图
抽象的
背景
人鼻病毒（HRV）是最普遍的人类病原体，并且由101个血清型组成，该血清型根据序列变化分为A和B组。HRV感染导致广泛的临床结果范围从无症状感染到严重的呼吸症状。定义特定菌株在各种HRV疾病中的作用一直很困难，因为传统血清学需要使用101种血清型抗血清的病毒培养和中和试验是不敏感和艰苦的。
方法和调查结果
为了直接在具有频繁呼吸疾病的婴儿的鼻腔分泌物中拟合HRV，我们基于5'非分量区域中的260-BP可变序列的系统发育比较，具有101个已知血清型的同源序列的系统发育比较，开发了一种敏感的分子键入测定。第一次使用26名婴儿的鼻样品用多重PCR测定进行呼吸病毒，HRV是发现最常见的病毒（108个样品中的108个）。键入已完成101个样品，并确定103个HRV。令人惊讶的是，54（52.4％）HRV与任何已知的血清型不匹配，并且来自最近的参考HRV有12-35％的核苷酸分歧。这些新型病毒，9株（17个HRV）从HRVA，HRVB和人肠病毒中间隔离成明显的遗传基（“C”）。这些新菌株中的任何一个都不能在传统的细胞系中培养。
引文：Lee W-M、Kiesner C、Pappas T、Lee I、Grindle K、Jartti T等（2007年）一组先前未被识别的人类鼻病毒是婴儿呼吸道疾病的常见原因。《公共科学图书馆一号》第2（10）：e966页。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000966
学术编辑器:Maurizio Del Poeta，南卡罗来纳医科大学，美利坚合众国
已收到：2007年7月16日;公认：2007年9月11日;发布：2007年10月3日
版权:©2007 Lee等人。这是在创意公约归因许可的条款下分发的开放式文章，其允许在任何媒体中不受限制地使用，分发和再现，只要原始作者和来源被记入。
基金：NIAID / NIH NO1-AI-25496，NIAID U19 AI070503-01和NIARRR大学威斯康星大学一般临床研究中心赞助/资助者在研究中没有作用，在收集，分析，和解释数据，以及在稿件的准备，审查或批准中。
利益冲突:作者宣布没有存在竞争利益。
介绍
人类鼻病毒（HRV）是小核糖核酸病毒家族的成员，是一种具有7200碱基mRNA正义RNA基因组的小型非内翻病毒［1］．第一个HRV是在1956年发现的[2]那[3]并且迄今为止，使用敏感细胞培养物和特定的抗血清鉴定了1987,111个血清型（1A和1B至100）[4]那[5]那[6]. 1975年至1983年间对血清型循环进行的多项流行病学研究表明，1973年之前制备的90种血清型特异性抗血清可鉴定出90%以上的现场分离株，而且早期鉴定的许多血清型仍在循环[6]那[7]那[8]. 这些结果表明HRV血清型是稳定的，不会发生流感病毒样抗原漂移[7]．
hrv是最普遍的人类呼吸道病原体[8]那［9］那[10]那[11]那[12]．每年，HRV负责> 50％的急性上呼吸疾病（常见感冒），最常见的人类疾病。HRV感染在全球范围内发生，并且在温带地区的早期秋季和晚春天的流行病。HRV感染导致各种临床结果，包括无症状感染，[13]那[14]那[15]那[16]那[17]上呼吸道疾病，儿童、哮喘患者和其他易感人群的下呼吸道症状。［18］那［19］那[20]那［21］那[22]那[23]．
定义特定菌株在各种HRV疾病中的作用难以困难，因为传统的血清学需要将HRV分离在易感细胞培养物中和对所有101种血清型抗血清的中和测试中的中和测试[6]．这种传统的血清学方法不敏感，劳动密集型和繁琐[24]．已经为血清型肠病患者开发了更敏感和更快的分子方法，这与HRV密切相关[25]. 此外，分子分型方法已被用于确定疾病与登革热病毒、流感病毒、人乳头状瘤病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病毒等特定病原体株之间的联系[26]那[27]．分子键入涉及PCR扩增靶病毒基因组的一部分，测序和系统发育分析。在本报告中，我们分析了具有新分子方法的病婴儿的临床标本，并确定了26种新的HRV菌株，包括9个构成新的HRV组。
结果
101 HRV血清型之间P1-P2区域的序列变异性
P1-P2序列的长度（引物位点P1和P2之间的区域图1)在101个确定的血清型之间仅略有差异，从261个碱基到273个碱基。该地区所有101个血清型之间的最大成对核苷酸差异(%)为45% (图2）.该结果类似于101VP4序列的最大成对分歧（46％），略低于VP1序列（54％）[28]那[29]．此外，97.5%的血清型对有9%的成对核苷酸差异。HRVA和HRVB病毒P1-P2序列的最大两两方差(%)分别为33%和27%。这些结果表明该区域在区分HRV血清型方面具有潜在的应用价值。
P1、P2和P3分别位于HRV16基因组的163-181、443-463和535-551碱基。采用PCR A片段(约900bps)测定101个HRV血清型的5'NCR序列。采用pan-HRV PCR正向引物P1-1和血清型特异性反向引物退火至VP2基因5'端(碱基# 1000 ~ 1100)。用pan-HRV PCR正向引物P1-1和反向引物P1-1分别获得了约390 bps的PCR片段B。用正向引物P1-1和反向引物P2-1、P2-2和P2-3等摩尔混合，得到PCR片段C(约300 bps)。P1-P2的可变序列用于分子分型分析。
横轴表示成对比较的分歧（％）的值，并且列高度表示观察的频率。分歧值计算为距离值×100％。
101个HRV血清型的P1-P2序列聚类为2个已确定的遗传群:HRVA和HRVB
系统发育树重建证实，101 p1-p2序列聚集成2个遗传基团，a和b，（图3.）.血清型的P1-P2对基团的P1-P2系统发育分布与基于VP1和VP4-VP2序列的已发表树木的系统相同[28]那[29]那[30]，HRVA组中具有相同的76次血清型和HRVB组中的25次血清型（图3.）.P1-P2树的拓扑结构与VP1和VP4-VP2树相似[28]那[29]那[30]．这些结果同意先前的报道：HRV的核苷酸系统在整个基因组中一致，从5'NCR到3'NCR[31]．
该树是根据多重比对中所有序列对之间的距离（发散度）使用邻域连接方法构建的。通过bootstrapping（1000个重复）评估序列聚类的可信度。只显示了显著的引导值（>500）。比例尺（左上）表示遗传距离（每个位点的核苷酸替换）。101个HRV血清型（R）分为2个先前定义的组：HRVA和HRVB，具有完美的自举值（1000）。HRVA组有76个血清型，HRVB组有25个血清型。
通过P1-P2序列的系统发育树重建精确打字79临床分离株
为了测试P1-P2序列是否适用于HRV血清型鉴定，我们将通过P1-P2序列获得的79个培养的临床分离株与VP1的NiM-1A序列获得的典型结果进行比较。用于PCR扩增的NiM-1A区域的退化引物EV292和EV222足够敏感，以便直接检测原始临床样品（未示出的数据）中的少量HRV，并且需要培养的分离物的高滴度感染细胞裂解物产生足够的用于克隆和测序的PCR产物。NiM-1A和P1-P2序列的长度分别为329-356个碱基和263-271个碱基。基于Nim-1A序列的系统发育树重建，79个临床分离株分配给24种不同的血清型，具有高度显着的自举值（77-100％，表格1）.P1-P2树获得了相同的分配结果，尽管一些分配(HRV1B、HRV15、HRV85和5个HRV89中的一个)有较低但仍然显著的bootstrap值(分别为60%、64%、61%和62%)。有趣的是，在P1-P2区域(平均3.5%，范围0-8%)，临床分离株和相应的参考株之间的核苷酸差异低于nima - 1a区域(平均9.6%，范围5-13%)(表格1）.这结果同意先前的报道，即由于保留了NCR内的保守的RNA结构元素，核苷酸序列比编码区域更加保守[31]那[32]．
临床标本中的HRV检测
通过呼吸组件测定分析来自26名婴儿患有常急呼吸疾病的患病的鼻灌洗样品[33]．HRV在108个样品中检测到（60％）（表2）.其他检测到的病毒有肠道病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、偏肺病毒和副流感病毒。在108份HRV阳性样本中，80份只有HRV, 28份同时感染了至少一种其他呼吸道病毒。
通过分子打字确定108个样品中101中HRV的同一性。在未键入的7个样品中，2没有样品左侧，5个未通过半嵌套PCR产生P1-P2片段。在101个样品中鉴定了总共103个HRV。只有2个样品含有2种不同的HRV，表明具有多于一种菌株的低感染率。在103个HRV中，通过系统发育树重建将血清型分配给49个HRV（表3）.45个hrv的赋值得到了高度显著的自举值(>74%)的有力支持。一项分配(HRV20)的引导值虽然低，但仍然很显著(52%)。46个HRVs的P1-P2序列与参考血清型的同源性为94 ~ 100%。有3个序列与HRV89聚类，但bootstrap值较低(<50%)，但与HRV89参考序列的一致性为99%。这可能是因为这3个hrv也与HRV36匹配良好，后者在P1-P2区域与HRV89的同一性为97%。这46个HRV分为23个血清型;42(19个血清型)为HRVA病毒，4(4个血清型)为HRVB病毒。表3）.
鉴定新的HRV菌株
54个HRV的P1-P2序列没有与系统发育树重建中的任何101个血清型中的任何一种的同源序列（图4.）.这些54个HRV聚集成26个新的独特菌株，具有从相应最近的参考血清型的高度核苷酸分歧（平均24.6％，12-35％）和菌株（平均32.5％，范围10-46％）（表4）.同一菌株的不同新的HRV在它们之间具有高度的身份（平均98.4％，范围为94-100％，表4）.与HRV组聚集的新菌株的十七个（图4.）来自最近的参考血清型（135％的成对核苷酸分歧）（表4）.其中，在亚型血清型附近的遥远分支中聚集在5个菌株（W7，W15，W24，W28和W36）;在亚型型51,65和71附近的遥感分支中，7株（W6，W10，W11，W12，W17，W23和W25）;菌株W8，W9，W20和W38形成了一种新的分支，菌株W33是新分支的孤独成员。此外，从HRVA和HRVB（以下）分离9株（W1，W13，W18，W21，W26，W31，W32，W35和W37）（图4.)，与最近参考血清型有31-35%的两两差异(表4）.我们认为它们代表了一个新的HRV遗传群(HRVC)。所有新菌株均未与HRVB病毒聚集。
如上所述生成该树图3.．所有新菌株均未与HRVB病毒聚集。十七个新菌株（蓝色）属于HRVA组，9个菌株（红色）集群进入新组（“C”），与A组和B分开。
有趣的是，含有新的HRV菌株的样品均未在标准Wi-38或MRC-5细胞培养物中产生CPE，用于检测和分离HRV（数据未示出）。
HRVC不同于人类肠道病毒（HEV）
混合动力汽车与hrv密切相关［1］，并包含> 65个不同的血清型，包括脊髓灰质炎病毒，Coxsackeigiruses A和B，Echoviruses和新的EVS。根据生物学和分子特性，HEVS分为5组：Poliovirus和人类肠道病毒A-D（HEV-A-D）。像HRV一样，一些HEV是上呼吸道病原体。为了确定HRVC对HEV的关系，用9个HRVC菌株的P1-P2序列和所有已知的HEV（n = 74）的相应序列进行系统发育树重建。结果表明，HRVC病毒与HEV不同：HRVC菌株与相应最近的HEV之间的P1-P2序列的成对分歧范围为31％至35％（图5.）.
对于5个血清型（Ca16，Ca24，CB4，CB5和EV71），在Genbank中发现了2种不同的P1-P2序列。如上所述生成该树图3.．HRVC和HEV可分为2组。
讨论
在本报告中，我们证明循环HRV菌株的池显着大于101种已知血清型的收集。在这些年轻婴儿中检测到的HRV的不到一半对应于先前认可的血清型（表3）和54以前未被识别的HRV属于26个新菌株（表4）.此外，其中9种毒株形成一个新的基因组“C”，与之前定义的HRVA和HRVB组以及人类肠道病毒(图5.）.其余17个新菌株聚集在HRVA组中现有的远处或新的分支(图4.）.有趣的是，没有一种新病毒在标准组织培养中增长，这可以解释为什么先前未被发现这些病毒。
通过敏感的分子方法检测这些新的HRV菌株，直接从原始临床标本中键入HRV。这种新的测定有3个关键组分：敏感的Pan-HRV引物和半嵌套PCR从原始临床标本中制备的cDNA扩增P1-P2区，序列数据库为5英寸的5'NCR的5'NCRHRV血清型作为HRV鉴定的标准参考，新的P1-P2序列和101个同源参考序列的系统发育树重建。已经显示系统发生树重建比其他序列分析方法更准确地分析肠道病毒的分析方法[34]．有趣的是，5'NCR不适合打字肠道病毒。例如，由于5'NCR频繁的重组，Coxackigiruses的5'CCR序列与血清型和VP1序列不相关[35]那[36]．相比之下，HRV在其基因组上保持一致的系统发育，重组有限[31]，这一特性使得5'NCR序列(P1-P2)可以用于菌株鉴定。对于肠道病毒，VP1测序通常用于分子血清分型，因为该区域包含与血清型密切相关的主要抗原位点[25]．然而，HRV VP1序列保守性较差，并伴有EV292、EV222等引物对的简并[24]该区域该区域对PCR扩增相对不敏感。
在1956年至1987年之间发现和指定了101个建立的HRV血清型（HRV1A至HRV100）。使用易感Wi-38细胞培养物分离它们，然后用血清型抗血清定义[4]那[5]那[6]．在1975-1983之间进行的血清型循环的多种流行病学研究表明，90％的野外分离物可以用1973年之前制备的90种血清型特异性抗血清（HRV1A至HRV89）鉴定，并且早先鉴定的许多血清型仍在循环[8]那[11][6]那[7]．这些结果表明，已经确定了几乎所有HRV血清型，并且新的血清型并不发展[6]那[7]．事实上，在未来20年（1987年至2006年）中只报告了一个可能的新血清型HRV-Hanks，随后通过仔细的序列分析和中和测试显示了HRV21[30]．
最近，利用分子技术而不是培养基诊断的研究提供了额外的HRV菌株的证据[37]那[38]．例如，汉森及其同事通过VP4测序确定了纽约州（NY）的8个新的HRV。他们得出结论，这些HRV代表了一种新的遗传腕表，因为它们聚集在HRVA根部根草根茎根部的分支中[37]．此外，McErlean和他的同事还获得了澳大利亚昆士兰州一种新的HRV毒株HRV- qpm的完整基因组序列。系统发育分析表明，HRV-QPM是HRVA的新成员，属于HRVA的一个新的遗传亚系HRV-A2, 8个新的NY hrv也属于HRV-A2[38]．
为了将这些新报告的HRV的身份与我们的新菌株进行比较，我们使用我们的新菌株，HRV-QPM的P1-P2序列进行系统发育树重建，以及101个已建立的血清型;然后使用HRV-QPM，8 NY HRV的VP4序列和101份建立的血清型类似的分析。P1-P2系统发育树（未示出）揭示了HRV-QPM和我们的新的HRVA病毒W24是相同的菌株，因此支持的Morlean的结论是HRV-QPM是一种病毒。VP4树（未示出）确认MCarlean发现HRV-QPM和8 NY HRV属于HRVA组中的相同群集。因此，8 NY HRV和HRV-QPM与我们的17个新的HRVA菌株有关。相比之下，我们的9个HRVC菌株形成与HRVA和HRVB分离的不同组（图4.）.
分析所有HRV血清型的5'NCR显示出存在高度保守的序列（例如P1，P2和P3引物位点，图1)以及P1和P2之间的可变序列。260 bp的P1-P2区域在血清型之间的成对核苷酸差异高达45%，类似于VP4(46%)和VP1(54%)。此外，97.5%来自不同血清型的P1-P2对存在9%的成对核苷酸差异。尽管有这种血清型间的变异，5'NCR的P1-P2序列在临床分离株和相应的参考原型株之间明显更保守(平均差异3.5%)，而VP1的nim1a编码序列(平均差异9.6%)，表格1）.这些数据表明，5'NCR序列可能在更大的选择性约束下，并且已知该区域含有对病毒复制和翻译至关重要的RNA结构元素[32]．
总之，在这些年轻婴儿中检测到的超过一半（52％）的HRV是新的HRV菌株，其中许多聚集成明显的遗传群C.这些发现表明HRV菌株的数量被传统显着低估了病毒培养和血清型技术，还提出了额外的问题。首先，这些推定的“C组”HRV广泛普及？我们的学习人口包括一群经历频繁疾病的婴儿，并且需要额外的研究来定义未选择性人群的HRV感染，以及其他年龄组的主题。其次，是这些新的菌株的生物学与其他HRV类似的生物学？这些病毒无法培养表明受体利用或其他生长要求是截然不同的。用于检测和分析呼吸道病毒的分子测定的开发为新的流行病学和机械研究提供了重要的工具，以解决这些问题。对呼吸道病毒频谱的更完全了解及其生物学对于针对预防和治疗这些常见和临床显着的疾病的努力至关重要。
材料和方法
本研究经威斯康星大学医学和公共卫生学院人员委员会批准。书面知情同意书是从父母获得的。
HRV样品和临床标本
为了确定标准参考序列，从弗吉尼亚大学夏洛茨维尔分校Fred Hayden博士(1A、1B、2至10、12至89、91至100和Hanks)和ATCC (HRV11和HRV90)获得了101个HRV血清型原型株的感染细胞裂解液。HRV87被排除在参考数据库之外，因为它已被重新分类为人类肠道病毒[39]那[40]．
从两个来源获得临床样品。首先，从0-1岁的婴儿获得样品，参加威斯康星州的前瞻性出生队列研究（儿童起源）在威斯康星素中的婴儿期，以确定病毒和宿主因子在哮喘发病机制中的作用[41]．在完成研究的第一年的285名儿童中，27名婴儿患有频繁(≥5)的中度至重度呼吸系统疾病，其中26人的样本可供进一步研究。从1999年春至2001年春采集181例患者的鼻腔灌洗标本。其次，为了验证我们的分子分型试验，我们从威斯康星州卫生实验室(WSLH)获得了另外79株HRV临床分离株的感染细胞裂解液。这些临床分离株于1999年和2000年通过WI38细胞培养从婴儿鼻腔灌洗液中回收，并通过HRV特有的细胞病变效应和酸不稳定性进行鉴定[42]．
序列分析
利用Clustal×1.8.3软件进行两两序列比对、多序列比对、%恒等计算、距离(散度)计算、系统发育树重建和bootstrap分析[43]那[44]．在典型的分析中，首先处理输入序列以在所有序列对之间产生多个对准和矩阵（发散）。邻近的连接方法使用距离基质，以产生一个由分支长度与序列分歧成比例的大型系统发育树。通过自动启动评估序列聚类的置信度（1000重复）。Bootstrap值> 700（70％）表示高度显着的聚类，而值<500（50％）表明聚类没有统计学意义。使用Bootstrap值的系统发育树使用软件NJPLOT可视化。
鼻腔标本cDNA的制备
如别处所述进行cDNA制备[33]．简而言之，将鼻流体（350μl）与萃取载体（糖原和甘油纤维）和750μl的三唑（Invitrogen 10296）混合，涡旋10分钟，供应230μl氯仿，再次涡旋5分钟，然后微胶合5分钟。将上清液水相（〜700μL）与600μL异丙醇混合，将该混合物在室温下温育1小时。通过微泡沫沉淀的RNA沉淀剂10分钟，用75％乙醇洗涤一次，风干，然后溶解在20μl水中。为了使cDNA，将16μl的RNA溶液与含有Promega amv-逆转录酶，AMV-RT缓冲液，随机引物，RNASIN和DNTPS的24μl反应溶液混合，然后在25℃下温育5分钟，42℃。10分钟，50℃，20分钟，85°C 5分钟。
呼吸多发测定（RMA）鉴定临床标本中HRV和其他呼吸病毒
RMA是一种新的高通量，多重PCR - 微球体流式细胞术测定系统，用于综合检测常见呼吸道病毒，包括鼻病毒（HRV），肠病病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），Parainfluenza病毒，流感病毒，Metapneumoviruses，腺病毒和冠状病毒。先前已经描述了RMA测定的细节[33]．输出信号表示为MFI（中值荧光强度），并且具有平均信号> 6平均负控制信号的标准偏差（通常为400至500mFi）的样本被认为是正的。RMA能够区分密切相关的HRV和肠病毒[33]．
分子打字测定的开发和验证
选择目标区域。
为了鉴定适用于分子键入HRV的基因组区域，我们分析了所有已发表的HRV序列。这些包括8次血清型的完整基因组序列（1b，2,9,14,16,39,85和89）[45]那[46]那[47]那[48]那[49]那[50]那[51]那[52]和Picornavirus主页[http://www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/，所有血清型的VP1和VP4-VP2序列[28]那[29]那[30]，48个血清型的3D（RNA聚合酶）序列[53]37血清型的部分5'NCR序列[54]那[55]那[56]．这些序列的仔细对准分析表明，只有5'Cr区具有高度保守的序列（P1，P2和P3区，图1)和长可变序列(P1-P2，图1）适用于血清型分化。然而，只有5'CCR序列仅适用于101个血清型。
101例HRV参考血清型5’ncr的克隆与测序
建立分子键入的参考序列数据库，我们克隆并测序了所有101个HRV血清型的5'NCR。在其他地方描述了详细的病毒RNA制剂，RT-PCR，克隆和测序程序[33]．简而言之，通过酚萃取和乙醇沉淀从100μl感染的细胞裂解物中制备总核酸。Rt（逆转录） - 在RT-PCR混合物（Invitrogen 11922-028）中使用以下条件进行-PCR：在50℃下在50℃下进行30分钟，在94℃下2分钟，33个循环（30秒在94℃。，在50℃，60℃的50℃下30秒，68℃下5分钟。PCR引物对为所有血清型和血清型特异性反向引物正向引物P1-1（CaAgcacttctgtywcccc）。底漆P1-1设计在保守的P1区域内（图1）.在VP2基因5'端附近HRV16的1000-1100碱基区域内，对101个血清型的每一个选择反引物(图1)根据公布的顺序[29]．PCR产物，约900bp的DNA片段覆盖5'NCR的75％，完全VP4基因和约200个VP2基因碱（PCR片段A图1），通过琼脂糖凝胶电泳分离。通过苯酚萃取除去琼脂糖后，用激酶处理PCR片段，并将其连接到STUI线性化的plamsid载体PMJ3中，然后转化为大肠杆菌。将三种具有PCR片段的三种质粒分离每种血清型，扩增并纯化。每个病毒DNA片段完全测序（自动化DNA测序设施，U. Wisconsin）。通过将其VP4 / VP2序列匹配到相应发布的序列来验证每个序列的血清型同一性[29]．
从原始临床标本中半嵌套PCR扩增P1-P2区。
选择所有101个血清型的5'NCR的引物P1-1作为正向引物。对于反向引物，在高度保守的P2和P3区设计了多个候选者（图1）.根据有效的HRV序列扩增，筛选出引物P3-1 (ACGGACACCCAAAGTAG)、P2-1 (TTAGCCACATTCAGGGGC)、P2-2 (TTAGCCACATTCAGGAGCC)和P2-3 (TTAGCCGCATTCAGGGG)。
对于第一个PCR，将2.5μL来自RMA测定的剩余CDNA分析到含有23μL铂PCR超混合物HF（Invitrogen 12532-016）的管中，向前引物P1-1（25μm）和1μL反向逆转底漆P3-1（25μm）。反应在94℃下以2分钟开始，然后是“触地阵”循环（步骤为94℃，20s，68°C下至52℃（2°C间隔）30 s，然后68°C对于40秒。每个退火温度下降到54°C的两个循环，然后在52℃下进行12个循环，然后在68℃下最终5分钟。该反应产生390 bp的PCR产物（图1，片段B）。对于第二个PCR，将5µl第一个PCR产物转移到含有50µl铂PCR SuperMix HF、1µl正向引物P1-1（25µM）和1µl每个反向引物P2-1（25µM）、P2-2（25µM）和P2-3（25µM）的新PCR管中。反应条件为94°C下2分钟，28个循环（94°C下20秒，52°C下30秒，68°C下40秒）和68°C下3分钟。最终产物是一个300 bp的DNA片段(图1，片段c）。该半嵌套的PCR协议只需要每种样品的10个cDNA模板拷贝，以产生足够的产品以克隆，并且不会产生来自原始临床标本的非特异性产品（数据未显示）。然后将片段C纯化，克隆和含有含有片段C的3个质粒，并针对每个样品进行测序。对于2个样品，发现2种不同的P1-P2序列，表明存在多于一种血清型/菌株，因此分析了另外的另外的质粒。
79个HRV临床分离株VP1和5'CR的测序。
为了确定5'NCR内的P1-P2可变序列是否适用于HRV的分化和鉴定，与VP1的NiM-1A序列的序列进行比较了P1-P2序列的典型结果。nim-1a是首先用于HRV14的HRV的主要抗原位点［1］该区域的同源序列与hrv和肠道病毒的血清型有很好的相关性[57]那[58]．如上所述，从79个HRV临床分离株的病毒感染培养上清液中分离病毒RNA（QIAGEN 52904）[24]．为了获得VP1序列，首先使用引物对EV292和EV222首先扩增病毒RNA[24]在改进的RT-PCR条件下：38°C下10分钟，50°C下40分钟，95°C下3分钟，40个循环（95°C下30秒，42°C下45秒，65°C下30秒）和70°C下1分钟。PCR产物(∼琼脂糖凝胶电泳分离350 bp，测序[24]．为了获得5'CCR序列，使用P1-1和P3-1引物，克隆和测序，通过RT-PCR扩增病毒RNA。
血清型和新菌株的分配。
为每个新序列（NIm-1A或P1-P2）和101个同源参考序列（使用Clustal×默认比对参数，在测试一系列参数后选择）生成具有引导值的系统发育树和%成对核苷酸差异矩阵（距离×100%）。接下来，一个新的分离物或检测物被分配到它在系统发育树中聚集的血清型，具有显著的bootstrap值（>50%）[34]．相反，如果新的分离物或检测的p1-p2序列没有与系统发育树中的101次血清型中的一种簇，并且从最近的参考血清型患有> 9％的成对核苷酸分歧，它被称为新的菌株（以W）为前缀。在考虑到101个已知的血清型之间的成对发散值后，确定用于分配新菌株的阈值成对发散值（9％）（图2)，以及参考血清型与同一血清型临床分离株的两两差异值(表格1，最后一列）。
在评估两个序列时，可能会犯两种错误:A)当它们实际上不同时，会判定它们是相同的;B)当它们实际上相同时，会判定它们是不同的。这些误差的概率是由经验决定的，使用的数据显示图2和表格1， 分别。根据图2，所有101次血清型的99％，98％，97％，95％和90％的P1-P2对具有> 7％，> 8％，> 9％，> 10％和> 12％成对核苷酸分歧，分别。如图所示表格1（上一栏），临床分离株和相应参考血清型之间所有P1-P2对的成对核苷酸差异一致≤8%. 因此，对于错误a和B，9%的阈值分别与<3%和<1%的概率相关。
致谢
我们感谢Fred Hayden博士(弗吉尼亚大学夏洛茨维尔分校)慷慨地提供了受感染的hrv株原型细胞裂解物。我们还要感谢博士让Sgro(分子病毒学研究所,美国威斯康星-麦迪逊)分子序列分析的建议,迈克尔·埃文斯博士(生物统计学和医学信息学的部门,美国威斯康星-麦迪逊)咨询统计分析和罗伯特·戈登先生(儿科部门,美国威斯康星-麦迪逊)图形插图。这项研究的部分内容已于2007年3月4日在香港举行的第IX届呼吸道病毒感染国际研讨会上公布。
作者捐款
构思和设计了实验：WL。执行实验：WL CK TP IL KG TJ BJ。分析了数据：JG RL WL CK IL KG TJ BJ PS。贡献的试剂/材料/分析工具：JG RL WL CK TP PS。写论文：JG RL WL。
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