对皮肤和外周血单核细胞/巨噬细胞子集来自系统性硬化症患者

介绍

最近越来越多的证据表明巨噬细胞系的重要参与系统性硬化症(SSc)的发病机理。分析装配单核细胞/巨噬细胞的人口,我们评估的表达CD163 CD204和各种激活巨噬细胞标记,在皮肤的炎症细胞和外周血单核细胞(PBMCs)来自SSc患者。

方法

皮肤活检标本6健康控制和10 SSc患者(7有限的皮肤SSc和3弥漫性皮肤SSc)被使用单克隆抗体免疫组织化学分析CD68 (pan-macrophage标记),CD163 CD204。表面和/或细胞内蛋白质的表达CD14(单核细胞谱系的标志),CD163和流式细胞术分析了CD204 PBMCs从16名健康对照组和41 SSc患者(26有限的皮肤SSc和15弥漫性皮肤SSc)。使用Mann-Whitney U统计分析进行了测试比较的意思。

结果

从SSc患者皮肤,CD163的数量⁺细胞或CD204⁺细胞间胶原纤维明显高于健康对照组。流式细胞术显示,CD14的人口⁺细胞也显著大于PBMCs SSc患者比健康对照组。CD14的进一步分析⁺SSc病人透露CD163的高表达和细胞的存在两个独特的山峰CD204直方图。此外,我们发现CD163⁺属于细胞CD14^明亮的CD204⁺人口。

结论

这是第一个报告表明CD163⁺或CD204⁺激活巨噬细胞可能是一个潜在的SSc皮肤的纤维发生的监管机构。此外,这项研究表明部分PBMCs SSc患者异常区分成CD14^明亮的CD163⁺CD204⁺子集。SSc的特定子集可能发挥重要作用在这种疾病的发病机制,为CD163的来源⁺或CD204⁺巨噬细胞在皮肤上。

系统性硬化症(SSc)是一个multiorgan病因不明的疾病,特点是激活免疫细胞,产生自身抗体和微血管损伤,导致纤维化(1- - - - - -6]。组织病理学特征的SSc炎性浸润在疾病早期阶段和细胞外基质蛋白的积累导致组织纤维化。炎性浸润被巨噬细胞和T细胞(7,8]。

骨髓单核细胞,它离开,进入循环,已经成熟的细胞(如吞噬微生物和分泌细胞因子),但这些功能会进一步分化为巨噬细胞和树突细胞在外围组织9]。尽管激活巨噬细胞的定义仍然是有争议的,巨噬细胞的异质性讨论关于各种微环境刺激的不同反应。巨噬细胞是经典激活对M1表现型由微生物产品或干扰素(IFN) -γ。M1巨噬细胞il - 12^高,IL-23^高,il - 10^低表型和生产氮中间体和炎性细胞因子,如IL-1βTNF-α,il - 6,促进积极的炎症(10,11]。相比之下,巨噬细胞可以通过刺激或者激活对M2表型与il - 4或IL-13 [10- - - - - -12]。他们是与高度血管化和伤口修复。此外,这些巨噬细胞可以在某些纤维化疾病中发挥作用,产生转化生长因子(TGF) -β[13]。CD204被公认为M2标记(14,15),而CD163也被称为激活巨噬细胞的标志之一;CD163(血红蛋白清道夫受体)据报道上调激活巨噬细胞il - 10的刺激下(16]。

另一方面,一些研究人员报道il - 4的表达水平增加,IL-13, SSc血清中il - 10 (17- - - - - -19]。他们是负责激活巨噬细胞的细胞因子如前所述,暗示CD163参与的可能性⁺或CD204⁺激活巨噬细胞在SSc的发病机制。激活巨噬细胞被认为是特别皮肤病患者包括SSc和fibrosis-inducing细胞因子具有潜在的重要来源,如TGF-β[7,8]。此外,激活循环单核细胞也被报道SSc病人,支持的这些细胞可能参与该病的发病机理(20.,21]。然而,CD163之间没有联系⁺或CD204⁺单核/巨噬细胞系和SSc已经建立在皮肤或外周血SSc的病人。

因此,为了更全面地探索SSc患者的免疫细胞调节改变的性质,我们显示细胞的分布与CD163或CD204皮肤健康对照组和SSc患者免疫组织化学。此外,我们评估了CD163人口⁺或CD204⁺细胞循环单核细胞的SSc病人流仪分析。我们建议CD163⁺或CD204⁺巨噬细胞在皮肤和CD14^明亮的CD163⁺CD204⁺周边血液中单核细胞子集参与SSc的发病机制。

病人和控制

51 SSc患者平均(±标准差(SD)) 57.3±14.1岁来自韩国日本和参观了美国皮肤科门诊,熊本、日本熊本大学医院。患者分为弥漫性皮肤SSc (dcSSc;n = 18)和有限的皮肤SSc (lcSSc;n = 33)据勒罗伊和他的同事们提出的分类系统(22]。表1总结了病人的临床特征。皮肤活检标本和血液样本从患者获得伦理委员会批准后的熊本大学并获得书面知情同意。作为健康对照组,22无病志愿者(平均年龄;44.1±42.0岁)参加了这项研究。

抗体的免疫组织化学

以下使用抗体:anti-human-CD68(稀释1:300;鼠标反人类免疫球蛋白(Ig) G1,克隆KP1;DakoCytomation, Carpinteria、钙、美国),anti-human-CD163(稀释施用;鼠标反IgG1,克隆10 d6;英国Novocastra)和anti-human-CD204(鼠标反IgG1、克隆SRA-E5反式基因,熊本,日本)(23,24]。

免疫组织化学

皮肤活检样本影响前臂的七个lcSSc,三个dcSSc患者neutral-buffered 10%福尔马林固定,石蜡嵌入式,切片的大小4μm。部分在二甲苯deparaffinized和水化后乙醇分级系列、抗原被孵化检索与胰蛋白酶(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 30分钟反CD68抗体。为染色了反CD163或CD204抗体,deparaffinized部分被孵化与检索目标检索解决方案(美国Dako Carpinteria, CA)或柠檬酸缓冲pH值6 5分钟用微波炉,分别。内源性过氧化活性抑制,之后部分孵化与5%正常山羊血清20分钟,然后反应与单克隆抗体(anti-CD68 CD163,或CD204抗体)六个小时在4°C。与PBS多余的抗体被淘汰后,样本孵化与辣根peroxidase-labelled山羊anti-mouse抗体(Nichirei、东京、日本)60分钟。使用diaminobenzidine底物的反应是可视化系统(Dojin、熊本、日本)。幻灯片是轻和迈耶的苏木精复染色,光学显微镜下检查(奥林巴斯BX50、东京、日本)。阳性细胞数了三次,结果表示为每10000μm阳性细胞的平均数量²使用ImageJ(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

抗体对流式细胞术

单克隆鼠标反CD14-phycoerythrin-cyanin 5.1 (PC5)(美国贝克曼库尔特公司,富勒顿,CA)和反CD163-phycoerythrin (PE)(美国圣地亚哥BioLegend Inc . CA)被用于表面疣状。反CD204(鼠标反IgG1,克隆SRA-E5)从反式购买使用免疫球蛋白基因(熊本、日本)和提纯净化Kit-A (Dojindo实验室、熊本、日本)。纯化CD204抗体是顺序共轭与异硫氰酸荧光素(FITC)使用荧光素标签Kit-NH2 (Dojindo实验室、熊本、日本)。荧光素/蛋白质的吸光度比例是由解决方案在208 nm和500 nm。CD204-FITC抗体被用于表面和细胞内染色。适当匹配同形像控制马伯每个抗原单克隆抗体被用于控制。

隔离PBMCs

外周血单核细胞(PBMCs)获得肝素化静脉血,用梯度离心/ Ficoll-Paque +(美国新泽西州Amersham生物科学公司)根据制造商的协议。

流式细胞术

孤立的细胞数量PBMCs(大约5×10⁵)测定Burker-turk线(Erma、东京、日本)和阻塞货代货代阻塞试剂(Miltenyi研究GmbH, Bergisch格拉德巴赫,德国)10分钟4°C。然后,细胞(5×10⁵)在每个试管孵化与isotype-matched控制抗体染色或相关抗体(CD14, CD163或CD204)在黑暗中在室温下15分钟。细胞内染色,细胞被固定和permeabilized根据制造商的指示使用内部预科(美国贝克曼库尔特公司,富勒顿,CA)。然后在PBS细胞被洗一次,进一步培养细胞内染色isotype-matched控制抗体或相关抗体CD204在黑暗中在室温下15分钟。最后,细胞被洗了三次,500年resuspendedμl PBS含有0.5%甲醛、和分析使用Cytomics FC 500(美国贝克曼库尔特公司,富勒顿,CA)。数据转换与FlowJo软件(树星公司,亚什兰,美国)。单核细胞是封闭的基于forward-sideward分散配置文件和CD14表达被用来验证是否封闭细胞确实是单核细胞。

统计分析和临床意义

统计分析进行了使用Mann-Whitney U测试手段和斯皮尔曼等级相关系数的比较来评估相关的因素。每个蛋白质表达水平检测到流式细胞术是由平均荧光强度(MFI)。P值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有数据都表示为平均数±标准差。

首先,我们确定是否激活巨噬细胞在SSc皮肤渗透。我们发现细胞阳性CD68 (pan-macrophage标记),CD163和CD204之间增加不仅血管周的地区,而且胶原束增厚的皮肤SSc病人(图1)。当细胞数量(每10000μm随机选择的区域²数,CD68的数量⁺,CD163⁺或CD204⁺SSc患者的皮肤细胞比健康对照组(5.3±2.5 vs 2.2±0.2, 4.0±2.0 vs 1.3±1.0, 3.5±1.6 vs 1.5±0.5,分别;P< 0.05)。此外,评估贡献巨噬细胞纤维化,我们进一步计算巨噬细胞间胶原束的数量,不包括血管周的和periappendageal浸润的巨噬细胞(表2)。CD68的数量没有区别⁺细胞之间健康控制和SSc的病人。然而,CD163的数量⁺细胞和CD204⁺皮肤胶原纤维之间的细胞SSc患者显著高于健康对照组(3.8±0.8 vs 1.2±0.5, 3.6±0.6 vs 0.4±1.6,分别;P< 0.05、表2)。CD68的数量⁺,CD163⁺或CD204⁺细胞在胶原束之间的随机选择区域或dcSSc皮肤没有明显不同于lcSSc皮肤。因此,巨噬细胞在胶原纤维之间表达CD163被激活⁺和CD204⁺SSc的皮肤,不改变巨噬细胞的总数。

回答这个问题为什么激活巨噬细胞的浸润是增加SSc皮肤,然后检查PBMCs CD14阳性,这是被广泛接受作为一个有用的单核细胞谱系的标志,SSc患者通过流式细胞术(图2)。CD14的人口⁺PBMCs也显著大于SSc患者比健康对照组(19.6±7.8%和11.5±5.1%,P> 0.05;图2 b)。之间没有显著差异lcSSc和dcSSc病人的人口规模(P= 0.45)。我们证实,CD14⁺人口是单核细胞,向前的概要文件和侧光散射。我们下一个调查表达水平的激活巨噬细胞标记(CD14 CD163和CD204)⁺PBMCs SSc患者和健康对照组的检测MFI(图3)。我们决定染色表面和胞内CD204因为每个表面或细胞内CD204 MFI没有足够高的检测(数据未显示)。此外,它也被报道,CD204主要表达在内质网,核膜和non-monocyte谱系细胞的高尔基体,但搬到细胞表面和单核细胞宗族例如细胞的核内体24]。MFI CD14 CD163⁺PMBCs lcSSc和dcSSc患者明显高于健康对照组(数字3和3 b),这表明单核细胞在SSc PMBCs已经表达激活巨噬细胞标记。另一方面,小额信贷机构在CD14 CD204⁺PMBCs lcSSc或dcSSc患者与健康对照组相比没有明显改变(图3 b)。值得注意的是,表面和胞内CD204的柱状图显示两个峰值;显然弱和强阳性人群(数字3和3 c)。染色只有表面CD204没有显示这样独特的山峰在健康对照组和SSc病人(数据未显示)。事实上,SSc病人CD204直方图峰值的数量明显高于健康对照组(图3 c)。

进一步描述CD14的特点⁺由CD14-PC-5 PBMCs,我们进行三色染色,CD163-PE, CD204-FITC抗体。CD14的百分比增加⁺细胞PBMCs SSc患者与健康对照组(图2)是由三色染色证实(23.4% vs 8.1%,数字4i和ii)。清楚地表明存在CD14扩展直方图表示^昏暗的和CD14^明亮的亚种群中CD14⁺PMBCs CD14的百分比^明亮的亚种群增加SSc患者与健康对照组(8.6% vs 0.8%;数据4iii和iv)。此外,点阴谋CD14和CD163染色证明CD163的代表⁺细胞属于CD14^明亮的分组人口健康对照组和SSc病人(图4 b)。扩展点表示还透露CD14的阴谋^明亮的CD163⁺分组人口中的CD204(图4摄氏度)。CD14的人口^明亮的CD163⁺CD204⁺子集的SSc PBMCs明显高于健康对照组(11.0±9.0%和1.2±0.1%,P< 0.05;图4 d)。综上所述,CD14的存在^明亮的CD163⁺CD204⁺单核细胞可能在SSc PBMCs特征子集。

我们的研究揭示了三个主要的发现。首先,从SSc患者皮肤,CD163和CD204-positive激活巨噬细胞在胶原纤维之间在健康对照组相比显著增加。其次,从SSc PBMCs病人,CD14的人口⁺细胞显著高于健康对照组。第三,在SSc CD163 CD14的表达水平⁺PBMCs也显著高于健康对照组和CD163⁺细胞属于CD14^明亮的CD204⁺人口SSc的病人。

表达CD204与抗炎有关M2巨噬细胞表型和被认为是用于区分M2巨噬细胞炎性M1的巨噬细胞(14,15,25]。M2巨噬细胞,增加纤维化的早期阶段。这些细胞释放大量的促炎和纤维发生的介质如TGF-β[17]。我们之前报道的M2巨噬细胞数量增加,CD204⁺局限性硬皮病患者皮肤细胞,从(26]。这项研究表明一个重要的角色的M2巨噬细胞(即分泌TGF-β)SSc以及局限性硬皮病的发病机理。

确切的机制或CD163激活巨噬细胞上表达的意义还不清楚的命名不同巨噬细胞子集仍在不断发展之中,尽管最近的一篇文章中描述的M2巨噬细胞可以进一步细分为M2a (il - 4或IL-13之后),M2b(形成免疫复合物结合IL-1β或脂多糖)或M2c(接触il - 10后,TGF-β或糖皮质激素)(27]。巨噬细胞阳性CD204 CD163可能扮演了重要的角色在组织纤维化的形成。

CD14的人口⁺细胞循环单核细胞SSc患者据报道(21]。安德鲁和他的同事们(21)没有发现显著差异CD14的百分比⁺PBMCs SSc和健康对照组之间使用荧光显微镜方法,而CD14的人口增加⁺PBMCs SSc患者被发现通过流式细胞术在我们的研究中。这种差异可能是由于在早期研究中使用的不同的方法。减少或增加CD14的数字⁺细胞在病理条件下已报告(28,29日]。循环CD14⁺单核细胞来源于骨髓的造血干细胞。最近报道,il - 10的加入到新孤立的人类单核细胞CD14 mRNA导致相当大的增加在体外(30.]。增加数量的CD14⁺细胞在我们的研究中可能部分解释为增加的直接结果SSc患者血清il - 10,如上所述[17,19]。因此,我们推测,增加循环CD14的数字⁺电池可以增加CD68的来源⁺SSc患者巨噬细胞在皮肤上,来自单核细胞迁移。

CD163 PBMCs SSc的病人的表达水平明显高于健康对照组的研究。另一方面,安德鲁和他的同事们(21)也报道,SSc患者单核细胞与正常对照组和不同似乎发生了先进的分化和激活的变化(即更大数量的增加和轻酯酶染色阳性细胞,减少植物血凝素花生凝集素绑定和减少低浓缩铀平方米表面抗原阳性细胞的数量)。CD163表达的意义在单核细胞(巨噬细胞)也是未知的。高CD163 SSc CD14表达⁺PBMCs在我们的研究可能表明先进的单核细胞分化成活动状态。考虑到CD163表情单核细胞由pro-anti-inflammatory调制介质如il - 10 (16,31日),CD163数量增加⁺细胞CD14⁺PBMCs在我们的研究中可能被解释为增加的直接结果SSc患者血清il - 10 (17- - - - - -19]。同时,另一个调查员最近报道说,基因表达水平的增加CD204 PBMCs在急性冠脉综合症患者和得出结论,CD204水平可以预测标志的reattack心血管事件(32]。因此,我们发现在SSc CD14 CD204直方图的独特模式⁺PBMCs可能表明异常活化的单核细胞。作为CD14^明亮的CD163⁺CD204⁺从健康对照组细胞没有明显PBMCs,单核细胞的存在可能对这种疾病非常具体的子集。综上所述,这个子集的单核细胞可能起着重要的作用在SSc CD163的来源⁺或CD204⁺巨噬细胞在皮肤上。

我们的研究结果有一定的局限性。首先,我们不能执行CD68的三重染色,CD163和CD204在同一使用串行皮肤巨噬细胞部分。第二,我们找不到任何的表达之间的相关性CD163或CD204皮肤巨噬细胞或CD14的百分比^明亮的CD163⁺CD204⁺PBMCs细胞和血清细胞因子(如il - 10)水平,存在已知的疾病相关因素(如修改Rodnan皮肤分数)或治疗我们决定(数据未显示)。今后还需要进一步的研究。

根据报道的证据,包括目前的结果,我们得出这样的结论:CD163⁺或CD204⁺激活巨噬细胞可能是一个潜在的SSc皮肤的纤维发生的监管机构。此外,这项研究表明部分PBMCs SSc患者异常区分CD14^明亮的CD163⁺CD204⁺子集。进一步的研究来分析单核细胞/巨噬细胞的参与将提供一个更好地理解这种疾病的发病机理。

dsSSc:

弥漫性皮肤的系统性硬化病

FITC:

荧光素isothiocynate

IFN-α:

interferon-α

搞笑:

免疫球蛋白

IL:

白介素

lcSSc:

有限的皮肤的系统性硬化病

马伯:

单克隆抗体

小额信贷机构:

平均荧光强度

PBMCs:

外周血单核细胞

PBS:

磷酸盐

PC5:

phycoerythrin-cyanin 5.1

体育:

藻红蛋白

SD:

标准偏差

SSc:

系统性硬化病

TGF-β:

改变增长factor-β

TNF-α:

肿瘤坏死factor-α。

我们感谢Chiemi Shiotsu和Junko铃木在实验室提供的宝贵援助。

从属关系

1. 皮肤病学系和整形手术,生命科学学院,熊本大学1-1-1 Honjo,熊本,860 - 8556年,日本

   第一Masatoshi Jinnin Nobuyo Higashi-Kuwata,牧野,隆光Satoshi福岛,C Muchemwa与Hironobu Ihn Yuji井上信心

2. 输血医学和细胞疗法,生命科学学院,熊本大学1-1-1 Honjo,熊本,860 - 8556年,日本

   Yuji米村

3. 部的细胞病理学、生命科学学院、熊本大学1-1-1 Honjo,熊本,860 - 8556年,日本

   喜田岛Komohara & Motohiro Takeya

4. 血液学和传染病,生命科学学院,熊本大学1-1-1 Honjo,熊本,860 - 8556年,日本

   总裁中西宏明迁址

5. 实验Retrovirology部分,艾滋病毒和艾滋病恶性肿瘤分支,9000洛克维尔派克,贝塞斯达国家癌症研究所医学博士,20892年,美国

   总裁中西宏明迁址

相应的作者

对应到正敏Jinnin。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

嗨,乔丹设计研究。NHK报道,太,YY, FCM辅助研究设计,负责项目运行和数据分析,起草了手稿。TM、科幻、彝族、YK和HM研究设计和协调,协助并监督数据分析和绘图的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

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