数字
摘要
方法和调查结果
我们在74例IPF患者和53例对照个体的血浆中分析了49例血浆中49例蛋白的浓度。我们鉴定了五种蛋白质-MMP7，MMP1，MMP8，IGFBP1和TNFRSF1A的组合签名 - 足以区分患者的敏感性为98.6％（95％置信区间[CI] 92.7％-100％）和特异性98.1％（95％CI 89.9％-100％）。在IPF患者获得的肺组织和支气管肺泡灌洗液中也观察到MMP1和MMP7的增加。慢性阻塞性肺病或结节病的患者没有增加MMP7和MMP1血浆浓度，并与亚急性/慢性超敏肺炎相比，患有可能模拟IPF的疾病的疾病，敏感性为96.3％（95％CI 81.0％-100％）特异性为87.2％（95％CI 72.6％-95.7％）。我们核实我们的结果在由IPF，家族性肺纤维化，亚临床间质肺病（ILD）以及对照个体组成的独立验证队列中。与该队列中的对照组相比，IPF患者的MMP7和MMP1浓度显着高。此外，在亚临床ILD患者患者中升高了MMP7浓度，与预测的强制生命能力（FVC％）和预测的一氧化碳漫射能力的百分比呈负相关（DL有限公司%)。
引用:Rosas IO, Richards TJ, Konishi K, Zhang Y, Gibson K, Lokshin AE，等(2008)MMP1和MMP7作为特发性肺纤维化的潜在外周血生物标志物。公共科学图书馆5(4):e93。https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0050093
学术编辑：Peter Barnes，全国心脏和龙学院，英国
收到:2007年7月26日;接受:2008年3月13日;发布：2008年4月29日
这是在Creative Commons公共领域的宣言，该宣言规定的条款发布的开放式访问的文章，一旦放置在公共领域，这项工作可自由复制，分发，传输，修改，在建或以其他方式由任何人使用用于合法目的。
资金：NK，KG，TJR，YZ，JD，KOL和MS由国家健康研究所（NIH）提供资金HL073745，HL0793941，HL0894932，以及Simmons家族的慷慨捐赠。IOR，SDM和BRG得到了国内心，肺和血液研究所的Intramural Sore（NHLBI）的支持。MS和AP是Universidad NacionalAutónomadeMéxicoGrant Sdi.Pti.05.6支持。融资机构尚未参与本手稿的研究设计，数据收集，解释或准备。
利益争夺：NK是由Biogen Idec公司和Centocor公司的基因和蛋白质生物标志物的发现和验证研究者发起的研究补助金的获得者。数据本文提出没有受到任何这些赠款资助。FS，作为顾问，已经从葛兰素史克公司（GSK）和阿斯利康收到少于$ 10,000。所有其他作者宣称没有竞争的利益。
缩写:BAL，支气管肺泡灌洗;CART，分类回归树;CI，置信区间;COPD，慢性阻塞性肺病;弥散％，百分比预测一氧化碳弥散能力;FVC％，占预计用力肺活量;HP，过敏性肺炎;HRCT，高分辨率计算机断层摄影;ILD，间质肺病;IPF，特发性肺间质纤维化; MMP, matrix metalloprotease; NSIP, nonspecific interstitial pneumonia; ROC, receiver operating characteristic curve; SAM, significance analysis of microarrays
编者总结
背景。
特发性肺纤维化(IPF)是一种严重的疾病，其原因不明，肺部进行性瘢痕或增厚。健康的人通过嘴或鼻子吸入空气，然后沿着气管进入肺部的气道。每个气道都有许多小分支，其末端是肺泡，肺泡是由毛细血管包围的薄壁小气囊。当空气到达肺泡时，其中的氧气进入血液，并被带到身体的器官，以保持它们的工作。在IPF中，肺泡及其周围的空间(“间质”区域)逐渐变得疤痕和增厚，从而阻止氧气进入血流。当只有一小部分肺部有瘢痕时，IPF可能不会引起任何症状。但是，随着更多的肺受损，IPF最终会导致呼吸困难，即使在休息时也是如此。尽管类固醇和抑制人体免疫系统的药物经常被用来试图减缓IPF的发展，但目前还没有有效的治疗方法。平均而言，半数IPF患者在确诊后三年内死亡，通常死于呼吸或心脏衰竭。
为什么要做这项研究?
IPF很难诊断，因为有许多肺部疾病都有类似的症状，包括许多其他间质性肺部疾病。目前，医生只能通过反复检测患者的肺功能或多次做胸部x光检查来跟踪IPF的进展。如果能够确定血液中的蛋白质水平表明疾病活动(所谓的“外周血生物标记物”)，就会更容易诊断和监测患者。此外，这些生物标志物的鉴定可能为IPF的治疗提供新的药物靶点。在这项研究中，研究人员使用“多重分析”系统同时测量患者血液样本中几种蛋白质的水平，以寻找IPF中的外周血生物标志物。
什么的研究者们和查找？
研究人员测量了74名IPF患者和53名健康人(对照组)的49种血浆蛋白(血浆是血液的液体部分)的水平，并使用一种称为“递归分割”的技术来定义五种蛋白特征，以区分患者和未受影响的研究参与者(对照组)。基质金属蛋白酶7 (MMP7)和mmp1这两种血浆蛋白的水平在IPF患者中比对照组增加最多，它们是这一特征的关键组成部分。IPF患者肺组织样本中MMP7和MMP1的浓度高于健康人的类似样本。IPF患者MMP7和MMP1的血浆浓度明显高于过敏性肺炎(一种类似IPF的间质性肺病)患者，但在慢性阻塞性肺病或结节病(两种其他肺病)患者中没有增加。在一个独立验证组中，IPF和家族性肺纤维化患者血浆MMP7和MMP1浓度增加，这与疾病的严重程度相关。此外，在家族性肺纤维化患者的近亲中，MMP7浓度升高，这些患者肺功能测试正常，但有一些肺瘢痕。
这些发现意味着什么?
这些发现为IPF的血液蛋白特征提供了证据，提示MMP1和MMP7可能是IPF的有用生物标志物。这两种基质金属蛋白酶以前曾被认为参与了IPF的发展。然而，可能还需要做更多的工作来证实MMP7和MMP1的血浆浓度升高对IPF是特异性的，因为这些标志物可能无法将IPF与其他间质性肺疾病区分开来。
介绍
特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性纤维化间质肺疾病(ILD)，中位生存期为2.5-3年，目前可用的药物治疗在很大程度上未受影响[1］．该病的特点是肺泡上皮细胞损伤和活化，成纤维细胞/肌成纤维细胞灶形成，细胞外基质在肺实质中过度积聚。最近的研究使用高通量基因组技术分析来自IPF患者或转基因动物的样本，突出了疾病相关途径的复杂性(在[2- - - - - -4])。虽然这些研究提高了对肺纤维化分子机制的理解，但它们并没有很好地转化到临床领域。
外周血生物标志物的鉴定可以促进IPF患者的诊断和后续，以及新的治疗干预措施的实施。目前，建立IPF的诊断可能需要在非典型临床介绍或高分辨率计算断层扫描（HRCT）扫描中的患者手术肺活检。IPF患者通常通过连续肺部生理测量和重复的放射线检查来评估。这些研究提供了对疾病程度的一般性评估，但不提供分子水平的疾病活动的信息。高血清表面活性剂蛋白浓度[5], KL-6 [6]，fasl [7], CCL-2 [8),α-defensins [9]，以及最近的SPP1 [10.已曾在具有IPF和其他ILD的患者中报道，但大多数这些研究的大小适度，并仅同时测定单个或几种蛋白质标记物。
在这项研究中，我们使用多分析蛋白检测系统同时测量49种血浆蛋白的浓度，包括细胞因子、趋化因子、生长和血管生成因子、基质金属蛋白酶(MMPs)，以及由IPF患者和健康对照组组成的衍生队列中的凋亡标志物。我们鉴定了五种蛋白质的组合特征;其中，我们测量了其他慢性肺病患者中两种金属蛋白酶MMP7和MMP1的浓度，并将它们与IPF患者中观察到的水平进行了比较。最后，在一个独立的验证队列中测试了MMP7和MMP1作为IPF外周血生物标志物的潜在作用。
方法
有关本研究中使用的方法的详细描述，请参见文本S1．
初始IPF推导队列
本研究包括匹兹堡大学医疗中心评估了74名IPF患者。在公布标准的基础上建立了IPF的诊断[11.]，并在临床有需要时进行手术肺活检[12.] （看文本S1)．通过Simmons Center数据库获得临床数据。吸烟状态定义如前所述[13.］．五十三对照个体是从肺科样品采集核心获得。基线人口统计信息可以在详细表1．IPF患者的平均百分比预测用力肺活量（FVC％）为61.9±20.8;平均百分比预测一氧化碳弥散量（DL有限公司％）为42.1±17.4。
慢性阻塞性肺疾病
在匹兹堡大学评估的73例慢性阻塞性肺病（COPD）的血浆样品可用于本研究。在考试时，个体在临床上稳定，烟草暴露至少10年，并且没有风湿病，传染性或其他全身炎症疾病的临床诊断。使用如前所述的金分类测量疾病严重程度[14.］．COPD队列包括13例GOLD 0-I级患者、21例GOLD II级患者和39例GOLD III-IV级患者。
结节病
匹兹堡大学医学中心对47例结节病患者的血浆样本进行了检测。有肺病的病人(n= 29）展示了76.7±22.1的平均FVC％，平均DL有限公司％的72.9±25.5。诊断和疾病分期按照美国胸科协会和欧洲呼吸协会标准测定，如先前所描述的[188bet官网地址15.，16.］．
过敏性肺炎
41例亚急性/慢性超敏性肺炎(HP)患者和34例IPF患者的血清样本均来自墨西哥国家呼吸研究所(Instituto Nacional de Enfermedades respiratory)。IPF和HP的诊断以前在该队列中有过描述[17.，18.］．简单地说，HP患者表现出以下特点:(a)有禽类接触史，血清抗禽类抗原抗体阳性;(b) ILD的临床和功能特点;(c) HRCT示弥漫性小叶中央界限不清的小结节，磨玻璃衰减，局灶性气陷，轻度至中度纤维化改变;(d)支气管肺泡灌洗液中淋巴细胞含量大于35%。44%的患者接受了手术肺活检;所有病例的肺组织学均符合HP诊断。HP的平均FVC%为60.3±15.3,IPF的平均FVC%为59.1±17.2。
独立验证组
来自20个对照个体的血清样品，八位患有亚临床性发作性ILD，16名患有家族性肺纤维化患者的患者，以及零星的IPF九个患者，在国家健康大学院校（NIH）的沃伦格特拉姆森临床中心（NIH），可用于本研究．亚临床疾病的患者是家族肺纤维化患者的一级亲属;它们是无症状的，具有正常的肺功能测试，但HRCT调查结果与早期ILD一致。家族性肺纤维化定义如前所述[19.］．正常志愿者作为对照。
这些队列之前已经被我们描述过[20.，21.］．简而言之，散发性IPF和家族性肺纤维化患者的平均FVC％值分别为59.4±19.7和75.7±16.7。使用HRCT早期无症状患者诊断出八名家族肺纤维化患者[21.];本组的平均FVC％为101.3±10.1。性别，年龄，种族，和吸烟状况对所有群体都在呈现表2.．
验证队列患者特征
正如我们先前所描述的是通过匹兹堡健康科学组织库大学获得微阵列分析肺组织样本[22.］．23个样本来自接受肺移植的IPF患者的手术残余活检或移植的肺，14个对照的正常肺组织来自无病边缘，组织学正常的肺癌切除标本。IPF的形态学诊断是基于与通常间质性肺炎相一致的典型显微镜表现[12.，23.］．所有患者均满足美国胸部社会和欧洲呼吸社会概述的IPF诊断标准[188bet官网地址11.］．
所有研究均由匹兹堡大学，全国心脏，肺和血液研究所或国家呼吸系统，墨西哥审查委员会批准。知情同意是从所有患者获得的。
bal
如前所述，作为诊断过程的一部分，BAL是通过柔性纤维支气管镜进行的[18.，22.，24.］．将上清液保存在-70℃直至使用。从22名IPF患者（年龄62.2±7.2 y）和10名正常对照（年龄41.5±5 y）的BAL样品可用于本研究。
多重分析
根据适当的制造商协议（Invitrogen和R＆D系统），使用Luminex XMAP技术（Luminex Corporation）以96孔微孔板格式进行测定，如前所述[25.),在文本S1．
Bead-Based免疫测定
采用34层检测IL1A、IL1RA、IL1B、IL2、IL2R、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL10、IL12B、IL13、IL15、IL17、TNFA、IFNA、IFNG、GMCSF、EGF、VEGF、GCSF、FGF2、HGF、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、TNFRS1A、TNFRS1B和TRAIL-R2 (Invitrogen公司)。MMP检测包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12和MMP13 (R&D Systems)。
FAS, EGFR, FASL, Cyfra 21-1 (CKRT19片段)，IGFBP1和KLK10的检测是在我们的匹兹堡Luminex核心设施开发的。这些分析方法如所述进行了验证[25.］．
寡核苷酸微阵列实验
详细信息是在提供文本S1．简单地说，使用总RNA作为合成cDNA的模板，由阵列制造商(安捷伦技术)推荐。cDNA作为模板生成cy3标记的cRNA，用于安捷伦全人类基因组4X 44K多包阵列(安捷伦技术)杂交。杂交、扫描和特征提取后，数据文件导入微阵列数据库，并使用SOURCE (http://genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/SMD/source/sourceSearch），然后使用循环黄土[归一化26.］．差异表达基因通过显著微阵列分析(SAM)鉴定[27.］．对应于49个蛋白质标志物的探针通过其基因符号标识。提取为对应于这些标记探针的表达水平。在冗余探针的情况下，那些具有最高表达水平和具有最低Q值被选择用于呈现。
统计分析
当浓度变化至少为25%且具有统计学意义时，则认为蛋白表达差异p< 0.05经多次测试修正。数据以均数±标准偏差报告。使用Wilcoxon秩和检验来识别潜在的生物标志物，以单因素区分IPF样本与对照组。对于多次测试，使用Bonferroni方法将家族级错误率控制在5%。数据分析使用R语言进行统计计算(http://www.r-project.org/）[28.］．分类和回归树（购物车）方法用于识别可用于将IPF与对照区分开的外周血生物标志物的潜在组合。使用RPART包进行递归分区进行推车。使用范围内评估分类性能（http://rocr.bioinf.mpi-sb.mpg.de/)．对于寡核苷酸阵列数据分析，我们应用了SAM [27.］．使用Genomica（进行数据可视化和聚类http://genomica.weizmann.ac.il/index.html）[29.和Spotfire决策网站9 (TIBCO)。
结果
血浆蛋白在衍生队列中区分IPF患者和对照组
分析的49个标记中，48个在血浆中检测到(图1一个);单变量分析确定了IPF中与对照组相比差异表达的12个蛋白(表3)．五个的MMPs（MMP7，MMP1，MMP3，MMP8，MMP9），两个趋化因子（CXCL10，CCL11），FAS，IL12B，可溶性TNF受体（TNFRSF1A，TNFRSF1B）的过表达显著;意格在IPF患者与对照组相比血浆显著表达不足。MMP7和MMP1，先前已经显示出在IPF发病机制中的作用，在单因素分析排名第一的蛋白质（表3)．当年龄、性别或吸烟状况受到统计控制时，显著差异仍然存在。
（a）在IPF和对照患者的血浆中测量的蛋白质的热量。专栏，个体患者;行，蛋白质。每个蛋白质水平除以所有患者的相同蛋白质的几何平均值和基于对数的2种变化的。增加黄色色调，增加;增加紫色阴影，减少;灰色，不变。使用Genomica聚集蛋白质。红色垂直线，蛋白质簇在IPF中增加;绿色垂直线，IPF中的蛋白质簇减少。
（b）通过推车获得的分类树应用于来自IPF患者和对照的血浆蛋白浓度数据。蓝色框将终端节点标识为控制;作为IPF的一个红色框。所有计数都列为Control / IPF。浓度在ng / ml处。在具有高MMP7浓度但低MMP1浓度（14个IPF样品，五种对照样品）的亚组中，IGFBP1和TNFRSF1A上的分裂改善了分类，而在低MMP7的子组中，MMP8改善了分类。
（C）的ROC曲线用于使用每5个标记，或者它们的组合，来分类样品如IPF或控制。灵敏度，或真阳性率，绘制在y- 轴和假阳性率，或1 - 特异性，在x设在。每个ROC曲线下的面积相当于Mann-Whitney曲线的分子U- 比较IPF和控制样本之间的标记分布。标有“组合”的品红色线是使用所有五个标记的组合分类器。在45°处的标识线代表一个标记，其不能比分类样品更好地作为IPF或通过翻转公平的硬币来控制。
血浆蛋白从控件区分IPF
为了确定这些血浆蛋白组合是否能正确地对IPF患者进行分类，我们对全部49个标志物进行了递归划分，发现血浆蛋白谱可以清楚地将IPF患者与正常对照组区分开来。CART分析显示，MMP7和MMP1除了是两个最重要的生物标志物外，还是组合分类器的关键组成部分，该组合分类器还包括MMP8、IGFBP-1和TNFRS1A (图1B).分类器的敏感性和特异性分别为98.6%(95%置信区间[CI] 92.7%-100%)和98.1% (95% CI 89.9%-100%)。高浓度MMP7单独(≥1.99 ng/ml)能正确地将74例IPF患者中的69例(93.2%)区分为IPF，但将5个正常样本错误地划分为IPF，将5个IPF样本错误地划分为对照组，而高浓度MMP7(≥1.99 ng/ml)和MMP1(≥2.15 ng/ml)合并排除所有对照组。因此，结合MMP7和MMP1的高浓度可以区分IPF患者与对照组。接收机工作特性曲线(roc) (图1c）确认MMP7是最好的单变量分类器，尽管五个标记的组合更好地表现出稍微更好（图1c），MMP7和MMP1的组合（未发布数据）。
IPF患者肺液和BAL液中MMP7和MMP1升高
为了确定外周血蛋白浓度的差异是否反映了肺中基因表达的差异，我们使用寡核苷酸微阵列分析了23例IPF和14例对照肺中的基因表达模式(图2A). CART血浆信号中的五种血浆蛋白(图1b），与对照（SAM Q值= 0对于两种基因的SAM Q值= 0分别增加，只有MMP7和MMP1的基因在IPF肺中显着过表达; 7.3-和15.7倍增加）。在IPF患者的血浆中具有显着差异的十种其他蛋白质（表3)， MMP3、AGER和IL12B基因在IPF肺中也有显著差异表达(图2一种）。
(A)使用编码IPF肺中49种蛋白标记物的基因表达微阵列测量的平均基因表达水平(对数尺度)(y轴）与对照相比，肺（x-轴）。彩色方块（黑色或红色）的基因编码蛋白质，在等离子体显著改变。红色正方形是基因改变显著在基因表达数据（SAM Q值<5％）和外周血测定其编码的蛋白质。绿色斜线表示两倍变化。
（B和C）MMP7（B）和MMP1（C）的浓度（毫微克/毫升）的显著（p< 0.00001和p= 0.018，分别地）的患者BAL流体的IPF更高（n= 22)与对照个体(n= 10)。
为了确定MMP7和MMP1蛋白是否分泌到肺泡微环境中，我们测量了22例IPF患者和10例对照组患者的BAL中MMP7和MMP1蛋白的浓度。IPF患者的MMP7和MMP1 BAL浓度明显高于对照组(p< 0.00001和p分别= 0.018）（图2B和2C)。因此，肺部微环境中的MMP7和MMP1水平升高是它们增加外周血浓度的最可能源。
MMP7和MMP1在COPD或结节病患者中没有增加
要确定是否MMP7和MMP1的浓度在其他常见的慢性肺部疾病的增加，我们在患有结节病或慢性阻塞性肺病患者中测量血浆浓度。47名结节病患者分为那些具有实质性肺病（阶段2或更大的证据;n= 29)，无肺实质受累者(n= 18）。如图所示图3，MMP7的血浆浓度没有显着差异（p= 0.78) (图3A)或MMP1 (p= 0.27）（图3b）与对照相比，在有或没有肺异常的结节病组之间。COPD参与者被黄金课程分组，进入0-I（n= 13），II（n= 21），和III-IV（n= 39)。MMP7的血药浓度无显著差异(p= 0.21)或MMP1 (p= 0.85)。图3A和3.分别为B)。
MMP7（A）和MMP1（B）的浓度（毫微克/毫升）是显著高于IPF患者（n= 74;p< 0.00001和p与对照相比，分别= 0.018）（n= 53），但不结节病（n= 47;p= 0.78,p= 0.28)，与对照组(n= 53）或COPD（n= 73;p= 0.21和0.85，分别由金类分层，AS 0-I，II和III-IV）。
IPF患者血清MMP7和MMP1明显高于HP患者
为了确定外周血MMP7和MMP1浓度是否能将IPF与其他常见类型的ILD区分开，我们测量了41例HP患者和34例IPF患者的MMP7和MMP1浓度。单因素分析，血清MMP7 (p= 0.01)及MMP1 (p< 0.001) IPF显著高于HP;MMP1和MMP7的fold变化分别为2.3和1.31 (图4A和4b）。
IPF患者的血液中MMP7（A）和MMP1（B）的浓度（Ng / ml）显着高（n= 34）的患者比HP（n= 41)。
（C）IPF样品中的平均基因表达水平（对数标度）（yy轴）相比，HP（x-轴)，由基因表达微阵列测量。灰色的圆圈代表所有基因;红色圆圈，MMP1和MMP7。绿色斜线表示两倍变化。
血清MMP7的（d）的组合（y-轴)和MMP1浓度(x-轴)，IPF(闭合圆)和HP患者(开放圆)。角落代表的是阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)之间的权衡，在MMP1和MMP7浓度的基础上排除IPF(蓝色)或得出IPF(红色)的最佳点。
（E）的ROC曲线用于使用MMP1或MMP7，或它们的组合，来分类样品如IPF或HP。灵敏度，或真阳性率，绘制在y- 轴和假阳性率，或1 - 特异性，在x设在。在45°处的标识线代表了通过翻转公平硬币而不是将样品或HP进行分类的标记。
类似的结果在先前公开的DNA微阵列从IPF和HP患者[获得肺组织中数据集的比较基因表达的再分析观察18.］．在该再分析，MMP7和MMP1水平显著相比HP（假发现率[FDR <5％）在IPF较高，但是，由于在周边血液中观察，在MMP7水平的变化相比，在增加时适中MMP1（图4C)。
血清MMP1和MMP7浓度的组合具有用于测定患者具有91％（MMP7> 2.6ng / mL和MMP1> 8.9ng / mL）的IPF的阳性预测值至66％，以及负预测值（裁定IPF）范围从96％（MMP7 <2.9 ng / ml和MMP1> 3.5ng / ml）到70％（图4D).此外，高MMP7和高MMP1外周血浓度联合区分IPF和HP的敏感性为96.3% (95% CI 81.0%-100%)和87.2% (95% CI 72.6%-95.7%) (图4E)，进一步支持MMP1结合MMP7区分IPF与HP。
独立验证队列的血清MMP7和MMP1显着较高
为了验证我们的研究结果，我们在由IPF，家族性肺纤维化或亚临床ILD影响的患者组成的独立验证队列中测量了MMP7和MMP1的血清浓度。此队列最近被美国描述了[21.］．尽管MMP7和MMP1的浓度是在血清中而不是在血浆中测量的，但与对照组相比，肺纤维化患者中MMP7和MMP1的浓度明显更高(p<0.001和p= 0.01分别）。值得注意的是，与对照个体相比，患有亚临床ILD的患者的血清MMP7浓度明显更高（p与具有全面IPF的患者相比，= 0.019）和显着降低（p<0.0001）（图5A），这表明MMP7可以用作疾病进展的生物标记。有一个在MMP7浓度患者之间没有显著差异与家族性或散发IPF，杨等人的研究结果是一致的。[30.］．
（A）暗实线表示各组的中位数浓度。浓度的四分位数间距（IR）或中间50％是由一个框界定。数据是在对数底2的规模表示。
(B)验证队列中使用MMP1或MMP7或它们的组合将样本分类为IPF(散发性或家族性)或对照的ROC曲线。
(C和D)血清MMP7浓度与FVC% (C)和DL降低中度相关有限公司线性回归和95% CI与MMP7浓度(ng/ml)与FVC%和DLCO%呈负相关。＊p<0.05，**p< 0.01， ***p<0.001。
在该队列中，高浓度的MMP7结合的升高的MMP1浓度可以将IPF与89.2％敏感性（95％CI 71.8％-91.7％）和95.0％特异性（95％CI 75.1％-99.9％）区分开（95％CI 75.1％-99.9％）。支持调查在我们的衍生队队列中（图5b）。
讨论
总的来说，据我们所知，我们的研究首次证明了IPF患者外周血蛋白特征。MMP7和MMP1，这两种基质金属蛋白酶先前与IPF发病机制有关[31]，在IPF患者的血浆，血清，BAL流体和肺组织中显着增加，表明外周血中的MMP7和MMP1水平呈现出表征IPF肺泡微环境的病理变化。组合使用，MMP1和MMP7的血液水平可以区分IPF患者，这些慢性肺病包括HP，一种常见的间质性肺炎，有时可以与IPF无法区分[32- - - - - -34］．在亚临床家族性肺纤维化患者中观察到MMP7血液浓度的增加，较高水平的MMP7与疾病严重程度有关。我们的研究结果一起支持MMP1和MMP7作为IPF生物标志物，并建议进一步调查它们在诊断，早期检测和对疾病进展监测中的作用。
IPF患者血液中12种蛋白中有多种MMPs显著升高。MMPs的作用在IPF中得到了深入的研究和讨论[35］．虽然基质蛋白酶在调节上皮细胞对损伤的异常反应、成纤维细胞增殖、细胞外基质积累和异常组织重塑方面有多种不同的作用，但共识是，基质降解酶家族参与了疾病发病机制[31，36- - - - - -40］．本研究中排名靠前的两个蛋白是已知在IPF肺中活化的肺泡上皮中显著过表达的MMPs。MMP1是一种基质金属蛋白酶，主要降解纤维胶原，在正常情况下很少表达，但在IPF肺的反应性肺泡上皮细胞中高度过表达[39］．MMP7，一种具有多种局部炎症调节作用的基质金属蛋白酶[41，42]，在IPF中的肺泡上皮细胞中也高度上调[39，43］．此外，MMP7敲除小鼠相对保护来自Bleomycin诱导的纤维化[39]，提示MMP7可以具有在IPF促纤维化作用。采取在上述背景下，我们的结果有力地表明，在IPF肺激活上皮细胞是MMP1和MMP7外周血浓度升高的可能的来源，从而支持其作为生物标志物用于疾病检测和进展的用途。
我们的数据显示，患有COPD的患者，慢性进行肺病，也不是患有术慢性肉芽肿的患者，表达显着增加了MMP7或MMP1的外周血浓度。此外，在升高的MMP7浓度存在下，升高的外周血MMP1浓度与HP区分IPF。在IPF和HP患者的肺部中发现了MMP7和MMP1的基因表达的类似趋势，进一步支持了MMP7和MMP1的外周血浓度的变化对肺基因环境的反映并构成了疾病特异性的观点信号。这一发现可能是非常重要的临床上，因为亚急性HP经常被误诊为特异性非特异性间质性肺炎（NSIP），并且在其慢性高级形式的HP中可以从IPF中不可替补[32- - - - - -34］．事实上，最近的研究已证明，在慢性HP与那些普通型间质性肺炎（UIP）的观察到的通常的重叠和病理异常HRCT，代表到这些条件的鉴别诊断[一个重要的挑战33，34，44］．因此，IPF中观察到的外周血MMP7和MMP1浓度升高并非由于慢性肺病的全身应激反应，并可将COPD、结节病和HP与IPF区分开。虽然现阶段我们不主张仅依靠外周血MMP7和MMP1浓度来区分IPF与HP、结节病或难度较小的COPD鉴别诊断，但知道这些浓度可能会影响临床决策。
我们没有将IPF与其他特发性间质性肺炎(如NSIP)进行比较。我们的数据中没有任何东西表明我们可以利用MMP7和MMP1外周血浓度来区分IPF和这些疾病。事实上，在亚临床ILD患者中发现的MMP7升高可能表明这种升高可能存在于其他特发性ILD中。此外，IPF和NSIP的基因表达模式极为相似[30.，45]，最近也发现IPF和NSIP患者的BAL MMP7水平相似[46］．这些研究的主要局限性是NSIP病例数量少，因为孤立的NSIP非常罕见。因此，我们的结果应该鼓励建立多中心采集的ILD患者外周血样本，有足够的力量来确定NSIP和IPF是否在外周血蛋白表达上存在差异。
与其他研究相比，我们的分析的主要属性包括我们衍生队列的规模相对较大，在IPF患者队列中检测了大量的蛋白质，外周血生物标志物水平与它们在肺和BAL中的基因表达水平的比较，与其他慢性肺病的多个相对较大的对照人群进行比较，以确立我们研究结果的特异性，并在一个独立验证队列中验证我们的初步结果。我们的验证队列的一个独特特征是，它包含了亚临床间质性肺病患者，这些患者是家族性IPF患者的无症状一级亲属。这些患者HRCT显示早期ILD，但无肺功能异常、咳嗽或呼吸困难[19.，21.］．来自该队列的样本分析允许我们证明，早期亚临床肺病患者MMP7浓度显着高，表明MMP7可以是早期无症状ILD的标志物。MMP7的外周血浓度也与肺功能试验相关，这是抗病严重程度的替代衡量标准，因此可能反映IPF中肺重塑的分子机制[31］．自然地，使用的不同平台和不同样品类型限制了我们在此阶段的能力来设置疾病特异性MMP浓度阈值。然而，重复性和我们在不同类型的样品，并在多个队列的结果一致的建议，这样的阈值可以而且应该确定。
总之，在这项研究中，我们首次报告了我们知道在局限于肺部的疾病中存在外周血蛋白签名的存在。该签名由MMP，TNF受体和一些趋化因子组成。我们的数据表明，在肺中也观察到这些标记中的两种（MMP1和MMP7）中的两个外周血增加，并且可能特异于IPF。我们在独立的验证队列中提供了我们观察的验证，并显示MMP7与疾病严重程度相关，并且患有亚临床ILD的患者中增加。虽然额外的研究将在临床实践中确定该蛋白质签名的价值，但我们的结果支持外周血蛋白的潜在价值作为IPF的器官局部疾病中的生物标志物。如果经过验证，这些生物标志物有可能大大促进在IPF中引入新疗法，并对这些患者的管理进行深刻影响。
支持信息
入藏号
Entrez基因ID（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）本文讨论的蛋白质是：Ager，177;CCL11,6356;CXCL10,3627;IL12B，3593;IGFBP1,3484;MMP1,4312;MMP3,4314;MMP7,4316;MMP8,4317;MMP9,5318; TNFRSF1A, 7132; TNFRSF1B, 7133.
致谢
作者要感谢L. Chensny，A Marrangoni，K. Johnson和M. Bisceglia他们在处理样品和D. Plaskon维护数据库的帮助。A.财，J.莫斯，E法因戈尔德和J.李提供了有益的讨论和建议。没有的西蒙斯中心和肺部，重症医学科的患者的配合这项研究不会有可能的。
作者捐款
IOR有助于招聘和分析验证队列，数据分析，概念化和设计，数据分析和稿件准备。TJR促进了项目概念化，数据分析，统计数据和纸稿初始草案的撰写。KK有助于微阵列数据生成和分析，研究的概念化和稿件生成。yz有助于样本收集和协议开发，数据分析和稿件生成。KG为参与者的招募，诊断和确定的结节病群以及衍生队，协议开发，实验规划以及手稿准备的促进队列和确定。AEL促成了Luminex数据生成，包括自定义测定和数据分析。KOL为参与者招募和诊断确定了推导队，协议开发和手稿准备的促进和诊断。JC促成了参与者的招募和诊断确定HP队列，ELISA测定，数据分析和稿件准备。SDM为验证队列，议定书开发和稿件准备方面有助于参与者招聘和诊断确定。AP促成了数据分析和稿件准备。 FS contributed to participant recruitment and diagnosis ascertainment of the COPD cohort, protocol development, and manuscript preparation. JD contributed to conceptualization of proposed studies, diagnosis ascertainment of the derivation cohort, data analysis, and manuscript preparation. MS contributed to participant recruitment and diagnosis ascertainment of all Mexican patient cohorts, planning of the study, preparation of early drafts, and manuscript development. BRG contributed to design and conceptualization of the research project, participant recruitment and diagnosis ascertainment of the validation cohort, protocol development, and manuscript preparation. NK contributed to design and conceptualization of the research project, analysis of all data including gene expression and protein measurements, paper writing, and manuscript submission.
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