无法分析，原因是cre诱导的细胞凋亡导致造血缺陷[36]不可能分析有条件的Tbx5使用诱导剂的空胚胎体内CreER因为致命的心脏缺陷。为了避免这些限制，我们使用Tbx4cre等位基因，在肺和气管中表达，但在心脏中不表达[37]．从这个等位基因中，Cre在发育中的肺和气管间质的大多数细胞中都有表达，正如在E13.5处看到的lacZ报告基因表达(图3I, 3J）[38]．

Lung-specificTbx5空突变体，携带一个拷贝Tbx4cre显示了一系列的表型，从明显正常的肺到肺尺寸严重减小(数据未显示)。我们假设表型的可变性是由于重组程度的不同Tbx5fl等位基因(图S1)．所有lung-specificTbx4杂合的;Tbx5空幼崽(n = 13/13来自5窝)在出生时出现青色，随后不久因呼吸窘迫死亡。不同于不同肺大小的肺特异性Tbx5在E13.5时，这些突变体的肺始终小于对照组(图3K, 3L)和出生时(图3N, 3O)，在E13.5时分支尖显著减少(图3米)．在P0，肺特异性组织学Tbx4杂合的;Tbx5缺失的肺与对照组相当，尽管突变的气管显示出粘液样物质的积累(图3P, 3Q)．突变肺上皮细胞表达T1α和前表面活性蛋白C (Pro-SPC) (图S2A- - - - - -S2D)，肺泡细胞分化的标记物[10]，［19］提示适当的肺上皮分化发生在肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5零的肺。这些肺的叶状缺损与条件肺非常相似Tbx4零;Tbx5杂合子突变肺。副裂片在大多数胚胎中不存在，但出现时分枝较少;颅叶和尾叶的分支也减少了。头颅、内侧和尾叶未分离(图S3A, S3B)．此外，尽管这些肺中存在第三支背侧支，但它们拥挤在一起，次要侧支比对照组长出的距离更短(图S3C、S3D）

使用Tbx4cre，不能将条件双空值研究为Tbx4也是由这个等位基因表达的。因此，为了进一步探索在两个等位基因的条件下的分支形态发生Tbx4而且Tbx5用肺芽培养系统进行肺芽培养，其中肺芽来自含或不含克里尔在4-OH他莫西芬存在下培养转基因。有条件的Tbx4零;Tbx5杂合的，或条件的Tbx4杂合的;Tbx5无肺芽显示分枝减少(图4A、4B、4C)与观察到的枝尖数量减少相一致在活的有机体内．条件双空肺在培养3天后显示完全分支停止(图4D, 4E, 4F)．现有的分支在培养4天后继续拉长(箭头所指)图4 e)．因此,Tbx4而且Tbx5是继续分支形态发生的必要条件吗体外．

缩略图
下载:
图4。的损失Tbx4而且Tbx5导致分支停止体外．

在E11.5分离肺芽，在4-OH他莫西芬存在下培养。培养结束后观察气道使用情况钙粘蛋白伊什。有条件的Tbx4纯合子的;Tbx5杂合的(B)和条件的Tbx4杂合的;Tbx5空肺克里尔与对照组(A)相比，培养4天后分枝减少克里尔， (D)和条件双空肺芽，与克里尔(E)分别培养4天，分别于1天、2天、3天、4天拍照。E中的箭头表示气道拉长的过程。支撑点的数量与对照和条件双空肺(F)的时间函数关系图显示，培养2天后条件双空肺的支撑点停止(Mann Whitney U检验p = 0.036)。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g004

的损失Tbx4而且Tbx5影响Fgf10信号通路Wnt2表达式

肺间质标记物的表达Fgf10以及Fgf10信号通路的上皮靶点，Bmp4，Spry2而且Etv5[39]，[40]，[41]在肺中分析Tbx4而且Tbx5表达式。Fgf10在标记未来芽形成部位的远端上皮顶端周围的间充质中表达(图5一个）[42]．与较小的整体肺尺寸一致，病灶较少Fgf10条件语句中的表达式Tbx4零;Tbx5杂合子肺(图5 b)和肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5null (图5 c)．这一途径的主要受体，Fgfr2[43]，在肺特异性上皮中正常表达Tbx4杂合的;Tbx5无肺(图5D, 5E)．Bmp4（图5F, 5G, 5H),Spry2（图5I, 5J)被下调Tbx4而且Tbx5 -肺有缺陷Etv5（图5N, 5O)的表达不受影响，尽管在条件双空培养中其表达大幅减少体外(见图6J, 6K)．

缩略图
下载:
图5。的损失Tbx4而且Tbx5影响Fgf10信号通路和Wnt2表达式。

(A-X)对照和标记分析Tbx4- - -Tbx5用ISH (A-O, S-X)和IHC (P-R)检测缺陷肺:较少的病灶Fgf10表情都看到了Tbx4而且Tbx5-缺陷肺(B,C)与对照组(A)相比。米,内侧;cd,尾;A、辅叶。Fgf10靶基因Bmp4(F, G, H)和Spry2(I,J)和正则Wnt2(K,L,M)表达下调Tbx4而且Tbx5与对照组相比有明显的肺缺陷。Fgfr2(D, E),Etv5(n, o)， pecam (p, q, r)，嘘(S, T),Ptc(列车自动控制系统)(U, V)Nkx2.1(W,X)在对照组和对照组表达相似Tbx4而且Tbx5缺肺。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g005

缩略图
下载:
图6。 Tbx4而且Tbx5相互作用Fgf10，但FGF10未能营救成功Tbx4 -而且Tbx5缺肺。

(A-E) E18.5不同基因型的肺。Tbx4；Tbx5双杂合子肺(B)比对照肺(A)小。Tbx4；Tbx5；Fgf10三杂合子肺(C)比双杂合子肺(B)小，但大小与肺特异性肺相当Tbx4heterozyous;Tbx5无效肺(D)。从肺特异性Tbx4heterozyous;Tbx5无肺不进一步影响肺大小(E). ht，心脏。(外)E-cad在外源性Fgf10缺失(F,G)和存在(H,I)的情况下，对照肺和条件双阴性肺的上皮细胞表达，显示分枝形态发生缺乏挽救作用。(J-M)Etv5外源Fgf10缺失(J,K)和存在(L,M)时，对照肺和条件双无效肺的表达。Etv5添加Fgf10后，表达不变。(N,O)对照和条件双空肺都对FGF10包被珠(f)有反应，但对BSA包被珠(b)无反应，从FGF10珠附近的尖(箭头)肿胀可见。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g006

Wnt2，通常在发育中的肺间质中表达(图5 k）［5］，在条件条件下E13.5时显著降低Tbx4零;Tbx5杂合的(图5 l)和肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5无肺(图5米)．除了Fgf10而且Wnt2信号通路,嘘信号转导也与肺的分支形态发生有关[11]．上皮嘘（图5S, 5T)及其间充质受体Ptc(列车自动控制系统)（图5U, 5V)在肺特异性表达正常Tbx4杂合的;Tbx5零的肺。上皮标记物Nkx2.1这是肺分支的必要条件[44]在条件句中表现为单侧表达Tbx5规范时的空前置符(图2)，表达与肺特异性E13.5位点的对照相似Tbx4杂合的;Tbx5无肺(图5W, 5X)．在E13.5时，血管标记物Pecam的表达表明单个细支气管周围的血管发育正常Tbx4而且Tbx5-缺陷突变体(图5P, 5Q, 5R)．

Tbx4而且Tbx5相互作用Fgf10在肺发育期间

由于间充质Fgf10突变体中上皮靶细胞的表达和表达受到影响Tbx4而且Tbx5，我们调查了Tbx4，Tbx5而且Fgf10在使用双杂合子和三杂合子突变体的分枝形态发生中。Tbx4；Tbx5双杂合子肺在E18.5处小于对照组肺(图6A, 6B)．Tbx4；Tbx5；Fgf10三杂合子肺小于Tbx4；Tbx5双杂合子肺(图6B, 6C)，暗示Tbx4而且Tbx5肺发育过程中与Fgf10信号通路的基因相互作用。删除一个副本Fgf10从lung-specificTbx4杂合的;Tbx5null没有进一步减小肺的大小(图6D, 6E)．

尽管存在遗传相互作用，但在条件双零的肺芽培养中添加外源性Fgf10并不能挽救分枝(图6 f-6i)．缺乏变化Etv5表达,Fgf10结果表明，在条件双空肺中，外源性Fgf10存在时，Fgf10信号通路未被激活(图6 j-6m)．为了确保用于挽救实验的Fgf10是活跃的，Fgf10包被肝素珠被放置在肺外植体的分支尖附近。对照组和条件组双空肺的肺尖对Fgf10小珠有反应，但对bsa包被肝素小珠没有反应。图6N, 6O）[45]．自Fgfr2正常表达在Tbx4而且Tbx5肺有缺陷(图5 e)和条件双空肺(数据未显示)，因此条件双空肺尖端能够对Fgf10作出反应就不足为奇了。然而，条件双空肺在Fgf10存在时不能发生分枝。因此，除了Fgf10一定有其他因素在控制之下Tbx4而且Tbx5对激活Fgf10信号通路导致分支形态发生非常重要。

的损失Tbx4而且Tbx5导致气管/支气管环缺陷

目的:分析肾衰胚胎气管/支气管软骨的发育情况Tbx4而且Tbx5出生时用阿利新蓝染色观察软骨环。Lung-specificTbx5空腔和肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5缺失胚胎的软骨环发育有缺陷(图7 a-7c)和一些正常的环(箭头在图7B, 7C)和孤立的软骨灶(黑色箭头在图7B, 7C)．对照组新生幼犬气管和支气管腔均扩大(图7D, 7E)，但肺特异性衰竭Tbx4杂合的;Tbx5为空，并含有粘液样物质(图7F, 7G)．阿利新蓝染色显示，这些突变体的气管上皮分泌黏液的细胞数目增加(图7D '， 7D″，7F '， 7F″）［19］．为了评估软骨环在早期阶段的发展，Sox9分析E12.5和E13.5在肺特异性蛋白中的表达Tbx4杂合的;Tbx5null。在E12.5，这些突变的气管有Sox9气管腹侧的表达与对照组相似(图7H, 7I)但未能在E13.5处形成间质凝聚(图7J, 7K)．基因下游两个基因的表达Sox9、Sox6（图7L, 7M),Sox5（图7N, 7O)，在E13.5下调，而Col2α1,一个Sox9靶蛋白，在这些环中以正常水平表达(图7P, 7Q)．平滑肌标记SM22α以评估气管背肌的发育。SM22α在突变体气管中表达区域扩大，并丢失了特征性的条带模式(图7R, 7S)，表明由于失去Tbx4而且Tbx5．

缩略图
下载:
图7。的损失Tbx4而且Tbx5破坏气管/支气管软骨和平滑肌的形成。

(A-G)阿利新蓝染色显示气管/支气管软骨。对照组气管中可见10 - 11个软骨环(E18.5, A);肺特异性气管和支气管(分别为黑色和红色箭头)可见正常环(箭头)和不完全环Tbx5null (E18.5, B)和肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5null(出生后日(P) 0, C)。(A-C)中的星号表示支气管与气管分离的点。P0切片上阿利新蓝显示对照组气管(D)和主茎支气管腔(E)扩张，软骨细胞呈C形环(箭头)。的lung-specificTbx4杂合的;Tbx5无效气管管腔(F)和主茎支气管管腔(G)塌陷，充满粘液样物质(箭头)，可见阿利新蓝阳性灶(黑色箭头)。对照(D’，D″)和肺特异性的高倍镜视图Tbx4杂合的;Tbx5null (F '，F″)气管。黄色箭头表示肺特异性阿利新蓝阳性粘液产生细胞Tbx4杂合的;Tbx5零气管。TL:气管管腔;RBL:右侧支气管腔;左支气管腔。(H-S)对软骨形成和平滑肌发育重要的基因。Sox9E12.5的表达在对照(H)和肺特异性中表现出类似的腹侧表达模式Tbx4杂合的;Tbx5缺失的气管(I)。Sox9阳性细胞在对照组(J)中开始凝结并呈环状出现，但在突变体气管中没有(K)。Sox6(L, M)和Sox5(N,O)在肺特异性表达下调Tbx4杂合的;Tbx5E13.5处气管缺损。Col2α1表达为环状(P)，类似于Sox9在对照组的气管中，肺特异性的环表达明显正常Tbx4杂合的;Tbx5缺失气管(Q)。SM22α分析对照组(R)和肺特异性细胞在E13.5时气管背侧的表达Tbx4杂合的;Tbx5缺失的气管(S)。(S)中的箭头指向突变体中非特征性的异位表达。比例尺代表100 μ m。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g007

Tbx4而且Tbx5不要与Fgf10在气管发育过程中

对照组气管(图8)，Tbx4；Fgf10双杂合子(图8 b),Tbx5；Fgf10双杂合子(图8 c)显示出10-11个软骨环的正常模式，这表明它们之间缺乏基因相互作用Tbx4或Tbx5而且Fgf10在气管形成过程中。Fgf10缺失突变体不形成肺，但气管被截断，有6-8个软骨环，其中一些软骨环是畸形形成的[22]（图8 d)．Tbx4；Tbx5双杂合子小鼠的气管也有6-8个软骨环，但也有主支气管软骨环(图8 e)．删除Fgf10在这些双杂合子中，表型没有改变(图8 f)显示Fgf10-独立角色Tbx4而且Tbx5在气管/支气管软骨环的形成。还有，删除一个副本Fgf10在肺特异性中Tbx4杂合的;Tbx5null没有改变气管/支气管软骨环的表型(图8G, 8H)．因此,Tbx4而且Tbx5影响肺发育通过控制Fgf10但影响气管/支气管软骨发育独立于Fgf10信号通路。

缩略图
下载:
图8。缺乏基因之间的相互作用Tbx4，Tbx5,Fgf10在气管形成过程中。

阿利新蓝染色分析不同基因型气管/支气管软骨在E18.5时的发育情况。控制气管(A)，Tbx4；Fgf10双杂合子气管(B)和Tbx5；Fgf10双杂合子气管(C)有10-11个C形腹侧气管软骨环，气管形成两个主支支气管，主支支气管外侧有C形软骨环。Fgf10纯合突变体(D)，Tbx4；Tbx5双杂合突变体(E)和Tbx4；Tbx5；Fgf10三杂合子突变体(F)每个形成较少(6-8)个气管软骨环，一些形状不规则或不完整(箭头)。此外,Fgf10突变体缺乏支气管，因此没有支气管软骨环(D)，但双杂合子和三杂合子形成正常的外侧支气管软骨环(E和F中的箭头)。肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5null (G)显示气管/支气管软骨环的形成严重中断，一种表型随an的去除而不变Fgf10等位基因(H)。星号表示支气管与气管分离的点。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g008

讨论

的损失Tbx5影响肺芽和气管的发育

Tbx5是在肺/气管原基周围同时表达的Nkx2.1，规格的标志，首先在前肠内胚层的原基中表达。Tbx4在肺芽形成时稍晚表达。在我们的学习中，失去了Tbx5，但不是Tbx4，导致单侧肺芽规格丧失，表明Tbx5对肺芽的形成有明显的作用。相比之下，在小鸡中，虽然异位表达Tbx4在食道可指定肺命运，表现为显性阴性形式Tbx4在分析的突变体中，只有三分之一的突变体缺乏初芽［30］．然而，占主导地位的是消极Tbx4也可能会影响Tbx5目标作为阻遏剂结构利用完整的T-box域和Tbx4而且Tbx5它们的t盒结构域有94%的氨基酸同一性[46]．这种解释与我们的假设是一致的Tbx5在脊椎动物肺原基规范中起显著作用(图9)．进一步的研究结果表明Tbx5通过调节的活动来调节规格Wnt2而且Wnt2b．

缩略图
下载:
图9。模型的作用Tbx4而且Tbx5在肺和气管的发育中。

(A)肺和气管规格从腹前肠E9.0开始，此时Tbx5表达(浅紫色)靠近假定的内胚层。之后,Tbx4而且Tbx5表达(深紫色)在与肺和气管相关的间充质中。Tbx5但不是Tbx4对双侧肺芽和气管的发育很重要。(B) (A)中所示框的放大图，表示分枝形态发生过程中生长尖端的事件。灰色表示上皮，紫色表示间质。Tbx4而且Tbx5相互作用并作用于Fgf10信号通路的上游。减少Tbx4而且Tbx5影响间质Fgf10其靶细胞在上皮细胞中的表达和表达Bmp4，Spry2而且Etv5-而不是上皮细胞Fgf10受体的表达Fgfr2．除了Fgf10在间充质中的表达，Tbx4而且Tbx5也控制一个未知因子(X)的表达，这是激活Fgf10信号通路所必需的。此外,Tbx4而且Tbx5在…上游行动Wnt2在间充质中。(C)气管和主茎支气管Tbx4而且Tbx5要么控制Sox9表达，进而调节软骨凝结，或者Tbx4而且Tbx5调节另一因子(X)对软骨形成的继发性影响Sox9表达式。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.g009

的损失Tbx5单独使用会导致气管规格的缺失体外，一种表型类似于突变的小鼠Bmpr1而且Bmpr2．在这些突变体中，虽然发生了肺芽规格化，但腹前肠不能获得气管的特性[47]．因此,Tbx5或与前肠进入气管的BMP信号通路平行或同时作用(图9)．

Tbx4而且Tbx5肺发育的相互作用

在肺分支形态发生中，Tbx4而且Tbx5基因上相互作用(图9 b)．虽然,既不Tbx5(数据未显示)Tbx4单杂合子肺有分支缺陷，双杂合子肺在E13.5和E18.5处较小，在E13.5处分支尖数量减少。因为这些基因是紧密相关的[46]在美国，它们可能通过与类似的T-box结合元件相结合，彼此独立地调节相同的目标基因。另外,Tbx4而且Tbx5是否能像其他T-box基因那样，通过异二聚体相互作用激活或抑制下游靶点的转录[48]．尽管Tbx4和Tbx5在调节肺分支中有共同的作用，但它们的相对贡献可能并不相等，因为Tbx4；Tbx5双杂合子肺比条件肺小Tbx4null。不相等和不同的函数可以用t框之外的域来解释。例如，Tbx4和Tbx5的C端结构域都具有转录激活能力，这与这些基因共同的肢体生长促进活性有关[49]但Tbx4也有一个C末端阻遏子结构域，该结构域被认为负责其独特的后肢特定模式活动[50]．在另一个例子中，Tbx5和Tbx4都与鸡体内LMP4蛋白的一个不同的LIM结构域重复相结合[51]，说明了不同的蛋白质-蛋白质相互作用可能具有功能意义。

在有条件的Tbx4使无效;Tbx5杂合子和肺特异性Tbx4杂合的;Tbx5无肺，复位Tbx4或Tbx5导致分枝严重减少，裂片形成缺陷和裂片分离失败，而缺乏裂片Tbx4而且Tbx5导致分支停止。这些结果与发表的反义rna用于对抗两者的观察结果一致Tbx4而且Tbx5在培养过程中抑制肺分支，这种影响可以通过Fgf10表达的丧失来解释[29]．Tbx5结合并激活Fgf10启动子在体外这表明Fgf10是直接下游靶标[52]．在我们的研究中，对肺分支的剧烈影响是由重要调控基因的表达缺失所解释的Fgf10而且Wnt2在肺间质中。Fgf10瞄准目标Bmp4而且Spry2在上皮细胞中表达水平很低Tbx4而且Tbx5-缺陷突变体和Etv5， Fgf10的另一个靶，在条件双空肺中表达大大减少，导致假设Fgf10信号通路在下游被激活Tbx4而且Tbx5和Fgf10在基因上相互作用Tbx4而且Tbx5．肺是三杂合子的Tbx4，Tbx5而且Fgf10尺寸都变小了Tbx4；Tbx5双杂合子肺，支持这个假设。Lung-specificTbx4杂合子;Tbx5无肺严重发育迟缓，但肺的大小不受肺功能进一步丧失的影响Fgf10，证明了上位性，并支持假设Fgf10位于Tbx4而且Tbx5．培养中外源Fgf10缺乏对分支形成的拯救和Fgf10信号通路的激活，这表明下游有其他因素Tbx4而且Tbx5影响Fgf10信号通路。虽然，肺亏在Tbx4而且Tbx5保留对Fgf10涂层珠粒的反应能力(我们的研究和[29])，它们无法激活分枝形态发生所必需的其他因子(X in图9 b)．

这种因子的一种可能是间充质信号分子，它与上皮细胞交流并激活Fgf10通路所需的下游靶点。我们检查了Ptc(列车自动控制系统)而且嘘来确定Shh通路是否参与其中，但在肺特异性细胞中，Shh信号不受影响Tbx4杂合的;Tbx5或在条件双空区域性中(数据未显示)。细胞外基质(ECM)分子，硫酸肝素蛋白多糖(HS)帮助Fgf10-Fgfr2肺发育过程中的相互作用[45]和因此是遗漏的因素的很好的候选者Tbx4而且Tbx5有缺陷的突变体。由于Fgf信号的缺乏，肝素酶的抑制降低了培养的颌下腺的形态发生[53]．此外，HS缺陷的空鼠胚胎不能对Fgf信号作出反应，细胞表面拴系HS链的时空表达在胚胎发育过程中调节Fgf信号活性的局部接收[54]．Tbx4在尿囊发育过程中调节ECM分子，特别是硫酸软骨素蛋白多糖(R. Arora和V. E. Papaioannou未发表的观察结果)，这表明ECM可能是T-box基因调节其他器官发育的目标之一。

Tbx4而且Tbx5气管/支气管软骨发育的相互作用

适当的背平滑肌发育和腹侧气管/支气管软骨发育对气管的正常功能非常重要。平滑肌提供气管灵活性，软骨环防止气管塌陷。气管形成缺陷可导致气管软化或气管狭窄。减少Tbx4而且Tbx5导致气管软骨环的形成和气管平滑肌发育的缺陷，表明两者之间的相互作用Tbx4而且Tbx5．Tbx4而且Tbx5杂合子气管有10-11个软骨环Tbx4; Tbx5双杂合子气管有6-8个软骨环，部分软骨环不完整。额外削减Tbx4而且Tbx5在肺特异性中Tbx4杂合的;Tbx5无肺导致软骨环的形成完全中断，支持基因之间的相互作用Tbx4而且Tbx5在气管形成过程中。

Sox9是软骨形成过程的主要调控因子，在肺特异性腹侧间质中在E12.5正常表达Tbx4杂合的;Tbx5缺失的气管，但在E13.5时，这些气管显示缺乏特征性的间充质凝聚和缩小Sox9表达式。要么Tbx4而且Tbx5的控制Sox9在E13.5或Tbx4而且Tbx5控制着另一个因素，可能是一个ECM分子，它对间充质凝聚的形成很重要，在没有这些凝聚的情况下，有一个下调Sox9表达式(图9 c)．的表达Sox5而且Sox6的基因下游Sox9对凝结和软骨形成很重要，在肺特异性中下调Tbx4杂合的;Tbx5缺失的气管，与软骨形成过程中的异常一致。

而Tbx4而且Tbx5它们对气管/支气管软骨形成的控制与Fgf10信号通路无关。Fgf10纯合突变体有6-8个气管软骨环，尽管它们之间的间距减小，且环并不总是形成特征的C形［8］，[9]，[22]．既不Tbx4; Fgf10双杂合子的气管Tbx5；Fgf10双杂合子气管表现为软骨凝结缺损或软骨环数量减少。相比之下,Tbx4；Tbx5双杂合子气管较短，有6-8个气管软骨环提示Tbx4而且Tbx5在气管形成过程中相互作用但不相互作用Fgf10．三杂合子气管没有表现出急性Tbx4；Tbx5双杂合子气管表型。此外，异常的Fgf10信号已被证明影响气管软骨的形成和Fgf10影响的丧失嘘表达但不Sox9表达式[22]．相比之下，在Tbx4而且Tbx5有缺陷的突变体嘘表达似乎不受影响Sox9表达在E13.5处减少。因此,Tbx4而且Tbx5控制气管/支气管软骨形成Sox9，独立于Fgf10信号通路。

材料与方法

小鼠品系，杂交和胚胎收集

携带以下等位基因的小鼠按照前面描述的那样进行基因分型:Tbx4条件型“floxed”等位基因，Tbx4tm1.2Pa[55]，以后简称为Tbx4fl；Tbx5条件絮凝等位基因，Tbx5tm1.2Jse[56]，以后简称为Tbx5fl；一个Fgf10无效等位基因［8］；ROSA26CRE-ERT2它是一种无处不在的三苯氧胺诱导剂cre转基因[57]，以后简称为克里尔；Tbx4-cre，插入到内源性Tbx4等位基因导致双基因等位基因表达这两种基因cre而且Tbx4在所有的领域Tbx4表达包括肺和气管[37]，[38]，以后简称为Tbx4cre；和一个R26RlacZ记者[58]．所有系的小鼠都保持混合遗传背景。从定时交配中解剖胚胎，取出卵黄囊进行PCR基因分型。黑暗期为19.00 - 05.00 h，交配插头当天的中午被识别为E0.5。所有的小鼠实验都是在哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会的指导方针下进行的。

它莫西芬注射

妊娠女性在E8.5的15.30 ~ 19.30小时或E9.0的23.00 ~ 24.00小时内腹腔注射浓度为20 mg/ml的三苯氧胺(Sigma)在向日葵油(Sigma)中。

原位杂交，免疫组化和组织学

全挂ISH、免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)和冰冻切片ISH如前所述[59]，[60]，[61]．使用的一抗是抗pecam (Pharmingen，目录号01951D)，抗e -cadherin (Takara克隆ECCD-2)，抗T1α (Developmental Studies Hybridoma Bank抗体8.1.1)和抗pro表面活性剂蛋白C (Millipore目录号AB3786)。所有二抗均为Jackson Immunochemicals的过氧化物酶偶联驴IgG或Invitrogen的Alexa Fluor 488。

在组织学上，胚胎从子宫角中取出，从蜕膜中分离出来，并固定在Bouin固定剂(Sigma)中。乙醇脱水后，用石蜡包埋胚胎，在8µm厚度切片，用苏木精和伊红染色(H & E)。

阿利新蓝染色

按照标准方案进行阿利新蓝染色[62]．肺和气管在不同阶段被解剖出来，固定在Bouin固定液中，用70%乙醇清洗。然后用5%醋酸平衡组织，用0.05%阿利新蓝在5%醋酸中染色2小时。组织在5%醋酸中洗涤以去除多余污渍，在100%甲醇中脱水，在BABB(苄醇，苯甲酸苄酯)中清除并拍照。切片阿利新蓝染色方法:将8µm石蜡切片复水，用0.05%阿利新蓝在5%醋酸中处理，然后用核固红反染。

前肠和肺芽培养

前肠培养如前所述进行[34]．用钨针从8-16个胚芽中分离出前肠，在37°C、95%空气和5% CO存在下培养2Transwell-Col过滤器(Fisher Scientific)含有1.5 ml BGJb培养基(Invitrogen)，添加10%胎牛血清(FBS)， 0.2 mg/ml维生素C (Sigma)和2 μ M 4-OH他莫西芬(Sigma)。肺芽培养时，肺芽在含0.1%牛血清白蛋白(Sigma)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中E11.5分离，然后在含DMEM (Invitrogen)的培养基中培养，DMEM (Invitrogen)含有10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素(Invitrogen)和1 μ M 4-OH他莫西芬(3.0 μ M过滤器(Millipore)或0.4 μ M Transwell过滤器(Fisher Scientific)。两种类型的滤波器都得到了相似的结果;报告的结果是实验用微孔过滤器。在指定的情况下，Fgf10 (R&D)在培养1天后以500 ng/ml的浓度添加。部分实验在培养1天后将包覆Fgf10(100µg/ml)或BSA(100µg/ml)的肝素珠放置于外植体的分枝尖附近。实验采用Transwell滤波器。

肺分支分析

肺用免疫组化e -钙粘蛋白抗体或钙粘蛋白用ISH进行RNA探针。如果是整个坐骑的肺，将肺叶分离并拍照以计数分枝尖的数量。对培养的肺拍照，计数分枝尖。对于一些实验，之后钙粘蛋白ISH组，肺固定于4% PFA, PBT冲洗，100%甲醇脱水，BABB清液，拍照。

支持信息

图S1。

切除效率分析Tbx4fl而且Tbx5fl．雌性携带的胚胎Tbx4fl，Tbx5fl而且克里尔等位基因在E9.0时注射8 mg他莫西芬，在E12.5时解剖(A,E)，或在E8.5时注射7 mg他莫西芬，在E13.5时解剖(B,F)。Tbx4fl / fl完全被切除成了突变体Tbx4−−/在剂量和时间上(A,B)，而单条件等位基因Tbx5fl / +E9.0时注射未完全切除(E)， E8.5时注射完全切除(F)。此外，基因型Tbx4fl / fl；Tbx5fl / fl；克里尔用1 μ m他莫昔芬进行培养Tbx4在培养1天后，基因座几乎被完全切除(C)Tbx5位点仅部分切除(G)Tbx4(D)和Tbx5(H)基因座几乎完全切除。fl, floxed条件PCR条带;WT，野生型PCR条带;Mut，切除的PCR条带。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.s001

(TIF)

图S2。

的损失Tbx4而且Tbx5不影响肺泡分化。(A,B) T1α免疫组化在对照和肺特异性冷冻切片上的作用Tbx4杂合的;Tbx5在E18.5的空肺在肺上皮中可见类似的染色。核耐蚀红被用作反染色剂。A '和B '是A和B中方框区域的高倍放大视图。(C,D)对照和肺特异性冷冻切片上的pro表面活性蛋白C (Pro-SPC) IFTbx4杂合的;Tbx5在E18.5的空肺在肺上皮中可见类似的染色。DAPI染色细胞核。比例尺代表100 μ m。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.s002

(TIF)

图S3。

的损失Tbx4而且Tbx5对分支形态发生有多重影响。(A,B)肺特异性H和E切片Tbx4杂合的;Tbx5与对照肺(A)相比，缺失肺(B)显示右肺的颅叶(cr)、内侧叶(m)和尾叶(cd)缺少分离。黑色箭头指向对照肺(A)和突变肺(B)的相应区域之间的空间。(C,D)对照肺染色钙粘蛋白在E13显示出比肺特异性分支(C)更大的分支(黄色括号)Tbx4杂合的;Tbx5无肺(D)。标尺代表100 μ m。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002866.s003

(TIF)

致谢

我们要感谢伯努瓦·布鲁诺博士Tbx5突变小鼠和Papaioannou实验室的成员对手稿进行了批判性阅读。

作者的贡献

构思和设计实验:RA VEP。进行实验:RA VEP。分析数据:RA VEP rtm。贡献试剂/材料/分析工具:RA VEP。论文作者:rra VEP rj。

参考文献

  1. 1.Whitsett JA, Wert SE, Trapnell BC(2004)影响出生时肺形成和功能的遗传疾病。Hum Mol Genet 13规格2:R207-215。
  2. 2.Cardoso WV, Lu J(2006)早期肺形态发生的调节:问题、事实和争议。发展133:1611-1624。
  3. 3.Spooner BS, wessellers NK(1970)哺乳动物肺发育:原基形成和支气管形态发生的相互作用。J Exp Zool 175: 445-454。
  4. 4.Metzger RJ, Klein OD, Martin GR, Krasnow MA(2008)小鼠肺发育的分支程序。自然453:745-750。
  5. 5.Goss AM, Tian Y, Tsukiyama T, Cohen ED, Zhou D，等(2009)Wnt2/2b和[β]-catenin信号通路是确定前肠中的肺祖细胞的必要和充分条件。发育细胞17:290-298。
  6. 6.Harris-Johnson KS, Domyan ET, Vezina CM, Sun X(2009) -连环蛋白促进小鼠前肠中的呼吸祖细胞同一性。美国科学院学报106:16287-16292。
  7. 7.Domyan ET，孙X(2011)呼吸谱系发展中的模式和可塑性。Dev Dyn 240: 477-485。
  8. 8.Min H, Danilenko DM, Scully SA, Bolon B, Ring BD，等(1998)Fgf-10是四肢和肺部发育所必需的，在功能上与果蝇表现出惊人的相似无枝的．基因Dev 12: 3156-3161。
  9. 9.Sekine K, Ohuchi H, Fujiwara M, Yamasaki M, Yoshizawa T，等(1999)Fgf10在肢体和肺的形成中是必不可少的。Nat Genet 21: 138-141。
  10. 10.Weaver M, Yingling JM, Dunn NR, Bellusci S, Hogan BL (1999) Bmp信号调节小鼠肺发育中内胚层的近端-远端分化。开发126:4005-4015。
  11. 11.Pepicelli CV, Lewis PM, McMahon AP (1998) Sonic hedgehog基因调节哺乳动物肺的分支形态发生。病原生物学8:1083-1086。
  12. 12.Miller LA, Wert SE, Clark JC, Xu Y, Perl AK，等(2004)声波刺猬气管-支气管软骨和周围肺的图示。Dev Dyn 231: 57-71。
  13. 13.Mendelsohn C, Lohnes D, Decimo D, Lufkin T, LeMeur M, et al.(1994)视黄酸受体(RARs)发育过程中的功能(II) RAR双突变体在器官发生不同阶段的多重异常。开发120:2749-2771。
  14. 14.德莱斯，费希尔，段瑞斯(2000)软骨发育中的细胞相互作用和信号传导。骨关节炎软骨8:309-334。
  15. 15.de Crombrugghe B, Lefebvre V, Nakashima K(2001)软骨和骨形成途径的调控机制。细胞生物学杂志13:721-727。
  16. 16.Akiyama H, Chaboissier MC, Martin JF, scheda, de Crombrugghe B(2002)转录因子Sox9在软骨细胞分化途径的连续步骤中具有重要作用，是表达Sox5而且Sox6．基因Dev 16: 2813-2828。
  17. 17.Hardingham TE, Oldershaw RA, Tew SR(2006)软骨、SOX9和Notch信号在软骨形成中的作用。阿纳特杂志209:469-480。
  18. 18.Park J，张俊杰，Moro A, Kushida M, Wegner M，等(2010)Sox9刺猬索尼克(嘘)是气管软骨形成和形成的必要条件。Dev Dyn 239: 514-526。
  19. 19.阙洁，罗旭，Schwartz RJ, Hogan BL (2009) Sox2在发育和成年小鼠气管中的多重作用。发展136:1899-1907。
  20. 20.Vermot J, Niederreither K, Garnier JM, Chambon P, Dolle P(2003)胚胎维甲酸合成减少导致新生小鼠DiGeorge综合征表型。美国国家科学研究100:1763-1768。
  21. 21.Tiozzo C, De Langhe S, Carraro G, Alam DA, Nagy A，等(2009)成纤维细胞生长因子10在Apert综合征小鼠模型气管软骨缺损中起致病作用。儿科文献66:386-390。
  22. 22.Sala FG, Del Moral PM, Tiozzo C, Alam DA, Warburton D，等人(2011)FGF10通过气管软骨环的模式控制嘘．发展138:273-282。
  23. 23.Naiche LA, Harrelson Z, Kelly RG, Papaioannou VE (2005) T-box基因在脊椎动物发育中的作用。《启示录》39:219-239。
  24. 24.Gibson-Brown JJ, Agulnik SI, Silver LM, Papaioannou VE (1998) T-box基因的表达Tbx2-Tbx5在小鸡器官发生过程中。Mech Dev 74: 165-169。
  25. 25.Chapman DL, Garvey N, Hancock S, Alexiou M, Agulnik SI等(1996)T-box家族基因的表达，Tbx1-Tbx5在小鼠发育早期。Dev Dyn 206: 379-390。
  26. 26.Jerome LA, Papaioannou VE (2001) T-box基因突变小鼠的digegeorge综合征表型，Tbx1．Nat Genet 27: 286-291。
  27. 27.LA Naiche, Papaioannou VE (2003)Tbx4阻碍后肢发育，影响尿囊的血管化和融合。发展130:2681-2693。
  28. 28.Bruneau BG, Nemer G, Schmitt JP, Charron F, Robitaille L, et al.(2001)一个Holt-Oram综合征的小鼠模型定义了t箱转录因子Tbx5在心脏发生和疾病中的作用。106号房:709-721。
  29. 29.braa - thomas JA, Bromer J, Gardner R, Lam GK, Sheipe H, et al.(2003)小鼠胚胎肺间充质诱导上皮分支需要T-box基因产物。Dev Dyn 226: 82-90。
  30. 30.熊山美，山岸美，黑岩美(2003)Tbx4-Fgf10系统控制鸡胚胎发育过程中肺芽的形成。发展130:1225-1234。
  31. 31.曾逸年，苏燕，吕福林，郑顺峰，谢文伟等。(2007)肺组织新生突变引起的霍尔特-奥兰姆综合征合并右肺发育不全TBX5基因。中华医学杂志杂志143A: 1012-1014。
  32. 32.Elluru RG, Whitsett JA (2004) Sox9在胚胎小鼠模型中形成气管软骨环的潜在作用。耳鼻喉弓头颈外科130:732-736。
  33. 33.周勇，周勇，周勇(2008)气管平滑肌的胚胎学起源。胸腔镜系统5:4-10。
  34. 34.陈飞，曹勇，钱娟，邵飞，等。(2010)小鼠肺原基形成与前肠维甲酸依赖网络的关系。投资120:2040-2048。
  35. 35.Desai TJ, Malpel S, Flentke GR, Smith SM, Cardoso WV(2004)维甲酸选择性调节Fgf10在发育中的前肠的前瞻性肺野中表达和维持细胞的特性。Dev Biol 273: 402-415。
  36. 36.Naiche LA, Papaioannou VE (2007) Cre活性导致胚胎发育过程中广泛的细胞凋亡和致死性贫血。创世纪45:768-775。
  37. 37.Luria V, Krawchuk D, Jessell TM, Laufer E, Kania A (2008) ephrin-B:EphB信号通路对运动轴突轨迹的规范:发育中的肢体轴突模式的对称控制。神经元60:1039-1053。
  38. 38.Naiche LA, Arora R, Kania A, Lewandoski M, Papaioannou VE (2011)Tbx4-表达细胞揭示了尿囊、肢体和外生殖器中发育细胞命运的决定。Dev Dyn 240: 2290-2300。
  39. 39.Weaver M, Dunn NR, Hogan BL (2000) Bmp4和Fgf10在肺芽形态发生过程中起相反的作用。开发127:2695-2704。
  40. 40.王晓明，张晓明，张晓明(2008)。Circ Res 103: 784-795。
  41. 41.Firnberg N, Neubuser A (2002) FGF信号调节Tbx2，嗯，Pea3,Pax3在鼻部早期。Dev Biol 247: 237-250。
  42. 42.Bellusci S, Grindley J, Emoto H, Itoh N, Hogan BL(1997)小鼠胚胎肺中的成纤维细胞生长因子10 (FGF10)和分支形态发生。开发124:4867-4878。
  43. 43.Arman E, Haffner-Krausz R, gororivodsky M, Lonai P (1999)Fgfr2是肢体生长和肺分支形态发生所必需的。美国科学院学报96:11895-11899。
  44. 44.Kimura S, Hara Y, Pineau T, perez - salguero P, Fox CH, et al. (1996) T/ebp缺失小鼠:甲状腺特异性增强子结合蛋白对甲状腺、肺、腹侧前脑和垂体的器官发生至关重要。基因发育10:60-69。
  45. 45.Izvolsky KI, Shoykhet D, Yang Y, Yu Q, Nugent MA等。(2003)硫酸肝素- fgf10在肺形态发生中的相互作用。Dev Biol 258: 185-200。
  46. 46.Papaioannou VE, Goldin SN(2008)介绍T-box基因及其在发育信号通路中的作用。在:爱泼斯坦CJ，埃里克森RP，温肖鲍里斯A，编辑。先天的发展错误。形态发生临床障碍的分子基础，2nd版。牛津:牛津大学出版社。852 - 861页。
    • 47.Domyan ET, Ferretti E, Throckmorton K, Mishina Y, Nicolis SK等(2011)通过BMP受体发出信号，通过抑制前肠中的呼吸识别Sox2．发展138:971-981。
    • 48.Goering LM, Hoshijima K, Hug B, Bisgrove B, Kispert A, et al.(2003)斑马鱼中胚层中T-box基因相互作用网络指导基因表达和命运。美国科学院学报100:9410-9415。
    • 49.Duboc V, Logan MP(2011)肢芽起始和肢型形态的调控。Dev Dyn 240: 1017-1027。
    • 50.陈晓燕，陈晓燕，陈晓燕(2010)不同的转录活性决定了肢体的特征。Nat comm 1:35。
    • 51.Krause A, Zacharias W, Camarata T, Linkhart B, Law E，等(2004)Tbx5和Tbx4转录因子与一种新的鸡PDZ-LIM蛋白在肢体和心脏发育中的相互作用。Dev Biol 273: 106-120。
    • 52.Agarwal P, Wylie JN, Galceran J, Arkhitko O, Li C等(2003)Tbx5在小鼠胚胎中，前肢芽在肢体场形成后萌发是必不可少的。发展130:623-633。
    • 53.Patel VN, Knox SM, Likar KM, Lathrop CA, Hossain R，等(2007)在体外颌下腺分支形态发生过程中，过氧化肝素硫酸酯的肝素酶裂解调节FGF10活性。发展134:4177-4186。
    • 54.Shimokawa K, Kimura-Yoshida C, Nagai N, Mukai K, Matsubara K, et al.(2011)小鼠胚胎细胞表面的硫酸盐肝素链调节FGF信号的局部接收。Dev Cell 21: 257-272。
    • 55.LA Naiche, Papaioannou VE (2007)Tbx4后肢鉴别或后肢芽后生长不需要。发展134:93-103。
    • 56.Mori AD, Zhu Y, Vahora I, Nieman B, Koshiba-Takeuchi K，等(2006)tbx5依赖的心脏基因表达和形态发生的流变控制。Dev Biol 297: 566-586。
    • 57.de Luca C, Kowalski TJ, Zhang Y, Elmquist JK, Lee C，等(2005)肥胖、糖尿病和不孕症的完全拯救db / db小鼠的神经元特异性LEPR-B转基因。J clinin投资115:3484-3493。
    • 58.Soriano P(1999)广义lacZ表达与rosa26cre报告株。Nat Genet 21: 70-71。
    • 59.Wilkinson DG, Nieto MA(1993)通过组织切片和整个标本的原位杂交检测信使RNA。方法酶粒225:361-373。
    • 60.Davis CA(1993)全身免疫组化。方法酶学225:502-516。
    • 61.Grieshammer U, Le M, Plump AS, Wang F, Tessier-Lavigne M等(2004)slit2介导的ROBO2信号通路将肾脏诱导限制在单一位点。开发单元6:709-717。
    • 62.Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R(2009)小鼠胎儿软骨骨骼的阿利新蓝染色。冷泉港协议2009:pdb.prot5169。
    • 63.Douglas NC, Heng K, Sauer MV, Papaioannou VE (2011) Tbx2亚家族基因在小鼠生殖系统发育中的动态表达。Dev Dyn 241: 365-375。