细胞色素P450 25-羟基维生素D3.-1α-羟化酶(CYP27b1)通过催化活性1,25-二羟基维生素D的合成,在维生素D生理过程中起关键作用3.(1,25 (OH)2D3.].与其他p450一样,已知CYP27b1具有选择性剪接。在这里,我们克隆并测序了1,25(OH)中CYP27b1的几种含有内含子2的非编码剪接变体mrna2D3.产生人近端小管的HKC-8和THP-1单核细胞。1,25(OH)的调节2D3.在这些细胞系中,促钙性和非促钙性因子的合成与CYP27b1剪接变异的表达改变有关。为了评估其功能意义,我们用短发夹RNA (shRNA)转染HKC-8细胞,以抑制含有内含子2序列的mrna。这导致了CYP27b1蛋白表达和1,25(OH)合成的显著增加。2D3.与对照细胞相比,两种不同的含内含子2的shRNAs(两者都P< 0.001)。shRNA到内含子2对野生型CYP27b1 mRNA水平无显著影响,提示其作用的转录后机制。相比之下,野生型CYP27b1的shRNA抑制酶的转录和活性分别为70%和31%P< 0.01)。这些数据表明,CYP27b1的非编码剪接变体具有功能活性,可能在1,25(OH)的调控中发挥重要作用。2D3.正常生理过程中的合成。
维生素D的活性形式,1,25-二羟基维生素D3.(1,25 (OH)2D3.]是一种多能的seco-类固醇,与多种生理功能的调节有关(1,2).然而,尽管1,25(OH)有许多有益的作用,2D3.也可能产生有害的高钙副作用时,出现过量(3.).鉴于亲本维生素D及其主要循环代谢物25-羟基维生素D的循环水平,这一点尤为重要3.(25 ohd3.)在个体中差异很大,这取决于营养限制和皮肤暴露在阳光下的水平(皮肤内产生维生素D所必需的)(4).防止1,25(OH)的过量生产2D3.,存在一个复杂的反馈调节系统,包括代谢和分解代谢途径(5).1,25(OH)的内分泌合成2D3.主要发生在肾脏近端小管细胞中,这一过程是由线粒体细胞色素P450, 25-羟基维生素D催化的3.-1α-羟化酶(CYP27b1) (6,7).25OHD前体的肾脏代谢3.1,25 (OH)2D3.受甲状旁腺素和降钙素等促钙化因子刺激(8,9),但也受制于1,25(OH)的反馈调节2D3.细胞外钙、磷酸盐和相关因子(10- - - - - -13).除了直接调节CYP27b1的表达,循环1,25(OH)水平2D3.也被相关的线粒体细胞色素P450维生素D-24-羟化酶(CYP24)减弱,该酶催化合成活性较低的24-羟化维生素D代谢物(14).与CYP27b1相反,1,25(OH)能有效诱导CYP24的转录。2D3.,强调其作为1,25(OH)反馈调节机制的一部分的重要性。2D3.定向信号(15,16).
1,25(OH)的调节2D3.多水平的维生素D生产在肾脏内分泌学中起着关键作用,因此,在正常生理状态下,循环底物25OHD水平之间没有明显的相关性3.产物1,25(OH)2D3.(17).然而,CYP27b1和CYP24代谢活性的整合也可能是1,25(OH)非经典方面的关键决定因素。2D3.函数。例如1,25(OH)的合成增加2D3.肉芽肿性疾病患者也出现了伴随的高钙血症/高钙血症并发症(18)及一些肿瘤(19,20.).以类似的方式,在乳腺肿瘤中也描述了CYP24的表达失调,这可能是癌细胞对1,25(OH)的抗增殖作用产生明显抗性的关键因素。2D3.(21,22).CYP27b1/CYP24代谢活性的改变和许多组织对1,25(OH)的高度敏感的维生素D受体定向反应2D3.表明我们对维生素D代谢调节机制的理解还远远不够完整。
在最近的研究中,我们发现了CYP24的剪接变体,它在巨噬细胞中大量表达,并编码了这种酶的氨基末端截断但有功能的版本(23).尽管这种CYP24变体不能与线粒体结合,但它能更有效地抑制1,25(OH)的合成。2D3.可能是作为CYP24/CYP27b1底物的胞质诱饵。其他研究小组报道了正常细胞和癌细胞中CYP27b1剪接变体的差异表达(24- - - - - -28),表明基因剪接在1,25(OH)的组织特异性调控中的作用。2D3.生产。为了进一步研究这一点,我们评估了CYP27b1含内含子剪接变体对1,25(OH)合成的调控和功能影响。2D3.由人的肾细胞和非肾细胞。
材料与方法
试剂
无标号1,25 (OH)2D3.和25-OHD3.从Biomol(普利茅斯会议,宾夕法尼亚州)购买。[3.H] 25 ohd3.(比活性,187 Ci/mmol)和[3.H] 1,25 (OH)2D3.(179 Ci/mmol)购自GE Healthcare Biosciences (Piscataway, NJ)。CaCl2和13-乙酸十四烷酰磷酯(TPA)从西格玛(St. Louis, MO)获得。
细胞培养
HKC-8人近端肾小管细胞系,已知能合成1,25(OH)2D3.(10),在添加5%胎牛血清(FCS)的DMEM/F-12培养基中维持。THP-1人单核细胞细胞在添加10% FCS的RPMI 1640培养基中培养。细胞处理包括增加细胞外钙浓度(2 m米CaCl2与1米相比米对照培养基中的钙),1,25(OH)2D3.(100 n米), 25 ohd3.(200 n米)和TPA (160 n米).
CYP27b1野生型和剪接变异转录本的分析
使用RNAeasy试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从HKC-8和THP-1细胞中提取总RNA。RT使用5 μg总RNA和PowerScript逆转录酶(Clontech, Palo Alto, CA)进行。为了确保只有mRNA序列被反向转录,oligo-dT16作为RT引物。然后将得到的cDNA作为模板用于后续的PCR反应,所用引物的组合在表1.用于特定实验的引物定义在各自图的图例中。按照指示,采用一步法或两步法进行cdna PCR反应扩增。一步法包括:1个94℃(2分钟)循环;10个循环,94℃(5秒),62℃(10秒),72℃(2分钟);12个周期94℃(5秒),68℃(10秒,每周期着陆−0.5℃),72℃(2分钟);25个周期,94℃(5秒),68℃(30秒),72℃(2分钟)。
底漆细节(5 ' -3 '). | CYP27b1基因定位(bp). |
---|---|
内含子2,ACT CAA GTT ACC CGG GAA CC | 1731 - 1750 |
内含子2(1),GGC AGG AAA TGA GTA AAG AGG AA | 1763 - 1785 |
内含子2(2),TGC AGG TTT CCGTAC CCC AA | 1813 - 1832 |
内含子2(3),AGA CGC AAT CCC TCT CCT G | 1839 - 1857 |
外显子9,GGG TGA TGA TGA CAG TCT | 4336 - 4319 |
外显子9(1),GG TGA TGA TGA CAG TCTCTTTCCATG | 4335 - 4310 |
外显子8(1),TAC AGC TGC GCT TGC CAA AGC CAA | 3790 - 3767 |
外显子7(1),CAC CCA CAT GAA TGT CTT TGT CT | 3330 - 3308 |
外显子6,GTGATCTCTGAGTGGAGTGCTGTC | 2977 - 2954 |
外显子4,TGTGGGCTCGGTGTTTGTG | 2319 - 2337 |
底漆细节(5 ' -3 '). | CYP27b1基因定位(bp). |
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内含子2,ACT CAA GTT ACC CGG GAA CC | 1731 - 1750 |
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内含子2(3),AGA CGC AAT CCC TCT CCT G | 1839 - 1857 |
外显子9,GGG TGA TGA TGA CAG TCT | 4336 - 4319 |
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外显子6,GTGATCTCTGAGTGGAGTGCTGTC | 2977 - 2954 |
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底漆细节(5 ' -3 '). | CYP27b1基因定位(bp). |
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内含子2,ACT CAA GTT ACC CGG GAA CC | 1731 - 1750 |
内含子2(1),GGC AGG AAA TGA GTA AAG AGG AA | 1763 - 1785 |
内含子2(2),TGC AGG TTT CCGTAC CCC AA | 1813 - 1832 |
内含子2(3),AGA CGC AAT CCC TCT CCT G | 1839 - 1857 |
外显子9,GGG TGA TGA TGA CAG TCT | 4336 - 4319 |
外显子9(1),GG TGA TGA TGA CAG TCTCTTTCCATG | 4335 - 4310 |
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外显子4,TGTGGGCTCGGTGTTTGTG | 2319 - 2337 |
底漆细节(5 ' -3 '). | CYP27b1基因定位(bp). |
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内含子2,ACT CAA GTT ACC CGG GAA CC | 1731 - 1750 |
内含子2(1),GGC AGG AAA TGA GTA AAG AGG AA | 1763 - 1785 |
内含子2(2),TGC AGG TTT CCGTAC CCC AA | 1813 - 1832 |
内含子2(3),AGA CGC AAT CCC TCT CCT G | 1839 - 1857 |
外显子9,GGG TGA TGA TGA CAG TCT | 4336 - 4319 |
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外显子8(1),TAC AGC TGC GCT TGC CAA AGC CAA | 3790 - 3767 |
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外显子6,GTGATCTCTGAGTGGAGTGCTGTC | 2977 - 2954 |
外显子4,TGTGGGCTCGGTGTTTGTG | 2319 - 2337 |
两步处理方案包括:1个94℃(2分钟)循环;12个周期,94℃(5秒),68℃(10秒,每周期着陆- 0.5℃),72℃(2分钟)。在此之后,从每个反应中提取纯化的PCR产物(1 μl或原反应混合物的1/10至1/25)作为模板,使用新试剂和巢式PCR引物进行进一步扩增。第二轮扩增包括:1个周期94 C(2分钟);37个周期,94℃(5秒),68℃(30秒),72℃(2分钟)。
含CYP27b1内含子2的剪接变异构体mrna的克隆与测序
PCR产物在1%琼脂糖凝胶上分离,特异性条带被切除和提取,并使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)将得到的DNA克隆到pCR4-TOPO载体上。序列分析由Sequetech公司(Mountain View, CA)使用引物到T3.或T7克隆载体内的站点。
制备短发夹rna (shRNAs)沉默的CYP27b1内含子剪接变体
使用MessageMuter shRNA Production kit (EPICENTRE, Madison, WI)合成了对应于CYP27b1基因内含子2和外显子2区域的shRNA,并针对以下DNA序列:内含子2。i, 5 ' -GGC AGG AAA TGA GTA AAG AGG AA(CYP27b1 1763-1785);基因内区2。ii, 5 ' -GGA TCT GGA TGG AAT GAA TGT (CYP27b1的1699-1719);外显子2,5 ' -GGT GTG GCT AGC CAG CTT T (CYP27b1基因的1276-1294);和紧急控制,5 ' -ACG AGA - GAG AGA - GAG。
短暂转染CYP27b1和CYP27b1剪接变体的shRNAs
转染前1 d,将HKC-8细胞置于12孔板中培养至60%汇合。然后将每个shRNA通过lipofection (LipoTAXI;Stratagene, La Jolla, CA)以2 μg/孔的浓度培养,然后再培养72 h,以促进shRNA的最大抑制效果。
25OHD分析3.代谢的HKC-8和THP-1细胞
1,25(OH)的合成2D3.由HKC-8和THP-1细胞首先通过量化25OHD的转换进行评估3.1,25 (OH)2D3.这些细胞的无血清培养。每次测定50 n米[3.H] 25 ohd3.在200 μl无血清培养液中加入(GE Healthcare Biosciences), 37℃孵育5 h,−20℃冷冻终止反应,用加入的乙腈(1:1)初步沉淀这些样品中的蛋白质。然后,根据制造商(DiaSorin, Stillwater, MN)的说明,在C18-OH柱上洗脱,从反应混合物中提取维生素D代谢物。将得到的洗脱液重新悬浮在25 μl的洗脱溶剂正己烷/甲醇/异丙醇(90:5:5)中,旋动15秒,然后使用Beckman Coulter(富勒顿,加州)System Gold系统和安哲伦科技(帕洛阿尔托,加州)Zobax Sil正相色谱柱,以1.5 ml/min的速度洗脱20分钟,分离单个代谢物3.24岁25 (OH)2D3.1,25(OH)2D3.]在264 nm处用紫外吸光度测定。[代谢物的洗脱3.H] 25 ohd3.使用β-Ram Model 4流内检测器(IN/US Systems, Tampa, FL)与Ultima-Flo M闪烁液(PerkinElmer, Boston, MA)以2:1的比例进行评估,停留时间为5秒,以指定数据收集增量。Lauralite 3软件(LabLogic, Sheffield, UK)用于定量25OHD对应的放射性峰值3.24岁25 (OH)2D3.,或1,25(OH)2D3..数据报告为平均值±sdn = 3次单独孵育后每小时每毫克细胞蛋白合成的飞瘤代谢物。1,25(OH)的分析2D3.细胞在与shRNA构建物孵育后,使用25OHD进行生产3.(200 n米)作为底物,在含2% FCS的培养基中反应4小时。加入乙腈终止反应,细胞和培养基均提取1,25(OH)2D3.使用1,25(OH)进行定量2D3.IRA试剂盒(DiaSorin)。数据报告为平均值±sdpg 1,25 (OH)2D3.每105细胞(n = 4个单独试验)。
野生型CYP27b1基因表达的定量PCR分析
如前所述,使用ABI 7700序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)量化野生型CYP27b1 mRNA的表达(29).每次反应大约使用50 ng cDNA。所有的反应都与管家基因18S rRNA进行多路复用,作为用VIC荧光色素标记的优化对照探针(Applied Biosystems)提供,使数据能够根据内部参考数据进行表达,以考虑取样的差异。用五羧基荧光素标记CYP27b1荧光探针。数据以Ct值(对数PCR图越过计算阈值线的周期数)获得,并用于确定ΔCt值(目标基因Ct -管家基因Ct, 18S rRNA)。所有反应均重复进行,并表示为这些值的平均值。PCR扩增CYP27B1利用Taqman基因表达试验Hs01096149 (Applied Biosystems)进行cDNA分析,该方法使用探针和引物到外显子3和4的边界。cdna在以下条件下扩增:50℃,2分钟;95℃保温10分钟;接着进行44个循环,95℃持续15秒,60℃持续1分钟。
统计数据
当提示时,使用未配对的学生的实验均值进行统计比较t测试。
结果
我们之前已经证明,维生素D分解代谢酶CYP24的基因被交替拼接,导致包括含有内含子2的转录本在内的变异mrna的表达,该转录本编码一个截断的CYP24肽(23).我们假设类似的剪接变体可能也与相关的维生素d激活酶CYP27b1有关。为了验证这一点,我们使用了人类近端小管细胞系HKC-8,一种具有良好特征的CYP27b1表达和活性的肾脏来源。最初的RT-PCR分析使用来自这些细胞的oligo- dt来源的mRNA和PCR引物定向到野生型CYP27b1基因产物的C端和内含子2内的序列(图1)证实非经典PCR产物的存在。然而,与野生型CYP27b1的mRNA相比,这些假定的新转录本的表达水平相对较低(在使用引物对和PCR条件下,未处理的HKC-8细胞中<10%的总转录本图1).为了回收足够的产物用于序列分析,我们开发了一种两阶段PCR扩增方案,包括嵌套引物对(图2一个).这产生了一系列PCR产物,每个产物都包含内含子2的片段(图2 b).
建立了这些协议后,我们的目标是识别和克隆与1,25(OH)的调控合成相关的序列特异性的新型内含子mrna。2D3.在HKC-8细胞。细胞外高钙(2 m)处理6 h后,从HKC-8细胞中分离RNA米), 1,25 (OH)2D3.(100 n米),或25OHD3.(200 n米).用引物插入2(3.)和外显子9(1)表明,每一种不同的处理都产生了不同的替代转录本模式,而对野生型CYP27b1的表达没有任何显著影响(图3).在这个实验中扩增的6个物种中有5个(称为SV)1对SV5)克隆并测序,其cDNA长度与原PCR产物一致。剩余的PCR产物没有产生与原PCR产物长度一致的克隆产物,因此该cDNA没有被纳入其他研究(数据未显示)。维生素D代谢分析表明,高钙1,25(OH)处理2D3.和25OHD3.对25OHD有明显影响3.HKC-8细胞的新陈代谢(图3 b).具体来说,高(2米)米)细胞外钙浓度被抑制1,25(OH)2D3.但对CYP27b1 mRNA表达和CYP24活性均无影响。用1,25(OH)处理的细胞2D3.也表现为CYP27b1活性的抑制,但这与抑制CYP27b1 mRNA表达和诱导CYP24活性有关。Pro-hormone 25 ohd3.对CYP27b1和CYP24均无影响。所示的每一种治疗方法图3与不同内含子2剪接变体的表达相关:对照组、SV1和SV2;高细胞外钙,SV3.;1,25 (OH)2D3., SV4;和25 ohd3., SV5).SV的序列分析1sv5证实PCR产物为CYP27b1的剪接变体(GenBank登录号:SV1DQ925362;SV2DQ925363;SV3.DQ925364;SV4DQ925365;和SV5DQ925366)。对这些cdna的进一步分析表明,这些剪接变体除了包含内含子2的片段外,还具有外显子3-8的异常剪接的特征4)也含有内含子3的片段(图4).
维生素D的内分泌作用依赖于cyp27b1介导的25OHD的激活3.由近端肾小管细胞,但酶也由来自其他部位的细胞表达。确定CYP27b1的剪接变体在多大程度上也是1,25(OH)的特征。2D3.我们使用单核细胞细胞系THP-1 (图5).与HKC-8肾细胞一样,THP-1细胞在与单核细胞或维生素D代谢调节相关的培养条件下显示出独特的CYP27b1剪接变体表达模式,而野生型CYP27b1表达没有任何明显变化(图5).与HKC-8的数据相反图3,响应1,25(OH)2D3.似乎与增强的CYP24活性无关。数据显示24,25(OH)的合成减少2D3.在TPA和/或1,25(OH)处理的细胞中2D3.(图5 b).用1,25(OH)培养THP-1细胞2D3.显示了在对照细胞(0.1%乙醇)中不存在的两种剪接变异的额外表达8和SV9).其中,SV8在phorbol酯TPA处理的THP-1细胞中也表达(160 n米, 24 h),对1,25(OH)的合成没有影响2D3.或野生型CYP27b1 mRNA的表达。值得注意的是1,25(OH)的相加2D3.TPA进一步降低1,25(OH)的合成2D3.而SV无显著表达8和SV91,25(OH)处理后观察2D3.一个人。数据图5显示了三个独立实验的PCR产物,表明变异CYP27b1 mrna的表达模式非常一致。THP-1细胞PCR产物的克隆及序列分析6sv10)发现了5种新的CYP27b1 mrna (GenBank登录号:SV6DQ925367;SV7DQ925368;SV8DQ925369;SV9DQ925370;和SV10, DQ925371)具有不同的拼接模式,如图所示图6.这包括外显子4的异常剪接和内含子5的片段包含。
为了确定研究中发现的含内含子的CYP27b1剪接变体是否具有功能活性,我们使用抑制性shRNA敲除含有内含子2或外显子2片段的mrna,然后评估受体HKC-8细胞中CYP27b1表达和活性的变化(图7).数据显示shRNA对内含子2的抑制了含有内含子2的剪接变体的表达(图7),但对野生型CYP27b1 mRNA表达水平无显著影响(图7 b).然而,shRNA抑制含内含子2的mrna确实导致野生型CYP27b1的蛋白水平上调(图7 c)和增强的25OHD代谢3.1,25 (OH)2D3.(图7 d).这些数据在多个内含子2 shRNA中是一致的。与剪接变体敲除的效果相反,靶向野生型CYP27b1 mRNA的shRNA导致1,25(OH)的降低。2D3.生产。这种效应与野生型CYP27b1 mRNA和蛋白的显著抑制以及含有内含子2的CYP27b1剪接变体的表达改变有关。
讨论
替代基因剪接影响了70%的人类基因,并在高等生物的转录体中起着不可或缺的作用(30.).在许多情况下,选择性剪接通过从单个基因中产生具有不同功能的多个蛋白质或亚细胞定位来增强遗传多样性(31,32).在其他情况下,剪接变体是异常剪接的产物,导致帧外RNA异构体没有明显的末端功能(33,34).后者的分子影响尚未被完全定义,但大约三分之一的剪接变体被认为是mRNA衰变或其他机制的结果,改变了基因转录(32,35- - - - - -38).框架改变和框架保留RNA异构体的进化保守性表明替代基因剪接在生物学上是相关的(30.,39),这是人类疾病新疗法发展的潜在重要靶点。
在之前的研究中,我们报道了维生素d分解酶CYP24的框架内剪接变异mRNA,其中该基因的内含子2的一部分包含在其中,产生了一个N末端截断肽,其功能发生改变(23).这种被称为CYP24-SV的剪接变体保留了与底物结合的能力[25OHD]3.或1,25 (OH)2D3.],但外显子1和2编码的线粒体靶向序列的缺失意味着它的存在仅限于细胞质,因此消除了任何催化活性。虽然CYP24-SV没有酶活性,但它能够抑制1,25(OH)的合成。2D3.大概是作为25OHD的“诱饵”3.衬底。在目前的研究中,我们无法识别CYP27b1的框架内剪接变体,但我们确实检测到许多其他PCR产物,随后被证明是含有内含子2的酶剪接变体。尽管这些是非编码的,并且与野生型CYP27b1相比表达较弱,但我们假设剪接变体有可能在转录或转录后水平上对酶的表达发挥调节作用。我们的假设是基于最近的一系列报告,这些报告表明,非编码rna的表达并不简单地代表“转录噪声”,而是为基因表达提供了额外的控制层(39).例如,囊性纤维化跨膜传导调节基因内含子序列的异位表达已被证明会引起HeLa基因表达的实质性变化(40).值得注意的是,剪接变异的分子影响可能与其表达水平不成比例;尽管与野生型mRNA相比,剪接变体的血小板生成素基因的丰度相对较低,但已被证明对蛋白质表达有很大影响(41).
CYP27b1的剪接变体在以前的报道中有很好的记录(24- - - - - -28),但它们对维生素D代谢的影响目前尚不清楚。为了解决这个问题,我们使用shRNA技术专门靶向含有内含子的CYP27b1 mRNA,从而允许我们选择性地抑制剪接变体mRNA相对于野生型转录本的表达;通过shRNA等策略的RNA干扰(RNAi)被认为主要在细胞质、转录后水平上针对成熟RNA (42),尽管一些研究表明与未拼接的pre-mRNA存在潜在的相互作用(43).在我们的研究中,我们观察到1,25(OH)的生成增强2D3.含有内含子序列的shRNAs表明,这些shRNAs最有可能的目标不是pre-mRNA。这与先前的报道一致,该报道描述了保留该基因内含子1的COX-1剪接变体的RNAi敲除(44).与CYP27b1类似,RNAi靶向COX-1内含子1增强了野生型COX-1和COX-2的表达,进一步证实了RNAi的靶点不太可能是野生型pre-mRNA的观点。对这类研究的一种可能的解释是,对剪接变异mrna的抑制导致野生型基因产物的代偿性表达增加。在CYP27b1的例子中,内含子shRNA在没有野生型mRNA水平变化的情况下增强了CYP27b1蛋白的功能,这表明代偿反应是在翻译水平上的。
先前的研究支持这样的观点,即核糖体的个别结合位点之间存在竞争,因此这一步可以成为mRNA与蛋白质水平比值的速率限制因素(45).其他研究也进一步证实了这一点,这些研究表明RNA代谢的改变,最终导致与无意义密码子相关的RNA衰变,涉及到细胞质中这些转录本的识别(37).介导由此产生的mRNA监测的机制似乎涉及到“先锋”轮翻译(46),表明这是一个与野生型mRNA在核糖体机制中积极竞争的动态过程。因此,我们可以推测,在肾脏和肾外细胞中检测到的大量CYP27b1剪接变体可能在1,25(OH)的正常调节中发挥作用。2D3.通过作为有限数量核糖体mRNA结合位点的竞争者而产生。这一机制的精确分子基础尚不清楚,但有趣的是,最近的报告显示,在没有任何明显野生型mRNA表达的一些组织中,可以检测到CYP27b1的剪接变体(27).
本研究提供的数据,以及先前关于其他不同的CYP27b1剪接变体的报道(24- - - - - -28),表明在不同的细胞类型中存在多种形式的CYP27b1 mRNA。因此,剩下的一个关键问题是,这些转录本的潜在调控作用如何与控制维生素D代谢的更传统机制相关。由于1,25(OH)的高效钙质特性,其内分泌合成2D3.在正常维生素D生理过程中,由肾近端小管细胞严格调控。因此,虽然转换25OHD3.1,25 (OH)2D3.被降钙素和甲状旁腺素等促钙激素上调,同时1α-羟基化抑制1,25(OH)。2D3.本身和细胞外高浓度的钙(5).通过识别CYP27b1基因启动子的蛋白激酶a响应区域(47),而CYP27b1转录衰减1,25(OH)2D3.似乎涉及到CYP27b1基因近端启动子中一个明显的负性维生素D反应元件(48).然而,目前尚不清楚CYP27b1酶活性的调控是否仅发生在mRNA表达水平。此外,目前还没有明确的分子模型来说明其他因素(如细胞外钙)对CYP27b1活性的调控,尽管这可能涉及直接的(即。非甲状旁腺素介导的影响(10).一种可能的解释是,除了目前已确定的启动子区域外,还有CYP27b1转录调控的替代位点。另一种可能性,如上所述,是存在一个额外的基因调控层,由选择性的CYP27b1转录本剪接提供。
与CYP27b1的转录抑制相反,剪接变体mrna的衰减作用不一定依赖于1,25(OH)的实际合成。2D3.本身。因此,CYP27b1剪接变异体具有调节1α-羟化酶活性在“酶前”水平的潜力,其方式类似于先前描述的CYP24剪接变异体(23).在后者的情况下,截断的胞质CYP24蛋白作为底物25OHD诱饵的能力3.可为1,25(OH)的下调提供更灵敏的机制2D3.而非通过野生型CYP24分解代谢。人们很容易推测,CYP27b1剪接变体也将作为1,25(OH)的酶前调节因子。2D3.生产。然而,与被翻译成功能性蛋白的CYP24剪接变体不同,CYP27b1剪接变体似乎是翻译竞争者,因此限制了野生型1α-羟化酶蛋白的可用性。这在1,25(OH)的肾外部位尤其重要2D3.如巨噬细胞,其中CYP27b1不受甲状旁腺素和/或24-羟化酶活性的经典调节(49).然而,在肾近端小管细胞中存在的CYP27b1剪接变异体表明,这种调节维生素D代谢的替代模式可能与更经典的机制一起存在,可能作为1,25(OH)微调的补充系统。2D3.由这些细胞产生。进一步分析这与CYP27b1的常规转录调控之间的联系,特别是mrna替代剪接的分子基础,将是未来研究这一重要的类固醇生成酶的关键目标。
确认
这项工作得到了美国国立卫生研究院RO1AR050626基金(给M.H.)的支持。
作者披露摘要:作者无任何需要声明的内容。
缩写:
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CYP24
细胞色素P450维生素d -24羟化酶
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CYP27b1
细胞色素P450 25-羟基维生素D3.1α羟化酶
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FCS
胎牛血清
-
1,25 (OH)2D3.
1, 25-dihydroxyvitamin D3.
-
25 ohd3.
人体内25 -羟维生素D3.
-
RNAi
RNA干扰
-
成分
短发夹RNA
-
SV
剪接变体
-
TPA
tetradecanoylphorbol 13-acetate
参考文献