不同的流感感染血液中签名转录组的患者严重的肺炎

介绍

严重流感肺炎的诊断仍然是具有挑战性的,因为缺乏流感病毒的存在之间的相关性及临床状态。我们进行了基因表达分析在危重患者的全血来识别基因签名允许临床医生区分流感感染和其它原因造成的严重的呼吸衰竭,如细菌性肺炎和noninfective系统性炎症反应综合征。

方法

遗传损伤样本收集的危重Illumina公司HT-12的基因表达beadarrays个人和化验。差异表达基因由线性混合模型分析和过多的生物通路由使用GeneGo MetaCore。

结果

甲型H1N1流感的基因表达状况与细菌性肺炎肺炎是截然不同的和系统性炎症反应综合征。流感基因表达形象特点是upregulation细胞循环调控的基因,细胞凋亡,DNA-damage-response通路。相比之下,没有发现独特的基因表达特征患者细菌性肺炎或全身炎症反应综合征。流感感染的基因表达状况持续到5天的随访。此外,在主要的甲型H1N1流感患者感染细菌合并感染随后发达,流感的基因表达特征仍然没有改变,尽管叠加细菌感染的存在。

结论

的遗传表达谱数据表明宿主应对流感引起的肺炎截然不同于细菌病原体。这些信息的识别速度可能导致感染的病人出现严重的呼吸衰竭,允许更快地承担适当的病人护理。

2009年H1N1流感大流行再度强调呼吸道病毒的重要作用严重肺炎的原因。据世界卫生组织估计,每年有4.5亿肺炎病例记录,大约有400万人死于这种疾病(1,2]。仅在美国,据估计社区获得性肺炎的经济负担,每年超过170亿美元(3]。能够正确识别病毒性肺炎患者具有重要的病患管理的影响,但仍然是一个挑战。一些研究,包括(4,5),表明原降钙素的蛋白质生物标记物和c反应蛋白通常是低呼吸道感染病毒与细菌感染引起的。然而,这些研究是初步的,由小样本大小。也在尝试区分临床细菌性肺炎和流感之间,通过使用一个变量如年龄、心理取向、温度、白细胞计数,和胸部x光发现(6]。然而,细菌和病毒性肺炎的临床症状和体征可以重叠,往往混淆等基础疾病的免疫抑制和肺外并发症(7- - - - - -9]。当这些个人与社区获得性肺炎,很难确定哪个生物致病病原体(细菌和病毒)。

评估免疫反应的基因表达水平可能协助诊断以及响应的理解肺病毒与细菌病原体引起的感染。我们先前表明,流感感染,出现的异常免疫反应的基因表达水平与临床症状的发展(10]。此外,我们表明,这种免疫反应的变化关联与被感染的病人发展为呼吸衰竭。然而,尚不清楚这是否不曾想签名是特定于流感感染,或仅仅是一个通用的宿主对感染的一部分。因此,本研究的目的是研究基因表达的签名是否出现在严重流感肺炎患者,以及这是否不曾想签名是有别于其他条件,共享一个相似的临床表现,如细菌性肺炎或系统性炎症由于非传染性的原因。

主题

这项研究包括共有39名患者和18名健康志愿者。重症社区获得性肺炎患者重症监护室(ICU)入学要求参加这项研究。noninfective患者全身炎症反应综合征(SIRS)也为(n= 12)。批准的这项研究是悉尼西部地区卫生服务研究伦理委员会和知情同意书得到病人或其家属。2009年甲型H1N1流感肺炎(n= 8)证实了用聚合酶链反应(PCR)和细菌性肺炎(n= 16)通过微生物的文化。三个额外的患者纳入研究作为一个独立的群体,因为他们有积极的病理结果为甲型H1N1流感和细菌感染。健康志愿者(n= 18)在研究注册控件。重症社区获得性肺炎的诊断(由细菌引起的流感感染)或先生们成立的病人的住院(或死后)。众位被定义为至少两个的存在以下四个临床标准:(一)发热或体温过低(温度> 100.4°F (38°C)或< 96.8°F (36°C));(b)心动过速(> 90次/分钟),(c)呼吸急促(> 20次/分钟或帕科₂< 4.3 kPa(32毫米汞柱)),或机械通风的必要性;(d)白细胞计数的改变> 12000细胞/μl, < 4000细胞/μl,或存在> 10%乐队形式。肺炎是定义为一个微生物确诊感染肺部,导致病人履行SIRS标准。通过使用所有可用的信息确定诊断的病人的医疗记录。这些信息包括微生物学报告、PCR结果图像的研究(例如,电脑断层扫描),手术发现,组织组织病理学报告,对抗生素和响应。医生确定参考诊断是盲目的微阵列分析结果。遗传损伤样本来自所有科目。第一个样本收集每个病人的最初24小时内进入ICU,从今以后称为第一天。患者监测5天来评估他们的纵向基因。抽样进行只有在天1和5的健康控制队列,我们不希望一天比一天重要基因的变化特征。 For critically ill individuals, clinical characteristics, including APACHE II (Acute Physiology And Chronic Health Evaluation score II [11)、年龄、性别、并发症、ICU停留的长度,和死亡率,收集。

基因表达分析

遗传损伤样本收集到PAXgene管和立即存储在-20°C。RNA提取是由使用标准的协议(PAXgene血液RNA工具包,试剂盒、希尔登,德国)。RNA质量进行了分析通过使用安捷伦2100 Bioanalyser(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA),和所有样本获得的RNA完整性的数量大于6.5,表明样本质量高。提取RNA是储存在- 80°C到表达分析,通过使用Illumina公司Sentrix HT-12_v3_BeadChip数组(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。样品进行放大和标签200 ng的总RNA通过使用Illumina公司TotalPrep放大工具包(美国Ambion、奥斯汀、TX)。放大互补的RNA被使用安捷伦2100 Bioanalyser评估,以确保满意的放大。样本然后立刻杂化到HT-12_v3_BeadChips;750 ng的每个样本被加载到阵列上。杂交和洗涤过程为每个组数组处理是相同的。减少实验的文物,所有的RNA提取,样品放大和标签,杂交和洗涤,和扫描过程进行同样的操作,在同一时间。 After raw-data processing and normalization, no significant batch effects were identified. Therefore, no additional adjustment of the microarray data was required. The microarray data discussed here have been deposited in the NCBI Gene Expression Omnibus [12),可通过地理系列加入GSE40012数量(13]。

科学工作流

微阵列幻灯片的扫描获得的原始数据处理用Illumina公司GenomeStudio V2010.3。每个探测阵列是通过一个过滤器需要检测P值< 0.0050的至少一个样品被包括在任何进一步的分析。48804年调查现在的Illumina公司HT 12数组,24840探针(此后称为基因)通过了这一标准。基因通过过滤被加载到马上回来ArrayTools [14),分位数标准化和日志数据的转换。微阵列实验的验证是由测量表达式相对于GAPDH基因的一个子集,使用中存在。R²值时获得的比较中存在和微阵列相对fold-changes范围从0.67到0.83,表明两个平台之间的强一致性。

规范化和对数转换数据导入到R (v2.12)。基因在所有样本方差较低,小于中位数定义,从数据中删除。这12420个基因用于统计分析。每个病人表型与健康控制队列通过拟合线性混合模型使用R图书馆lme4每个基因。ICU患者表型,天留下来,性别、年龄、病人ID, APACHEII评分(疾病严重程度)都包括在模型中作为独立的变量。这使得对表型的基因选择重要会计后的每个模型中的其他条款。P值调整为多个业务测试通过使用Benjamini和错误发现率(罗斯福)方法(15)(R库multitest)。罗斯福5%被用作截止基因被认为是两个类之间的差异表达。

差异表达基因列表被上传到GeneGo Metacore(美国圣约瑟夫、MI),一个集成的软件套件的功能分析的基因表达数据。与GeneGo MetaCore、生物通路分析每个基因列表。通路分析涉及匹配指定的列表基因到轮唱的通路或网络和计算的统计相关性匹配。罗斯福5%被用来确定一个通路的截止统计过多在基因列表中。

识别特定的免疫细胞导致应对流感和特异表达的基因子集细菌性肺炎,我们执行一个过程称为免疫细胞反褶积。第一,排名前100的基因排序的统计显著性测定甲型H1N1流感肺炎的基因调节和基因调节的细菌性肺炎。每个基因在这些名单随后寻找利用ImmGen数据库(16)来评估他们的免疫细胞subset-specific表达式。据说一个基因标记特定免疫细胞类型如果是在少于四个不同的免疫细胞类型。Fisher精确检验是用来确定是否有显著差异存在于免疫比例cell-tagging基因基因高表达甲型H1N1流感肺炎与细菌性肺炎患者的基因高表达。

测试列表的浓缩的干扰素刺激基因(17流感和细菌性肺炎组,称为基因集富集的技术分析(18,19]。基因集富集分析进行排名由基因的基因列表P的表型值生成线性混合模型分析从最重要到最不重要。

进一步量化H1N1甲型流感的基因表达模式的差异和细菌性肺炎样本进入ICU的第1天,支持向量机(SVM)类预测建成[20.]。一个P值1 e-5被选为最优阈值决定基因被包括在区分第一天样本的类预测H1N1流感肺炎、细菌性肺炎。更严格的P值阈值导致减少使用的基因数量的类预测;然而,这也导致减少平均正确分类的百分比。见附加文件1,表S1P值阈值测试和结果使用的基因数量,以及每个类的正确分类预测的平均百分比。类的性能预测在训练数据集的评估通过分析交叉验证方法(21),也是评估在两个独立的数据集22,23]。第一个独立的数据集,由Ramilo出版等。(22),包括外周血单核细胞样品的细菌败血症和甲型和乙型流感患者。第二个数据集,由Bermejo-Martin出版等。(23),由PAXgene甲型H1N1流感患者的遗传损伤样本严重肺炎,与健康对照组相比。利用训练集的权重和阈值决定,SVM整数是绘制每个样本的两组独立的验证。SVM整数计算的每个基因的预先确定的重量乘以相应的表达水平,并添加这些值的每个基因预测的类。生物学通路分析和免疫细胞进行反褶积gene-list用于构建类预测。

进行聚类分析可视化表达谱的差异之间的样本收集患者并发细菌和甲型H1N1流感的感染与众位,细菌性肺炎或甲型H1N1流感肺炎患者。集群系统树图是通过使用生成的基因用于构建支持向量机类预测,利用欧氏距离度量和平均的联系。第一天所包含的系统树图样本细菌和甲型H1N1流感群体以及第一天样品三个患者并发细菌和H1N1甲型流感感染。第一天样本非传染性的众位群也包括在内。

每个病人的组织特点,总结在表1。每个细菌性肺炎的患者中,感染的病原体和标本的结果是获得额外的文件中列出1、表S2。没有区别的严重性疾病(以APACHE II评分)细菌性肺炎的病人被发现与甲型H1N1流感肺炎组(P= 0.82)。细菌性肺炎患者的平均年龄高于甲型流感患者(P= 0.00040)。因此我们把年龄作为协变量的线性混合模型分析。今后所有的结果报道占年龄群体之间的差异。

线性混合模型分析表明,基因表达水平的变化是由患者表型(H1N1甲型流感,细菌,或先生们)。其他变量,如疾病严重程度、ICU停留,和病人的年龄,没有与任何相关基因表达水平的变化。除了Y-linked基因RPS4Y1, JARID1D,EIF1AY, UTY,RPS4Y2病人性别不存在影响基因表达水平。每个表型相关的重大变化在大量基因的基因表达,总结如表2。

维恩图列表显示重叠的调节和表达下调基因与健康对照组相比,三个患者表型(图1 a, B)。罗斯福5%,1350个基因在所有三个调节与健康对照组相比,患者表型。这些基因生物学途径在资料库包括细胞凋亡(p = 4.4 e-8),免疫系统响应(P= 4.3 e-6)、dna损伤反应(P= 1.4 e-5),炎症反应(P= 6.8 e-5)。

一个独特的基因表达概要文件被发现甲型H1N1流感的一群。这主要是发现在调节基因表达型基因(图1)。1416个基因的生物学通路分析独特的调节在感染了甲型H1N1流感的传播途径相关的细胞周期及其调节(p = 4.2 e-20), dna损伤反应(P= 4.2 e-9)、细胞凋亡(P= 1.3)的军医,蛋白质降解(P= 4.1)的军医。图2列表顶部过多生物学途径的统计学意义。

与甲型流感感染、基因表达签名不存在在细菌性肺炎。独特的基因调节响应细菌性肺炎(n= 253)没有过多在任何生物通路或网络本体,暗示一个通用的炎症和免疫反应,但没有具体的应对细菌感染。

更多的基因调节在众位(586个基因)。进一步分析表明,他们过多在多个生物通路和网络本体,包括炎症反应(P= 6.3 e-6),细胞分化(P= 1.6 e-5),血管生成(P= 1.1)的军医,免疫系统响应(P= 2.6)的军医。这是符合已知的生物学的众位,这是一个非特异性宿主应对各种各样的压力,包括创伤、手术和感染。

大量的基因表达下调在H1N1流感感染,细菌感染,SIRS组(图1 b)。生物通路的表达下调的基因进行分析的三个患者表型(图3)。甲型H1N1流感的一组(934独特的基因),许多基因在炎症反应和免疫系统响应路径过多。进一步审问到不曾通路显示激活和信号通路的白细胞介素(引发,2、IL-15、il - 6、il - 10 IL-7, IL-3, IL-13, IL-17,和IL-23)严重过多的表达下调基因列表。这表明一个重要的免疫抑制程度严重的甲型H1N1流感感染病例。相比之下,在差别的程度对这些基因的生物学途径是大大减少细菌感染和SIRS组(图3)。

通路分析之间的直接比较甲型H1N1流感和细菌组显示一致的图片,与671年H1N1流感基因调节与细菌相比(罗斯福通过使用线性混合模型,5%)表现出显著的群体细胞周期及其调节本体(P= 2.9 e-20)。dna损伤反应也在这个列表的基因(高纯度P= 6.9平台以及)。则没有这种群体细胞循环通路的78个基因表达水平较高的细菌感染组(P= 0.35)。生物通路过多的78个基因包括免疫和炎症反应。然而,这些免疫/炎症基因也在众位调节,因此没有特定于细菌性肺炎。

最引起的免疫细胞亚群的基因表达信号之前概述如图4揭示了免疫细胞反褶积。更neutrophil-tagging基因调节细菌组较甲型H1N1流感肺炎(P= 2.4 e-17)。相反,更表示辅助cell-tagging基因被发现在前100名甲型H1N1流感肺炎调节基因(P= 2.1 e-11)。此外,b细胞基因明显的过多的甲型H1N1流感肺炎组相比,细菌组(P= 0.0062)。这些发现符合已知的生物感染、细菌感染是由neutrophil-dominant反应和病毒感染是由lymphocyte-dominant响应。在5天的病人随访,辅助cell-tagging基因的表达水平一直高于H1N1甲型流感,而neutrophil-tagging基因的表达水平是持续较高的细菌组,如图5。

一群基因众所周知与病毒感染有关,称为干扰素刺激基因,在甲型H1N1流感基因高度代表签名。与基因集富集分析,干扰素刺激基因丰富的基因过表达显著H1N1甲型流感肺炎,与健康对照组相比(罗斯福= 0.0010)。相比之下,即使在5%的罗斯福,没有观察干扰素刺激基因在基因过表达意义在细菌性肺炎,与健康对照组相比(罗斯福= 0.080)。我们重复分析通过直接比较细菌和甲型H1N1流感组。再一次,一个非常重要的浓缩的干扰素刺激基因在基因过表达甲型H1N1流感(罗斯福= 0.0010),但不是为一组基因过表达细菌组(罗斯福= 0.97)。

因为H1N1流感感染组显示独特的基因表达型不同于细菌感染,我们探索潜在的使用来诊断基因表达型H1N1甲型流感感染。通过使用支持向量机算法,我们发现29-gene类预测非常准确鉴别甲型H1N1流感的感染细菌性肺炎(图6)。这种区分细菌和病毒感染的能力是一致的在5天的病人随访(见附加文件1数字S1和S2)。当这类预测是两个独立的测试数据集,它被证明提供清晰的分离的甲型H1N1流感肺炎病人从一个健康控制队列,和细菌性肺炎病人从一个含有甲型流感和流感患者群B-infected个人。这些结果支持类的健壮性预测,明确分离是在独立的数据集生成通过使用不同的微阵列平台和归一化方法。

出奇地低重叠时发现比较29-gene类与类预测提出了研究预测了泽滋的先前的研究等。(24]基因(30)和Ramilo等。(22)(35)的基因。只有五个基因出现在不止一个“三基因签名列表:IFI44 LY6E, mx₁, OAS1,IFI27(见附加文件1、表S3)。值得注意的是,这五个基因是一个行之有效的interferon-inducible基因。

29-gene签名的进一步分析显示,生物传播的途径与细胞周期及其调节(P= 2.1)的军医。特定的细胞循环通路过多是过渡和终止DNA复制(P= 7.1)的军医,开始在早期年代DNA复制的阶段(P= 9.3)的军医。没有其他途径本体是明显的过多29-gene签名。免疫细胞反褶积的29-gene签名显示14 29主要是辅助细胞中表达的基因。这一发现表明,29-gene签名反映了在流感感染t细胞反应。

的诊断性能29-gene签名识别病毒感染仍然很高甚至并发细菌合并感染患者。我们执行一个分析血液样本的三个患者感染甲型H1N1流感和叠加细菌感染。图7显示了这些新样本后的聚类分析纳入我们的原始数据集。29-gene签名,所有甲型H1N1流感样本落入第一个集群,而细菌或众位样本分组在第二个集群。重要的是,这三个病毒和细菌合并感染患者的甲型H1N1流感。这表明29-gene病毒签名是不受细菌合并感染的存在。这三个的一个病人有一个额外的样品收集了13天。此时,甲型H1N1流感肺炎已解决;然而,细菌感染。我们注意到有兴趣的第十三天样本更类似于细菌感染组的基因表达。13天重复聚类分析表明,这个病人已经迁移到细菌和先生们集群(数据未显示)。

我们的遗传损伤表达式分析数据显示,甲型H1N1流感肺炎免疫反应基因表达水平检测。这种免疫反应持续超越的第一个24小时进入ICU和出现在5天的随访。此外,甲型H1N1流感的签名是高度一致的,因为它仍可检测患者并发细菌感染的一个子集。此外,这个签名是非常特定于病毒性肺炎(流感),因为它是独特的不同于基因表达的细菌性肺炎,或任何可能模仿宿主炎症反应的条件。因此我们的数据提供了概念验证证据表明基因表达分析可能确定急性肺部感染的病因在危重患者中,允许更具体的病人护理。

我们的研究解决了一个重要的问题在当前的流感感染的诊断。目前危重病人的诊断是困难的,因为流感病毒抗原之间缺乏相关性测试和临床状态。例如,许多influenza-infected个人测试为阴性流感病毒(25]。我们的研究表明,诊断的关键是存在的异常免疫反应与流感病毒有关。这使得生物,因为它是异常免疫反应,决定了发展为严重疾病,或有时,死亡。29-gene签名反映了特异性宿主的免疫反应。这允许将流感感染诊断正确,独立于病毒抗原检测的结果。另外,随着时间的流逝29-gene签名的坚持可以诊断病毒性肺炎入住ICU后至少5天。许多危重病人出现晚,经常与即将到来的呼吸衰竭。在这个阶段,病毒传染很小,小病毒抗原检测率也较低。另一个有用的应用我们的基因表达特征将协助诊断细菌合并感染患者。在流感季节期间,许多患者细菌性肺炎也为流感病毒检测呈阳性,很难确定感染的病因。 The 29-gene viral gene signature has the potential to resolve diagnostic uncertainty in this situation by directly demonstrating the presence of a virus-specific immune response. These results warrant further exploration in a future diagnostic study in which the gene-expression signature can be validated in a large independent patient cohort.

反褶积的遗传基因表达数据,开发的一种新方法来洞察免疫cell-subset基因表达(10,26,27),显示一个强大的辅助cell-expressed表示基因调节的遗传基因签名甲型H1N1流感a之前发现报道,甲型H1N1流感感染的特点是辅助细胞的反应,特别是类型1和类型17辅助细胞(28]。相反,缺乏辅助细胞反应是在细菌性肺炎的基因签名,由大表示neutrophil-expressed特征基因。这个发现增强了我们发现我们29-gene病毒签名反映了实际的主机在流感感染的免疫反应。

我们的研究还揭示了两个令人惊讶的新发现。首先,免疫和炎症通路基因已经被传统认为是宿主应对流感感染的主要决定因素。我们的研究结果表明,基因与细胞周期及其调节流感感染的宿主反应的主要因素,而大多数免疫和炎症基因表达下调。点转向差别这对这些免疫抑制状态,尤其是对于许多interleukin-receptor和信号通路。这一发现有潜力的诊断意义。几十年来,炎症或免疫反应基因和蛋白质进行了调查的效用作为细菌和病毒感染的诊断标志物。然而,许多这些标记没有因为缺乏特异性(例如,表达的标记病毒和细菌感染)。我们的研究结果表明,细胞cycle-related基因可能提供可选择的候选人的诊断标志物。

第二个令人惊讶的发现是,我们的研究未能识别特定于细菌性肺炎的免疫反应。少量的基因特异表达独特的细菌感染组。然而,这些基因的分析显示,没有特定的生物学途径或网络明显的过多了。细菌的基因表达模式组最相似的SIRS组,证明大重叠基因这两个组之间的维恩图(图1),在聚类分析(图7)。进一步的证据支持缺乏独特的免疫反应细菌性肺炎时安装的先生们和细菌性肺炎军团直接比较,利用线性混合模型。这两个表型之间没有显著不同的基因表达在5%罗斯福(数据没有显示)。缺乏bacteria-specific基因签名形成鲜明对比的发现29-gene特异签名。

在这项研究中,我们专注于一个特定的病毒性肺炎,流感大流行的H1N1流感A的结果我们已经提出,我们不能得出结论是否我们已经确定的基因表达特征是特定于大流行性H1N1流感病毒感染,针对所有亚型流感,或者一个通用的应对呼吸道病毒(例如,鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感A和B)。这是写给一个小程度上:我们使用一个独立的测试数据集包含甲型流感和B-infected个人。在这个数据集,所有的influenza-infected样品表现出类似的基因表达特征,以支持向量机计算的整数(图6 b)。已经由其他人试图解决这个问题,包括多种呼吸道病毒类型(24),他们的研究结果指向一个相对守恒的宿主对病毒感染的反应的性质。签名,区分一个响应病毒与细菌感染会有助于肺炎患者的临床管理。混杂变量,如治疗干预措施的影响,包括药物,在以后的研究中应该解决更大的样本量;然而,这是本研究的范围之外。

我们已经确定了一个T-cell-dominant基因表达特征与主机相关联响应严重流感肺炎。这个签名提供了一个洞察流感和可能的病理生理学作为一种诊断方法,协助重症社区获得性肺炎的管理。这种方法的有效性需要进一步研究在一个大的独立的病人队列。

• 甲型H1N1流感的遗传损伤的基因表达明显不同于细菌性肺炎和全身炎症反应综合征。

• 增加基因的表达水平与细胞周期及其调节流感感染的宿主反应的主要因素,而大多数免疫和炎症基因表达下调。

• 反褶积的遗传基因表达数据揭示了一个强大的辅助cell-expressed表示基因调节的遗传基因签名严重的甲型H1N1流感。

APACHE II:

急性生理和慢性健康评估得分第二

背景:

脱氧核糖核酸

罗斯福:

Benjamini和其错误发现率

加护病房:

重症监护室

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

存在:

定量逆转录酶聚合酶链反应

RNA:

核糖核酸

先生们:

全身炎症反应综合征

支持向量机:

支持向量机。

这项工作的部分支持由Nepean急救护理学院的教育和研究和Nepean医学研究基金会。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。作者表达真诚的感谢Nepean医院ICU研究协调小组,由数控蕾奥妮Weisbrodt,患者招募和样本收集;安妮·梁系的麻醉和重症监护,伊丽莎白女王医院;荣华燕ICU,帕梅拉Youde医院;雷蒙德·李的ICU,段妈妈医院;组织和收集的样品从香港;我们感谢威斯特年研究所的Stephen Schibeci实验室技术支持。

从属关系

1. 重症监护医学部门,悉尼大学Nepean临床学校,医院和Nepean Derby街,Kingswood, 2747年,澳大利亚

   格兰特P帕内尔,安东尼·麦克莱恩,Marek Nalos Stephen J黄&唐本杰明·M

2. 免疫学和过敏研究所,威斯特年研究所,达西路上,韦斯特米德,2145年,澳大利亚

   David R展位

3. 癌症研究计划,Garvan医学研究所的,Darlinghurst, 2010年,澳大利亚维多利亚街384号

   尼古拉·J·阿姆斯特朗

4. 学校的数学和统计,新南威尔士大学,肯辛顿,2052年,澳大利亚

   尼古拉·J·阿姆斯特朗

5. 代谢保健和老年医学,查尔斯大学医院,581年Sokolska Hradec Kralove, 500 00,捷克共和国

   1月海豹打捞器

6. 重症监护室北区医院9阿宝亲属路,上水、香港

   威尔逊唐

7. 尤德夫人东部医院重症监护室,3洛克人路,柴湾,香港岛,香港

   Oi-Yan Tam

8. 麻醉和重症监护,伊丽莎白女王医院30加斯科因路,香港九龙

   斯坦利·陈

相应的作者

对应到格兰特P帕内尔。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

BT, SH、我和医生的构思和设计实验。医生进行了实验。全科医生、DB和NA分析数据。医生写的手稿。全科医生、BT和DB解释数据。JM, WT、OT SC、锰、BT,医生,病人SH进行招聘和临床数据的收集。BT、SH、锰、钠和贡献的修订手稿。所有作者阅读和批准出版的手稿。

再版和权限