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研究文章gydF4y2Ba

上调和Profibrotic骨桥蛋白在人类特发性肺纤维化的作用gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

特发性肺纤维化(IPF)是一种进步的和致命的疾病,其特征是fibroproliferation和肺细胞外基质的过度积累。gydF4y2Ba

方法和结果gydF4y2Ba

利用寡核苷酸阵列,我们确认gydF4y2Ba骨桥蛋白gydF4y2Ba的基因明显IPF有别于正常的肺。骨桥蛋白在IPF肺局部肺泡上皮细胞,也显著升高支气管肺泡灌洗的IPF患者。研究骨桥蛋白的fibrosis-relevant影响我们刺激主要人类肺成纤维细胞和肺泡上皮细胞与骨桥蛋白重组(A549)。骨桥蛋白诱导显著增加成纤维细胞和上皮细胞的迁移和增殖。上皮细胞生长抑制的五肽Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (GRGDS)和CD44抗体,而fibroproliferation GRGDS和抗体抑制αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素。成纤维细胞和上皮细胞迁移被GRGDS抑制,anti-CD44, anti-αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba。在成纤维细胞、骨桥蛋白上调组织抑制剂metalloprotease-1和I型胶原蛋白,并抑制矩阵metalloprotease-1(金属蛋白酶- 1)的表达,而在A549细胞上调MMP-7引起的。在人类IPF肺、骨桥蛋白与MMP-7肺泡上皮细胞,和薄弱的环节统计模型应用到微阵列数据显示显著的骨桥蛋白之间的相互作用和MMP-7。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果提供了一个潜在的机制,骨桥蛋白分泌的肺泡上皮细胞可能在IPF profibrotic影响肺部和强调骨桥蛋白作为一个潜在的目标治疗不治之症。gydF4y2Ba

引用:gydF4y2BaPardo,吉布森K,西斯内罗斯J,理查兹TJ,杨Y, Becerril C, et al。(2005)上调和Profibrotic骨桥蛋白在人类特发性肺纤维化的作用。科学硕士2 (9):e251。https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251gydF4y2Ba

学术编辑器:gydF4y2Ba彼得·j·巴恩斯国家心肺研究所、英国gydF4y2Ba

收到:gydF4y2Ba2005年1月24日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2005年6月10日;gydF4y2Ba发表:gydF4y2Ba2005年9月6日gydF4y2Ba

版权:gydF4y2Ba©2005 Pardo et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用,分布,在任何介质,和繁殖提供了最初的工作是正确引用。gydF4y2Ba

利益冲突:gydF4y2Ba作者宣称没有利益冲突存在。gydF4y2Ba

缩写:gydF4y2BaAPMA aminophenylmercuric乙酸酯;落下帷幕,支气管肺泡灌洗;表皮生长因子受体、表皮生长因子(受体);IPF特发性肺纤维化;MMP矩阵metalloprotease;SD,标准偏差;TGF-β1,转化生长因子1;metalloprotease TIMP、组织抑制剂gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明的慢性fibrosing间质性肺炎表现为肺泡上皮细胞损伤/激活成纤维细胞增殖,积累和夸大的肺实质细胞外基质(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。这种疾病通常是进步,很大程度上对皮质类固醇和免疫抑制治疗gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

IPF的独特的形态特征是成纤维细胞的/染色疫源地的发展,由广泛分散,小骨料沉浸在myxoid-appearing牙龈间充质细胞的细胞外基质(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。这些成纤维细胞的/染色焦点代表活跃的纤维发生领域,扮演着重要的角色在进步纤维化反应(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。这些网站的特点是不恰当的组织愈合和受损细胞外基质重塑。虽然取得了重大进展描述的这种疾病的临床和形态特征,背后的分子机制在人类IPF发病机制仍然不太为人所知(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

骨桥蛋白(也称为分泌磷蛋白质1)是一种酸性磷酸化糖蛋白,它包含一个Arg-Gly-Asp主题,结合整合素家族的粘附分子(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。它作为细胞粘附和迁移功能分子,可以绑定到多个配体,包括αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素,CD44亚型,纤连蛋白(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。骨桥蛋白已经涉及到许多生理和病理过程包括骨吸收,恶变,和转移(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。它也被认为是一个关键的细胞因子调节炎症、细胞免疫反应,和组织修复,独特的效果对T细胞功能(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

利用寡核苷酸微阵列我们先前表明,骨桥蛋白是高度上调bleomycin-induced肺纤维化小鼠,我们报告了类似的结果初步报告涉及五个IPF肺部和四个控制样品(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。有趣的是,骨桥蛋白似乎有profibrotic bleomycin-induced肺纤维化发展的影响(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。博来霉素灌肠后,gydF4y2Ba骨桥蛋白gydF4y2Ba空发达减少小鼠肺纤维化的特点是扩张远端空气空间与降低积极转变增长因子1 (TGF-β1)和减少了I型胶原蛋白的表达与野生型相比控制(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。骨桥蛋白的机制,(即与主要TH1细胞因子的影响。,antifibrotic) T淋巴细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),可能会导致profibrotic效果并不完全理解。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们应用微阵列分析基因表达模式在更大群IPF肺(13 IPF样品和11控制),我们分析了骨桥蛋白对人类的直接影响肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞迁移和增殖gydF4y2Ba矩阵metalloprotease (MMP)gydF4y2Ba基因表达在体外。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

研究人群gydF4y2Ba

病人的呼吸疾病研究所墨西哥城,墨西哥(gydF4y2Ba协议S1gydF4y2Ba),匹兹堡大学,匹兹堡,宾夕法尼亚州,美国(gydF4y2Ba协议S2gydF4y2Ba),包括在这项研究中。协议是两个机构批准的,书面的知情同意是获得必需的。寡核苷酸微阵列得到的样本组织部门的银行在匹兹堡大学的病理学。使用存档组织已通过当地的机构审查委员会。IPF诊断是由历史、体格检查、肺功能的研究中,胸部HRCT和支气管肺泡灌洗(BAL)发现,并被开放肺活检证实。IPF的形态学诊断是基于典型的微观结果符合通常的间质性肺炎(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。病人完成了标准的美国胸腔学会和欧洲呼吸学会(188bet官网地址gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。BAL样本获得最初咨询作为最初的诊断检查的一部分。没有一个病人已经接受皮质类固醇或免疫抑制药物的时候落下帷幕。人口数据,肺功能数据,BAL微分细胞计数提供gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
下载:gydF4y2Ba
表1。gydF4y2Ba病人的特点gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.t001gydF4y2Ba

落下帷幕的液体的骨桥蛋白水平进行评估在十健康人(两个吸烟者,两个前吸烟者,从不吸烟和6)。都有正常的胸部x光检查和肺量测定法。同样,组织学正常的肺组织获得从六个不吸烟的成年人尸体剖检的人死于与肺部疾病无关的原因是用于免疫组织化学。寡核苷酸微阵列,控制样本包括正常组织学肺切除的肺癌患者样本从匹兹堡组织获得银行(匹兹堡,宾夕法尼亚州,美国)。gydF4y2Ba

寡核苷酸微阵列gydF4y2Ba

移植外科肺活检或残余的IPF患者接受肺移植是13 IPF样本的来源。肺切除的肺癌患者样本,从组织获得银行匹兹堡大学病理学系的,11个正常样本的来源。这些样品已经包含在我们的先前的研究。总RNA提取和用作模板来生成双链cDNA biotin-labeled cRNA,由制造商推荐的数组和之前描述的gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。支离破碎的cRNA是杂化Codelink联合装置我幻灯片。杂交后,数组被清洗和沾streptavidin-AlexaFluor 647。数组使用Genepix 4000 b基因芯片扫描仪进行扫描。图像进行了分析使用Codelink表达II分析套件。他们在视觉上检查缺陷和质量控制参数作为推荐的制造商。数据文件导入到一个微阵列基因数据库,并与更新注释使用源(gydF4y2Bahttp://genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/SMD/source/sourceSearchgydF4y2Ba),然后平均比例。根据我们之前的经验,表达水平低于0.01都是0.01。统计分析了使用Scoregene基因表达包(gydF4y2Bahttp://www.cs.huji.ac.il/labs/compbio/scoregenesgydF4y2Ba使用Genexpress(执行和数据可视化gydF4y2Bahttp://genexpress.stanford.edugydF4y2Ba8.0)和Spotfire决定网站(Spotfire、Goteborg、瑞典)。的全套基因阵列数据存入基因表达综合数据库与地理连续加入GSE2052数量(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geogydF4y2Ba)根据MIAME指南。描述的一般方法分析以前我们(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。薄弱的环节模型(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)安装使用Weaklink包R统计软件系统(gydF4y2Bahttp://www.r-project.orggydF4y2Ba)。的gydF4y2BapgydF4y2Ba值拟合得到逻辑回归模型与一个独立变量的最小百分位数的两个基因的表达水平。Bonferroni调整申请多个测试。gydF4y2Ba

支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba

拜尔港是在局部麻醉的情况下通过纤维支气管镜检查进行。简而言之,300毫升生理盐水是灌输给50毫升整除,平均回收率60%的-70%。恢复平衡液离心机在250年gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟在4°C。细胞颗粒在1毫升的PBS和一个整除resuspended被用来评估细胞的总数。其他整除固定在聚乙二醇,苏木精和伊红染色,用于鉴别细胞计数。上层清液保持在−70°C到使用。gydF4y2Ba

ELISAgydF4y2Ba

BAL液体样本中骨桥蛋白的量化进行了18 IPF患者和10名健康的个人控制,通过使用一个商业敏感和制造商的特定指令后ELISA (Calbiochem拉霍亚,加利福尼亚,美国)。gydF4y2Ba

免疫组织化学gydF4y2Ba

组织部分deparaffinized,水化,然后阻止H为3%gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在甲醇为30分钟,然后抗原与柠檬酸缓冲检索(10毫米,pH值6.0)5分钟在一台微波炉。兔多克隆抗体对人体骨桥蛋白(2 ng / ml;Calbiochem)应用和样本在一夜之间在4°C的环境中。二级生物素化的anti-immunoglobulin其次是辣根peroxidase-conjugated链霉亲和素(BioGenex,圣拉蒙,加利福尼亚,美国)是根据制造商的指示。原子能委员会(BioGenex)醋酸缓冲含有0.05% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba作为底物(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。的部分与苏木精复染色。主要的非免疫血清抗体取代消极控制幻灯片。gydF4y2Ba

的双色免疫荧光分析gydF4y2Ba

使用标准的两级double-immunofluorescence标签技术。简而言之,冰冻切片在PBS洗(0.01 (pH值7.4))5分钟,然后固定在冷丙酮10分钟,两次。组织孵化在阻断缓冲区(NP-40 1% BSA, 5%正常血清,0.05%,在PBS) 30分钟。然后孵化幻灯片和一只兔子抗体骨桥蛋白(1:10 0;Abcam,剑桥,麻萨诸塞州,美国)在室温下1 h和洗PBST (0.05% Tween-20 0.01 PBS (pH值7.4))10分钟,三次。一只老鼠anti-MMP-7单克隆抗体(1:1,000;Chemicon国际泰梅库拉,美国加利福尼亚州)补充说,幻灯片孵化了一个额外的1 h在室温下。在PBST三10分钟后洗,幻灯片和二次孵化抗体(羊anti-rabbit IgG-Cy3, 1:1,000;和山羊anti-mouse IgG-FITC 1:1,000;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟。幻灯片被洗在同一个缓冲区和安装不变色介质(包含DAPI染色细胞核)。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

主要得到了人类正常的肺成纤维细胞(如前所述)(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba),A549细胞株是来自写明ATCC(马里兰州罗克维尔市,美国)。gydF4y2Ba

生长速率测定gydF4y2Ba

肺成纤维细胞或A549细胞被播种在96 -文化板块在细胞密度为7.5×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和5×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba细胞/分别和孵化火腿F-12和DMEM媒体,分别(GIBCO-BRL,宏伟的岛,纽约,美国),补充10%的边后卫在37°C公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和95%的空气。12小时后,介质取代介质有0.1%的边后卫单独或骨桥蛋白浓度增加0.1%的边后卫+(0.4、1和2μg /毫升)和细胞保持文化另一个48 h。使用细胞增殖细胞生长决心试剂WST-1(勃林格曼海姆,曼海姆,德国)如前所述[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。所有分析都是一式三份。在平行实验中,成纤维细胞和A549细胞进行预处理与抗体对人体α25分钟gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素(10μg /毫升;Chemicon)、五肽Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (GRGDS;Calbiochem),或者人类CD44抗体(NeoMarkers弗里蒙特,加利福尼亚,美国),然后添加了骨桥蛋白(2μg /毫升)。此外,A549细胞使用抗体人类表皮生长因子受体(EGFR;10μg /毫升;Chemicon)。gydF4y2Ba

细胞迁移试验gydF4y2Ba

成纤维细胞迁移和A549细胞化验使用商用24-well collagen-coated Boyden钱伯斯(Chemicon) 8-μm孔隙大小。短暂,半支流(∼80%)肺成纤维细胞的单层或A549细胞与trypsin-EDTA收获,离心机,resuspended火腿的F-12包含5% BSA的媒介。细胞悬浊液(3×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/)添加到参议院。众议院包含0.3毫升的介质有5% BSA单独或与10μg /毫升的重组人类骨桥蛋白(Calbiochem)。PDGF (8 ng / ml)和表皮生长因子(EGF);50 ng / ml)被用作积极控制为成纤维细胞和A549细胞,分别。额外BSA-coated钱伯斯为每个样本被用作空白。孵化8 h后37°C湿润孵化器有限公司为5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和95%的空气,Boyden室的顶部nonmigrating细胞刮洗。迁移细胞被估计的数量根据制造商的指示。简而言之,这些细胞被染色,颜色筛选了300μl提取缓冲区,和150 -μl整除测量ELISA板阅读器545海里。所有分析都在重复执行。在平行实验中,A549细胞和成纤维细胞进行预处理如上所述的增长率。gydF4y2Ba

RNA隔离和北部污点分析gydF4y2Ba

总RNA提取肺成纤维细胞和上皮细胞A549使用RNeasy迷你包(试剂盒GmbH,德国)。细胞细胞溶解和均质在存在高度变性胍isothiocyanate-containing缓冲区。样品被应用到一个RNeasy minicolumn,和RNA在30μl筛选了的水。总RNA(20μg / lane)分馏1%琼脂糖凝胶含有甲醛(0.66米gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。核糖体RNA与溴化乙锭可视化,分馏RNA被转移到Nytran转移膜(NEN生命科学产品,波士顿,麻萨诸塞州,美国)在一夜之间由毛细管印迹。RNA被固定化发酵在80°C 2 h,然后prehybridized 42°C在5×18 h SSC, 50%甲酰胺,5×Denhardt的解决方案,和0.5% SDS,包含100μg /毫升的变性大马哈鱼精子DNA。杂交是42°C 18 h在杂交缓冲由甲酰胺,0.5% SDS, heat-denaturedgydF4y2Ba32gydF4y2BaP-labeled cDNA探针。洗后,膜被干,柯达以下电影女士−屏幕70°C的加剧。的cDNA克隆对人类金属蛋白酶- 1、TIMP-1α1 I型胶原蛋白,核糖体RNA 18岁从写明ATCC获得。人类MMP-7林恩Matrisian互补脱氧核糖核酸是一种礼物,美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学。互补脱氧核糖核酸探针是放射性标记的gydF4y2Ba32gydF4y2BaP-dCTP特定活动的200×106 dpm /μg使用一个随机引物标记工具包(Stratagene拉霍亚,加利福尼亚,美国)。所有的实验都重复两次。gydF4y2Ba

实时定量rt - pcrgydF4y2Ba

1μg RNA治疗1单位DNAase(生活技术,大岛,纽约,美国)。用随机引物合成第一链cDNA通过逆转录和Moloney-murine白血病病毒逆转录酶根据制造商的协议(优势RT-for-PCR设备;Clontech,帕洛阿尔托,加州,美国)。gydF4y2Ba

实时PCR扩增进行使用i-Cycler智商检测系统(BioRad,赫拉克勒斯,加州,美国),使用TAQMAN探针(PE应用生物系统公司,韦尔斯利,加利福尼亚,美国)标记FAM和春节。PCR的cDNA工作执行25-μl反应混合物体积包含3μl cDNA、20毫米Tris-HCl (pH值8.3),50 mM氯化钾,MgCl 2毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba200μM核苷酸,0.2μM具体5′和3′底漆18 s rRNA, 0.6μM特定基因5′和3′引物目标,0.2μM每个探测TAQMAN (18 s rRNA和基因目标)和1.25单位AmpliTaq黄金DNA聚合酶(PE应用生物系统公司)。每个产品的动态范围是建立PCR 1×10的拷贝数连续稀释gydF4y2Ba8gydF4y2Ba1×10gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;所有pcr进行了一式三份。标准曲线计算参考阈值周期(Ct)的日志cDNA稀释步骤。结果表示为目标基因的拷贝数归一化18 s rRNA。一些引物PCR反应中使用的设计使用设计师灯塔软件2.1 (BioRad)和检查爆炸的同源性。PCR扩增的循环条件进行使用以下协议:初始激活AmpliTaq黄金在95°C DNA聚合酶7分钟;的变性和40个周期95°C 30年代,退火30年代,60°C和扩展30年代的72°C。PCR引物的序列配对,并为每个基因探针所示gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba。PCR实验都是在重复完成。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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表2。gydF4y2Ba实时PCR引物和探针gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.t002gydF4y2Ba

页面ZymographygydF4y2Ba

MMP-7分析、条件媒体在12.5% SDS电泳凝胶含有基质牛CM-transferrin(0.3毫克/毫升)和肝素gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。经过电泳,凝胶在2.5%的溶液清洗Triton x - 100和孵化隔夜37°C 100毫米甘氨酸(pH值7.6),+ 10毫米CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和50 nM ZnClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。相同的凝胶被孵化,但在20毫米EDTA的存在。凝胶与考马斯亮蓝染色R250和使退色7.5%醋酸溶液和5%甲醇。重组体人MMP-7 (Chemicon)作为积极的控制。gydF4y2Ba

免疫印迹分析gydF4y2Ba

无血清条件媒体离心机,享年300岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟去除细胞碎片,然后由冻干浓缩。样本在水中可溶性,包含5整除μg蛋白质与Laemmli混合样品缓冲和10%或12.5% SDS-polyacrylamide凝胶电泳。被转移到蛋白质硝化纤维过滤器在15 V 20分钟用半干转移细胞(BioRad)。特异性的网站被封锁在一夜之间有4% (w / v)脱脂奶粉在PBS和膜孵化与兔抗体对人类间质胶原酶免疫球蛋白(摘要在PBS 1% BSA;美国加州圣克鲁斯生物技术),抗体对人类TIMP-1 (Chemicon)抗体对人类MMP-7(致癌基因,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国),或人类α-smooth肌肉肌动蛋白单克隆抗体(2μg /毫升;钱德勒Cymbus生物技术、福特、翰斯、英国)在室温下2 h。过滤器与二次孵化抗体结合在室温下过氧化物酶1 h。最后,过滤器与增强化学发光检测系统开发(Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)使用x光照片电影(Hyperfilm, Amersham淀粉微球生物科技)根据制造商的指示。西方的屁股重复两次。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

骨桥蛋白gydF4y2Ba基因表达是高度上调IPF肺gydF4y2Ba

基因表达的完整的微阵列数据集综合数据库与地理连续加入GSE2052数量(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geogydF4y2Ba)。基因表达模式显然杰出IPF肺部正常肺。gydF4y2Ba骨桥蛋白gydF4y2Ba基因表达是最上调的基因中杰出的IPF肺(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba),骨桥蛋白水平增加超过20倍(16.8平均表达式0.62控制肺部,IPF肺;gydF4y2Ba图1gydF4y2BaB)。这种增长是统计学意义我们是否应用阈值的错误分类(TNoM)分数(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.000221),或学生的学习任务(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0000035)。我们为多个测试通过控制纠正错误发现率在5%的水平gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。骨桥蛋白表达水平高在大多数IPF比在任何控制肺(肺gydF4y2Ba图1gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图1所示。gydF4y2Ba骨桥蛋白表达水平的微阵列分析控制和IPF的肺gydF4y2Ba

总RNA用于生成双链cDNA biotin-labeled cRNA。支离破碎的cRNA是杂化Codelink联合装置我幻灯片和染色和扫描中描述的材料和方法。gydF4y2Ba

(A)对数尺度散点图的平均强度上的所有基因阵列的控制(轴)和IPF(轴)。彩色点显示178基因显著改变(gydF4y2BapgydF4y2Ba在TNoM和学生t < 0.01)。点是彩色的褶皱比率;进步的深浅的蓝色线表示增加,进步深浅的红色表示减少。点颜色的灰色没有达到意义。斜实线表示的平等。两个绿色虚线线描绘10倍的变化。gydF4y2Ba

(B)骨桥蛋白水平在个别样本所示。y轴是任意的荧光水平表达水平(对数尺度)。蓝色建起了骨桥蛋白水平在个人样本。热图显示样本骨桥蛋白水平正常化的几何平均骨桥蛋白在控制和日志2-transformed基地。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g001gydF4y2Ba

骨桥蛋白增加BAL流体从IPF患者gydF4y2Ba

骨桥蛋白的蛋白质是量化BAL液体从18 IPF患者和健康对照组10。所示gydF4y2Ba图2gydF4y2BaELISA测定显示,在免疫反应性的蛋白显著增加液体来源于IPF肺(148.8±83 ng / ml IPF肺与健康对照组3.8±2.0 ng / ml,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图2。gydF4y2Ba骨桥蛋白水平落下帷幕gydF4y2Ba

量化的骨桥蛋白ELISA BAL液体样本中进行18 IPF患者和10名健康的个人控制。浓度的增加可溶骨桥蛋白被发现在球从IPF患者与健康对照组相比获得的流体。数据代表平均值±标准偏差(SD)。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g002gydF4y2Ba

免疫反应性的骨桥蛋白是本地化主要在上皮细胞gydF4y2Ba

检查骨桥蛋白的细胞来源分析IPF和控制肺部免疫组织化学。见gydF4y2Ba图3gydF4y2BaA -gydF4y2Ba3gydF4y2BaC,骨桥蛋白主要是局部肺泡上皮细胞,表现出一种强烈的IPF肺胞质染色。偶尔,集群的肺泡巨噬细胞也积极的(gydF4y2Ba图3gydF4y2BaC)。免疫组织化学染色法对骨桥蛋白-在正常的肺和肺组织样本孵化多发地血清(gydF4y2Ba图3gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图3。gydF4y2Ba骨桥蛋白在肺IPF的本地化gydF4y2Ba

免疫反应性的蛋白质与原子能委员会透露,和样本与苏木精复染色。两个代表IPF肺样本表现出强烈的上皮染色(原来的放大,40×)(A, B)。控制肺部没有染色(C)。负面控制部分IPF肺的主要抗体是取代多发地血清还显示没有染色(40×)(D)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g003gydF4y2Ba

骨桥蛋白诱导成纤维细胞和上皮细胞增长率gydF4y2Ba

确定骨桥蛋白对增长率的影响成纤维细胞和上皮细胞,细胞被刺激骨桥蛋白浓度增加,细胞数量确定后使用细胞增殖试剂WST-1 48 h。细胞增殖显著增加存在剂量依赖的相关性观察1μg /毫升和2μg /毫升。两个不同的控件(纤维母细胞达到220%和380%gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01),而在两个不同的实验A549细胞株展出增加60%和80%的增长率控制(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。gydF4y2Ba

Osteopontin-induced纤维母细胞增殖(2μg /毫升)被GRGDS-pentapeptide显著抑制,中断绑定RGD-containing蛋白质的细胞表面蛋白(gydF4y2BapgydF4y2Baα< 0.01)和抗体gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05),表明骨桥蛋白对增长率的影响是GRGDS域的相互作用介导的骨桥蛋白αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaA)。相比之下,上皮细胞生长部分被CD44抗体(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaB)。上皮细胞生长也显著抑制GRGDS但不是α抗体gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图4。gydF4y2Ba骨桥蛋白对成纤维细胞和上皮细胞增殖的影响gydF4y2Ba

人类正常的肺成纤维细胞(A)和A549上皮细胞(B)是生长在火腿F-12介质与2μg /毫升0.1%的边后卫和刺激骨桥蛋白。同时,与anti-αosteopontin-stimulated细胞治疗gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba、anti-CD44 GRGDS。每个酒吧代表均值±SD执行的三个实验一式三份;*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01。gydF4y2Ba

OPN,骨桥蛋白gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g004gydF4y2Ba

骨桥蛋白诱导成纤维细胞和上皮细胞迁移gydF4y2Ba

检查骨桥蛋白对细胞迁移的影响,我们使用collagen-coated Boyden室,一个完善的体外试验系统。细胞迁移的数量没有骨桥蛋白被用作控制迁移(0%)。显示在gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,成纤维细胞明显移向骨桥蛋白与细胞接触中独自加上5% BSA在众议院。骨桥蛋白(10μg)增强纤维母细胞迁移120%±11% (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01),类似于一项改进,获得强有力的纤维母细胞分裂素的血小板源生长因子,作为一个积极的控制(157%±12%,未发表的数据)。骨桥蛋白刺激迁移分析可能的机制,不同的阻滞剂。成纤维细胞迁移被GRGDS显著降低,α的抗体gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01),CD44抗体(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。抑制细胞迁移是特定的,因为孵化与免疫球蛋白g没有效果(未发表的数据)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图5。gydF4y2Ba骨桥蛋白对成纤维细胞和上皮细胞迁移的影响gydF4y2Ba

成纤维细胞(A)和A549上皮细胞(B)被放置在上层舱Boyden-type室,和火腿的F-12介质含有5% BSA单独或与10μg /毫升的骨桥蛋白添加到低舱。8 h的孵化后,迁移细胞染色,染色溶液的吸光度由ELISA测定。在平行实验中,与anti-αosteopontin-stimulated细胞治疗gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba、anti-CD44 GRGDS。每个酒吧代表三个实验的平均数±标准差;*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01;* *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

OPN,骨桥蛋白gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g005gydF4y2Ba

A549肺癌细胞也有显著提高细胞迁移在骨桥蛋白(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaB)。8 h的孵化后,A549细胞通过膜相比增加了114%±25%控制细胞(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。表皮生长因子,作为一个积极的控制、诱导细胞迁移增加168%±14%(未公开的数据)。Osteopontin-induced迁移被废除的上皮细胞分别与GRGDS预处理时,anti-αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素或anti-CD44 (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01;gydF4y2Ba图5gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

骨桥蛋白诱发的环境有利于在成纤维细胞细胞外基质沉积gydF4y2Ba

金属蛋白酶- 1由成纤维细胞表达。gydF4y2Ba

在基础条件下,一些主要的人类肺纤维母细胞细胞株可能表达金属蛋白酶- 1,而其他表达酶只有当刺激,例如,通过醋酸aminophenylmercuric (APMA)。在这种背景下,骨桥蛋白在金属蛋白酶- 1表达的影响由北部污点分析检查细胞系生产金属蛋白酶- 1在基底条件下,在没有产生金属蛋白酶- 1细胞系,但被APMA刺激(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)。骨桥蛋白抑制基底和APMA-induced金属蛋白酶- 1转录水平。当金属蛋白酶- 1 mRNA的信号归一化到18岁的水平由微RNA和量化,减少∼50%被注意到。这个结果证实了实时PCR显示∼40%抑制(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;gydF4y2Ba图6gydF4y2BaC)。抑制金属蛋白酶- 1表达的部分被CD44抗体,而不影响抗体αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素。骨桥蛋白在金属蛋白酶- 1的抑制作用也观察到蛋白质水平的免疫印迹分析。所示gydF4y2Ba图6gydF4y2BaD水平的免疫反应性的金属蛋白酶- 1条件培养液中被减少成纤维细胞与骨桥蛋白与控制细胞刺激。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图6。gydF4y2Ba骨桥蛋白对金属蛋白酶- 1基因和蛋白质表达的影响在两个人类肺纤维母细胞细胞系gydF4y2Ba

(A)代表北部污点20μg每车道提取细胞总RNA控制细胞和成纤维细胞刺激和0.4μg /毫升1μg /毫升骨桥蛋白。两种浓度的骨桥蛋白诱导金属蛋白酶- 1的表达下调。gydF4y2Ba

(B)在APMA-stimulated细胞骨桥蛋白也减少了金属蛋白酶- 1的超表达。gydF4y2Ba

(C)金属蛋白酶- 1的表达水平实时PCR确定材料和所述方法和规范化水平的18 s核糖体RNA。在平行实验中,与anti-αosteopontin-stimulated细胞治疗gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba和anti-CD44。酒吧代表平均±标准差(*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

(D)代表免疫印迹显示减少免疫反应性的金属蛋白酶- 1的媒体从成纤维细胞与骨桥蛋白刺激。成纤维细胞接受APMA和FGF-1加肝素作为积极控制强烈诱导金属蛋白酶- 1的表达。gydF4y2Ba

C、控制;FGF1 FGF-1加肝素;OPN,骨桥蛋白;PMA, APMA-stimulated。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g006gydF4y2Ba

骨桥蛋白表达增加TIMP-1成纤维细胞gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

骨桥蛋白的影响gydF4y2BaTIMP-1gydF4y2Ba在成纤维细胞中说明了基因表达gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba。北部污点分析(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba显示的增加gydF4y2BaTIMP-1gydF4y2Ba基因表达在0.4μg /毫升,1μg /毫升骨桥蛋白相比,控制。这个结果证实了实时多聚酶链式反应(gydF4y2Ba图7gydF4y2BaB)。骨桥蛋白增加了TIMP-1/18S核糖体RNA从55.7±14.2 121.2±13.1副本(副本gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。anti-CD44和anti-αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba整合素废除了这一增长。骨桥蛋白也增加了TIMP-1蛋白表达条件培养基见gydF4y2Ba图7gydF4y2BaC。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图7。gydF4y2Ba骨桥蛋白对TIMP-1基因和蛋白质表达的影响成纤维细胞gydF4y2Ba

(A)北部污点20μg每车道从控制和成纤维细胞中提取细胞总RNA刺激和0.4μg /毫升1μg /毫升骨桥蛋白。两种浓度的骨桥蛋白诱导增加TIMP-1表达式。gydF4y2Ba

(B)的表达水平TIMP-1实时PCR规范化水平的18 s核糖体RNA证实TIMP-1老年病的骨桥蛋白(*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。在平行实验中,与anti-αosteopontin-stimulated细胞治疗gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba和anti-CD44。gydF4y2Ba

(C)免疫印迹显示增加免疫反应性的TIMP-1条件媒体从成纤维细胞与骨桥蛋白刺激。gydF4y2Ba

C、控制;OPN,骨桥蛋白。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g007gydF4y2Ba

骨桥蛋白诱导成纤维细胞胶原基因表达。gydF4y2Ba

在胶原蛋白骨桥蛋白基因表达的影响中描述gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba。北部污点分析(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba一)显示增加2倍gydF4y2Baα1 I型胶原蛋白gydF4y2Ba基因的表达。α-smooth肌成纤维细胞中肌动蛋白的表达引起TGF-β1但不是由骨桥蛋白(gydF4y2Ba图8gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

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图8。gydF4y2Ba骨桥蛋白对胶原蛋白基因表达的影响和平滑肌α肌动蛋白的蛋白质在人类肺成纤维细胞gydF4y2Ba

(A)北部污点20μg每车道从控制和成纤维细胞中提取细胞总RNA刺激和0.4μg /毫升1μg /毫升骨桥蛋白。两种浓度的骨桥蛋白诱导的老年病α1 I型胶原蛋白的表达。gydF4y2Ba

(B)的骨桥蛋白免疫印迹显示没有影响免疫反应性的α平滑肌肌动蛋白。重组TGF-β1被用作积极控制。gydF4y2Ba

C、控制;OPN,骨桥蛋白。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g008gydF4y2Ba

骨桥蛋白表达增加MMP-7上皮细胞gydF4y2Ba

刺激A549细胞骨桥蛋白(0.4μg /毫升和2.0μg /毫升)诱导MMP-7基因表达的上调了北部的污点gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba答:实时PCR显示骨桥蛋白刺激后6 h倍增长,与anti-α废除的治疗gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba,anti-EGFR anti-CD44或GRGDS见gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba也证实了b Pro-MMP-7超表达的蛋白质免疫印迹分析水平的上皮细胞条件培养基(gydF4y2Ba图9gydF4y2BaC)。重组MMP-7用作控制显示低分子量乐队的条件培养基,这是对待APMA激活pro-MMP-7。酶原激活显示类似的重组蛋白分子量的乐队。Zymography使用CM-transferrin作为底物显示治疗A549的上皮细胞和0.4μg /毫升1μg /毫升骨桥蛋白诱导增加pro-MMP-7和MMP-7活动带(gydF4y2Ba图9gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图9。gydF4y2Ba骨桥蛋白对MMP-7基因和蛋白质表达的影响在A549上皮细胞和活动gydF4y2Ba

(一)北部污点20μg每车道提取细胞总RNA控制和A549细胞刺激为0.4,1,2μg /毫升骨桥蛋白。gydF4y2Ba

(B)微北部的污点和正常化MMP-7 18 s演示了一个3 - 4倍增加MMP-7控制权。gydF4y2Ba

(C)实时PCR显示老年病MMP-7表达式的骨桥蛋白(*gydF4y2BapgydF4y2Ba由anti-α< 0.01)和抑制gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba、anti-CD44 anti-EGFR, GRGDS。gydF4y2Ba

(D)免疫印迹显示增加免疫反应性的条件培养基中MMP-7 A549上皮细胞与骨桥蛋白刺激。激活的pro-MMP-7 APMA显示在左边的车道。gydF4y2Ba

(E) Zymography条件媒体12.5% SDS凝胶含有牛CM-transferrin(0.3毫克/毫升)和肝素作为底物。gydF4y2Ba

C、控制;OPN,骨桥蛋白。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g009gydF4y2Ba

骨桥蛋白与MMP-7 Colocalizes IPF肺的肺泡上皮细胞gydF4y2Ba

因为我们以前证明IPF肺强烈表达MMP-7肺泡上皮细胞(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),我们评估了这种酶的染色模式是否与骨桥蛋白有关。gydF4y2Ba图10gydF4y2Ba说明了共焦显微镜图像显示MMP-7 (gydF4y2Ba图10gydF4y2Ba与骨桥蛋白(A)部分重叠gydF4y2Ba图10gydF4y2BaB),给予实质性的双标记(gydF4y2Ba图10gydF4y2BaC和gydF4y2Ba10gydF4y2BaD)。正常肺并没有表现出任何重大染色MMP-7或骨桥蛋白(未公开的数据)。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图10。gydF4y2Ba骨桥蛋白和MMP-7 Colocalization IPF的肺gydF4y2Ba

(−C) MMP-7染色所示绿色(A),骨桥蛋白显示为红染色(B),和重叠的染色显示在黄色(C),建议colocalization MMP-7和骨桥蛋白在IPF肺的肺泡上皮细胞(60×)。gydF4y2Ba

(D) (20×) lower-magnification图像的同一地区(A - c),同样的颜色编码。白色的长方形描绘区域(−C)所示。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g010gydF4y2Ba

薄弱的环节模型识别统计上显著的骨桥蛋白和MMP-7之间的互动gydF4y2Ba

确定MMP-7和骨桥蛋白表达水平共同区分IPF和控制样本,我们应用薄弱的环节统计模型(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。薄弱的环节模型假设两个基因共同影响的概率随机选择样本属于某一表型(IPF)只有两个基因的表达水平躺在一个低维曲线的形式指定的模型和使用数据的观察分位数的估计。我们的分析检测到显著的联合效应MMP-7 IPF表型和骨桥蛋白(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)。这个关节关系中说明了gydF4y2Ba图11gydF4y2Ba的基因表达值(gydF4y2Ba图11gydF4y2Ba一)和样品百分位数(gydF4y2Ba图11gydF4y2BaB)。评估的相关性这个协会,我们选择实质上有意义的基因和基因更普遍的评价的贡献模型骨桥蛋白和MMP-7相关(最薄弱的一环gydF4y2Ba图11gydF4y2Ba)。在14个矩阵metalloproteases及其抑制剂代表人类联合装置我芯片,骨桥蛋白和MMP-7展出最重要的生物相互作用。骨桥蛋白也有显著的交互作用(弱链接模型gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)和金属蛋白酶- 1、MMP-2 MMP-11但没有MMP-7一样显著。我们也跑薄弱的环节模型相结合gydF4y2Ba骨桥蛋白gydF4y2Ba每400个基因的传递的错误发现率小于0.05 IPF之间的微分表达式和控制样品。之间的相互作用gydF4y2Ba骨桥蛋白gydF4y2Ba与MMP-7薄弱的环节模型比371 400个基因更重要。gydF4y2Ba

缩略图gydF4y2Ba
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图11。gydF4y2Ba骨桥蛋白和MMP-7薄弱的环节模型gydF4y2Ba

IPF样品中描述固体点和控制在开放点;y轴是MMP-7表达和轴是骨桥蛋白表达。黑色实线是最佳的曲线使用表明MMP-7和骨桥蛋白的表达水平共同决定IPF表型进行交互。概率等高线图所示的观察表达数据(规模log 2基因表达数据)(一个);和概率等高线图所示的百分位数的数据(规模是百分位数)(B)。gydF4y2Ba

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0020251.g011gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在目前的研究中我们集中在profibrotic骨桥蛋白的影响,一种多功能细胞因子介导不同的生物功能,包括细胞粘附、趋化性、和信号,以及说明组织修复的过程gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。我们表明,骨桥蛋白基因表达是最上调肺的IPF患者,这是主要由肺泡上皮细胞表达。为了更好地理解潜在的本地profibrotic骨桥蛋白的影响,我们研究了它对肺成纤维细胞和上皮细胞的影响。功能上,骨桥蛋白诱导成纤维细胞和上皮细胞增殖和迁移。对成纤维细胞迁移和增殖的影响主要是依赖蛋白在上皮细胞增殖主要是依赖CD44和迁移是依赖CD44和信号转导。骨桥蛋白表现出profibrotic对分子参与细胞外基质重塑的影响。因此,在成纤维细胞,骨桥蛋白增加TIMP-1和I型胶原蛋白和抑制金属蛋白酶- 1表达,在肺泡上皮细胞诱导MMP-7。对TIMP-1和金属蛋白酶- 1表达的影响似乎主要依赖CD44,而影响MMP-7表达依赖于CD44和信号转导。有趣的是,骨桥蛋白与MMP-7与IPF肺肺泡上皮细胞,和最薄弱的环节的应用模型的基因微阵列数据显示两个互动影响IPF表型。我们的研究结果提供了一个潜在的机制,骨桥蛋白分泌上皮细胞发挥其profibrotic通过直接影响信号成纤维细胞和上皮细胞。gydF4y2Ba

几项研究在实验组织纤维化可能建议profibrotic骨桥蛋白的作用。在肾脏纤维化,骨桥蛋白增强巨噬细胞招聘和刺激肾瘢痕的发展后急性缺血性侮辱(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。同样,骨桥蛋白表达增加心肌梗死后心肌,而缺乏这种中介与降低了胶原蛋白积累(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。同样,骨桥蛋白似乎是一个重要的调停人的心脏profibrotic血管紧张素ⅱ的影响通过促进胶原合成和间质心肌重构(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。在实验性肺纤维化有人建议,骨桥蛋白由肺泡巨噬细胞功能的纤维发生的细胞因子(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。肉芽肿性肺部疾病、骨桥蛋白也上调和它的主要来源是巨噬细胞和T淋巴细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。我们发现在人类IPF肺,增生的肺泡上皮细胞似乎骨桥蛋白的来源,这是符合伯曼的发现等。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。这些观察支持肺泡上皮细胞的关键作用的监管者肺profibrotic IPF的微环境,从而强调的关键区别机制相比,IPF纤维化动物模型或肺纤维化与炎症性疾病有关。gydF4y2Ba

正反馈机制之前提出了骨桥蛋白和MMP-2gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),骨桥蛋白诱发MMP-2表达式(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba和由MMP-2裂解并激活gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。相同的机制提出了骨桥蛋白和MMP-3,骨桥蛋白结合并激活MMP-3,进而可以分裂并激活它(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。同样,骨桥蛋白裂解和激活MMP-7 [gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),我们观察到MMP-7诱导的骨桥蛋白在上皮细胞,表明这种正反馈机制也适用于骨桥蛋白和MMP-7。这也是支持的colocalization MMP-7和骨桥蛋白在IPF上皮细胞和骨桥蛋白表达水平的计算关系,MMP-7。有趣的是,gydF4y2BaMMP-7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba骨桥蛋白gydF4y2Baβ-catenin目标基因(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。最近,Chilosi等人报道令人印象深刻的激活WNT /β-catenin IPF肺(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。他们主要观察β-catenin核本地化增生性细支气管病变,它与MMP-7 [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。总的来说,这些结果可能表明机制引起的骨桥蛋白和MMP-7 WNT /β-catenin通路的异常激活,并且每个影响其他基因的功能和表达,因此代表当地的正反馈机制,促进慢性,无情的肺部疾病。gydF4y2Ba

虽然有趣,但是这提出积极、自我循环本身无法解释胶原沉积增加,肝纤维化的重要标志。在这种背景下,我们的研究结果表明,骨桥蛋白影响的关键平衡基质金属蛋白酶及其抑制剂通过其特异性效应。同意的抑制白介素1β-stimulated MMP-2和MMP-9观察到谢et al。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),我们观察到在人类肺成纤维细胞,骨桥蛋白显著减少基线以及APMA-stimulated引起的金属蛋白酶- 1、MMP负责的纤维胶原蛋白降解。另外,我们观察到TIMP-1相应增加,金属蛋白酶- 1的主要抑制剂(以及MMP-2−9),并在gydF4y2BaI型胶原蛋白gydF4y2Ba基因表达,表明骨桥蛋白可能促进profibrotic环境不仅对上皮细胞的影响,还通过诱导nondegradative微环境和IPF相似的实验性肺纤维化(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。有趣的是,骨桥蛋白没有诱导α-smooth肌肉肌动蛋白在肺成纤维细胞体外,暗示,尽管它有一个作用在IPF profibrotic环境,它已经弱作用myofibroblast疫源地的形成。然而,需要进一步的实验来确定这一点。gydF4y2Ba

成纤维细胞的迁移和增殖至关重要的扩张人口和成纤维细胞的疫源地的形成,似乎代表进步纤维化过程的“前沿”(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。骨桥蛋白,诱导原代人肺成纤维细胞迁移和增殖表明,骨桥蛋白可能参与这个过程,支持以前的观测小鼠和人成纤维细胞的细胞系(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。骨桥蛋白促进成纤维细胞胶原凝胶收缩和大鼠心脏成纤维细胞增殖,它已经表明,它是一个重要的调停人的血管紧张素ⅱ监管心脏重塑过程中纤维母细胞的行为(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。它还诱导血管平滑肌细胞的增殖,表明它是参与血管重建在动脉粥样硬化的发展(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。这些结果强调了充分从肺泡上皮细胞分泌的细胞因子诱导的许多表型变化与肺纤维化有关。gydF4y2Ba

骨桥蛋白影响上皮细胞和成纤维细胞的机制尚未完全了解。一般来说它已经被绑定到提出,骨桥蛋白影响的细胞CD44亚型,某些蛋白和表皮生长因子受体(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。还不知道这些受体的表达在IPF改变;CD44表达对肺成纤维细胞和上皮细胞gydF4y2Ba43gydF4y2Ba),在辐射诱导和bleomycin-induced肺纤维化(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba和急性肺泡纤维化gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,是解决非传染性的肺部炎症的关键gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。骨桥蛋白的整合素受体广泛表达于肺上皮细胞和成纤维细胞(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),但他们的曲目的变化与IPF尚未报道。在本文中,我们不寻求完全解剖这些机制;然而,我们探讨一些可能的受体可能是重要的对成纤维细胞和上皮细胞骨桥蛋白的影响。我们的研究结果支持的一些以前的观测对integrin-mediated信号在成纤维细胞迁移的重要性。有趣的是,我们观察到一个微分效应在上皮细胞和成纤维细胞的细胞。CD44显著降低抑制上皮细胞的骨桥蛋白对细胞增殖的影响,而αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba3gydF4y2Ba抑制似乎主要是成纤维细胞的影响。这种整合素受体为各种细胞外基质配体暴露RGD序列,包括vitronectin、纤连蛋白、纤维蛋白原、血小板反应蛋白,proteolyzed胶原蛋白、血管性血友病因子,以及骨桥蛋白,似乎发挥重要作用在细胞迁移gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。透明质酸受体CD44也是一个骨桥蛋白受体,这已经涉及到趋化作用由中介(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。在我们的实验中,pan-integrin拮抗剂GRGDS-pentapeptide添加到培养基废除在成纤维细胞和上皮细胞的影响,表明不同的整合蛋白可能参与两种类型的细胞,这对于一些影响,整合蛋白和CD44是必需的。详细研究变异的影响骨桥蛋白表达不同受体亚型以及细胞需要阐明这些机制。gydF4y2Ba

我们的研究集中在人体组织和人类细胞系的特色IPF不易模仿的动物模型。我们坚持使用主要人类肺成纤维细胞实验;因此,我们相信,这些结果代表了一种机制,实际上可能发生在人类的肺。不幸的是,它几乎是不可能的使用主要的肺泡上皮细胞,我们不得不求助于上皮细胞系A549。然而,我们目前的证据来自人类肺部体外表明我们提出的机制确实存在在人类IPF肺。gydF4y2Ba

总之,在这项研究中,我们强调人类IPF骨桥蛋白的作用。尽管先前的研究表明,骨桥蛋白具有潜在profibrotic效果在肺纤维化动物模型,它的作用在人类IPF还不清楚。我们表明,骨桥蛋白是IPF肺中高度表达,表达的,它主要是增生性的肺泡上皮细胞。我们表明,骨桥蛋白纤维母细胞和上皮细胞增殖和迁移的影响,而且它有fibrosis-relevant影响MMP与TIMP表达式。我们的结果显示一个机制解释大多数profibrotic骨桥蛋白的效果直接影响肺成纤维细胞和上皮细胞。此外,我们的研究结果表明,在IPF MMP-7之间的交互和骨桥蛋白可能参与该病的不断进步的本质,并强调骨桥蛋白作为一个潜在的目标治疗不治之症。gydF4y2Ba

支持信息gydF4y2Ba

协议S1。gydF4y2Ba样本墨西哥gydF4y2Ba

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协议S2。gydF4y2Ba微阵列gydF4y2Ba

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(2.1 MB ZIP)。gydF4y2Ba

加入数据gydF4y2Ba

基因库(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba本文讨论的)加入数字基因gydF4y2Bar18gydF4y2Ba(X03205),gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba(NM_002421),gydF4y2BaMMP-7gydF4y2Ba(XM_017384),gydF4y2BaTIMP-1gydF4y2Ba(X03124)。gydF4y2Ba

病人总结gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

特发性肺纤维化是一种慢性进行性疾病的肺部,导致越来越多的疤痕组织的后续破坏肺。目前没有特效治疗。患者可能与糖皮质激素治疗或药物来抑制他们的免疫系统,尽管这些药物通常不是有效的。一些患者接受肺移植。gydF4y2Ba

为什么这样做研究?gydF4y2Ba

之前的研究工作表明,蛋白骨桥蛋白在小鼠肺纤维化和增加小鼠没有骨桥蛋白的基因不受肺纤维化。研究人员想要研究如果骨桥蛋白也参与了人类的疾病。gydF4y2Ba

研究人员做了什么,发现了什么?gydF4y2Ba

他们观察样本特发性肺纤维化患者的肺部和其他疾病并测量了许多基因表达。他们发现,骨桥蛋白增加在特发性肺纤维化患者的肺部。然后他们看着文化引起的肺细胞,发现骨桥蛋白的增加的数量和运动细胞参与肺纤维化。它的存在似乎也影响了其他蛋白质,参与纤维化。gydF4y2Ba

这些发现是什么意思?gydF4y2Ba

骨桥蛋白可能有关键作用的途径,导致肺纤维化发生的人与特发性肺纤维化。需要做进一步的工作来证实这些结果,但在未来药物针对骨桥蛋白或一个相关的蛋白质可能是一个可能的治疗这种疾病。目前还没有这样的药物。此外骨桥蛋白可能是有用的在疾病的诊断和早期检测,但还需要进一步的研究。gydF4y2Ba

我在哪里可以在网上获得更多的信息吗?gydF4y2Ba

Medline Plus疾病有许多页面的链接信息:gydF4y2Ba

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/pulmonaryfibrosis.htmlgydF4y2Ba

肺纤维化的联盟是一个非盈利组织,信息对病人和医生:gydF4y2Ba

http://www.coalitionforpf.org/gydF4y2Ba

多萝西·p·理查德·p·西蒙斯中心为间质性肺疾病包含IPF患者和他们的家庭信息:gydF4y2Ba

http://simmonscenterild.upmc.com/gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

Loutaev的作者希望承认去,劳拉Chensny威廉姆斯的技术帮助和玛丽对她帮助管理协作构成这个手稿。作者还要感谢a . Choi博士j .画匠博士和n·弗里德曼博士的评论和洞察力的评论。这项工作是支持美国国立卫生研究院的资助1 r01 HL073745-01慷慨的捐赠从西蒙斯的家庭。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

美联社,公斤,SY、虚拟现实、女士和NK设计研究。公斤,JC, TJR YY, CB, IH,虚拟现实,NK进行实验。美联社,公斤,JC, YY, SY, IH,虚拟现实,女士,NK分析数据。美联社,公斤,女士,NK登记的病人。美联社,公斤,女士,NK导致写作论文。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

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