促进α的实验室诊断₁抗胰蛋白酶缺乏症

文摘

α₁抗胰蛋白酶(AAT)不足导致恶化的肺是可以预防,诊断和治疗。等电点聚焦电泳(IEF)是当前生化检测AAT的黄金标准缺乏变异但涉及复杂的解释。变体AAT样本收集在两年的时间里。稳定AAT的表型测定评估在全血、血清干血滴,干点。纲要显示13常见和5罕见AAT表型,并详细描述如何识别方法AAT条带模式和解释一个罕见的表现型陪同这些视觉数据。AAT稳定能源论坛的合作,表型分析至少1周在24小时全血和血清干点。总之,参考纲要已知AAT的表型可以作为资源成立解释AAT表型。

α₁抗胰蛋白酶(AAT)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)总科。中性粒细胞弹性蛋白酶的主要基质AAT, broad-specificity丝氨酸蛋白酶分泌期间被中性粒细胞炎症。^1,2AAT由肝脏合成和分泌和功能主要在肺部,地方保护肺组织中性粒细胞弹性蛋白酶降解。AAT的缺乏导致性乱交的中性粒细胞弹性蛋白酶的活性,导致早发性肺气肿和慢性阻塞性肺疾病。此外,特定AAT变体可以聚集在肝细胞,导致肝细胞死亡和肝脏疾病。肺部症状通常出现在第四或第五个十年;肝损伤可以发生在任何年龄,包括新生儿。^3,4

流行病学,AAT缺乏症是一种常染色体共显性的遗传疾病¹相对比较常见(大约1/3,000个人)经常不被识别。^5,6据估计,仅在美国,大约有100000人有严重的缺AAT,但少于10000诊断和正在接受治疗。^7,8此外,AAT-deficient可能症状的患者数年之前和/或看到多个医生诊断。患病率和之间的差距对病人护理诊断有明显影响,适当的治疗可降低死亡率。^5,8,9此外,国家支持团体可以帮助缓解心理压力与诊断。

的SERPINA1AAT蛋白编码基因是高度多态,有超过100等位基因识别在文献中。¹这些等位基因产生的蛋白质变异的传统命名前缀π(蛋白酶抑制剂),其次是资本罗马字母被蛋白质迁移模式的等电点聚焦电泳(IEF)凝胶。加以最阳极的迁移变体,这款是最阴极的迁徙的变体。许多这些变异在临床上是良性的,导致正常AAT表达和功能。最常见的nondeficiency PiM的野生型等位基因编码蛋白变体。大约97%的人口是这等位基因纯合子。¹⁰其他AAT变异可能产生有害的影响通过降低肺的保护涂层和/或肝细胞合成。最常见的AAT不足为π和这款蛋白质变异等位基因代码。

确诊AAT的缺乏是最常在临床实验室使用的组合完成生化和/或基因测试。^{6,11 - 14号}这些包括量化AAT在血清蛋白浓度,确定AAT表型,和/或基因型检测来识别特定AAT等位基因。血清AAT浓度低敏感性检测一个AAT缺乏症。^15,16AAT表型能源论坛由合作电泳是goldstandard测试识别AAT变体。基因型检测,通常用来确定个人与π或这等位基因,通过DNA扩增技术实现与使用福斯特melt-curve分析共振能量转移探测特定基因突变所在的区域。¹²算法提出了整合这些3测试。^17,18

IEF电泳是最常用的方法来明确检测存在一个AAT表型使病人AAT不足的风险。因为不同的变异AAT可能在临床实验室中遇到,需要客观指导协助实验室工作人员正确地识别AAT表型。在这里,我们提出一个纲要显示和描述13常见和5罕见AAT表型。此外,我们描述一个过程来帮助识别AAT变异模式的观察到电泳。此外,我们评估的稳定性AAT在全血进行表型分析和解释的能力AAT表型从标本中提取干血滴(DBS)和血清分离器卡片。在一起,这些数据将促进缺AAT的生化研究。

材料和方法

样品

AAT表型的纲要,我们选择了18个剩余血清样本送到奥雅纳实验室(AAT盐湖城,UT)定量和表型测试2007年1月至2011年1月。AAT表型的18个样本代表大约98%的表型观察到实验室,包括13个常见和5罕见AAT表型。所有的标本都在使用前消除识别信息。这个研究是犹他大学的机构审查委员会批准。

评估AAT稳定,11分离管的新鲜全血(大约1毫升/管)收集从2显然健康个体(皮姆表型),存储在环境温度(21°C)或4°C 0到168个小时,和分析如下所述。EDTA-anticoagulated全血样品之一从一个个体(PiMZ表型)储存在4°C 12天前使用AAT稳定性研究。44 EDTA-anticoagulated AAT表型遗传样品发送到我们的实验室/基因型测试选择评估样品的稳定性获得干血滴和血清分离器卡片。

AAT表型

能源论坛AAT表型测定合作电泳使用唯一的食品和药物管理局(FDA)——清除商用设备根据制造商的指示(Hydragel A1AT Isofocusing;Sebia公司,诺GA)。样本应用于0.1%的琼脂糖凝胶(pH值4.2 - -4.9),和电泳进行45分钟20°C使用700 - 1000 V。AAT乐队可视化使用peroxidase-conjugated AAT-antiserum后产生色素添加酸性过氧化氢二甲基甲酰胺。AAT表型是由视觉检查和比较已知的模式。

AAT浓度

血清或血浆AAT量化使用immunoturbidimetric试验在罗氏模块化分析P仪器(罗氏诊断,印第安纳波利斯)使用制造商的指示。

AAT在全血的稳定

一管皮姆个体的全血离心后立即凝结的示例。结果血清冻结在-20°C被评估为零的时间(T₀)时间点。剩下的10个管的全血,5是存储在环境温度和5是储存在4°C为7天。连续4天,1管的全血保存在每个温度是离心机,以及由此产生的血清是储存在-20°C;最后一个样本处理同样后7天。毕竟时间点完成,AAT表型测定血清标本。

PiMZ表型的稳定是由12-day-old EDTA-anticoagulated遗传标本被储存在4°C。从这个标本,获得了等离子体及其AAT表型是评估。

提取AAT的干血滴和血清分离器卡片

从个人与皮姆(n = 10), (n = 3) pim和PiMZ (n = 5)我们获得700μL EDTA-anticoagulated全血和应用它来绘画纸纸(DBS)或血清分离器的名片。血清分离器卡使用专有专利技术论文保持红细胞在应用程序点但是允许迁移的血清或血浆中通过。这个卡片的创建一个区域,包含干血清或血浆。卡仍然静止24至48小时前删除6毫米的纸圈使用标准1-hole拳。评估使用血清表型的稳定分析分离器卡片,我们一直卡在适当环境温度,直到其时间点(21天)要删除。6毫米的纸圈是放置在一个96 - 75微量滴定板和孵化μL蒸馏水一夜之间在环境温度(16小时)。根据实验,AAT表型测试从提取的样本是立即执行或样本存储在-20°C,直到进行电泳。

此外,26 EDTA-anticoagulated遗传损伤样本代表各种AAT表型被用来评估的能力来解释各种表型使用血清分离器卡片。其中,4是省略了从分析因为过度溶血不可能确定AAT表型。样本应用于血清分离器卡片1个人(D.N.G.)没有蒙蔽AAT表型。第二个人(M.C.E.-J)被蒙蔽AAT表型提取完成,电泳,,AAT表型的解释。

结果

AAT纲要

AAT的命名源自共同的M,年代,和Z变异和罕见的变体。F被任命为其快速迁移(阳极的),其次是M为中产,缓慢的年代,Z泽塔(去年)。额外变量命名按字母顺序根据他们如何迁移相对于这四个变体。有一些例外模式(下面讨论)。

每个变量都有多个乐队与其表型关联模式图1。这是通常被称为主要和次要的乐队。比小乐队主要乐队染色深。他们被称为系统和数字字母的变体后跟2(最阳极的),4、6、7、8(大多数阴极的)。乐队2 7和8的小乐队,和4和6大乐队。尽管M2似乎是黑色染色图1这个乐队的强度的个人间的变化是相当大的(图1,通道1和5),因此M2被认为是一个小乐队。

当评估一个AAT表型,审稿人应该首先确定主要乐队和他们的移民相对于M乐队(图1巷1),M变体有3个主要的亚型称为M₁,米₂,米₃(图1道9和10)。虽然没有临床需要区分这些亚型,重要的是要理解他们的迁移模式。M₁和M₂主要乐队迁移相同,所以必须使用小乐队来区分它们。米₃M之间的迁移₁和M₂,只能确定如果是放置在一个车道旁边一个M₁米₂样本。D(变种图1巷3)迁移同样的M变体;然而,D变异没有小乐队,乐队错开略阳极的相对于M乐队。自D变异不缺对应一个等位基因,¹⁵误分类的D M应该没有临床后果。

识别和Z迁移模式也积分检测的许多其他变体。S变异是一个缺常见变体(图1,莱茵12)。¹年代主要乐队阳极的迁移到M6和阴极的M7。一般来说,主要乐队不会从M6得到解决,但将从M7得到解决。S8小乐队通常可以轻松可视化阴极的地区的凝胶。Z等位基因编码了AAT的最有害的变异。AAT蛋白浓度与Z变异个体往往很低,小乐队不能可视化。主要的乐队是可见的,虽然有时微弱,只是阴极的迁移到M小乐队(图1,莱茵17)。杂合的Z病人所示图1污渍的表型特征。然而,重要的是要记住的参考区间纯合子Z样本小于或等于29至52 ng / mL,¹⁸这意味着可能会有一个2倍变化这些个体的表达水平,从而直接影响染色的强度。

护理应采取正确识别变异可以容易混淆的年代或z T变体(图1巷13)迁移几乎相同的变体。区分这些变异是很重要的,因为,2变种,只有相关的变体是一贯AAT缺乏症。T变体尚未与AAT缺乏直接相关,但1研究还显示,相对于M表型,意味着AAT浓度从T个体略有下降。¹⁵T7和S7 T8错开S8, T乐队稍微阴极的迁移。E变异S变异也可以混淆,因为他们的小乐队相同迁移到年代主要乐队(图1;比较巷4车道6 - 12)。E变体可以区分主要E4和E6乐队迁移阴极的M2和M4乐队。此外,主要乐队更明显的相对于E小乐队。E与变异,变异不与AAT不足有关。¹⁵类似地,N变量可以被误认为是Z的变种,因为N8小乐队几乎相同的迁移到Z主要乐队(图1,莱茵16)。区分Z和N变异,每个人都应该找到N主要乐队,这将显示为杂合的MN个人的紧身上衣。一般来说,直接迁移的N变体1主要乐队M4和M6和第二大乐队之间直接M7和M6之间迁移。一些N变异阳极的迁移到指定的中点,如图所示图1,巷16所示。在新西兰的个人(没有显示),Z主要乐队会稍微解决从N小乐队。评价总AAT的浓度是重要的评价当一个N之间的歧视和Z带型;总AAT N的浓度标本应高于Z标本表1。¹⁵此外,Z乐队几乎含糊地迁移到Y乐队(图1巷15),但总AAT浓度应该解决之间的任何混乱2乐队,作为AAT Y运营商应该参考区间内浓度(表1)。

术语识别变异时也会引起混乱。例如,Z_普拉特变异是由nondeficiency等位基因编码。它迁移最阴极的所有的变异(图1,莱茵18),但直到1980年才发现的,这是在传统的术语已经建立和Z缺乏等位基因已经命名的。¹⁹Z的迁移模式_普拉特变异是截然不同的,与乐队迁移与Z相比更多的阴极的变体。与Z乐队相比,Z_普拉特乐队是点状的和不同的,对应于一个正常的AAT的浓度。

某些变异将迁移相同但不能假定AAT浓度相似。这是G的变体,具有相同的迁移模式和只能明确区分使用基因型分析。G变异(图1巷5)主要乐队G4和G6并列和阳极的阴极的M4的乐队,分别和G小调乐队经常缺席。我变异(图1,莱茵6)相同迁移到G变异,但G变异通常染色深由于更高浓度的AAT (表1)。尽管困难,重要的是要区分G和我不同,因为后者与AAT缺陷有关,而前者则不是。^15,20.

确定AAT浓度通常是诊断缺乏AAT的一个基本组成部分。然而,F变体是一个缺乏等位基因表达在浓度参考区间内,但催化活性下降。²¹F变量(图1巷7)显示一个明显的双重模式。一组对比出现M2和M4乐队之间,和其他组M4和M6乐队之间出现。相比之下,AAT尤为重要,当评估一个P浓度变异(图1,巷11)因为这些变异与正常和缺陷AAT等位基因相关联。²²多个P变体有稍微不同的迁移模式,但是他们的定义特征是P4乐队,迁移阳极的M6乐队。P7乐队将与小comigrate M7乐队在一个像素的杂合子,因此,这个乐队将似乎是一个主要的乐队。不应被误认为是L P变体变体(图1巷8),L和P变体有非常相似的迁徙模式2例外。首先,

L具有明显的变体主要带迁移只是阳极的M4乐队。这个乐队不在P变体。第二,LM杂合子,M7的地级乐队解决乐队,他们在国会议员comigrate杂合子。其余2变种见这个纲要不缺导致AAT,¹⁵和他们的迁徙模式遵循传统的术语。C的变体(图1巷2)主要乐队C4和C6并列和阳极的阴极的M2的乐队,分别。C的变体也有一个小乐队,C2,阳极的迁移到C4大乐队。相对应的乐队X变体所有阴极的迁移到M乐队,与主要的X乐队迁移以及M小乐队(图1,莱茵14)。

AAT在全血的稳定

我们评估的稳定性AAT皮姆表型在全血收集没有防腐剂和存储环境(21°C)和冷藏(4°C)的温度超过7天图片2。没有变化在AAT的迁移从样品储存在温度在这个时期。评估缺乏稳定性的变体,我们能源论坛进行合作,电泳12-day-old遗传损伤样本来自PiMZ杂合子图2 b。类似与皮姆表型观察,PiMZ模式仍然在这个长时间点很容易地辨认出。

分析和AAT的稳定使用干血滴和血清分离器卡片

先前AAT表现型能源论坛等方式合作,电泳,紧随其后的是银染色或免疫印迹检测,是适应分析从星展银行提取后。²³然而,AAT表现型使用DBS从未报道使用AAT的电泳和免疫化学检测。纯合子的野生型个体(皮姆)很容易识别从星展银行提取后图片3(巷3)。相比之下,缺乏运营商(MZ)出现的表型皮姆因为Z乐队没有检测到(图片3,莱茵5)。为了使用类似但更清洁的矩阵,我们从血清中提取AAT分离器卡片。样品从血清分离器卡获得了允许Z的正确识别缺陷变体(图片3,莱茵6)。然而,Z表型可以正确解释只有1天发现全血到血清分离器卡。M变异稳定在所有时期的血清分离器卡测试(21天;数据未显示)。

血清分离器卡识别精度各种AAT表型

22个遗传损伤样本与已知AAT表型和AAT蛋白浓度被发现在血清分离器卡片表2。个体(M.C.E.-J)盲已知表型提取血清,能源论坛进行合作,电泳,AAT表型决定。22日的结果,只有1 MZ表型被错误地解读为一种毫米(表2)。发生溶血标本对无法解释的表型出现结果(数据未显示)。

讨论

AAT的诊断不足在很大程度上依赖于临床实验室。AAT表型测试能源论坛的合作,电泳区分AAT的生化黄金标准变体。然而,AAT的解释表型是复杂的。在这项工作中,我们已经创建了一个解释指南协助实验室工作人员几个AAT表型的鉴定。这个纲要说明了超过98%的表型在实验室遇到的,其中包括13个常见和5罕见变异。支持这种表型频率估计最近两项研究,回顾了大型临床人群的患病率和相关的血清蛋白浓度AAT变异表型。^15,16尽管我们努力使这个纲要全面,有可能遇到一个变体,我们没有描述。额外的表型不说明在这个纲要,如PiV和尿,可以找到原始引用记录方法用于这项研究。²⁴此外,它可能是必要的SERPINA1基因测序对小说AAT表型进行分类²⁵或者解决一个基因型和表现型差异。²⁶

有两个关于AAT表型测试preanalytical误差的重要来源。第一,治疗AAT缺陷包括静脉注射重组AAT管理局(皮姆)。这变种将标本中发现从个人接受治疗和可能导致不可能获得AAT表型模式(例如,一个人一个明显的表型PiMSZ)或一个不正确的表现型任务(如一个拨弦个体出现PiMZ)。尽管通常没有临床需要执行AAT表型测试与已知AAT缺乏对个人,接受替代疗法,偶尔这样的样品提交给实验室phe-notype测试,大概在错误。同样,另一个错误发生在那些最近被输血与含有血浆的血液制品,AAT表型的捐赠也可以检测到。

AAT缺乏适合的标准世界卫生组织定义的疾病筛查。²⁷例如,它是一种比较常见的疾病是可以治疗的,通常有一个潜伏阶段的疾病,并有一个测试来检测条件。不幸的是,据估计,只有不到10%的患者严重缺乏诊断。²⁸因此,广泛筛选可能是合理的和测试可能更广泛使用如果DBS或血清分离器卡片样品可以使用。其他显示DBS的效用AAT基因型分析。^14,29日星展银行也被用来确定AAT表型之前用电泳的方法。²³我们的工作表明,星展银行是一个不足的样本类型AAT表型测定使用唯一的fda AAT表型测定方法(Hydragel A1AT Isofocusing;Sebia)。使用星展银行不允许Z变异的检测,即使卡是新鲜的血渍。相比之下,血清分离器的使用卡片允许Z乐队时发现分析是在24小时内完成样本收集,但检测Z乐队在之后的时间点明显下降。鉴于DBS的效用或血清分离器牌在于屏幕数量的能力,无法检测出缺陷变异只有24小时后表明,这个矩阵是不够的。这些结果令人不安,因为美国制药公司目前营销DBS的使用,免费的,作为一个筛选AAT缺乏足够的方法。^30.

使用毛细管的遗传损伤样本是一个有吸引力的替代DBS和血清分离器卡样品,虽然在全血AAT的稳定性还没有报道。我们这里显示PiM和这款变异稳定全血至少14天,这表明毛细管样品可以满足人口筛查。然而,应该注意的是,使用全血能源论坛的矩阵合作会导致AAT乐队更有小点的相对比较血清样本。自从AAT的解释表型已经是复杂的,它可能是有问题的实现分析全血或毛细管样品。进一步的研究关于AAT变异稳定全血和替代样本类型,如星展银行和血清分离器卡片,是必需的。

总之,这项工作为临床实验室提供了基本的信息评估AAT表型。这是通过第一次创建一个参考指南AAT表型解释和第二个通过评估表型稳定在不同样本矩阵。目前,没有其他出版物,在教科书或科学文献,提供了这样一个综合评价AAT的表型。结合,这项工作将促进实验室在AAT缺陷的正确诊断中的作用。

CME /山姆

引用

作者指出