早产儿支气管肺发育不良危险的分子微生物学特征GydF4y2Ba

感染在支气管肺发育不良(BPD)中的作用尚不清楚。我们提出了一项观察性研究，对两个三级新生儿重症监护病房中出生体重小于1.3公斤的55名早产儿进行了研究。采用DGGE变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)分析气管内抽吸物(ETA)和鼻胃抽吸物(NGA)的总细菌群落，并采用物种特异性PCR检测是否存在细菌GydF4y2Ba支原体GydF4y2BahominisGydF4y2Ba,GydF4y2BaUreaplasma体GydF4y2Ba和GydF4y2Ba微小脲原体GydF4y2BaDGGE鉴定了59%的NGA和ETA样本中的细菌种类。鉴定了多种种类，包括与早产有关的几种。鉴定了物种特异性PCRGydF4y2BaMGydF4y2Ba．GydF4y2BahominisGydF4y2Ba在25%的NGA和11%的ETA样本中。在48名存活到概念后36周的婴儿中，有序logistic回归显示BPD或死亡的比值比GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba存在/缺席为4.80 (95% CI 1.15-20.13)。在调整了通风天数后，这一数字降低到2.04(0.41-10.25)。这些数据表明了DGGE和种特异性PCR联合使用是如何识别高暴露的GydF4y2Ba子宫内GydF4y2Ba和出生前后的细菌可能与早产和随后的肺损伤有因果关系。GydF4y2Ba

新生儿重症监护的改善提高了极端早产后的存活率。这些婴儿有长期并发症的危险。尽管早期使用了通气和表面活性剂替代，但仍有大量患者因支气管肺发育不良(BPD)或新生儿慢性肺病而发生呼吸系统疾病。BPD的病因是多因素的，许多因素包括机械通气、高氧和绒毛膜羊膜炎(GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)先前的研究表明，围产期感染可能通过炎症性肺损伤的机制在这种疾病的发展中起重要作用。一些细菌种类已经被牵连，包括生殖器GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba新生儿在围产期可能接触到的Spp (GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.关于这些生物的作用的证据是不一致的。尽管一些研究表明产前接触GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp可能与BPD的发展有因果关系，其他研究表明没有关联(GydF4y2Ba9GydF4y2Ba–GydF4y2Ba11GydF4y2Ba).研究还调查了GydF4y2Ba支原体GydF4y2BahominisGydF4y2Ba应用PCR技术检测BPD高危新生儿(GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12GydF4y2Ba)这种微生物与感染性疾病有关，包括盆腔炎、细菌性阴道病、新生儿菌血症、脑膜炎和脓肿(GydF4y2Ba13GydF4y2Ba)但在早产儿的样本中很少被发现。GydF4y2Ba

调查感染在早产儿中的作用取决于收集适当的微生物样本。出生后不久获得的鼻胃液（NGA）被认为是关于围产期微生物暴露的信息。类似地，对那些因通气支持而插管的婴儿的气管内抽吸物（ETA）进行分析，可能会提示这些细菌在气道内的持续存在以及环境微生物的获得。GydF4y2Ba

大多数研究都使用了基于属或种特异性培养或PCR的方法来鉴定细菌种类，很少有人试图鉴定样本中存在的所有细菌种类(GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.采用16S核糖体RNA基因分析方法，对16S核糖体RNA基因进行了分析GydF4y2Ba等GydF4y2Ba(GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)在ETA和NGA中鉴定出22种细菌。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们的目的是利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析来扩展这些观察结果，DGGE分析是一种独立于培养的方法，用于表征样本的细菌物种组成GydF4y2Ba支原体GydF4y2Ba和GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba使用spp。这些测试能够对两个三级新生儿重症监护病房内早产儿的ETA和NGA中的细菌进行表征。微生物发现和围产期风险因素与通过标准化临床特征诊断的BPD的发展相关。GydF4y2Ba

科目。GydF4y2Ba

经过父母同意，55名出生体重低于1300克、需要机械通气的早产儿在出生后24小时内被安妮公主医院或圣玛丽医院新生儿重症监护病房收治，为期12个月。所有患者需要至少24小时的呼吸支持，并符合医生诊断的呼吸窘迫综合征(RDS)的临床和放射学标准。招募部分取决于是否有临床研究人员获得参与的知情同意。排除除动脉导管未闭外有先天性心脏病等明显先天性异常的儿童。该研究获得了特定地点的当地伦理委员会批准(REC参考no。06 / Q1702/78)。所有婴儿均开始常规机械通气，除一名婴儿外，根据标准方案给予至少一剂表面活性剂治疗。55名婴儿中有50名在出生后48小时接受头孢噻肟治疗，等待入院时的血液培养结果。其中2例在其他单位给予青霉素和庆大霉素48小时，3例未给予抗生素治疗。当常规通气不足以维持可接受的血气化学时，使用高频通气。 Infants were categorized according to whether they developed BPD using criteria for the National Institutes of Health definition (14GydF4y2Ba）.所有婴儿需要氧>21%至少28天被诊断为BPD。在36周校正胎龄时继续需要氧气的婴儿被归类为中度(FiOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba<30%）或严重（FiO）GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba>30%）BPD。GydF4y2Ba

样本采集。GydF4y2Ba

所有的婴儿在出生后几小时内都通过了气管插管。用注射器抽吸最多1ml胃液，转移到无菌通用容器中，在−80°C下保存。ETA是在生命最初24小时后通过开放抽吸获得的，如果有临床适应症，则更早。将婴儿与机械呼吸机短暂断开，将吸引导管插入ET管远端。用负压吸引获得吸出物，并收集到无菌标本捕集器中。如果没有得到抽吸，在向ET管中灌注最多1 mL 0.9%生理盐水后，再进行5次呼吸机呼吸。ETA的保存方法与NGA标本相同。本研究中使用的所有ETA均在生命的前5天内获得。GydF4y2Ba

核酸提取。GydF4y2Ba

样品用0.2-μM滤过的1× PBS 1:3稀释，4°C, 5000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba取上清液，用600 μL缓冲液(QIAGEN)重悬微球。裂解液使用一次性QIAshredder (QIAGEN)色谱柱均质，DNA提取使用QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒，按照制造商的动物和人类细胞说明书进行。GydF4y2Ba

PCR扩增人支原体。GydF4y2Ba

一段334bp的16srrna基因，该基因特异于GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba以25 μL REDTaq Ready Mix PCR Reaction Mix(含1.5 UGydF4y2BaTaqGydF4y2BaDNA聚合酶，每个dNTP的0.2 mM和1.5 mM MgClGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba；Sigma Chemical Co.-Aldrich)，每个引物(最终浓度)0.2 μM, 50 - 100 ng模板DNA和无核酸酶水(Ambion)到最终体积50 μL。DNA扩增反应包括95°C初始变性4 min, 95°C 50 s, 56°C 50 s, 72°C 50 s, 35个循环，72°C延伸3 min。GydF4y2Ba

猪的多带抗原（MBA）基因GydF4y2Ba美国体GydF4y2Ba用引物UMS-125f和UMA226r在标准PCR条件下扩增。根据菌株的血清型，该引物组可产生403bp或448bp的PCR扩增产物。在所描述的14个血清型中GydF4y2Ba美国体GydF4y2Ba，血清型1,3,6和14，形成生物变种1(细小生物变种-GydF4y2Ba微小脲原体GydF4y2Ba)，产生403bp的扩增子，而形成biovar 2（T960）的其余10个产生448bp的扩增子。DNA扩增反应条件如下：GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

16 s rRNA基因。GydF4y2Ba

用357f(结构域保守)引物扩增细菌16S rRNA基因GydF4y2Ba细菌GydF4y2Ba,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba和907rM(通用保守引物，GydF4y2BaEGydF4y2Ba．GydF4y2Ba杆菌GydF4y2Ba位置907–926），使用标准PCR条件。将GC夹钳连接到357f引物的5′端(GydF4y2Ba15GydF4y2Ba,GydF4y2Ba16GydF4y2Ba)使用的GC钳是一个40 bp的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸串。它们对变性有抵抗力，从而阻止DNA链的完全分离，从而使它们在变性部位固定在凝胶板上。引物扩增该结构域成员的16srrna基因的586bp片段GydF4y2Ba细菌GydF4y2Ba，包括高度可变的V3-V5区域。DNA扩增反应受到初始变性5分钟在94°C,紧随其后的是10着陆94°C的周期为1分钟,1分钟65°C(每个周期下降1°C),并为3分钟72°C。进一步20 94°C的周期为1分钟,1分钟55°C, 72°C, 3分钟后进行首次着陆周期,PCR反应在MJ Research PTC-225 Peltier热循环梯度(MJ Research)中进行。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中可见，用0.5× gel Red(终浓度)染色，−20℃保存。GydF4y2Ba

DGGE分析。GydF4y2Ba

使用Bio-Rad D代码（Bio-Rad）DGGE系统进行DGGE。使用皮滴分光光度计，GydF4y2Ba∼GydF4y2Ba60 ng的PCR产物分离与40 - 80% 6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素和甲酰胺的线性梯度的100 V, 60°C 17 h。变性梯度凝胶沾1×SYBR黄金核酸染色(分子探针),使用了Herolab UVT-20 M / W紫外线transluminator。分离出明显的条带，置于100 μL无核酸酶水(Ambion)中，4℃保存过夜，洗脱DNA。如前所述，通过PCR重新扩增DNA，并使用DGGE检测条带流动性。正确迁移率的原始PCR产物序列如下所示。GydF4y2Ba

测序分析。GydF4y2Ba

美国体GydF4y2Ba,GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba， DGGE PCR产物分别用引物ams -125f、RNAH1和907rM测序。测序前，根据制造商说明，所有PCR产品均使用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化。测序反应使用ABI BigDye Terminator version 3.1测序染料(Applied Biosystems)，按照韩国Macrogen公司的制造商说明进行。GydF4y2Ba

统计分析。GydF4y2Ba

Fisher精确检验或χGydF4y2Ba^2.GydF4y2Ba该测试用于比较比例和Mann-WhitneyGydF4y2BaUGydF4y2Ba采用检验对研究组之间的顺序数据进行比较。使用Spearman秩相关法探索与BPD发展相关的微生物和临床结局参数之间的关系，并使用有序logistic回归法调整在单因素分析中观察到的可能混杂因素的关系。这些分析使用SPSS版本17和Stata版本10进行。GydF4y2Ba

纳入符合研究标准的55名婴儿（男：女，32:23）(GydF4y2Ba表1GydF4y2Ba)。只有一个受邀参与的家庭拒绝同意，但在南安普敦单位，由于研究开始时除了临床职责外，可招募的工作人员有限，因此有许多符合条件的患者缺席。53名患者出院后有完整的结果测量。两人在调离该地区后失去了后续行动。婴儿分为0组，无BPD；第1组，轻度BPD；第2组，中度或重度BPD；第3组在BPD相关呼吸原因的认知后36周死亡。5名婴儿在校正胎龄36周内死亡，2名失去随访，无法归类为BPD，未纳入结果分析。研究中心之间的研究人群和结果没有显著差异。GydF4y2Ba

DGGE分析。GydF4y2Ba

44例婴儿成功获得NGA标本。放大的GydF4y2BaCGydF4y2Ba.586 bp的PCR产物在61%（44个样本中的27个）的样本中成功，其中26个样本在DGGE后产生可见图谱。如条带数所示(GydF4y2Ba即GydF4y2Ba，种），朴茨茅斯的细菌多样性高于南安普敦的样品（平均条带/样品=3.14）GydF4y2Ba对GydF4y2Ba1.62)。从DGGE图谱中检索到的序列表明，朴茨茅斯和南安普顿NGA共有的细菌种类很少(GydF4y2Ba表2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对55个ETA样本进行分析。放大的GydF4y2BaCGydF4y2Ba．586-bp PCR产物在56份样本中有32份(57%)成功。这分别代表了朴茨茅斯和南安普顿医院23例阳性样本中的14例和33例阳性样本中的18例。所有PCR产物在DGGE后都产生了可见的细菌谱，通过重复的DGGE分析，这些都是可重复的(数据未显示)。朴茨茅斯和南安普顿婴儿的细菌多样性相似(1.63GydF4y2Ba对GydF4y2Ba每个样本有1.60种)，很少有常见品种(GydF4y2Ba表3GydF4y2Ba）.与凝固酶阴性相关的序列GydF4y2Ba葡萄球菌GydF4y2Ba(缺点)GydF4y2Ba葡萄球菌GydF4y2Ba溶血性GydF4y2Ba和GydF4y2Ba葡萄球菌GydF4y2BaepidermidisGydF4y2Ba所有DGGE序列的核苷酸序列数据均出现在Genbank数据库中，登录号为FJ999768–FJ999861。NGA样本中最常见的生物体为GydF4y2Ba梭菌属GydF4y2BanucleatumGydF4y2Ba是细菌性阴道病的公认病因。ETA标本中最常见的微生物为GydF4y2BasGydF4y2Ba．GydF4y2BahemolyticusGydF4y2Ba．这些微生物的存在与样本采集时间或临床结果之间没有关系。我们无法分析其他生物体的存在与结果的关系，因为数量很少。同样，DGGE在NGA和/或ETA样本中确定的任何生物体的绝对存在与临床结果无关。GydF4y2Ba

PCR分析。GydF4y2Ba

人型支原体GydF4y2Ba13% (GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)及9% (GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)， 21% (GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)和30%(GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)分别来自朴茨茅斯和南安普敦新生儿的NGA(GydF4y2Ba表4GydF4y2Ba）.经序列分析，所有PCR产物的相似性为99 ~ 100%GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba(到达M96660 EU443622)。GydF4y2Ba

UreaplasmaGydF4y2Ba在大约一半的样本中检测到spp。对检索到的MBA基因序列的扩增子进行测序，以尝试将血清型分配给患者GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba所有检测的PCR产物均显示出99–100%的相似性GydF4y2BaUGydF4y2Ba．GydF4y2Ba以及GydF4y2Ba，血清1 (AF056983)， 3 (CP000942)和6 (AF056984);和GydF4y2Ba美国体GydF4y2Ba，血清4 (AF055363)和9 (AF055367)。GydF4y2Ba美国以及GydF4y2Ba是最普遍的。核苷酸序列数据GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba和GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp序列出现在Genbank数据库中，登录号分别为FJ999914-FJ999929和FJ999862-FJ999913。GydF4y2Ba

临床结果。GydF4y2Ba

采用Spearman秩相关法探讨微生物学发现与临床结果之间的关系(GydF4y2Ba表5GydF4y2Ba）.值得注意的是鉴定之间的显著相关GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba对ETA样本的spp和随后BPD的不良结果(GydF4y2BaPGydF4y2Ba= 0.029)和孕周成反比(GydF4y2BaPGydF4y2Ba= 0.027)。两者之间没有显著的关系GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba在分娩后不久获得的NGA上发现的spp以及这些结果中的任何一种GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2BaETA样本中的spp也与更长的通气时间相关(GydF4y2BaPGydF4y2Ba= 0.01)。有序logistic回归显示BPD或死亡的比值比GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba存在/不存在的风险为4.80（95%可信区间1.15–20.13），但在调整通气天数后，该比值比降低至2.04（0.41–10.25），不再显著。GydF4y2Ba

正如预期的那样，更严重的BPD的发展与妊娠之间存在显著的相关性(GydF4y2BaPGydF4y2Ba=0.001）和低出生体重(GydF4y2BaPGydF4y2Ba< 0.001). BPD也与较高的通气压力相关(GydF4y2BaPGydF4y2Ba< 0.001)和导管未闭(GydF4y2BaPGydF4y2Ba= 0.013)。GydF4y2Ba

根据分娩方式对NGA和ETA样本中鉴定出微生物的患者进行分组。两组的分离率无显著差异GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba和GydF4y2Ba支原体GydF4y2Ba但是，当DGGE结果与以前报告的与细菌性阴道病和/或羊膜炎相关的微生物进行比较时，与剖腹产相比，阴道分娩婴儿的NGA样本中更常见微生物(GydF4y2BaPGydF4y2Ba= 0.02). 剖腹产在早产儿中不太常见。GydF4y2Ba

尽管这是一项关注有限临床变量的小型研究，但这些数据显示了一幅复杂的图景，在出生后不久获得的NGA标本和随后的ETA中存在广泛的细菌物种。我们的发现与Oue的报告一致GydF4y2Ba等GydF4y2Ba(GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)，尽管我们能够确定更多的物种和更高的感染率GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp和GydF4y2BaMGydF4y2Ba．GydF4y2BahominisGydF4y2Ba在我们的早产儿中。这与我们的发现一致，即GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2BaETA中的spp与妊娠周数呈负相关(GydF4y2BaPGydF4y2Ba= 0.027)。GydF4y2Ba

UreaplasmaGydF4y2Baspp是从女性泌尿生殖道分离出来的最常见的微生物之一，因此它们经常出现在ETA和NGA样本中并不令人惊讶。一些报告表明，它们可以从高达80%的健康女性的宫颈阴道分泌物中分离出来(GydF4y2Ba13GydF4y2Ba）.GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp长期与早产和羊膜炎有关，这是BPD的两个主要危险因素。尽管这项研究发现了GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp在ETA和不良呼吸结果中的作用(GydF4y2BaPGydF4y2Ba=0.029），这可能是由于混杂变量造成的，并且考虑到通气天数的回归分析后，相关性缺乏统计学意义。虽然早产后的通气性气压伤是公认的BPD危险因素，但由于感染引起的气道炎症，可能需要延长通气时间。我们没有发现两者之间的关联GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp在NGA和BPD中，这可能是意料之中的，因为这种生物体很可能在出生前后获得。然而，这与之前的研究一致，可能与取样误差或对该生物体的检测阈值水平有关(GydF4y2Ba11GydF4y2Ba).与之前的研究一致，几乎所有GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba检测到的spp为GydF4y2Ba美国以及GydF4y2Ba(GydF4y2Ba17GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

的水平GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba这两家医院的病人比之前报道的要多EgawaGydF4y2Ba等GydF4y2Ba(GydF4y2Ba9GydF4y2Ba)发现只有4.8%的ETA或NGA样本对GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba，courucliGydF4y2Ba等GydF4y2Ba(GydF4y2Ba18GydF4y2Ba)报告89个ETA样本中只有一个呈阳性。王GydF4y2Ba等GydF4y2Ba(GydF4y2Ba12GydF4y2Ba)恢复GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba加GydF4y2Ba美国体GydF4y2Ba来自7%早产儿的ETA和NGA样本。GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba与细菌性阴道病、盆腔炎、新生儿菌血症、脑膜炎和脓肿等感染有关(GydF4y2Ba13GydF4y2Ba）.在一项研究中，脐带血培养检查提示阳性婴儿GydF4y2Ba美国体GydF4y2Ba和/或GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba培养物更有可能出现新生儿全身炎症反应综合征(GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba).我们无法联系到GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba与临床相关的结果参数。GydF4y2Ba

DGGE分析在NGA和ETA样本中发现的物种数量比以前描述的要多(GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)，但在比较两种样本的个体中没有发现明显的相关性。这些发现的临床意义尚不明确。生物体的存在GydF4y2Ba本质上GydF4y2Ba与临床结果无关，但这可能是分娩方式的复合效应GydF4y2BaAtopobium阴道GydF4y2Ba,GydF4y2Ba梭菌属GydF4y2Ba最高人民检察院，GydF4y2Ba拟杆菌GydF4y2Ba最高人民检察院，GydF4y2Ba普氏菌biviaGydF4y2Ba,GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba,GydF4y2Ba羊膜纤毛虫GydF4y2Ba,GydF4y2BaMegasphaeraGydF4y2Ba最高人民检察院，GydF4y2BaSneathiaGydF4y2Ba最高人民检察院，GydF4y2Ba脉内拉GydF4y2Ba最高人民检察院，GydF4y2Ba厌氧球菌GydF4y2Baspp,GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2BaSPP与细菌性阴道病(GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba）.所有这些在我们的研究中至少被确认过一次。类似的培养和PCR/克隆研究从早产儿羊水样本中鉴定出17种细菌类群(GydF4y2Ba21GydF4y2Ba）.GydF4y2Bal . amnioniiGydF4y2Ba和GydF4y2BaSneathiaGydF4y2Ba在我们的6个NGA样本中鉴定了spp。这些微生物有可能是羊膜内病原体，从而导致早产。虽然绒毛膜羊膜炎通常发生没有培养感染的证据，我们的研究结果表明，这可能是因为存在以前未识别，未培养，或难以培养的物种。未来对绒毛膜羊膜炎病例的分子研究可能有助于确定哪些物种会导致早产，并对产前抗生素的选择有影响(GydF4y2Ba22GydF4y2Ba）.一个对照组的足月婴儿将有助于澄清这些问题。我们的研究表明阴道分娩增加了NGA致病物种的发生。我们怀疑这反映了这类生物的获取时间较长。不幸的是，我们没有收集关于膜破裂和输送之间的时间的数据来进一步探索这个问题。GydF4y2Ba

ETA和NGA样本的总体细菌组成差异很大。其原因可能包括出生后气管导管在医院内的定植以及围产期获得后气道内生长的微生物相对数量的变化。数字不足以确定ETA的时间是否影响生物体的相对分布，但这可以通过分析更长时间内的标本来探索。CoNS是ETA样本中发现的最常见的生物体。仅在一个NGA中检测到CoNS。这些微生物在早产儿的血液培养中被广泛报道，并且作为败血症的一个原因在我们研究的六名新生儿的血液中被培养。他们在BPD中的作用尚不确定(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24GydF4y2Ba)在这项研究中，尽管6例CoNS血培养阳性患者中有5例随后发展为中度或重度BPD，但ET管中CoNS的存在与不良呼吸结局之间没有关联。以前也有过类似的报道(GydF4y2Ba25GydF4y2Ba)我们怀疑这不是因果关系，但反映了独立存在BPD和新生儿败血症风险的长期住院新生儿的并发症。GydF4y2Ba

值得注意的是，GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp和GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba使用物种特异性PCR比16S rRNA基因DGGE分析更频繁地在样本中检测到。汉GydF4y2Ba等GydF4y2Ba(GydF4y2Ba22GydF4y2Ba)遇到了类似的问题比较培养和16S rRNA基因克隆。这种差异可能是由许多原因造成的。PCR偏差可能导致了混合模板样品中特定DNA序列扩增效率的差异(GydF4y2Ba26GydF4y2Ba)也有可能是较低的rRNA操纵子拷贝数GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp和GydF4y2BaMGydF4y2Ba．GydF4y2BahominisGydF4y2Ba与其他细菌种类相比，含有这些属的模板的扩增有偏差(GydF4y2Ba27GydF4y2Ba)。此外，据报道，使用GC夹钳进行DGGE分析会降低PCR的灵敏度，并可能导致从DNA中扩增序列的困难GydF4y2Ba软体动物GydF4y2Ba类。另一种解释是，这些差异是检测限度的结果。也就是GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Baspp和GydF4y2Ba人型支原体GydF4y2Ba在通过物种特异性PCR而非DGGE检测到它们的样本中，它们的含量非常低，因此，低于DGGE的检测阈值，建议GydF4y2Ba∼GydF4y2Ba样本总体的1%(28)。检测极限的差异也可能解释了两者之间缺乏联系GydF4y2BaUGydF4y2BaRGydF4y2Ba胞浆GydF4y2Baspp在NGA和随后的ETA。有可能气道内的微生物数量会随着时间的推移而增加，直到最终出现促炎“感染”数量(GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba).进一步的研究应包括顺序PCR分析，以阐明GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba特别是，呼吸道内出现的spp数量越来越多，足以引起感染。在纵向研究中使用最近发表的定量PCR方案将有助于确定病毒的致病性GydF4y2BaUreaplasmaGydF4y2Ba早产新生儿中的spp和其他微生物（29）。研究结果可能对早产和产后抗生素选择具有重要意义。GydF4y2Ba

BPD：GydF4y2Ba

支气管肺发育不良GydF4y2Ba

欺骗：GydF4y2Ba

凝固酶阴性GydF4y2Ba葡萄球菌GydF4y2Ba

DGGE：GydF4y2Ba

变性梯度凝胶电泳GydF4y2Ba

ET:GydF4y2Ba

气管内GydF4y2Ba

预计到达时间：GydF4y2Ba

气管内吸出GydF4y2Ba

NG:GydF4y2Ba

鼻胃GydF4y2Ba

NGA:GydF4y2Ba

胃吸入GydF4y2Ba

我们感谢父母和婴儿对这项研究的参与。同时，我们感谢朴茨茅斯和南安普顿新生儿重症监护室的医疗、护理、实验室和支持人员，感谢他们在整个研究过程中的帮助和鼓励。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 英国伦敦国王学院生物医学和健康科学学院药理学部，SE1 9nhhGydF4y2Ba

   马修·佩恩和肯尼斯·D·布鲁斯GydF4y2Ba

2. 英国南安普敦南安普敦综合医院儿科，SO16 6YDGydF4y2Ba

   加里·J·康尼特和朱利安·P·莱格GydF4y2Ba

3. 新生儿重症监护室，安妮公主医院，南安普敦，SO16 5YA，英国GydF4y2Ba

   Tanoj Kollamparambil和Victoria PuddyGydF4y2Ba

4. 英国朴茨茅斯圣玛丽医院新生儿重症监护室，PO3 6ADGydF4y2Ba

   Kevin C W Goss、Richard Thwaites和Mark AshtonGydF4y2Ba

5. 南安普敦大学医学院公共卫生科学与医学统计学，英国SO16 6YDGydF4y2Ba

   珍妮特·L·孔雀GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

给加里·J·康尼特的信件。GydF4y2Ba

英国肺脏基金会，儿童肺脏疾病补助金的支持。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba