上皮细胞衰老会损害呼吸道损伤后修复过程和加剧炎症

背景

基因毒性压力、如暴露于溴脱氧尿苷(BrdU)和香烟,诱发细胞过早衰老。最近的证据表明,各种类型的细胞的细胞衰老加速慢性阻塞性肺病患者。然而,气道上皮细胞的衰老是否会导致呼吸道疾病的发展是未知的。本研究旨在测试假设过早衰老的气道上皮细胞(克拉拉细胞)会损害呼吸道损伤后修复过程和加剧炎症。

方法

C57 / BL6J老鼠注射了Clara-cell-specific毒物萘(NA)天0,7和14,和每个NA注入之后,每日剂量的BrdU下面每3天,在此期间再生细胞被允许BrdU合并到他们的DNA,并开始衰老。p38 MAPK抑制剂SB202190是每个BrdU剂量注射前30分钟。老鼠牺牲在不同的时间,直到28天和肺的老鼠获得调查是否克拉拉细胞衰老会损害呼吸道上皮再生和加剧气道炎症。NCI-H441细胞诱导接触BrdU或开始衰老的端粒酶抑制剂mst - 312。人类的肺组织样本来自慢性阻塞性肺病患者,无症状吸烟者和非吸烟者调查是否克拉拉细胞衰老加速在慢性阻塞性肺病患者的航空公司,如果是这样,是否伴有p38 MAPK激活。

结果

BrdU没有改变气道上皮损伤或炎症后的强度单个NA曝光。然而,经过反复NA曝光,BrdU诱导上皮细胞(克拉拉细胞衰老,证明了一个DNA损伤反应,p21过度,增加senescence-associatedβ-galactosidase活动,逮捕和增长,导致上皮再生受损。上皮衰老伴随着p38 MAPK-dependent气道炎症。衰老NCI-H441细胞受损上皮创伤修复和增加大量的促炎细胞因子分泌p38 MAPK-dependent的方式。克拉拉COPD患者的细胞衰老加快,伴随着p38 MAPK激活。

结论

衰老的气道上皮细胞损害修复过程和加剧p38 MAPK-dependent气道损伤后炎症,这可能导致COPD的发病机制。

老化是一个风险因素对慢性阻塞性肺病(COPD) (1]。最近的证据表明,各种类型的细胞的细胞衰老加速在COPD患者中,包括肺泡II型细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血淋巴细胞(2- - - - - -5]。细胞衰老是一种本质上不可逆状态增长被捕是由于大量的细胞分裂(复制衰老)或接触任何广泛的刺激,包括癌基因活化、氧化应激、DNA损伤(过早衰老)6,7]。与细胞凋亡、衰老细胞新陈代谢保持活跃和有能力改变他们的微环境,只要他们坚持(6,7]。因为衰老细胞积聚在体内,他们认为导致衰老相关疾病的发病机制,如慢性阻塞性肺病和动脉粥样硬化,在至少两个不同的方面,首先抑制组织修复,因为他们仍然可行的但无法分裂和修复组织缺陷,其次,作为一种慢性炎症,因为衰老细胞已被证明分泌促炎介质(1,6- - - - - -10]。然而,气道上皮细胞的衰老是否会导致呼吸道疾病的发展是未知的。

克拉拉细胞远端气道上皮的主要祖细胞(11- - - - - -14]。克拉拉细胞的老鼠和某些其他物种含有丰富的细胞色素P450酶(CYP2F2),因此对萘毒性的敏感(NA),这是一种有毒的代谢酶(中间的11- - - - - -14]。完成NA后气道上皮损伤的修复在几个重叠的阶段。在小鼠中,增生性反应峰值后1到2天NA受伤,紧随其后的是分化阶段,通常在2周内完成(13]。

我们假设衰老的气道上皮细胞损害呼吸道损伤后修复过程和加剧炎症。为了验证这个假设,我们利用NA-induced克拉拉细胞耗竭的小鼠模型。诱导气道上皮细胞衰老在这个模型中,我们与溴化腹腔注射小鼠胸苷模拟5-bromo-2的脱氧尿苷(BrdU) NA受伤后。BrdU纳入DNA在细胞周期的s阶段,和通常用于识别和跟踪增殖细胞。然而,证据表明,BrdU强加基因毒性压力,导致过早衰老,因此限制了细胞的增殖反应增长刺激(15- - - - - -18]。在这项研究中我们证明了政府的反复接触后BrdU NA诱导上皮细胞(克拉拉细胞衰老和p38增殖蛋白激酶(MAPK)端依赖大鼠远端气道上皮细胞的炎症。这些发现表明,气道上皮细胞衰老损害修复过程和加剧炎症后气道损伤,并可能有助于病理变化在慢性阻塞性肺病患者的航空公司。

动物协议

动物协议进行审核和批准的动物保健、使用和东京女子医科大学的伦理委员会。八周大的男性C57 / BL6J小鼠腹腔注射NA(关东大化工、日本东京:200毫克/公斤身体wt)或玉米油车辆在0天(急性模型),或在天0、7和14(慢性模型)。每个NA注射之后BrdU腹腔注射(σ,圣路易斯,密苏里州:200毫克/公斤身体wt)或0.3% carboxymethycellulose,连续3天(1 - 3天,8 - 10和15 - 17)。这个BrdU政府计划被选中,是因为在小鼠上皮增殖是最大接触NA(后1到2天13]。p38增殖作用的蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190(恩佐生命科学,普利茅斯会议上,PA)或0.1% DMSO溶液是由腹腔内注射前30分钟BrdU注入。动物被杀害在1、2、3、4、11、28注射过量戊巴比妥钠(19]。

人类的肺组织样本

这项研究的协议符合赫尔辛基宣言和东京女子医科大学的批准机构审查委员会。肺组织阻止了慢性阻塞性肺病患者(n= 14),无症状吸烟者(n= 7)和无症状的不吸烟者(n= 8)在肺减容手术或局部肺癌肺切除术。这些患者的临床资料如表所示1。

组织准备

老鼠通胀的肺原位固定5分钟10%中性缓冲福尔马林(NBF) 25厘米的水压力,删除,沉浸在NBF固定24小时。Formalin-fixed组织是嵌入在石蜡,切割(3μm)。冷冻固定,肺膨胀50%手工作品的最佳切削温度,迅速冷冻,切割(3μm)。从人类的肺组织块固定在NBF,嵌入在石蜡,切割(3μm)。

细胞培养

NCI-H441细胞(位于马里兰州Rockville美国文化集合类型,),人类肺腺癌Clara-cell-like细胞系,在RPMI 1640补充10% FCS培养。培养的细胞暴露于BrdU 10天的BrdU(25、50、100μM),介质交换5天;控制细胞在缺乏BrdU同样讲究的。在一些实验中,p38 MAPK抑制剂SB202190浓度添加到10μM [19]。为端粒酶抑制,细胞被培养为28天的mst - 312(2.5μM: Calbiochem Gibbstown,新泽西),与通道每7天;控制细胞类似的培养缺乏mst - 312 (20.]。手机号码被Alamar手动或计算^®蓝色化验(表达载体,打击士气,CA)。人口翻倍(PD)在每个通道是通过使用公式计算:PD = ln(数量的细胞恢复/数量的细胞接种)/ ln2。

上皮修复试验

NCI-H441细胞培养30日mm-plates RPMI 1640年补充10% FCS的存在与否25μM BrdU了10天。细胞单层膜被损坏的机械三次跨越10 - 200μl体积普遍吸管提示(美国纽约康宁)和上皮修复机械损伤监测后72小时。(看到额外的文件1详情)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

细胞因子/趋化因子的浓度在细胞培养上清液测定用ELISA试剂盒(Biosource国际,打击士气,CA)和值归一化细胞的数量。

Senescence-associatedβ-galactosidase (SAβ-gal)染色

如前所述(执行SAβ-gal染色21]。(看到额外的文件1详情)。

免疫组织化学和免疫荧光

主克拉拉细胞10-kDa抗体分泌蛋白(CC10)β-tubulin IV, ki - 67, BrdU, p16^INK4ap21 (p16)^{WAF1 / CIP1}(p21),磷(Thr180 / Tyr182) p38 MAPK、多克隆anti-phospho(对丝氨酸/苏氨酸)共济失调teleangiectasia突变激酶(ATM) /共济失调teleangiectasia Rad3-related激酶(ATR)衬底,磷(Ser139) -H2AX(γH2AX)、CD45、CD90.2。免疫组织化学和免疫细胞化学的主要抗体检测与二次抗体结合辣根过氧化物酶标记聚合物(Envison +(合)^®DAKO日本,日本东京;Histofine^®简单的污点,Nichirei生物科学,日本东京)。免疫反应物与diaminobenzidine衬底或HistoGreen检测^®衬底(AbCys、巴黎、法国)。(看到额外的文件1详情)。抗体免疫荧光染色,主要与次要anti-IgG抗体反应共轭Alexa萤石350 Alexa萤石488,或Alexa萤石594(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。图像被使用一个奥林巴斯收购BX60显微镜(奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)配备了数码相机,和加工电脑彩色图像分析软件系统(赢得屋顶3.5版本;Mitani公司、福井、日本)和Adobe Photoshop软件(CA)圣何塞。γH2AX-foci的数量至少50细胞核的细胞数直观地通过一个奥林巴斯显微镜BX60配备了100×目标如前所述22,23]。

免疫印迹分析

细胞溶解产物被钠十二烷基分馏sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜与初级抗体对磷(Thr180 / Tyr182) p38 MAPK, p38 MAPK, NF-κB p65, phospho-NF-κB p65 (Ser536),磷(Ser139) -H2AX(γH2AX、细胞信号),p21或肌动蛋白(看到额外的文件1详情)。

细胞周期分析

被流式细胞术分析细胞的DNA含量(24]。

的形态学分析小鼠远航空公司

远端细支气管气道地区的形态学分析。自随细胞类型表示解剖位置,分析仅限于最后200 -μm基底膜(BM),结束于一个定义良好的支气管肺泡管结25]。远端细支气管气道上皮细胞被定义为位于气道腔和基板之间,和peribronchiolar间质细胞被定义为位于远端基板之间的细支气管气道上皮细胞和一个邻近的血管,肺泡或细支气管。十远端细支气管气道被随机选中每个幻灯片和显微镜下检查×400放大。

上皮损伤量化在hematoxylin-eosin-stained幻灯片通过计算的支气管上皮细胞坏死脱落到气道腔和数量除以大英博物馆的总长度。克拉拉细胞被免疫组织化学CC10, CC10-positive上皮细胞的数量除以大英博物馆的总长度。上皮细胞增殖是量化的数量除以ki - 67标记核CC10-positive CC10-positive细胞总数的细胞,或ki - 67标记的数量CC10-negative上皮细胞中的细胞核CC10-negative上皮细胞的总数。上皮细胞衰老是由计数量化CC10-positive p21-labeled细胞核的细胞数量或数量的SAβ-gal-positive细胞co-express CC10和数量除以总数CC10-positive细胞。DNA损伤反应是量化的数量除以phospho-ATM / ATR substrate-labeled核CC10-positive CC10-positive细胞总数的细胞,或通过计算γH2AX疫源地在CC10-positive细胞的数量。激活p38 MAPK的量化的数量除以phospho-p38 MAPK-labeled CC10-positive细胞的细胞核CC10-positive细胞的总数。气道炎症是评估通过计算CD45-positive细胞的数量(pan-leukocytes)和CD90.2-positive细胞(t细胞)的数量peribronchiolar间质和它们的数量除以大英博物馆的总长度。

的形态学分析人类细支气管的气道

人类肺组织部分CC10三重免疫荧光染色,p16和phospho-p38 MAPK,和五个微观领域的组织从包含一个区域每个病人的远端细支气管气道上皮细胞在一个数字化的显微镜下检查×400放大。CC10-positive细胞p16呈阳性的数量除以CC10-positive细胞的总数,CC10-positive细胞染色阳性的数量phospho-p38 MAPK的总数除以CC10-positive细胞,和CC10-positive细胞的数量都呈阳性phospho-p38 MAPK和p16除以CC10-positive细胞的总数。CC10-positive细胞的数量都呈阳性phospho-p38 MAPK和p16的总数除以CC10-positive细胞染色阳性p16 (p38 MAPK指数衰老克拉拉细胞)和CC10-positive细胞的数量呈阳性phospho-p38 MAPK但不利于p16的总数除以CC10-positive负面的细胞p16 (p38 MAPK指数presenescent克拉拉细胞)。

统计分析

数据表示为±SEM手段。统计分析使用Excel X软件程序与插件软件Statcel 2 (OMS、东京、日本)。从两组数据使用学生的比较t以及。比较三个或更多的团体是由方差分析(方差分析),以及任何显著差异被Tukey-Kramer比较事后进一步检查测试。斯皮尔曼等级相关数据进行相关性检测的测试。p值< 0.05被认为是显著的。

BrdU并不影响急性上皮损伤,修复或炎症后一个暴露在NA

我们第一次调查BrdU管理是否会加剧气道上皮损伤后一个接触NA。之前的研究表明,单个接触NA诱发急性,远的克拉拉细胞的选择性损伤气道上皮细胞在2天。急性NA损伤是上皮细胞增殖和re-differentiation紧随其后,通常在两周内解决12- - - - - -14]。如图1NA曝光后,在第一天的克拉拉细胞远端气道上皮有液泡的肿胀,和许多的脱落细胞进入气道腔。纤毛细胞已经成为鳞状和扩展到覆盖裸露的BM。管理BrdU天1、2和3 post-NA接触并不影响上皮细胞的强度剥落进入气道腔(图1 b)或数量的减少和随后的复苏10-kDa克拉拉细胞分泌蛋白(CC10)阳性细胞(克拉拉细胞)在气道上皮细胞(图1 c)。没有观察到小鼠的肺组织学变化暴露BrdU孤单。

NA-induced气道上皮损伤之后,由中性粒细胞和单核淋巴细胞浸润。BrdU没有改变的强度CD45-positive细胞(pan-leukocytes)渗透远航空的老鼠暴露在NA(图1 d)。因此,BrdU并不影响“急性”气道上皮损伤,修复,或单个NA曝光后炎症反应。

BrdU损害上皮再生后重复NA曝光

上述结果表明,BrdU不加重NA-induced气道上皮损伤。然而,先前的研究表明,长期接触BrdU强加基因毒性强调导致过早衰老和限制了细胞的增殖反应增长刺激(15- - - - - -18]。因此,我们调查是否BrdU政府老鼠最终会诱导衰老增长逮捕受损上皮再生反应重复气道损伤。,老鼠注射NA每周3周(天0、7和14),并且每个NA注入之后,管理BrdU连续3天(1 - 3天,8 - 10和15 - 17日),在此期间再生细胞被允许BrdU合并到他们的DNA,并开始衰老。老鼠牺牲了28天,这使得气道上皮恢复最后接触后14日内NA。

远端气道上皮的老鼠暴露在NA对天0,7和14个牺牲在28天主要是由CC10-positive克拉拉细胞,但偶尔β-tubulin-positive纤毛细胞和CC10-negative,β-tubulin-negative的普通细胞观察(图2)。CC10-positive远端气道上皮细胞的数量的老鼠是基础水平的69%,表明再生仍继续当老鼠牺牲(图2摄氏度)。然而,在老鼠暴露在NA(天0 7和14)和注射BrdU(1 - 3天,8 - 10和15 - 17日),CC10-positive远端气道上皮细胞的数量已经恢复到只有55%的基础水平,表明再生受损。

不同的细胞参与再生反应NA-induced克拉拉在远端气道细胞耗竭,包括生存CC10-positive克拉拉细胞和分组人口CC10-positive pollutant-resistant族群的上皮细胞,由克拉拉细胞保留CC10表达(变体CC10 / CCSP-expressing细胞;vCE细胞),支气管肺泡干细胞(过时),和CC10-negative细胞,如肺神经内分泌细胞(PNECs)和纤毛细胞(26]。收到了NA的老鼠和BrdU CC10-positive上皮细胞的比例较低,表达了ki - 67和CC10-negative上皮细胞表达ki - 67比仅接受NA(图的老鼠2 b和二维)。这些结果表明,BrdU钝化气道上皮细胞祖细胞的增殖反应(CC10-positive还是CC10-negative)。此外,CC10-positive细胞的34.9%和7.5%的CC10-negative远端气道上皮细胞的老鼠收到NA和BrdU BrdU呈阳性,表明除以天17 (BrdU政府的最后一天)和合并BrdU到他们的DNA在细胞周期的s阶段。然而,很少(< 0.1%)的BrdU-positive ki - 67(图)阳性细胞2 e)。因此,合并的上皮细胞BrdU成为无法繁殖。

BrdU重复NA曝光后引起上皮细胞衰老

接下来,我们调查是否受损的小鼠气道上皮的再生反复暴露于NA和BrdU归因于诱导细胞衰老。衰老的气道上皮细胞的组织学染色检测肺组织样本获得28天为不同衰老标记,包括phospho-ATM / ATR基质和phospho-H2AX(γH2AX)(标记DNA损伤反应),p21(一个衰老的标志增长被捕),和SAβ-gal(综述参考7)。γH2AX, H2A蛋白的变异形式,是一个组件的组蛋白octomer在核小体和磷酸化的激酶ATM / ATR磷酸肌醇3-kinase (PI3K)途径招聘的第一步和本地化DNA修复蛋白(22,27]。一些CC10-positive远端气道上皮细胞的老鼠反复暴露于NA phospho-ATM / ATR呈阳性,γH2AX, p21和SAβ-gal(图3),而1.5到2倍的老鼠CC10-positive细胞收到NA和BrdU这些衰老标记(图呈阳性3和3 b)。当SAβ-gal-stained肺组织样本为BrdU应用,许多SAβ-gal-positive细胞染色阳性BrdU(图3 c),这表明BrdU合并前上皮细胞的衰老。总的来说,这些结果表明,BrdU CC10-positive诱导衰老的细胞(即。航空公司,克拉拉细胞)的老鼠被暴露在NA。

上皮细胞衰老伴随着强烈的气道炎症

由于NA损伤后的修复过程是伴随着气道炎症,我们下一个评估小鼠气道炎症的严重程度,收到了NA单独或NA和BrdU。老鼠的远端航空公司曾多次收到NA和BrdU包含更多的CD45-positive细胞(pan-leukocytes)和CD90.2-positive细胞(t细胞)比老鼠的远端航空公司收到了NA(图4)。因此,上皮细胞衰老的感应BrdU伴随着气道炎症的恶化。

BrdU诱导细胞衰老,影响伤口修复、促炎细胞因子分泌NCI-H441细胞

接下来,我们建立了一个链接,连接细胞衰老和炎症的文化NCI-H441细胞,人肺腺癌细胞与克拉拉细胞特征。台盼蓝染色显示,没有细胞死亡发生当NCI-H441细胞暴露在浓度BrdU 100μM或更少(数据没有显示)。然而,当这些细胞被暴露在25日BrdU 50和100μM了10天,他们存在剂量依赖的相关性显示衰老表型,以增加SAβ-gal活动(图5),一个独特的,平坦,并扩大形态(图5),增长被捕(图5 b),和p21表达(图5度)。当NCI-H441细胞暴露在BrdU无论这三个浓度为10天,在PBS洗,然后用10% FCS刺激3天,细胞生长没有简历,确认的不可逆性衰老增长逮捕(数据未显示)。此外,BrdU暴露诱导细胞衰老伴随着的磷酸化H2AX(γH2AX)(图5 d),这表明基因毒性压力由BrdU导致衰老的感应15- - - - - -18]。调查是否细胞衰老影响上皮细胞的自我修复能力,层的NCI-H441cells培养存在与否的25μM BrdU机械受损。BrdU-exposed单层膜的受损区域增添更慢比未曝光的单层膜(图5 e),这表明细胞衰老上皮受损伤口修复。

如图6NCI-H441细胞暴露于BrdU 10天分泌15至30倍大量的促炎细胞因子il - 6, TNFα,比未曝光的gm - csf细胞分泌。然而,抗炎细胞因子il - 10的数量由BrdU-exposed分泌细胞和未暴露的细胞低于检测极限(< 3.1 pg / ml),这表明BrdU接触后发生了炎性改变。只接触BrdU 24小时不刺激NCI-H441细胞分泌促炎细胞因子(0.33±0.02 fg /由BrdU-exposed细胞分泌细胞gm - csf和0.24±0.07 fg /细胞gm - csf由控制细胞分泌,P = 0.38),表明促炎细胞因子分泌,以应对BrdU不是由于直接刺激对细胞的影响。是否衰老诱发BrdU以外还增加促炎细胞因子分泌,NCI-H441细胞培养30天的存在与否端粒酶抑制剂mst - 312 (20.]。暴露在mst - 312诱导衰老增长逮捕和TNFα分泌明显增加,IL-1β,引发NCI-H441细胞(图7)。这些结果表明,增加senescence-associated促炎细胞因子分泌不是一个BrdU特有的效果。

信号通路,导致炎性细胞因子分泌通常涉及各种分子的激活,包括NF-κB和p38 MAPK。NCI-H441细胞免疫印迹分析表明,接触BrdU 10天显著增加p38 MAPK的磷酸化而不是NF-κB(图6 b)。此外,治疗与p38 MAPK NCI-H441细胞抑制剂SB202190大大降低il - 6水平的增加,TNFα,gm - csf由BrdU-exposed分泌细胞(图6)。相比之下,SB202190没有抑制BrdU-induced增长逮捕或SAβ-gal激活(图6摄氏度)。这些结果表明,p38 MAPK激活需要senescence-associated促炎细胞因子分泌BrdU NCI-H441诱导后细胞衰老,但不是为了增长逮捕。

P38 MAPK抑制剂抑制senescence-associated在小鼠气道炎症

接下来,我们研究SB202190是否会抑制senescence-associated在小鼠气道炎症。CC10-positive细胞的百分比表示phospho-p38 MAPK在老鼠反复暴露于更高的NA和BrdU比控制老鼠(图8和8 b)。治疗的小鼠SB202190不仅减少的比例的增加CC10-positive细胞表达phospho-p38 MAPK(图8 b),但CD45-positive细胞的数量增加和CD90.2-positive细胞渗透到远端航空(图8 c)。相比之下,SB202190没有抑制CC10-positive细胞的数量减少或增加的百分比CC10-positive p21表达细胞远端气道的老鼠(图8 d和8 e)。这些结果表明,SB202190抑制senescence-associated炎症但不是衰老小鼠模型中的增长逮捕BrdU-induced上皮衰老。

P38 MAPK激活衰老克拉拉细胞在慢性阻塞性肺病患者的航空公司

获得的结果在小鼠和细胞培养实验表明BrdU诱发衰老的上皮细胞(克拉拉细胞和NCI-H441细胞)陪同不仅通过上皮再生受损而且p38 MAPK-dependent恶化的炎症反应。因此,我们调查是否克拉拉细胞衰老加速在慢性阻塞性肺病患者的航空公司,如果是这样,是否伴有p38 MAPK激活。慢性阻塞性肺病患者的远端气道上皮细胞被发现含有更高百分比的CC10-positive p16阳性细胞,CC10-positive细胞阳性phospho-p38 MAPK,和CC10-positive细胞阳性p16和phospho-p38 MAPK比无症状吸烟者的远端气道上皮细胞(图9和9 b)。当所有的受试者纳入相关分析,p16-positive克拉拉细胞的百分比被发现的比例与phospho-p38 MAPK-positive克拉拉细胞(图9 c)。这些结果表明,克拉拉细胞在慢性阻塞性肺病患者的航空公司开始衰老更快和表达高水平的p38 MAPK激活。我们还发现,一个更高比例的p16阳性(即CC10-positive细胞。,senescent Clara cells) expressed phospho-p38 MAPK than CC10-positive cells that were negative for p16 (i.e., presenescent Clara cells), indicating that MAPK activation is correlated with senescence at the cellular level in vivo (Figure9 d)。更高的积极phospho-p38 MAPK率衰老克拉拉细胞比presenescent克拉拉细胞中观察到的所有对象作为一个整体在每个子组,即。、慢性阻塞性肺病患者无症状吸烟者和不吸烟者(图9 d)。这些结果表明更大的激活衰老p38 MAPK的克拉拉细胞比presenescent细胞的存在和慢性阻塞性肺病。

本研究的结果表明,衰老BrdU-induced气道上皮细胞损害上皮再生,刺激p38 MAPK-dependent NA-induced克拉拉细胞耗竭小鼠后炎症。据我们所知,这是第一个证据表明上皮细胞衰老导致不完整的修复和过度炎症小鼠的航空公司。研究结果还显示,克拉拉细胞衰老是首次在COPD患者和加速伴随着p38 MAPK激活,这表明上皮细胞衰老可能导致慢性阻塞性肺病患者的呼吸道的炎症反应过度。

我们使用BrdU作为诱导物的过早衰老模型小鼠气道上皮细胞衰老,在本研究中使用BrdU提供了几个优势。首先,衰老的感应接触BrdU过早衰老的建立作为一个模型在各种类型的细胞(16- - - - - -19]。其次,由于钠选择性损害克拉拉细胞,利用NA结合BrdU促进选择性诱导气道上皮细胞的衰老,并只允许增生的上皮细胞BrdU合并到他们的DNA在细胞分裂,开始恢复NA-depleted池的克拉拉细胞。这是由我们的发现,虽然BrdU诱导衰老细胞体外增殖NCI-H441文化,BrdU本身没有诱导静止气道上皮细胞的衰老小鼠并没有暴露在NA。因此我们认为衰老CC10-positive细胞中发现老鼠暴露在NA和BrdU大多是来自克拉拉细胞,它们的主要细胞的祖细胞远端航空公司,但可能包括一个族群的克拉拉细胞,如vCE细胞或过时,函数作为祖细胞能够更新NA-injured气道上皮细胞(26]。第三,疣状ki - 67(增殖标记)和SAβ-gal(衰老标记)结合BrdU疣状跟踪成为可能的命运将BrdU吸收到DNA的上皮细胞。事实上,我们发现的上皮细胞DNA融入了BrdU变得衰老,不再扩散。然而,限制我们的研究源于这一事实BrdU被细胞磷酸化是deoxynucleotide一磷酸的救助途径酶胸苷激酶,水平可能不同于细胞的细胞(28],因此重复BrdU注射的老鼠可能选择一个子集打捞的低水平的细胞酶和不再能够BrdU合并到他们的DNA。这样的选择可能有偏见的研究的结果。我们研究的另一个限制是,我们使用BrdU,不吸烟,诱导细胞衰老,这可能使它不确定翻译人类COPD动物实验的结果。

然而,我们的克拉拉细胞衰老小鼠模型提供了明确的证据表明,衰老会损害呼吸道损伤再生反应。这一发现并不令人惊讶,因为不再衰老细胞增殖在增长刺激6,7]。遭到损害的再生反应,本研究并不是由于BrdU的直接细胞毒性效应,因为BrdU没有造成任何明显的上皮损伤,而且它没有加剧NA-induced气道上皮损伤的老鼠(图1)。相比之下,BrdU实施基因毒性压力,ATM / ATR磷酸化的底物和γH2AX(图3),它触发了DNA损伤信号通路导致p21-dependent细胞周期阻滞,并最终不可逆转衰老逮捕[6,7,29日]。

最近的证据表明,气道上皮细胞,包括克拉拉细胞,在免疫反应中发挥促炎作用通过分泌促炎细胞因子(30.,31日]。在目前的研究中我们发现,克拉拉细胞衰老伴随着气道炎症的恶化至少部分归因于促炎细胞因子分泌增加衰老上皮细胞(克拉拉细胞)。这些发现证实了先前的研究显示,其他衰老诱导物,包括癌基因激活、DNA损伤,端粒缩短,刺激促炎细胞因子分泌通过培养的成纤维细胞和内皮细胞,这种现象称为“senescence-associated分泌表型(SASP)”[10,32- - - - - -38]。我们的研究还表明,senescent-associated炎症发生在体外和体内,并确定p38 MAPK的激活是一个积极监管机构senescence-associated炎症。P38 MAPK激活是一个至关重要的步骤,合成多种促炎细胞因子和最近的证据表明P38 MAPK途径的关键作用促炎细胞因子生产细胞经历了致癌基因和环境压力诱导衰老(39,40]。类似的发现在自己的研究中,先前的研究表明,抑制p38 MAPK的SB202190 oncogene-induced衰老后引发的表达减少了成纤维细胞(33]。其他潜在的监管机构senescence-associated炎症包括转录因子NF-κB和C / EBPβ[10,41]。尽管没有显著NF-κB激活BrdU-induced衰老NCI-H441细胞被发现在这项研究中,在之前的研究中我们发现,NF-κB被激活,以应对衰老telomerase-inhibitor-induced肺泡型II-like A549细胞(42]。自端粒酶已被证明线粒体定位,减少活性氧的生产,抑制端粒酶可能增加活性氧的形成,这可能反过来激活NF-κB [43]。因此,senescence-associated炎症的机制可能不同根据细胞类型和诱导衰老的物质。我们的研究结果还表明,通路,调节senescence-associated炎症可能不同于通路调节衰老增长被捕,因为p38 MAPK抑制剂SB202190大幅减少senescence-associated炎症(数字6和8 c),但并没有抑制BrdU-induced生长逮捕,p21表达,或SAβ-gal活动增加(数据6摄氏度,8 d和8 e)。

衰老的促炎细胞因子分泌增加上皮细胞(克拉拉细胞)可能不是唯一机制负责加剧气道炎症小鼠上皮细胞衰老模型。以前的研究已经表明CC10,主要的克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP),发挥抗炎作用,可以减弱气道炎症通过分泌磷脂酶A2的失活或巨噬细胞行为的监管44,45]。因此,减少气道CC-10水平液造成无效的恢复克拉拉细胞由于衰老生长逮捕也可能导致增加气道炎症的机制。

促炎细胞因子的分泌是一个复杂的特性senescence-associated分泌表型,包括破坏正常组织结构,促进内皮细胞入侵和刺激肿瘤细胞生长和入侵10,37,46]。为什么衰老细胞发起促炎细胞因子反应?最近的证据表明,至少有两个重要角色senescence-associated促炎细胞因子分泌(10,37,46]。首先,促炎细胞因子il - 6和引发行为的自分泌反馈循环加强衰老增长逮捕,从而降低致癌细胞自动地转换的风险(33,46]。第二,促炎细胞因子动员先天免疫细胞,如自然杀伤细胞,清除衰老细胞(47,48]。这些角色表明senescence-associated炎症是很重要的,特别是早期衰老感应后,以确保有效的增长最终逮捕和刺激免疫系统清除衰老细胞(10]。然而,衰老细胞积聚在组织随着年龄的增长和影响组织的与年龄相关的疾病,如动脉粥样硬化和慢性阻塞性肺病患者,可能是因为免疫清除效率低和/或衰老细胞的速度超过生产间隙率(2,6,9,10]。因此,细胞衰老的有害影响。,impaired tissue restoration and chronic inflammation, may become apparent with time and contribute to the pathogenesis of age-related diseases.

如果这是真的,是细胞衰老导致COPD的发病和进展?我们的研究结果显示加速衰老的克拉拉细胞在慢性阻塞性肺病患者的航空公司,他们扩展先前的研究中发现,包括我们自己的以前的研究,证明各种类型的细胞,包括肺泡II型细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血淋巴细胞,开始衰老更快在慢性阻塞性肺病患者比对照组(2- - - - - -5]。在目前的研究中我们还演示了增加的磷酸化形式p38 MAPK在慢性阻塞性肺病患者的克拉拉细胞,确凿的一项研究显示的数字增加phospho-p38 MAPK-positive巨噬细胞和phospho-p38 MAPK-positive肺泡细胞在慢性阻塞性肺病患者的肺49]。重要的是,我们发现p38 MAPK优先激活衰老克拉拉细胞而不是presenescent细胞,表明相关性p38 MAPK在细胞水平上激活和衰老体内。有证据表明,p38 MAPK在招聘过程中发挥作用CD8 T淋巴细胞激活进入肺部的慢性阻塞性肺病患者,和p38 MAPK抑制剂已被证明是有效地抑制炎症模型中吸烟引起的小鼠的慢性阻塞性肺病(49,50]。根据这些证据,senescence-associated p38 MAPK在克拉拉细胞激活似乎有助于在COPD气道炎症的发病和进展。

我们的研究结果提供的证据表明,衰老的气道上皮细胞损害修复过程和刺激p38 MAPK-dependent炎症反应气道损伤(图10)。我们的发现是临床重要的,因为慢性阻塞性肺病的特征是修复受损和过度的炎症和肺细胞的加速衰老(有关9,51]。然而,研究结果遗留了许多问题没有回答。是一个DNA损伤反应或衰老生长所需逮捕BrdU-induced senescence-associated炎症发生(图10)?做其他衰老诱导物,如氧化应激和香烟,也诱导senescence-associated气道炎症(21]?多久衰老细胞在气道上皮细胞的老鼠和人类生存吗?做senescence-associated炎症占持续气道炎症慢性阻塞性肺病患者戒烟吗?所有这些问题在将来需要回答。

慢性阻塞性肺病:

慢性阻塞性肺疾病

拿拿淋:

萘

BrdU:

5-bromo-2的脱氧尿苷

p38 MAPK:

p38增殖蛋白激酶

CYP:

细胞色素P450

NBF:

中性缓冲福尔马林

帕金森病:

人口增加了一倍

ELISA:

酶联免疫吸附试验

SAβ-gal:

senescence-associatedβ-galactosidase

半乳糖苷:

5-bromo-4-chloro-3-indoylβ-D半乳糖苷

CC10:

克拉拉细胞10-kDa分泌蛋白

p16:

p16^INK4a

p21:

p21^{WAF1 / CIP1}

ATM / ATR:

共济失调teleangiectasia突变激酶/共济失调teleangiectasia Rad3-related激酶

合:

辣根过氧化物酶

BM:

基底膜

方差分析:

方差分析

PI3K:

磷酸肌醇3-kinase

SASP:

senescence-associated分泌表型

CCSP:

克拉拉细胞分泌蛋白

作者感谢Masayuki Shino先生,女士主管Yoshimi Sugimura和烟花王博士的技术援助。这项工作是支持的补助金从教育部科学研究,科学和文化,日本,由卫生部、劳动和福利日本调查棘手的疾病。

从属关系

1. 肺,医学研究生院,东京女子医科大学,8 - 1 Kawada-cho, Shinjuku-ku, 162 - 8666年,日本东京

   方周& Kazutetsu Aoshiba

2. 第一个医学系的东京女子医科大学,8 - 1 Kawada-cho, Shinjuku-ku, 162 - 8666年,日本东京

   Shigemitsu Onizawa Atsushi Nagai & Kazutetsu Aoshiba

相应的作者

对应到Kazutetsu Aoshiba。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

FZ进行动物实验、细胞培养的研究中,人类肺组织研究,起草了手稿。所以人类的肺组织进行研究。NA参与的设计研究。KA研究的构想,并参与其设计和协调,帮助起草手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

再版和权限