吸烟对健康间歇性吸烟者炎症的急性影响

背景

慢性吸烟是慢性阻塞性肺疾病的主要危险因素。了解初次接触烟雾时的反应可能有助于了解慢性吸烟造成的变化，因为反复的急性烟雾影响可能会累积并导致不可逆的肺损伤。

方法

我们在一项开放随机交叉研究中调查了16名健康间歇性吸烟者吸烟对炎症的急性影响。我们比较了吸烟两种香烟在0、1、3、6、12、24、48、96和192小时对呼出空气、诱导痰、血液和尿液中炎症标志物的影响，以及不吸烟的结果。所有痰液和血液参数均采用线性混合效应模型进行对数转换和分析。

结果

重要的发现是:与不吸烟相比，吸烟在0 - 1小时内增加了呼出的一氧化碳，并在0 - 3小时内诱导血液嗜酸性粒细胞和痰淋巴细胞更大程度的减少。与不吸烟相比，吸烟在0 - 3小时内诱导受刺激的血细胞释放更多的白细胞介素-8，在3 - 12小时内诱导痰淋巴细胞和中性粒细胞增加更多。

结论

我们得出的结论是，除了慢性吸烟引起的炎症增加外，吸两支烟对特定的炎症参数也有抑制作用。

慢性阻塞性肺病(COPD)是全世界发病和死亡的主要原因之一，其患病率仍在上升[1］．为了制定预防和治疗策略，重要的是要了解这种疾病的潜在病理生理机制。由于慢性吸烟是发生COPD的主要危险因素，该领域的大多数研究都是在患有或不患有COPD的慢性(前)吸烟者中进行的。研究对香烟烟雾的初始反应，以更好地了解慢性吸烟的影响也很重要，因为重复的急性烟雾影响可能会累积，最终导致与COPD相关的不可逆肺损伤。此外，为了适当评估慢性吸烟的影响，应确定急性吸烟的“背景”影响。

到目前为止，只有少数研究调查了吸烟对人类的急性影响[2］．不幸的是，这些研究只调查了少量吸烟后的时间点，因此关于吸烟引起的变化的时间过程和解决方案的信息很少。此外，所有研究都评估了戒烟24小时以上的慢性吸烟者吸烟的急性影响。目前尚不清楚这是否足够长，以排除以前吸烟对急性吸烟结果的影响。最后，到目前为止还没有研究研究急性烟雾对痰的影响。

在本研究中，我们调查了吸烟两支的急性影响，这些健康的间歇性吸烟者在研究期前9天没有吸烟。这样，长期吸烟对呼吸道造成的暂时影响可能不会影响对吸烟的急性反应。我们评估了吸烟对呼出空气、诱导痰、血液和尿液炎症反应的诱导和消退的时间影响。我们假设吸两支烟会在有限的时间间隔内引起炎症细胞和标志物的增加。

研究设计

我们进行了一项随机、两期交叉的初步研究。受试者被随机分为吸两支烟组和不吸烟组。受试者在每个研究期前9天内不吸烟，通过呼出一氧化碳(CO < 6ppm)和尿可替宁(< 25ng /ml)来验证。两个研究周期之间的时间间隔在9到20天之间。测量呼出一氧化碳、呼出一氧化氮(NO)、抽血和1秒用力呼气量(FEV)₁)分别在吸烟前(基线)、吸烟后1、3、6、12、24、48、96和192小时以及禁烟期间的同一时间点进行。在吸烟和不吸烟后3、6、12、24、48、96、192小时诱导痰液。所有受试者在30分钟内抽了两支同一品牌的香烟，并被鼓励深吸(Caballero无过滤嘴香烟，焦油12毫克，尼古丁1.0毫克，市售，不送礼)。调查人员确认吸入烟雾是否充足。急诊科的吸痰工作小组最近指出，48小时内不应重复吸痰，以避免延续影响(3.］．考虑到这一点，我们在本研究中采用了交叉设计(包括不吸烟)来纠正这一点延续的效果。我们将对照组的结果作为单独的研究进行了分析，以探讨重复痰液诱导所产生的炎症反应的诱导和缓解[4］．

主题

当地报纸的广告招募了16名健康的间歇性吸烟者。间歇性吸烟被定义为在过去6个月内每月吸烟超过一支，但不是每天吸烟。我们之所以选择调查间歇性吸烟者，是因为他们能够在一段时间内不吸烟(与大多数当前吸烟者相反)，而且他们习惯于吸入烟雾(与不吸烟者相反)。包括年龄大于40岁，肺功能正常的受试者(支气管扩张剂前FEV)₁/IVC[吸气肺活量]>为女性预期的89%，>为男性预期的88% [5和支气管扩张剂前FEV₁> 1升)。排除的受试者有:1)哮喘、过敏性鼻炎或过敏性湿疹病史;2)特异反应，经皮肤点刺试验阳性证实;3)目前有任何呼吸道疾病、咳嗽或咳痰症状;4)在过去8周内有呼吸道感染或在过去4周内有鼻腔感染;5)前8周内使用糖皮质激素治疗;6)前4周内服用过阿司匹林、非甾体抗炎药、扑热息痛或抗组胺药。受试者被要求在研究期间避免接触高环境烟草烟雾的地方。这项研究得到了荷兰格罗宁根大学医学中心医学伦理委员会的批准。所有受试者均获得书面知情同意。

肺功能、呼出NO、CO

FEV₁并根据欧洲呼吸学会的指导方针进行测量[188bet官网地址5]，使用气功描记仪(Jaeger, Wurzberg, Germany)。呼出的NO水平根据美国胸科学会的指南确定[6]，以100毫升/秒的速度呼气，呼气阻力在5至20厘米H之间₂O，使用化学发光分析仪(生态物理学CLD 700 AL)。使用红外CO分析仪测量呼出CO水平(UNOR 6N, Maihak AG，德国汉堡)[7］．

血液分析

使用血液流式细胞仪自动分析血液差异细胞计数(Coulter- stks, Beckman Coulter, Miami, USA)。流式细胞术分析采用了外周血素叶绿素蛋白(PerCP)标记的抗人白细胞抗原(HLA)-DR、藻红素(PE)标记的抗cd11b、异藻蓝蛋白(APC)标记的CD14和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD63单克隆抗体(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ USA)。HLA-DR、CD63和CD11b分别是单核细胞和粒细胞的激活标记。CD14用于区分单核细胞和粒细胞。对未刺激和脂多糖(LPS, 1 ng/ml, BioWhittaker, Walkerville, USA)刺激的血细胞进行功能测定，通过ELISA (Sanquin, Amsterdam, Netherlands)测量肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β， IL-8和IL-10。

痰的诱导和处理

根据改良的标准技术诱导痰液[8]，使用4.5%的高渗盐水。按照Rutgers等的改进方法，在120分钟内处理全痰[8］．收集无细胞上清液，在-80°C下等分储存，等待可溶性介质分析。

痰液分析

采用PerCP标记的抗hla - dr、PE标记的抗cd11b、APC标记的CD14和FITC标记的CD63单克隆抗体(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ USA)对痰细胞进行流式细胞分析。采用免疫细胞学方法量化诱导NO合酶(iNOS)阳性巨噬细胞的百分比。细胞旋用抗CD68单克隆抗体(IgG1同型，Dako, Glostrup, Danmark)作为巨噬细胞和抗iNOS的兔多克隆抗血清进行双染色(Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA)。

在痰液上清中测定以下可溶性介质。没有₂^-/不_3.^-采用Griess反应，采用荧光酶免疫分析法UniCAP ECP (Pharmacia, Uppsala，瑞典)测定嗜酸性阳离子蛋白(ECP)。IL-8和白三烯B4 (LTB4)用商业ELISA法测定(IL-8: Sanquin, Amsterdam, Netherlands, LTB4: Amersham Biosciences, UK)。基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)采用明胶酶谱法测定[9]和组织金属蛋白酶-1抑制因子(TIMP-1) (R&D, Abingdon, UK)。中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性通过显色底物测定(n -甲氧基琥珀酰-ala-ala- proval -p-nitoanilide, Sigma，英国)][10］．

泌尿测量

在吸入烟雾(或对照组)之前，收集尿液部分以测量尿液可替宁。可替宁采用气相色谱-质谱法测定(荷兰格罗宁根药学系)。此外，在24小时内收集所有受试者的尿液，分为5个连续分数:0-1小时、1-3小时、3-6小时、6-12小时和12-24小时，以评估白三烯E4水平(ELISA, Amersham Biosciences, UK)。

统计分析

由于吸烟两支烟对我们参数的急性影响的开始和持续时间未知，因此绘制了所有变量的时间序列。在目视检查这些图的基础上，选择了要分析的时间间隔。使用线性混合效应模型估计参数的斜率[11包括时间(小时)、吸烟(是或否)以及它们之间的相互作用。痰液参数无基线值，故以时间点192小时为基线值。对所有血、痰变量进行对数变换后，模型残差呈正态分布。所有分析均在S-plus 2000中进行(insights Corporation, Seattle, WA, USA)。p值<0.05为有统计学意义。

主题

16例患者的临床特征见表1．15名受试者成功戒烟9天。其中一名受试者在研究开始前五天抽了一根烟，但尿液中的可替宁和呼出的一氧化碳含量都在要求的范围内。对所有16个受试者的数据进行了分析。

呼出NO, CO和FEV₁

在0到1小时之间，吸烟比不吸烟的呼出CO显著增加，随后在1到12小时之间显著减少(表2,图1)．吸烟对呼出no(数据未显示)或FEV无显著影响₁(表2)．

血

在0到3小时之间，吸烟比不吸烟的血液嗜酸性粒细胞数量减少更多(表3.和图2)．吸烟对其他血细胞的数量没有显著影响(表2)3.附加文件1、表1)．在0 - 3小时内，吸烟时LPS刺激的血细胞释放的IL-8比不吸烟时增加更多(表2)3.)．与不吸烟相比，吸烟对TNF-α， IL-10和IL-1β的释放没有显著影响(附加文件)1、表2)．吸烟与不吸烟患者CD14高、低细胞CD11b、CD63、HLA-DR的表达差异无统计学意义(数据未显示)。

痰

吸烟后和不吸烟后24小时内痰细胞总数和百分比见表4．吸烟后3 - 12小时内中性粒细胞数量明显增加(表2)5,图3.)．在0 ~ 3小时内，吸烟组的痰淋巴细胞数量比不吸烟组减少更多5,图4)．然而，在随后的3 - 12小时内，吸烟组的痰淋巴细胞百分比和数量比不吸烟组增加更多(表2)5,图4)．吸烟对痰中嗜酸性粒细胞的百分比和数量无显著影响5,图5)和巨噬细胞(表5)．吸烟对痰中炎症介质的水平也没有显著影响(附加文件)1、表3.)， CD11b、CD63和HLA-DR在CD14高、CD14低细胞中的表达以及iNOS阳性巨噬细胞的数量(数据未显示)。

尿液

与不吸烟相比，吸烟对尿液中白三烯E4水平没有显著影响(数据未显示)。

为了更好地了解长期吸烟的影响，研究对香烟烟雾的初始(急性)反应很重要，因为重复的急性吸烟影响可能会累积并最终导致不可逆的损害。因此，我们调查了吸烟对健康间歇性吸烟者炎症反应的诱导和解决的急性影响。这项研究表明，吸两支烟会严重抑制血液中的嗜酸性粒细胞。此外，吸烟诱导了痰淋巴细胞的双相反应，在最初的吸烟相关抑制后，吸烟比不吸烟时细胞增加更多。最后，吸烟增加痰中性粒细胞和全血细胞中IL-8的释放。

在我们的研究中，一个显著的发现是吸两支烟会减少血液中的嗜酸性粒细胞。其他三项研究也报告了类似的结果:健康女性吸烟者在吸了12支烟后的两小时内，血液中的嗜酸性粒细胞减少[12]，在大鼠暴露烟雾后6小时内的肺组织中[13]，以及烟雾暴露3周后卵清蛋白致敏小鼠肺灌洗液中[14］．嗜酸性粒细胞的减少可能是由于香烟烟雾中有毒物质的直接(凋亡)作用[15]，或香烟烟雾中的抗炎物质，如一氧化碳[16，17］．在我们的研究中，吸烟没有显示出对痰中嗜酸性粒细胞的显著抑制作用，尽管数据显示吸烟后3小时后痰中嗜酸性粒细胞的减少比不吸烟时更多。原因可能是缺乏研究能力，因为在痰中成功测量的数量低于血液中，或者由于在我们的健康非特应性疾病受试者中，痰中嗜酸性粒细胞的基线水平较低。我们必须认识到，在我们的研究中，血液中嗜酸性粒细胞的减少是显著的，但相对较小。

这项研究首次报道了痰可用于研究急性烟雾效应。吸烟后3 ~ 12小时，痰中中性粒细胞增多。与此一致，我们证明了吸烟后LPS刺激的血细胞释放更高的IL-8，这可能有助于增加中性粒细胞的趋化性。中性粒细胞的增加与两项关于吸烟对人类急性影响的研究一致，表明吸烟1小时后支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞增加[18]以及暴露在烟雾中的肺中性粒细胞潴留增加[19］．痰中中性粒细胞快速增加可能是由于中性粒细胞脱离肺血管内皮(即所谓的边缘池)[20.]或从骨髓中募集[21，22］．

吸烟也能在短时间内抑制痰中淋巴细胞的数量。吸烟组比不吸烟组痰淋巴细胞增加较多。最初的下降可能是由于吸烟后黏附分子的快速上调导致肺组织淋巴细胞黏附增加[23]亦可能是由前段所述的抑制性一氧化碳所引起[16］．随后痰中淋巴细胞的增加可能反映了淋巴细胞从组织向痰中流出，痰可视为肺部炎症细胞的垃圾箱。

吸烟并没有影响我们调查的所有炎症标志物。有几个因素可能导致这种反应的缺乏。首先，研究对象的数量和香烟的数量(n = 2)可能太低了。其次，我们可能纳入了一组不同的受试者，以了解他们对香烟烟雾的反应。我们知道大约80%的吸烟者从未患慢性阻塞性肺病。因此，可以想象，我们的一部分健康吸烟者对吸烟没有反应。第三，我们纳入了目前和过去吸烟范围广泛的受试者。第四，痰液可能只反映部分急性气道壁炎症变化[8］．研究吸烟对肺组织的急性影响是很有趣的。最后，香烟烟雾中的CO可能抑制了炎症反应，特别是在早期阶段。持续吸烟后，损害和刺激作用可能会占上风，引起更明显的炎症。

研究吸烟对间歇性健康吸烟者的急性影响既有好处也有坏处。我们选择这个模型有很多原因。首先，与大多数正在吸烟的人相比，间歇性吸烟者可以戒烟三周。其次，间歇性吸烟者的肺功能正常(与COPD相反)，可能(几乎)没有结构性气道变化，这可能会影响对香烟烟雾的正常反应。第三，我们假设在9天的戒断期后检测对吸烟的急性炎症反应比检测慢性烟雾暴露后的反应更容易。最后，间歇性吸烟者习惯于吸入香烟烟雾(与不吸烟者相反)。我们意识到我们的模型有缺点，我们的研究结果不能轻易地推断吸烟或COPD发展的慢性影响。然而，当我们的研究对象与吸烟的COPD患者气道炎症进行比较时，两者都显示痰中中性粒细胞、淋巴细胞和IL-8水平升高。然而，在戒烟后的COPD患者中，淋巴细胞和中性粒细胞没有恢复正常[24]，与这项研究中吸烟的短期急性影响形成鲜明对比。这表明，导致慢性阻塞性肺病持续炎症的不是吸烟，而是气道的结构变化。尽管存在上述局限性，但我们认为，关于吸烟的急性和慢性影响的知识将有助于更好地理解吸烟诱导炎症的机制，而炎症可能是COPD发展的基础。

我们得出的结论是，除了慢性吸烟引起的炎症增加外，吸两支烟对特定的炎症参数也有抑制作用。虽然这似乎是有益的，但它可能会扰乱生理反应，如修复过程，炎症细胞在其中发挥作用。

作者感谢M.A. Star-Kroezen, A.J. van der Laan-Boers, E.M.D.H. Swierenga(肺功能科)进行了许多肺功能测量和痰诱导;I. slots, M. van der Toorn, H.A. Buivenga-Steketee, J.A. Noordhoek(肺病学和过敏症学实验室)用于痰和血液的所有测量;M.D.W. Barentsen(病理学实验室)计数细胞旋上的iNOS阳性巨噬细胞;Dr. R.A. Uges教授和Dr. B. Greijdanus(药学系)为尿可替宁的测量。这项研究由瑞典隆德的阿斯利康公司资助。该研究的部分内容在2003年ATS会议上以摘要形式发表。

从属关系

1. 荷兰格罗宁根大学医学中心肺科

   赫斯特·范德法特，德克杰·斯波斯特马和尼克·海肯

2. 荷兰格罗宁根大学医学中心病理科

   Wim Timens, Machteld N Hylkema & Brigitte WM Willemse

3. 荷兰格罗宁根大学医学中心过敏症科

   Dorothea M de Reus & Henk F Kauffman

4. 荷兰格罗宁根大学医学中心流行病学和统计学系

   H Marike Boezen和Judith M Vonk

相应的作者

给尼克·哈肯的通信。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

HV:参与研究设计，执行研究并起草手稿。

DP:构思研究，参与研究的设计和统筹，帮助起草手稿。

WT:参与了研究的设计，并帮助起草了手稿。

MH:参与研究的设计，协调FACS分析，并帮助起草手稿。

BW:进行了一些实验室分析，参与了研究的设计，并帮助起草了手稿。

HB:进行统计分析并帮助起草手稿。

JV:进行统计分析并帮助起草手稿。

DR:执行和协调大部分实验室分析，并帮助起草手稿。

HK:协调实验室分析，参与研究设计并帮助起草手稿。

NH:构思研究，参与设计和协调研究，并帮助起草手稿。

转载及权限