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研究文章

Senescence-Associated分泌表型揭示Cell-Nonautonomous致癌RAS和p53肿瘤抑制功能

  • 机构让-菲利普•Coppe,

    联系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国

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  • 克里斯托弗·K帕蒂尔,

    贡献同样处理:克里斯托弗·K帕蒂尔,弗朗西斯Rodier

    联系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国

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  • 弗朗西斯Rodier,

    贡献同样处理:克里斯托弗·K帕蒂尔,弗朗西斯Rodier

    从属关系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国,巴克年龄研究所,诺瓦托,加州,美国

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  • 于太阳,

    联系人类生物学,弗雷德哈钦森癌症研究中心,西雅图,华盛顿,美国

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  • 丹尼斯P穆尼奥斯,

    从属关系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国,巴克年龄研究所,诺瓦托,加州,美国

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  • 约书亚•戈尔茨坦

    ¤当前地址:诺华研究基金会的基因组学研究所,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国

    联系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国

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  • 彼得·尼尔森,

    联系人类生物学,弗雷德哈钦森癌症研究中心,西雅图,华盛顿,美国

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  • 皮埃尔·Desprez,

    从属关系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国,加州太平洋医疗中心研究所,旧金山,加州,美国

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  • Judith Campisi

    人信件应该解决。电子邮件:jcampisi@lbl.gov

    从属关系生命科学部门,劳伦斯伯克利国家实验室,伯克利,加州,美国,巴克年龄研究所,诺瓦托,加州,美国

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Senescence-Associated分泌表型揭示Cell-Nonautonomous致癌RAS和p53肿瘤抑制功能

  • 机构让-菲利普•Coppe,
  • 克里斯托弗·K帕蒂尔
  • 弗朗西斯•Rodier
  • 于太阳,
  • 丹尼斯P穆尼奥斯,
  • 约书亚•戈尔茨坦
  • 彼得·尼尔森,
  • 皮埃尔·Desprez,
  • Judith Campisi
公共科学图书馆
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文摘

由逮捕细胞增殖,细胞衰老抑制癌症的本质上是永久,致癌的刺激,包括基因毒性压力。我们修改了使用抗体阵列提供了一个定量的评估由衰老细胞分泌的因素。我们表明,人类细胞诱导开始衰老的基因毒性应激分泌多种与炎症和肿瘤相关的因素。这senescence-associated分泌表型(SASP)在几个天,之后才慢慢发展起来的DNA损伤足够诱导衰老的大小。非常相似SASPs发达在正常成纤维细胞,正常上皮细胞和上皮肿瘤细胞在文化基因毒性压力后,在上皮肿瘤细胞体内的前列腺癌患者治疗后能损伤dna的化疗。在培养的癌变前的上皮细胞,SASPs诱导epithelial-mesenchyme过渡和侵袭性,恶性肿瘤的特点,通过旁分泌机制,很大程度上取决于SASP因子白介素(IL) 6和引发。引人注目的是,两个操作明显放大,加速发展,SASPs:致癌RAS表达,正常细胞,导致基因毒性压力和衰老和功能丧失的p53肿瘤抑制蛋白。p53损失和增加致癌RAS也加剧了SASPs promalignant旁分泌活动。我们的研究结果定义的基因毒性应激衰老。此外,他们建议cell-nonautonomous p53可以抑制机制,和致癌RAS能促进发展与年龄相关的癌症通过改变组织微环境。

作者总结

细胞受损的DNA有可能成为恶性肿瘤。尽管“细胞衰老”可以从受损细胞通过阻断抑制肿瘤的形成是肿瘤生长的细胞分裂,它也涉及促进癌症和其他与年龄相关的疾病。了解这可能发生,我们测量蛋白质人类衰老细胞分泌到当地的环境,发现许多炎症和癌症发展的相关因素。不同类型的细胞分泌一组通用的蛋白质时,他们开始衰老。这senescence-associated分泌表型(SASP)发生不仅在培养细胞,体内还能损伤dna的化疗。正常细胞,获得高活性突变版本的RAS蛋白,这是导致肿瘤生长,进行细胞衰老,并开发一个非常强烈的SASP,水平较高的蛋白质分泌。同样,当细胞失去SASP更为严重的肿瘤抑制基因p53的函数。衰老细胞促进增长和附近的癌前或癌细胞的攻击性,和细胞更强烈SASP更有效地这样做。我们的研究结果支持这样的设想,即细胞衰老可以是有益的,在防止受损的细胞分裂,和有害的,通过对相邻细胞的影响;这种平衡的效果预测的进化理论老化。

引用:Coppe J],帕蒂尔CK Rodier F,太阳Y,穆尼奥斯DP, Goldstein J, et al。(2008) Senescence-Associated分泌表型揭示Cell-Nonautonomous致癌RAS和p53肿瘤抑制功能。公共科学图书馆杂志6 (12):e301。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301

学术编辑器:朱利安向下,英国癌症研究中心,联合王国

收到:2008年6月27日;接受:2008年10月22日;发表:2008年12月2日

版权:机构©2008 Coppe等。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是支持由美国国立卫生研究院(研究资助AG09909 & AG017242 JC;CA126540 PSN和JC;培训格兰特AG000266詹和CKP);太平洋西北地区前列腺癌孢子CA97186)和拉里·l·Hillblom基金会(CKP奖学金)。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

缩写:厘米,条件培养基;DDR, DNA损伤反应;ELISA酶联免疫吸附试验;EMT epithelial-mesenchymal过渡;GSE基因抑制元素;IL,白介素;麻省理工学院、米托蒽醌;前,presenescent;前的,正常的人类前列腺上皮细胞;代表,复制的疲惫; SASP, senescence-associated secretory phenotype; SEN, senescent; shRNA, short hairpin RNA; XRA, X-irradiation

介绍

癌症是一种多步疾病的细胞获得越来越多的恶性表型。这些表型获得部分体细胞突变,扰乱正常的控制细胞增殖(增长),生存,对恶性肿瘤发生[入侵和其他过程重要1]。此外,有越来越多的证据表明,组织的微环境是一个重要的决定因素是否和恶性肿瘤如何发展2,3]。正常组织环境往往抑制恶性表型,而异常组织环境等引起的炎症可促进癌症进展。

癌症的发展受制于多种肿瘤抑制基因。其中一些基因永久逮捕的生长细胞肿瘤的风险转变,这一过程称为细胞衰老(4- - - - - -6]。两个肿瘤抑制通路,由p53和p16INK4a分子/蛋白质,控制调节衰老反应。通路整合多个方面的细胞生理学和直接的细胞命运对生存、死亡、扩散,或增长逮捕,这取决于上下文(7,8]。

了多方面的证据表明,细胞衰老是一种有效的肿瘤抑制机制(4,9,10]。许多潜在的致癌刺激(如功能失调的端粒,DNA损伤,某些致癌基因)诱导衰老(6,11]。此外,突变,抑制p53或p16INK4a分子/复审委员会途径赋予抵抗衰老,大大增加患癌症的风险12,13]。大多数癌症港突变在这些途径(一个或两个14,15]。最后,在小鼠和人类衰老反应强烈的促有丝分裂的信号,例如那些由某些致癌基因,防止癌变前的病变发展到恶性肿瘤(16- - - - - -19]。有趣的是,一些肿瘤细胞保留开始衰老的能力,以应对能损伤dna的化疗或p53复活;在老鼠中,这种反应逮捕肿瘤恶化[20.- - - - - -22]。

尽管支持认为衰老是一种有益的抗癌机制,间接证据表明,衰老细胞也可以有害,可能导致老年性疾病10,23- - - - - -25]。明显的矛盾导致肿瘤抑制和老化老化的进化理论是一致的,称为拮抗基因多效性(26]。生物一般进化在充斥着外在的环境危害,所以老个人往往是罕见的自然种群。因此,几乎没有选择压力对肿瘤抑制机制是有效的,直到晚年;相反,这些机制需要充分有效的只有以确保成功的繁殖。此外,肿瘤抑制机制可以在先进的年龄原则上是有害的,预测的进化拮抗基因多效性。符合这一观点,衰老细胞随着年龄的增加在哺乳动物组织(27),被发现在网站与年龄有关的疾病如关节炎和动脉粥样硬化28- - - - - -30.]。此外,在小鼠体内,长期活跃p53促进细胞衰老和加速衰老表型(31日,32]。

衰老细胞可能是有害的吗?衰老细胞获得许多基因表达的变化,主要是记录改变mRNA丰富,包括增加分泌蛋白的表达(33- - - - - -41]。这些分泌蛋白以自分泌的方式采取行动,加强衰老增长逮捕[37,38,40,41]。此外,细胞培养和鼠标异种移植研究表明,衰老细胞中分泌的蛋白质能促进退行性或hyperproliferative邻近细胞的变化35,39,42,43]。因此,尽管衰老细胞自动增长逮捕抑制癌症、衰老细胞中分泌的因素可能有有害的cell-nonautonomous改变组织微环境的影响。迄今为止,衰老细胞的分泌状况的综合分析缺乏,知识是关于这个概要文件随细胞类型或衰老诱导物,或它如何控制衰老与肿瘤抑制蛋白。

我们的知识来填补这些空白,我们修改抗体阵列是定量的和敏感的宽动态范围和定义了senescence-associated分泌表型(SASP)。我们表明,该表型是复杂的,包含元素与炎症和肿瘤发生有关,和只有不会引起足够的压力大小导致衰老。SASPs人类衰老成纤维细胞和上皮细胞表达的文化。此外,上皮肿瘤细胞暴露于能损伤dna的化疗开始衰老和SASP体内表达。数组允许我们识别两个新的恶性表型由衰老细胞(epithelial-mesenchyme过渡和侵袭性),和SASP因素负责(白介素(IL) 6和引发)。引人注目的是,明显放大了SASP致癌RAS或损失的p53功能。我们的结果识别机制p53充当cell-nonautonomous肿瘤抑制,和RAS cell-nonautonomous致癌基因,并提供一个新颖的框架了解与年龄相关的癌症可能进步。

结果

Senescence-Associated人类成纤维细胞分泌表达的表型

确定组织的起源、供体的年龄,或基因型分泌表型的影响,我们首先研究了五个人类成纤维细胞菌株,来源于胚胎肺(WI-38 imr - 90),新生儿包皮(BJ, HCA2),或成人乳房(hBF184)。我们培养细胞在标准条件下,大气(∼20%)O2或3%啊2,这是更多的生理44]。我们presenescent(前)文化细胞能够增殖(> 80%)增长静止的细胞融合为了进行比较:增生性衰老(SEN)文化(< 10%)(表S1)。我们反复诱导衰老通过使细胞(代表,复制的疲惫)或通过公开他们相对高剂量(10 Gy)的电离辐射(XRA [X-irradiation])(见材料和方法;表S1;和文本S1)。

识别蛋白质分泌PRE和森细胞,我们生成条件孵化每种文化传媒(CM)的无血清培养基为正常化后24 h。细胞数量,我们分析了CM使用抗体阵列设计检测120蛋白质在细胞间信号选择角色(表S2)。我们修改了检测协议(见材料和方法和文本S1),从而呈现线性阵列在两到三个数量级;准确,由一致性与酶联免疫吸附实验(elisa)的重组蛋白;可靠,通过比较确定一式三份样品分别分析混合样品(文本S2)。我们量化信号,规格化强度控制阵列来促进interexperiment比较,并计算分泌蛋白质含量作为日志2倍的所有样本的变化相对于平均每个细胞株(基线)。我们使用这些值定量数据分析(数据集S1- - - - - -S4视觉显示)和(图1A)。视觉显示,在基线值显示在等级的黄色,和价值观下基线显示在蓝色的成绩(图1一个)。

缩略图
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图1所示。SASP人类成纤维细胞

(A)表示细胞分泌的可溶性因子的检测到抗体阵列中描述和分析文本,材料和方法;文本S2;和数据集S1- - - - - -S4。对于每个细胞株,PRE和森信号平均,作为基线。衰老(SEN)诱导通过反复使细胞(代表,复制的疲惫)或通过公开他们相对高剂量(10 Gy)的电离辐射(XRA X-irradiation);为简化XRA森和代表信号平均单个信号(见也图1C)。信号高于基线显示在黄色;信号低于基线以蓝色显示。热点图上的数字键(右)表明日志2倍基线的变化。

(B)验证免疫染色。PRE WI-38细胞衰老的代表或XRA,维持在10%血清固定,应用细胞因子il - 6和引发和衰老p16INK4a分子标志。

(C)相关性WI-38细胞诱导衰老的SASPs XRA或代表,与前细胞相比,描绘成日志2倍的变化。

(D) WI-38细胞X-irradiated表示剂量。CM收集2、4、7、10 d后,可溶性因子分析抗体阵列。预辐照细胞和细胞0.5 Gy短暂逮捕了增长,但恢复增殖24 - 48 h后CM集合。细胞辐射10 Gy变得衰老,因此做繁殖期间及以后的实验。PRE和森(10 d)信号平均,作为基线。信号高于基线显示在黄色;信号低于基线以蓝色显示。

森(E)和细胞分析显示mrna的定量rt - pcr和归一化到相应的前值(基线)。衰老的诱导物(代表或XRA)给出了括号。信号高于基线红色所示,信号低于基线显示在绿色和褶皱的变化信号热图的右边。结果平均四株细胞(WI-38, IMR90 HCA-2, BJ),并为每个条件给出的样本总数低于热图。星号(*)表示non-SASP因素(见图S4)。

(F) mRNA和蛋白分泌水平之间的相关性为SASP(红色)和non-SASP(蓝色)因素(见图S4)。前和森值平均为创建一个基线;所有的值被表示为日志2倍的变化相对于基线;前与基线和森与基线所示。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301.g001

虽然只显示了半定量的评估如何分泌水平各不相同(见附带的规模图1与日志,2倍的变化表示),数据(数据集S1- - - - - -S4森)表明,细胞分泌的水平明显高于许多蛋白质相比前细胞(图1)。我们术语这一现象senescence-associated分泌表型(SASP)。120个蛋白质审问的数组,41在森厘米,显著改变oversecreted相比以前厘米(图1一个和数据集S4)。然而,SASPs并非源于一般的刺激分泌。七十九年森之间的蛋白质分泌水平没有显著差异和前细胞,尽管许多这些蛋白质很容易检测到的数组(数据集S4)。

SASPs是复杂的,他们无法预测先天的生物效应。SASP组件包括炎症和免疫调节细胞因子和趋化因子(例如,il - 6, 7−−8日MCP-2,和MIP-3a)。他们也包括生长因子(例如,GRO、HGF和IGFBPs),脱落细胞表面分子(例如,icam、uPAR和TNF受体),和生存因素(图1一个和表S2)。然而,SASP并不是一个固定的表型。相反,它是一个广泛的资料,因为每个单元应变也显示独特的定量或定性的特性。此外,在紧张,以前文化分泌较高水平的一些因素分别为20%和3%2分泌,森文化更高层次的一些因素在3%和20%2。因此,尽管人类细胞更敏感比老鼠细胞hyperphysiological O2(44),人体细胞不受环境的影响2的水平。尽管如此,分泌表型是高度保守的(r> 0.75)在人类衰老细胞培养中分别为3%和20%2。相比之下,周围的O2水平强烈影响小鼠衰老细胞的分泌表型(机构j.p. Coppe, c·k·帕蒂尔f . Rodier a . Krtolica s Parrinello et al .,未公开的数据)。

我们验证了几个SASP蛋白质的分泌水平通过elisa (图S1和文本S1)。另外,由于分泌增加了一些SASP因素大于10倍,我们可以验证通过细胞内免疫染色老年病。例如,il - 6,引发几乎看不到前细胞显然在森发现细胞(图1B,图S2,文本S1)。我们进行免疫染色在10%血清的细胞,这使我们能够排除这种可能性,SASP senescence-specific回应所需的无血清培养收集厘米。此外,森细胞诱导的SASPs代表和XRA高度相关(r> 0.9;图1C),这表明表型不是特定于一个衰老诱导物。成纤维细胞分泌的概要文件的菌株从相同的组织(例如,BJ和HCA2新生儿包皮;从胎儿肺和IMR90 Wi-38)高度相关(S3数据集和S4)。在随后的数据,数据从这些相关细胞菌株,以及代表和XRA样本相同类型的细胞,是汇集和平均为了简化显示。

因为代表和XRA诱导衰老主要由基因损害(分别从端粒缩短和DNA断裂),我们问SASP是否主要DNA损伤反应。我们使用0.5或辐照细胞10 Gy。正如所料,两个剂量启动了DNA损伤反应,由p53稳定和磷酸化(见图S3和文本S1)。然而,细胞收到0.5 Gy短暂逮捕增长仅为24 - 48 h之前恢复增长,而细胞获得10 Gy接受永久衰老生长逮捕(图1D)。抗体阵列进行CM之间收集2和辐照后10 D显示,只有10 Gy诱导SASP (图1D和图S3)。此外,由于DNA损伤细胞开始衰老了SASP缓慢,需要4 - 7 d后辐照前表达一个健壮的SASP。这些发现表明SASP不是DNA损伤反应本身。然而,它是由DNA损伤引起足够的大小导致衰老,之后,它需要几天时间来培养。

我们还确定蛋白质组成SASP,一般来说,在mRNA水平的丰度差异(图1E和1F,红色象征和行;图S4,文本S1)。然而,对于检测蛋白质显示很少或没有senescence-associated分泌的变化,mRNA水平的预测因素分泌蛋白质水平(图1F,蓝色象征和行;和图S4)。因此,抗体阵列提供了一个更准确的评估senescence-associated分泌比mRNA分析签名。

SASPs人类上皮细胞

确定SASP仅限于成纤维细胞,我们研究了上皮细胞的分泌活动。正常的人类前列腺上皮细胞(prec)接受了经典衰老逮捕回应X-irradiation(见增长表S1)。我们收集了PRE的厘米,森prec,分析由这些细胞分泌抗体阵列使用的因素。正常prec表示一个健壮的SASP衰老(图2一个和数据集S5- - - - - -S8)。如成纤维细胞,森prec分泌许多因素比prec以前在更高水平。比较正常的人类的SASPs上皮和基质细胞开始衰老在相似的条件下,我们分析因素显示一个明显的变化(p< 0.05)在衰老prec XRA引起的或成纤维细胞(图2)。使用超几何分布,我们确定的SASPs正常细胞类型重叠高度显著(p=∼10−3;看到材料和方法)。所有120年的趋势分析因素对数组(图2B)证明了分泌概要文件相关(r= 0.53),还表示> 66%重叠成纤维细胞和上皮细胞正常。更具体地说,两个SASPs包括炎症或免疫因素如il - 6,引发,或MCP-1增长调节器如GRO IGFBP-2,细胞生存调控等功能或sTNF RI,和表面分子如uPAR或ICAM-1 (图2),不足为奇,也有差异的SASPs成纤维细胞和前的。成纤维细胞相比,三个因素(Acrp30, BTC IGFBP-6)被森在前的显著下调。此外,IL-1α或HGF SASP因素独特的正常上皮SASP或正常的纤维母细胞SASP,分别。这个结果表明SASP并不局限于正常基质细胞,大量重叠正常衰老细胞不同的组织起源的存在。

缩略图
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图2。SASP人类上皮细胞

(A)可溶性因子表示正常分泌的细胞类型(上皮和基质)检测到抗体阵列中描述和分析文本,材料和方法数据集S5- - - - - -S8。正常的前列腺上皮细胞(prec)被10 Gy辐照诱导开始衰老,和CM PRE和森的细胞进行了分析。的SASP prec并排比较的SASP森(XRA)成纤维细胞(HCA-2 WI-38 imr - 90, BJ)。每个细胞类型的值作为基线。信号高于基线显示在黄色;信号低于基线以蓝色显示。热图键(右)表明日志2倍基线的变化。p值计算的学生t以及,右边的热图。ns=不显著(p> 0.05)和定义non-SASP因素。

(B)的日志2120倍的变化对所有蛋白质抗体检测到的数组绘制了森(XRA) prec和森(XRA)成纤维细胞,相对于之前的基线。七十九年分泌因素(66%)遵循了同样的监管趋势(红色)。其余因素没有coregulated(用蓝色表示)。

(C)产生的可溶性因子显示正常或改变前列腺上皮细胞被抗体阵列分析,结果显示所述图1答:为每个细胞株或细胞系,PRE和森信号被平均,作为基线。信号高于基线所示黄色;信号低于基线以蓝色显示。星号(*)表示SASP因素之间是守恒的成纤维细胞(图1和所有的上皮细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301.g002

一些肿瘤细胞保留开始衰老,以应对DNA损伤的能力,包括能损伤DNA的化疗(20.- - - - - -22]。我们也因此被问及前列腺癌细胞SASP。我们研究了三种前列腺肿瘤细胞系(BPH1 [45],RWPE1 [46),和生物47),不同程度的恶性肿瘤如下:生物> RWPE1 > BPH1)。与正常上皮细胞(prec),我们通过XRA诱导衰老,并分析了CM使用抗体阵列(数据集S5- - - - - -S8)。森上皮细胞分泌的水平明显高于许多蛋白质相比前(图2C)。前列腺癌的SASPs正常上皮细胞显示惊人的重叠和转化细胞(图2C和数据集S8),也有惊人的相似之处SASP成纤维细胞和上皮细胞的转化,而不是改变了(图2C,星号表示共同分泌蛋白质,数据集S5- - - - - -S8)。24蛋白质之间共享SASPs的成纤维细胞(图1)和所有上皮细胞(图2C);这种重叠是非常重要的相对于重叠可以预测从机会(p=∼10−5;看到材料和方法)。我们得出这样的结论:正常成纤维细胞正常和改变上皮细胞可以开发SASPs明显重叠,显示许多常见,但也有不同的功能。

化疗所致SASPs体内发生

许多人类肿瘤细胞保留开始衰老的能力,在应对文化和体内,能损伤dna的化疗药物(48,49]。上皮细胞系以及正常成纤维细胞,在文化接受衰老反应米托蒽醌(麻省理工学院)(见表S1),2β拓扑异构酶抑制剂导致DNA断裂和用于治疗前列腺癌(50]。抗体数组(图3一个和数据集S5- - - - - -S8对il - 6)和elisa,引发和GRO-α(图S1)表明,麻省理工学院(MIT)诱导SASP相关(r= 0.89)与XRA-induced SASP (图3一个)。

缩略图
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图3。化疗所致SASP在文化和体内

(A)整体XRA之间的相关性和米托蒽醌(MIT)全身SASPs为所有三个前列腺上皮肿瘤细胞系(BPH-1, RWPE-1,曲泽)。相关性对个人细胞系向右表中给出。衰老的诱导物(XRA或麻省理工学院)在括号中给出。

(中)人类肿瘤细胞被隔绝活检获得相同的患者化疗前麻省理工学院和麻省理工学院(MIT)化疗后前列腺切除术后前列腺组织。激光捕获细胞分析定量rt - pcr的信使rna编码表示蛋白质,如材料和方法和所述文本S1。结果显示在一个日志10规模指示(水平或之前的值x(垂直或后设在)相比y设在)化疗(前左面板[B])。每一个黑点(B, C和D)代表获得的结果从一个病人。所有患者化疗之前和之后的平均值由红点表示(罪犯);这些值也表示成一个热图(E)。

信使rna编码(B)值与衰老相关的蛋白质(p16和p21)和扩散(细胞周期蛋白A、MCM-3和PCNA)。

信使rna (C)值编码SASP-associated蛋白(GRO-α,il - 6,引发,gm - csf IGFBP-2,和IL-1β)。

(D)值为一个信使rna编码non-SASP-associated蛋白(2)。

(E)所示值的平均值(罪犯)。整体p值,由学生决定t以及,和配对样本的数量(或病人)为每个mRNA分析热图的右边。信号高于prechemotherapy基线显示为红色;用绿色显示信号低于基线。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301.g003

发现人类前列腺肿瘤细胞表达SASP在麻省理工学院在文化允许我们确定麻省理工学院诱导SASP体内。我们激光捕获大约1000人类前列腺癌患者肿瘤上皮细胞活检前麻省理工学院在组织切除化疗和化疗和前列腺切除术(50]。通过显微镜检查,捕获细胞的基质细胞和白细胞。自从mRNA和蛋白分泌水平相关的表达显著上调SASP因素(图1E和1F和图S4),我们使用定量PCR量化mrna编码衰老和增殖标记和SASP因素。

化疗后,大多数肿瘤包含p16INK4a分子和p21的mrna水平显著升高,而通常上调衰老细胞(图3B)。他们还包含proliferation-associated信使rna编码细胞周期蛋白的含量明显低于A, MCM-3和PCNA (图3B)。这些结果表明,麻省理工学院(MIT)诱导肿瘤细胞在体内开始衰老。重要的是,大部分的肿瘤含有更高水平的信使rna编码il - 6的SASP组件,引发,gm - csf, GRO-αIGFBP-2, IL-1β(图3C)。然而,信使rna编码- 2的水平,这并不是一个SASP组件,并没有显著改变平均(图3D)。这些发现(总结图3E)表明,SASP并不局限于培养细胞,也发生在人类细胞体内开始衰老。

SASPs诱导Epithelial-Mesenchyme转换和侵袭性

epithelial-mesenchymal过渡(EMT)授予侵袭性和转移性上皮细胞上的属性,在癌症的发展过程中是一个重要的一步,预示着转换原位癌侵袭性癌症(有可能是致命的,51,52]。我们发现成纤维细胞SASP诱导一个经典的EMT在两个非主动人类乳腺癌细胞系T47D和ZR75.1)。从森分泌的因素,但不是以前,成纤维细胞上皮细胞存在剂量依赖的相关性引起的散射,间充质特征(图4)。此外,免疫染色显示,PRE厘米保存surface-associatedβ-catenin和钙粘蛋白,和强大的细胞角蛋白8/18表达式(图4B),和西方的分析表明,PRE厘米保存波形蛋白的低表达(见下文)。这些特性是上皮细胞特征经常被非主动保留细胞(51,52]。相比之下,森厘米从总体细胞明显减少,细胞表面β-catenin和钙粘蛋白和细胞角蛋白表达减少(图4B),符合间充质转变。进一步,森CM理气紧密连接蛋白claudin-1,留下剩下的主要蛋白质局部核(图4B),一个标志的EMT原发肿瘤和转移性的一个特征而不是[53]。最后,森厘米增加波形蛋白表达(见下文),另一个的间叶细胞标记和标志EMT (52]。

缩略图
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图4。小说SASP生物活动和关键因素

(一)T47D ZR75.1细胞培养2 d CM与预成纤维细胞,或由XRA森成纤维细胞诱导。细胞相衬下拍摄,或分析集群大小使用一个自动化Cellomix成像仪和软件。小集群或丛大小(像素2)表明更大的散射。括号中给出了衰老诱导物。四星号(* * * *)表示p< 0.001。误差线显示周围的标准差的意思。

(B) T47D和ZR75.1细胞孵化表示厘米为3 d和应用表明EMT标记蛋白质。诱导间充质标记波形蛋白的森(XRA)厘米的免疫印迹显示图7一个。

(C)上皮细胞入侵用Boyden测量室包含厘米单独或厘米+ il - 6和引发重组蛋白或il - 6和引发阻止抗体,所述材料和方法。~ 24 h后,入侵得分通过计算细胞的数量在膜的底部。入侵刺激前厘米是给定一个值之一,和其他条件规范化这个值。入侵显著刺激和重组蛋白的显著抑制抗体(p< 0.05)。误差线显示周围的标准差的意思。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301.g004

从森符合SASP-induced EMT,厘米,但不是以前,刺激细胞癌变前的MCF-10A和恶性T47D ZR75.1 CAMA1, HCC1187细胞入侵基底膜(图4C)以及mda - mb - 231和mda - mb - 453(数据和未发表的数据未显示)。抗体阵列引导我们在确定高度分泌il - 6 SASP组件和引发的这次活动的候选人54,55]。重组il - 6,刺激引发了PRE厘米入侵不同程度取决于上皮。重要的是,il - 6和引发抗体阻断入侵刺激减少了森厘米(图4C),表明il - 6和引发重大贡献。这些结果支持SASP旁分泌活动可以促进附近的癌变前的或恶性肿瘤细胞的恶性表型,并确定新的SASP活动:能够引起急诊医疗和入侵基底膜。

致癌RAS诱发SASP放大

某些致癌基因,其中致癌RAS是原型56),诱导衰老的间接导致DNA损伤(57,58]。最出名的RAS和相关癌基因产生促有丝分裂的信号,促进细胞自动恶性表型,尽管RAS-transformed细胞也分泌特定因素,导致肿瘤发生[59- - - - - -61年]。我们发现SASPs能促进细胞恶性表型在附近建议RAS-like致癌基因也可能促进恶性肿瘤通过复杂SASP cell-nonautonomously。为了测试这种可能性,我们表示使用慢病毒致癌RAS在成纤维细胞和上皮细胞,使细胞开始衰老(表S1),并分析了CM使用抗体阵列。

RAS诱导SASP,都共同和独特的特征引起的相对于SASPs代表或XRA (图5A -5E和数据集S9- - - - - -S12)。包容的一个子集诱发性SASP蛋白质显示增加分泌在代表——或者XRA-induced衰老(图5A)。为了简化视觉比较,我们平均高度相关的数据(图5一个和5C)从细胞来自同一组织(WI-38 + IMR90从胚胎肺,和BJ + HCA-2从新生儿包皮),和细胞诱导开始衰老的代表或XRA(见数据集S9- - - - - -S12平均的细节,和原材料数据)。总的来说,之间有良好的相关成纤维细胞诱导的SASPs RAS开始衰老,XRA或代表(图5C)。森(XRA或代表)之间的相关性(平均)和森(RAS) 0.75 WI-38和imr - 90成纤维细胞(平均)和0.84 HCA-2成纤维细胞。

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图5。SASP致癌RAS放大

(A)表示成纤维细胞产生的可溶性因子分析抗体阵列并显示所述图1以前,但在这种情况下,信号被用作基线。因此,颜色强度代表日志2倍森厘米的变化相对于以前厘米从细胞相同的基因型在相同的培养条件。我们汇集和平均高度相关数据(见图1C)从细胞起源于一个共同的组织(WI-38 imr - 90从胚胎肺;从新生儿包皮)和HCA-2 BJ,衰老引起的代表或XRA。提供了数据处理的细节数据集S9- - - - - -S12。括号中给出了衰老诱导物。信号高于基线所示黄色;信号低于基线以蓝色显示。热点图上的数字键(右)表明日志2倍基线的变化。

(B) WI-38细胞诱导开始衰老的RAS SASP蛋白质的应用il - 6和引发,p16INK4a分子和衰老的标志。

(C)之间的相关性引起的SASPs RAS和代表或XRA从胚胎肺成纤维细胞(WI-38 imr - 90(左)或新生儿包皮(HCA-2吧)。相关性的单个细胞压力和衰老抗病诱导剂在图下面的表。

(D)所示的日志2倍值因素显著增加在CM中从成纤维细胞诱导开始衰老的RAS相比,成纤维细胞诱导开始衰老XRA或众议员森绿色指示WI-38和imr - 90细胞诱导RAS和XRA开始衰老。红色代表森WI-38和imr - 90诱导开始衰老的RAS和众议员灰色显示HCA2细胞诱导RAS和XRA开始衰老。蓝色表明HCA2细胞诱导开始衰老的RAS和代表。

(E)所示的日志2倍值所特有的文化因素,在CM中显著增加从成纤维细胞诱导衰老的RAS相比以前厘米,但不显著改变在CM中从成纤维细胞诱导开始衰老XRA或众议员颜色代码是相同的(D)。

从CM (F)溶性因素表明上皮细胞产生的抗体阵列并显示所述的分析图1使用前厘米作为基线。信号高于基线所示黄色;用蓝色信号低于基线。星号(*)表示因素守恒的成纤维细胞和上皮细胞之间。

(G)之间的相关性引起的SASPs RAS和XRA前列腺上皮细胞。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301.g005

诱发性SASP的显著特征是,所有成纤维细胞诱导开始衰老的RAS分泌多种蛋白质水平显著和显著高于其他森细胞。因为视觉显示(图5)只有半定量的,放大的定量性质SASP金家族的条形图(图5D),情节的日志2倍增加的因素由森(RAS)分泌细胞相比,森(代表或XRA)同行(9蛋白质分泌更多在森(RAS)与森(代表;XRA)在所有成纤维细胞)。此外,诱发性SASPs独特的特性,因为这SASP包括五没有分泌蛋白质含量严重超标,其他森(代表或XRA)细胞(图5E)。我们将整个细胞分泌反应诱导RAS开始衰老,包括具体的定量增加分泌蛋白质和蛋白质的分泌没有出现在代表或XRA SASPs, SASP放大。我们证实了强劲SASP诱导通过RAS疣状(图5B和图S2)和elisa (图S1)。此外,我们确认致癌RAS诱导一个放大SASP在前列腺上皮细胞(图5F和5G)。

总的来说,这些结果表明致癌RAS,尽管诱导肿瘤抑制衰老被捕,可能促进肿瘤发生诱导一个放大SASP cell-nonautonomous的方式。

Cell-Nonautonomous p53的肿瘤抑制功能

p53通路是重要的建立和维护造成的衰老增长逮捕基因毒性压力,尽管缺乏细胞p53可以接受衰老提供他们表达p16 (62年]。因此,我们问p53 SASP建立或维护。灭活p53,我们表达基因抑制元素22 (GSE22,也指定GSE),肽抑制p53 tetramerization、引发活性单体的p53积累(被免疫染色,图S2)[63年]。我们获得了类似的结果使用短发卡RNA(成分),减少p53表达通过RNA干扰。我们WI-38诱导成纤维细胞开始衰老的代表或XRA然后灭活p53。因为WI-38 IMR90与高水平的p16INK4a分子细胞开始衰老,他们不恢复增殖时p53是灭活62年]。简化的视觉比较抗体阵列读数,我们平均高度相关的数据样本,描述图5(见数据集向- - - - - -S16平均的细节,和原材料数据)。森的SASPs WI-38 p53的野生型或灭活后衰老是由视觉显示器(类似图6比较第一行与行11),和图形绘制的日志2倍的变化发生在特定因素(图6B,绿条显示变化获得使用适当的p53野生型基线(例如,森(代表> GSE)与森(代表)在WI-38)数据集向- - - - - -S16)。这一发现表明p53不需要维护一个SASP建立。

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图6。p53抑制的SASP

包含(A)厘米起诉细胞分泌的因素进行了分析通过抗体数组并显示,使用前厘米作为基线。我们汇集的数据来自同一基因型的细胞(p53野生型p53缺陷)在相同的培养条件。SEN表示从细胞汇集数据来自同一组织(WI-38 imr - 90从胚胎肺;和HCA-2, BJ从新生儿包皮)和诱导代表或XRA开始衰老。池和平均高度相关的样本进行描述图5,并提供了数据处理的细节数据集向- - - - - -S16。四大行四大行是相同的图5,包括作为视觉参考。括号中给出了衰老诱导物。p53状态表示为野生型(wt)或不足(d)由于GSE22表达或表达反对p53的成分。操作所示顺序,由大于符号(>)。热图键(右)表明日志2倍的变化。信号高于基线所示黄色;信号低于基线以蓝色显示。比较行准确地体现在(B)和(C)中,每个转基因细胞类型相比,其适当控制基线。

(B)日志2SASP倍值显著增加的因素,或明显和独特(双星号(* *)所显示的那样)升高,在CM中森从细胞由GSE22 p53缺陷,使用未经处理的野生型森值作为基准。绿色表示WI-38细胞衰老由XRA,之后p53随后表达GSE22使用慢病毒灭活;这些细胞不恢复增殖(“unreverted”)在p53失活(见图S6)。蓝色表明WI-38 p16的shRNA灭活,诱导XRA开始衰老,然后感染GSE22-expressing慢病毒;这些细胞p53失活后恢复(牧师)。粉色表示HCA2细胞由XRA森,然后感染GSE22慢病毒;这些细胞也p53失活后恢复。

(C)日志2SASP倍值显著增加的因素,或明显和独特(双星号(* *)所显示的那样)升高,在CM中从细胞p53-deficient(通过GSE22表达式),然后诱导代表开始衰老,XRA或RAS。红色代表WI-38和IMR90(平均)细胞表达GSE22,然后诱导XRA或代表开始衰老,使用电池森XRA或代表作为基准。灰色表示WI-38 imr - 90和HCA2(平均)表达GSE22,然后由RAS衰老,使用森拉作为基准。

(D) WI-38细胞表达GSE22被XRA诱导开始衰老,然后应用SASP蛋白质il - 6和引发衰老标记p16INK4a分子,和p53在GSE22的积累。

比较图示(E)的分泌的细胞衰老XRA或代表(虚线),RAS(黑线),p53失活(GSE22)其次是XRA或代表(蓝线),或p53失活(GSE22)其次是RAS(红线)。山坡上的增加(如箭头所示)显示放大SASPs。

(F)分层聚类分析的细胞分析(A),加上SASP引起的RAS(见图5)。RAS状态表示为野生型(wt)或致癌(o)由于Ha-RAS的表情v12。

与野生型细胞(G) WI-38 (wt)或不活跃(GSE) p53辐照或诱导表达致癌RAS (RAS),和CM收集4或10 d后。溶性因素分析抗体阵列并显示所述图1D,使用前厘米作为基线(黑列在左边;另请参阅图S5C)。信号高于基线所示黄色;用蓝色信号低于基线。n / a,不适用。

(H)日志2倍值前列腺上皮细胞SASP因素显著或独特(双星号(* *)所显示的那样)升高厘米从p53-deficient癌细胞(生物、BPH1 RWPE1),诱导XRA开始衰老,而主要p53野生型细胞(prec)被XRA诱导开始衰老。

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图7。放大SASP的生物活性

(一)T47D ZR75.1细胞被孵化的表示厘米3 d细胞散射分析,表明蛋白质的应用,并分析了波形蛋白和肌动蛋白免疫印迹。控制来自同一个人的免疫荧光实验中所示图4括号中给出了衰老的诱导物。p53地位是野生型或不足(GSE)。操作所示顺序,由>。

(B)上皮细胞孵化了厘米表示WI-38细胞和化验的入侵中描述的材料和方法图3c双星号(* *)表示p< 0.02。误差线显示周围的标准差的意思。

(C)上皮细胞被孵化的厘米表示成纤维细胞和细胞数量是由细胞计数、血清总蛋白、或绿色荧光蛋白(GFP)使用上皮细胞表达绿色荧光蛋白的荧光,如[80年]。一个星号(*)表示p< 0.05。误差线显示周围的标准差的意思。

(D)模型cell-nonautonomous活动致癌RAS和p53肿瘤抑制蛋白。致癌基因和基因毒性的压力足够大小SASP引起衰老,即细胞分泌炎性细胞因子,趋化因子,生长因子,可以改变组织微环境和刺激在附近的细胞恶性表型。因此,除了著名的细胞自动作用,致癌基因可以通过诱导促进癌症cell-nonautonomously SASP。致癌基因和基因毒性压力也激活p53、抑制癌症细胞自动机制(促进修复,或诱导细胞凋亡或衰老)。此外,p53 cell-nonautonomous抑制癌症的抑制效应的强度SASP及其有害的影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060301.g007

决定是否需要启动SASP p53,我们灭活前WI-38细胞p53诱导衰老XRA,代表或RAS (图6行8 - 10)。p53失活并没有产生SASP前细胞(图6行5 - 7,S1的数据和S2,数据集向- - - - - -S16)。在衰老通过代表、XRA或RAS,然而,不仅开发了SASP p53-deficient细胞,但SASP的大小显著增强(图6行8 - 10对1 - 4),类似于放大SASP RAS引起的。p53缺陷的定量影响SASPs金家族的条形图,这阴谋的日志2倍增加显著改变因素分泌细胞p53缺陷,然后诱导开始衰老,相比与野生型p53,诱导衰老细胞(图6C,红色和灰色酒吧)。我们证实了强劲SASP疣状(图6D和图S2)和ELISA (图S1)。这些发现表明p53 SASP不需要初始化,并进一步抑制放大SASP的发展。

重要的是,合并后的p53和增加致癌RAS的损失导致大多数放大SASP (图69 - 10 A,行与行1 - 4;图6E和6F,图S5一个,文本S1)。此外,当p53灭活XRA之前,SASP发达早先2和4 d辐照后(图6G和S5的数据B和S5C),而4 - 7 d与野生型p53细胞(图1D)。有趣的是,细胞诱导开始衰老的RAS还开发了放大SASP earlier-within辐照后2 - 4 D (图6克,S5的数据B,S5C、S6文本S1)。因此,p53肿瘤抑制的损失,或增加致癌RAS,不仅SASP放大,而且加速其发展。

我们还在成纤维细胞灭活p53与低p16INK4a分子水平开始衰老:HCA2, BJ, WI-38表达成分(shp16)减少通过RNA干扰p16INK4a分子的表达。在这些细胞,是否开始衰老的细胞诱导代表或XRA SASP也明显放大(图6行1 - 4和11 - 14行)。p53损失的定量结果建立SASPs金家族的条形图,列出了显著改变因素由细胞分泌开始衰老了,然后诱导失去p53功能,而细胞p53诱导衰老和保持功能(图6B,蓝色和粉红色酒吧)。报道[62年),p53失活逆转的增长逮捕这些细胞,恢复细胞恢复增长(图S6)。我们称这些细胞为牧师,逆转的增长逮捕验证p53失活的功效。,这些发现表明,一旦确定,不能抑制SASP尽管降级衰老的增长被逮捕。在一起,结果表明,激活p53的基因毒性压力不仅抑制细胞增殖,但也抑制了SASP。

的SASPs p53-deficient细胞定性类似与野生型p53森细胞,导致紧密集群配置文件(图6F), p53地位是量化的主要影响。作为诱发性衰老的情况,一个子集SASP蛋白质的分泌在p53失活后5 - 30倍高水平(图6B,66 C, e,数据集向- - - - - -S16)。然而,也有独特的特点p53-deficient SASP (图6B和6C,底部)。有趣的是,许多因素都进一步的或独特的上调细胞衰老的RAS放大以类似的方式在p53-deficient细胞(图6B,6C,6E,5D,5E)。

p53也克制SASP前列腺上皮细胞。因素确定为上皮SASP的一部分(图2一个和2C)在生物放大、BPH1 RWPE1癌细胞,p53缺陷,与正常prec相比,野生型p53 (图6H,集群)。此外,p53-deficient上皮细胞接受衰老oversecreted大多数因素被p53在正常成纤维细胞(比较克制图6H,底部集群和上市的因素图6B和6C)。总的来说,这些发现表明,成纤维细胞和上皮细胞诱导开始衰老的基因毒性压力发展SASP p53克制的活动。

生物放大SASPs活动

确定可能的生物放大SASPs的后果,我们比较的能力CM与unamplified成纤维细胞或放大SASPs诱导EMT和侵袭性相对非主动的人类癌症细胞。厘米从细胞放大SASP明显更有效比森厘米从细胞与野生型p53诱导EMT,由细胞散射(比较图7一个与图4),疣状(比较图7一个与图4B),和健壮的表达波形蛋白(图7),一个重要的定量标志EMT (52]。这些比较是在同一个细胞实验。此外,放大SASP明显更强刺激癌细胞侵袭性(图7B)。衰老细胞已被证明刺激癌变前的或恶性上皮细胞的生长42,43]。我们发现这个放大SASP刺激上皮细胞生长明显更大程度上比unamplified SASP (图7C)。这些研究结果支持这样的设想,即p53抑制cell-nonautonomous promalignant SASP的活动。

讨论

我们发现了一个细胞的标志senescence-the senescence-associated分泌表型或SASP-that授予cell-nonautonomous旁分泌功能细胞,明显加剧了增加致癌RAS p53功能的或损失。

研究SASP,我们修改一系列商用抗体协议,取代放射性化学发光作为最终的检测方法。这一修改大大提高动态范围的数组,并呈现高度量化,可靠和准确的。使用这个数组修改协议,我们可以研究SASP定性和定量两方面,个人捐赠者之间异同的比较,细胞,原产地和组织。重要的是,我们发现数量差异引起的致癌RAS p53功能的或损失。

SASP是来自不同组织的衰老成纤维细胞的一般特性,捐助者和捐助,以及前列腺上皮细胞、正常和转换。有不同的定量和定性的差异在不同的细胞菌株和线条,像预期的那样给他们不同的基因型和组织起源,表明SASP不是一个不变的表型。然而,显著特征的表型之间的显著的相似性SASPs来自不同捐助者、细胞类型,和组织,这表明守恒的核心的存在分泌程序,任何细胞发生衰老将触发。值得注意的是,所有的SASPs特色高水平分泌炎性细胞因子、免疫调节器和生长因子,这表明SASPs可能有无数的生物活性除了这些我们这里描述。许多SASP因素差异在mRNA水平的丰度,这表明表型可能是转录控制。

之间的对应关系mRNA水平和SASP因素允许我们探测人类活检样本SASP组件之前和之后的表达能损伤dna的化疗。我们的研究结果显示,人类肿瘤细胞很可能接受衰老DNA破坏体内化疗,作为老鼠的报道(49]。此外,人类肿瘤细胞很可能表达SASP化疗后。我们推测,化疗所致的组件SASPs,特别是高水平的炎症细胞因子,能损伤dna的化疗造成的破坏性影响。这些SASPs也可能燃料二次癌症通过创建一个局部组织的发展环境,是细胞生长和进展的宽容获得治疗导致突变,而无法开始衰老或死亡。

人类衰老成纤维细胞已被证明刺激癌变前的扩散和恶性上皮细胞在文化、老鼠和癌变前的上皮细胞的致瘤性异种移植(35,42,43]。然而,这些刺激活动负责的机制不完全清楚。我们确定了两个新的生物活性SASP:森细胞介导的诱导能力的EMT相对非主动癌的细胞,并且能够通过基底膜刺激他们的入侵。抗体阵列允许我们识别两个SASP因素,il - 6和引发,这解释了这两种生物活性。除了刺激急诊医疗和侵袭性,il - 6和引发促进炎症,其他SASP组件。此外,衰老细胞分泌或脱落细胞因子受体,这可以作为诱饵,让附近的癌变前的或恶性肿瘤细胞逃避免疫监视。他们坚持组织,衰老细胞可能创建促炎的组织环境中,这是protumorigenic [3,64年]。综上所述,我们的研究结果支持这样的设想,衰老细胞可以创建一个组织微环境,促进肿瘤进化的多个阶段。

最近的研究表明,肿瘤诱导小鼠开始衰老逐渐回归(21,22],由于可能渗透到细胞的先天免疫系统22]。炎性细胞因子和趋化因子,il - 6等引发,GRO-α,MCP-1,或gm - csf, SASP的核心特性,可能导致这个渗透和最终的间隙。那么,为什么衰老细胞发现随着频率与年龄相关的病理学在衰老和网站?一些森细胞免疫清除可能耐火材料是因为它们在本质上是不同的或产生更高水平的因素,促进免疫逃避。另外,老化或与年龄相关的疾病可能会抑制免疫反应或增加的速度衰老细胞。不管怎样,越来越多的证据表明衰老细胞随着年龄的增加(65年- - - - - -68年),慢性炎症是衰老的一个重要特征69年]。如果衰老反应是拮抗基因多效性的一个例子,衰老微环境由SASPs可能导致衰老的退化性疾病,如关节炎或动脉粥样硬化(28- - - - - -30.),衰老细胞的发现,以及燃料晚期癌症的发展。

拮抗基因多效性的进化理论提供了一个解释衰老的明显的矛盾的反应,或任何生物过程,可以既有益又有害,这取决于年龄的有机体。现在认识到,衰老是自然选择的力量下降的结果随着年龄(26,70年]。这种下降是由于外在危险引起的高死亡率在自然环境中,导致老年人的相对稀缺。因此,自然选择可以支持一个特征有助于早期生活健康(例如,防止癌症),即使在老年人特征是有害的(例如,促进癌症发展)。我们推测,增长逮捕和衰老细胞分泌表型可以有益的和有害的。

senescence-associated增长逮捕是有益的因为它逮捕的生长细胞肿瘤的风险转换(细胞自动肿瘤抑制功能)。然而,它可以是有害的,因为:衰老细胞的积累可以减少可再生组织修复和再生的能力。尽管一些组织包含小于1岁或者只有几个百分点的衰老细胞29日,66年,71年),其他人可以积累多达15%衰老细胞(65年,72年]。同样,senescence-associated分泌表型可能有益和有害的影响。SASP可以是有益的,因为一些SASP组件加强衰老增长逮捕的自分泌细胞因子网络(37,38,40,41),从而维护衰老增长被捕。此外,许多SASP组件预计促进组织修复和再生,并充当“危险信号”在附近的组织或系统在生物体水平。因此,细胞处于衰老可能最初信号组织损伤,通过SASP发起组织修复。这样的效果将是有益的cell-nonautonomous细胞衰老的功能。然而,当长期存在,衰老细胞的分泌活动可能是有害的,破坏正常组织结构和功能,并最终刺激与年龄有关的组织变性或促进恶性表型(如癌症恶化,这里描述)。

致癌RAS诱导SASP是比其他衰老诱发更健壮,即使p53功能完好无损。致癌RAS是细胞增殖的细胞自动驱动程序在许多癌细胞。然而在正常细胞,致癌RAS导致基因毒性压力和衰老57,58),诱导SASP从而赋予复杂cell-nonautonomous致癌的活动。因此,致癌基因如RAS,已知激活protumorigenic旁分泌机制转换期间(59- - - - - -61年),也可能发挥cell-nonautonomous protumorigenic影响通过是非细胞诱导衰老过程中(图7D)。

致癌RAS诱导SASP如何?RAS的一种可能性是,这个活动是由于基因毒性压力造成RAS-stimulated增生。另外,致癌RAS可能诱发SASP更直接通过刺激MAP激酶或其他信号通路。无论如何,许多方面SASP诱导的RAS类似的SASP p53-deficient细胞。

不会压力足以导致衰老SASP激活p53和刺激。我们的数据表明p53的双重角色(图7D)。首先,在应对基因毒性压力、p53强加衰老增长逮捕,符合其作为细胞自动肿瘤抑制作用。第二,p53抑制SASP因为p53的损失函数,结合senescence-causing损伤,大大增强了SASP。p53可能抑制SASP经验后被迅速逮捕增长部分细胞DNA损伤(未发表的数据),从而防止进一步损害,可能接踵而来的积累应该试图复制细胞受损的DNA模板。此外,p53优化DNA修复,所以细胞p53缺乏可能与野生型p53积累超过细胞的DNA损伤,进而可能导致一种更健壮的SASP(放大)。因此,p53肿瘤抑制可能成为致癌的早期传感器压力,并最终操作作为一个分子催化剂防止组织炎症。DNA损伤之间的关联度和发展SASP表明SASP可能由哺乳动物的DNA损伤反应激活(DDR)。的确,我们的初步数据表明,一些组件DDR是重要的建立和维持SASP (f . Rodier j]。Coppe, c·k·帕蒂尔w·a . m . Hoeijmakers d·p·穆尼奥斯et al .,未公开的数据)。然而,DNA损伤后立刻SASP不开发,因此不是一个简单的或经典的DDR。相反,SASP是一个缓慢和持久响应足够规模的严重的或不可挽回的损害导致衰老。

SASP可能重要的生物的持久性的后果。例如,细胞p16表达低INK4a水平(例如,森(代表)或森(XRA) HCA2)开始衰老,以应对严重的破坏通过激活p53通路;随后当p53在这些细胞灭活,他们的简历扩散62年),但不要失去SASP。此外,他们最终放大SASP获得额外伤害由于扩散在缺乏功能检查点。增殖p53-deficient开始衰老的细胞响应基因毒性压力也开发了一种高度放大分泌表型。这些细胞有更大的风险逃避衰老(未发表的数据),并将威胁的组织,不仅由于其扩散,但也由于他们的放大SASP。此外,人体细胞绕过oncogene-induced衰老(58),以及一些人类细胞癌变前的病变(73年,74年),显示出持续激活DDR的迹象。这是有可能的,如果不可能,这些细胞也表达SASP因此大大增加体内癌症恶化的风险。通过抑制SASP, p53充当cell-nonautonomous肿瘤抑制,抑制SASP protumorigenic活动。这个活动可能解释为什么p53-deficient基质促进上皮癌进展(75年,76年]。因此,我们建议,除了其细胞自动抑制癌症通过抑制细胞生长的能力,p53可能会进一步抑制癌症抑制炎症组织的发展环境由SASP造成的。

我们的广泛的、量化的评估因素由衰老细胞分泌揭示了高度复杂的分泌表型。这里显示这种表型可以促进细胞与恶性肿瘤相关的行为,并建议,那些灭活等细胞获得突变p53和/或RAS激活函数可以特别恶性SASP由于旁分泌活动。这很有可能,不过,额外的后果SASP将发现的许多SASP组件测试特定的活动。

材料和方法

细胞。

细胞,培养,使静止的或衰老中描述文本S1(42,66年]。

抗体阵列。

文化在无血清杜尔贝科清洗和孵化的修改鹰介质(DMEM) 24小时生成厘米,这是收集和细胞计数。厘米是过滤(0.2μm孔隙),冻结在−80°C,并分析了使用抗体阵列(RayBiotech或Chemicon;人类的猫# AA1001CH-8;老鼠猫# AA1003M-8)基本上按照制造商的指示。短暂,CM解冻和集中2 - 3重4°C (3 kDa截止)。卷相当于2×105细胞被稀释到1.2毫升DMEM和混合300μl阻塞的解决方案。数组膜与1.5毫升preincubated屏蔽解决方案,孵化用厘米混合物(一夜之间,4°C),洗5×,然后孵化与biotin-conjugated抗体鸡尾酒(1小时45分钟,室温)。包含0.265μCi五洗之后,检测解决方案35S-streptavidin (732 Ci /更易;0.1 mCi /毫升)屏蔽解决方案中添加(1小时45分钟,室温),紧随其后的是五洗。放射性绑定到使用phosphorimager过滤器检测和量化。信号分析中描述文本S2。

ELISA、免疫荧光和入侵检测。

分析进行描述(77年,78年),使用工具和抗体中描述文本S1。

重组蛋白、抗体阻断和向量。

重组蛋白和抗体阻断中描述文本S1。向量来表达致癌RAS (Ha-RASv12)、TIN215C和GSE22描述(62年,77年,79年]。

人类学习和组织。

高风险的局限性前列腺癌患者登记和治疗i ii期临床试验新辅助化疗在俄勒冈健康与科学大学,波特兰VA医学中心,Kaiser Permanente西北地区,遗留卫生系统和华盛顿大学(50]。患者签署知情同意提供。从每个病人前列腺活检获得之前化疗。在根治性前列腺切除术后化疗,一并得到了组织样本和冷冻。冰冻切片加工中描述文本S1。癌变上皮进行活检和posttreated前列腺切除术标本分别被抓获并获得细胞组织学验证审查的苏木精和伊红染色(圆))部分从每个样本和审查的激光共焦显微镜(LCM)图像。

实时聚合酶链反应(rt - pcr)。

RNA分离培养或laser-captured细胞中描述和分析文本S1。

统计分析。

皮尔逊相关系数评价相关。统计显著性分布的蛋白质或信使rna信号之间使用一个学生评价t以及两个尾巴,和一个假设的方差相等。的上皮细胞和纤维母细胞SASPs重叠的意义,我们使用了超几何分布用以下参数:人口规模= 120(总蛋白质阵列),样本大小= 41(成纤维细胞SASP;看到图1人口),成功= 39(上皮SASP;看到图2C),并成功示例= 24(重叠成纤维细胞和上皮SASPs;看到图2C,星号)。同样的统计分析是用来比较森(XRA)正常上皮细胞(prec)与森(XRA)正常成纤维细胞(使用以下参数:120,29岁,25岁和12;看到图2和结果)。

支持信息

图S1。ELISA SASP溶性因素的测量

(A)选择SASP因素(白介素(绿色),引发(蓝色),GRO-α/ KC(橙色),FGF-7 / KGF[(粉红色)和功能(灰色))出现在厘米,被阵列由elisa分析验证和量化,如材料和所述方法。

(B) il - 6(绿色),引发(蓝色),和GRO-α(橙色)测量厘米从森(XRA)和森(MIT)成纤维细胞和上皮细胞ELISA。值归一化到以前的水平。

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图S2。疣状SASP因素

选择SASP因素出现在厘米,通过阵列分析可视化细胞免疫荧光检测到。p16和p53的细胞也被应用。每个小组都是一个不同的领域。细胞被指定为文本和所描述的表S1。增长状态由一个加号(+)表示意味着激增,一个负号(−)意味着细胞周期被捕。p53状态由一个加号(+)表示意思是野生型,一个负号(−)意味着缺乏。

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图S3。低或高剂量X-Irradiation p53激活

WI-38细胞X-irradiated为0,0.5,或10 Gy x射线。细胞溶解产物2 h或10 d后准备和分析总p53蛋白的水平,p53磷酸化丝氨酸15 (p-p53ser15),或肌动蛋白免疫印迹(加载控制)。

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图S4。对比分泌蛋白质含量和mRNA水平在PRE和森人类成纤维细胞(XRA和代表)

(A)所示是热的地图选择SASP(分泌蛋白质水平表达显著上调森相比前细胞)和non-SASP(分泌蛋白质含量没有显著改变了森相比前细胞)的因素。研究il - 6和8−SASP因素,GRO-α,-β,-γ,gm - csf, ICAM-1,功能,MCP-1,−−4,瘦素。研究non-SASP因素MCP-3咆哮,ena - 78, PDGF-B, IGFBP-3, eotaxin GCP-2,沙土荒漠。左栏列出的因素,所有这些都是很容易检测到的抗体阵列(见数据集S4)。正确的列给mRNA和蛋白分泌水平之间的相关性。为每个显示细胞菌株(HCA-2 WI-38 imr - 90, BJ),彩色显示器显示了平均mRNA水平(绿色低于基线;上面红色的基线)或平均分泌蛋白水平(蓝色低于基线;黄色高于基线),相对于所有样本的平均每个应变。一些SASP组件显示高相关性mRNA和蛋白分泌水平。然而一些SASP和几乎所有non-SASP因素显示贫穷甚至分泌蛋白mRNA水平之间的负相关。

(B)分泌的蛋白质含量和mRNA水平总体比较以前和森(XRA和代表)。PRE和森测量平均创建一个基线,(a)中描述的所有数据点在(a)绘制。

森(C)和数据点分别绘制。每个图显示所有SASP和non-SASP因素。

(D)和SASP non-SASP数据点分别绘制。每个图显示所有PRE和森数据点。

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图S5。SASP发展是由p53和RAS

(一)比较分析SASPs程度使用WI-38和IMR90作为衰老的模型建立和维护。括号中给出了衰老诱导物。下面列出了p53和RAS状态(一个加号(+)意味着野生型;一个负号(−)意味着p53功能失调和致癌RAS)。分泌概要程度是显著的数量每个SASP oversecreted因素构成。使用森(代表;XRA)概要作为基线SASP概要(p53和RAS野生型),其他可以分析SASPs:一些分泌因素整体守恒和重叠的森(代表;XRA) SASP;在这些守恒的因素中,有些是明显进一步增加;最后,一些其他因素是独一无二的这些其他SASPs(见也图5和6)。这种比较表明p53肿瘤抑制的损失加上致癌RAS的获得允许的发展最SASP放大。

(B) WI-38细胞,野生型(wt),或p53-deficient (GSE表达;指出作为一个减号(−)),在指定的剂量辐照或诱导衰老的RAS(见也图1D和6收集G)厘米。2、4、7、10 d后,可溶性因素检测并显示出来。PRE和森(10 d)信号平均,作为基线。信号高于基线所示黄色;信号基线在蓝色(见以下图1一个和1D,传说)。

(C)无监督层次聚类分析的细胞了图6g . PRE细胞分泌剖面与CM的分泌细胞的收集4 d或10 d后低剂量(0.5 Gy)或高剂量(10 Gy)照射,或诱导衰老由于致癌RAS过度,和缺乏或不p53功能(GSE)。注意,开始衰老的细胞而缺乏p53功能或由于致癌RAS过度聚集在一起在每一个时间点后衰老归纳。细胞辐照0.5 Gy非常类似于在所有时间点之前postdamage(> 0.95)的相关性。4 d后10 Gy辐照,细胞窝藏野生型p53通路仍然非常类似于之前的同行(相关系数> 0.95),而在10 d后10 Gy辐照细胞非常不同的PRE(相关< 0;他们已经开发出一种SASP)。聚类分析也表明,开始衰老的细胞,在缺乏p53功能或由于致癌RAS超表达彼此相似比细胞与野生型p53背景开始衰老,这表明p53的损失占主导地位和致癌RAS的获得也有类似的影响在SASP开发和建立。

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图S6。增长降级后森细胞p53失活

森(代表)和森(XRA) WI-38细胞监测细胞生长在感染前20 d lenti-GSE(矩形)。手机号随后监视一个额外的30 d。因为森WI-38细胞表达p16、p53失活GSE森不恢复增长被捕。细胞不表达p16在森(shp16-expressing WI-38或修改的HCA2细胞)类似的监测和感染。与森WI-38细胞,p16-deficient细胞恢复增长(恢复)p53-inactivation和扩散后至少接下来的30 d。

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数据集S1。计算抗体阵列数据中提供的分析图1(人类成纤维细胞;森(XRA)和森(代表):第1部分

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数据集S2。计算抗体阵列数据中提供的分析图1(人类成纤维细胞;森(XRA)和森(代表):第2部分

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S3数据集。计算抗体阵列数据中提供的分析图1(人类成纤维细胞;森(XRA)和森(代表):第3部分

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数据集S4。计算抗体阵列数据中提供的分析图1(人类成纤维细胞;森(XRA)和森(代表):第4部分

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数据集S5。计算抗体阵列数据中提供的分析图2和图3(人类上皮细胞;森(XRA)):第1部分

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数据集S6。计算抗体阵列数据中提供的分析图2和图3(人类上皮细胞;森(XRA)):第2部分

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数据集S7。计算抗体阵列数据中提供的分析图2和图3(人类上皮细胞;森(XRA)):第3部分

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数据集S8。计算抗体阵列数据中提供的分析图2和图3(人类上皮细胞;森(XRA)):第4部分

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数据集S9。计算抗体阵列数据中提供的分析图5(Oncogene-Induced衰老):第1部分

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数据集S10。计算抗体阵列数据中提供的分析图5(Oncogene-Induced衰老):第2部分

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数据集S11。计算抗体阵列数据中提供的分析图5(Oncogene-Induced衰老):第3部分

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数据集S12。计算抗体阵列数据中提供的分析图5(Oncogene-Induced衰老):第4部分

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数据集向。计算抗体阵列数据中提供的分析图6(p53-Deficient衰老):第1部分

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数据集S14系列。计算抗体阵列数据中提供的分析图6(p53-Deficient衰老):第2部分

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数据集S15。计算抗体阵列数据中提供的分析图6(p53-Deficient衰老):第3部分

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数据集S16。计算抗体阵列数据中提供的分析图6(p53-Deficient衰老):第4部分

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表S1。Presenescent和衰老细胞特征

(SA-bGal)染色标记指数和senescence-associatedβ-半乳糖人类成纤维细胞和前列腺上皮细胞体外。

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表S2。Entrez基因的完整目录id为所有蛋白质抗体对应的数组

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文本S1。补充的方法

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文本S2。计算处理、分析和验证抗体阵列

数字化和抗体阵列的量化;数值计算和统计方法;线性度;准确;和可靠性。

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确认

我们感谢r .驱动程序支持的阵列实验中,j .灰色和r . Neve讨论,细胞,并使用Cellomix;答:黄帮助显微解剖和PCR;a . Zielinski和j·埃里森技术帮助;t .啤酒,m . Garzotto c . Higano l .诚然,r . Vessella和华盛顿大学医学中心泌尿人员临床材料;病人的参与;和a。r . Davalos, c . Beausejour和m . O ' connor宝贵的意见。

作者的贡献

JPC和CKP进行实验和分析数组。JPC和FR的构思和设计遗传实验。JPC,詹和PYD设计并进行了生物活性实验。JPC、y和PSN设计并进行了临床试验,JPC, DPM,詹设计并进行免疫荧光实验,JPC分析数据,JPC, CKP, FR, PYD, JC写道。

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