结节病患者家中真菌暴露的环境暴露研究

背景

越来越多的证据表明，接触霉菌(真菌)可能影响结节病的发展。为了评估环境暴露的影响，开展了一项研究，以确定结节病患者家中对真菌的暴露。

方法

受试者是在2007年9月期间征收的临床征生患者，直到2010年6月。其中，这55个被新诊断且目前正在治疗不到一年，25例已经治疗，并且没有复发，27人已经治疗，但经常治疗疾病。没有任何呼吸系统症状的对照是健康的受试者（n = 30）。空气样品（约2.5米^3.)，使用便携式泵和纤维素酯过滤器在受试者的卧室内拍摄。使用特定底物和荧光技术分析了作为真菌细胞生物量标记的n -乙酰己糖苷酶(NAHA)的含量，并以NAHA单位(U)/m表示^3.．

结果

与对照组相比，接受该疾病治疗(新诊断或复发)的受试者家中NAHA的活性明显高于对照组(33.6和39.9 U/m vs 10.0 U/m)^3.， p <0.001和<0.001)。在对照组中，30名受试者中只有5名NAHA水平高于第二个四分位值(14 U/m)^3.）.在治疗时间少于一年的新诊断疾病患者家中，值高于14 NAHA U/m^3.55人中有35人，27人中有18人患有复发性疾病。

结论

在活动性和复发性结节病受试者家中发现较高的NAHA酶活性，提示真菌暴露与结节病风险相关。进一步的环境研究来评估这种暴露对结节病患者的重要性是有必要的。结果表明，在真菌含量高的家庭采取补救措施可能是合理的。

有人提出，环境特征，特别是微生物，影响开发结节病的风险[1，流行病学研究表明结节病与霉菌(真菌)存在的环境之间存在关系。对273例结节病和618例无结节病的兄弟姐妹进行职业危险因素评估[2］．表明真菌可能接触真菌的特定风险暴露是蔬菜粉尘、室内高湿度、水损害或霉味。在一项对706例新招募结节病病例和相同数量年龄、种族和性别匹配的对照病例进行的病例对照研究中，结节病与农业就业和接触霉菌的工作环境呈正相关[3.］．亦有报道称，一群在有严重霉变问题的建筑物工作的人，会患上结节病[4］．此外，也发现消防员罹患结节病的风险增加[5，6］．他们的工作环境中有大量的气溶胶有机，潮湿的材料。

这些发现表明，环境中的真菌可以在疾病的发展中发挥作用。这种可能的关系并不一定意味着感染，但也可以是真菌细胞壁中的一种或几种试剂的免疫反应结果。可能的机制可以是在真菌细胞壁中对某种药剂的晚期过敏反应的发展，例如β-葡聚糖或甲壳素[7］．β-葡聚糖本身具有免疫抑制潜力[8这可能会诱导真菌细胞壁中或其他地方存在的药剂的敏化途径。

如果真菌在结节病的发展中发挥作用，人们可以预期，在疾病患者和健康对照者之间的环境暴露有梯度。为了验证这一假设，开展了一项研究，目的是确定结节病患者和无肺部疾病患者家中空气中真菌的水平。通过分析空气样品中n -乙酰己糖苷酶(NAHA)作为真菌细胞生物量的标记，确定真菌细胞的存在[9］．

主题

斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医疗中心的呼吸系统疾病和过敏诊所是结节病患者的国家中心之一。ERS/ATS诊断标准[10使用，包括支气管肺灌洗（BAL）和一个或多个跨晶体活组织检查。诊所的常规是使支气管镜检查有5至10个跨界活组织检查和200mL的BAL。组织学上验证非孢子丸组织的存在。如果活检不被认为是代表性的，则患者经历外科手术或淋巴结活检。

从肺叶抽吸进行细菌、真菌和结核的微生物分析。BAL液被培养，大多数活检被染色(银染色，Gomori)以排除真菌感染的存在。测定了对念珠菌和曲霉菌的IgA、IgG和IgG抗体。

适应症治疗诊所的第二和第三阶段与肺部症状的恶化,包括咳嗽和/或气短或胸痛,和一个或多个下列标准:肺功能恶化的肺活量下降10%或更多,在一秒用力肺活量下降(FEV₁) 15%或以上，弥散能力下降20%或以上，休息时或运动时气体交换减少，放射学改变进行性或出现肺动脉高压症状。所有肺外结节病患者均接受治疗。对无症状的I、II、III期患者不予治疗。

诊所的治疗方案是，在第一个4周内，每天早餐后使用甲基强的松龙0.5 mg/kg理想体重，然后在1年内使用0.25 mg/kg替代日疗法。

在2005年9月至2010年6月期间从结节病患者招募了该研究的受试者。在此期间，有207名患者（24阶段，无治疗，142阶段II，66阶段治疗，34阶段，28阶段，治疗，24阶段，28阶段治疗，24阶段，28阶段治疗，24阶段，治疗，6例阶段IV，所有治疗）。选择受试者特别的根据他们来门诊随访的情况。

我们招募了8名患有I阶段，71例患有第II期的患者，27例III阶段和IV阶段。27中存在额外的肺表现。它们分为三组。一个包含具有新诊断的rARAROIZ病的受试者，目前正在基于上述临床标准进行治疗。第二组是诊断出患有各个阶段的轻度顺曲，未接受治疗或成功治疗两年多的疗法，没有积极疾病的诊断受试者。第三组包括未能响应治疗超过一年的受试者或在终止后恢复疾病（阶段II和III除了一个有阶段IV的受试者）。小组只有五名吸烟者。

对照组为健康、不吸烟、无呼吸道症状和无呼吸道疾病家庭成员的工作人员和其他接触者。该研究得到卢布尔雅那大学医学中心伦理委员会的批准(198/05/04)，并获得了知情同意。

测定由肺部扩散能力（DL_有限公司）.血清血管紧张素转换酶(sACE)，壳三糖苷酶(CTO)，总IgE，使用标准的实验室方法。在对照组中没有进行这些测量。

不同组的背景数据如表所示1．

治疗组的平均年龄略低，无复发组的女性比例略高，但两组比较具有可比性。治疗组CTO值略高于其他组(NS)。复发组IgE值高于其他各组(NS)。< 1年组的肺外表现略高于其他组(NS)。

空气取样

研究人员为参与者提供了一个便携式泵，该泵配备了预先装载了醋酸纤维素过滤器的过滤器支架(PCM cassetteswith mixed cellulose Esters filter, 25mm, 0.8 μm孔径，Zefon International, Inc.， Ocala, FL, USA)。受试者打开泵并在大约四个小时内进行取样。房间的窗户和门在取样前几个小时就关闭了。采样的准确体积是从附在泵上的体积计中读取的，体积通常在2.5米左右^3.．

酶分析

对于酶分析，将1 mL的荧光酶底物(4-甲基伞形酰基n -乙酰- β - d -氨基葡萄糖，Mycometer a /S，哥本哈根，丹麦)添加到过滤器中并孵育约30分钟——确切时间由室温设定。然后在过滤器中加入2ml碱性缓冲液(显影剂)。过滤器支架中的液体通过过滤器吸出，收集在比色皿中。用荧光计(Picofluor, Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA)读取液体的荧光，并从样品值中扣除控制过滤器的荧光值。一个计数等于2.3 ng稻瘟病菌NAHA。为避免随机散射，荧光计读数除以10，并给出一个圆形数字，以单位(U/m)表示NAHA酶活性^3.）.

样品的重现性非常高。通过在25个不同的房间中平行采集两个过滤器样本，R²为0.956，方差分析f 504.2, p < 0.001。对于在26个房间中间隔几周两次采集的样本，R²为0.796，方差分析f为93.42,p < 0.001。在荧光计上重复读数相同的样品，显示在几个单位的顺序上有非常小的变化。

统计分析

使用Mann-Whitney和chi评估组间差异的统计学意义²测试。用斯皮尔曼检验计算关系。p值为0.05被认为是显著的。

NAHA在不同组的活性见表2．

正在接受治疗或有复发的受试者显著高于对照组和接受治疗但没有复发的受试者(p < 0.001, Mann-Whitney)。

NAHA值高度倾斜，因此从整个材料(对照和结节病)的值分为低于或高于第二四分位数(14 NAHA U/m^3.）.表格3.显示低接触组和高接触组的对照和结节病病例数。

治疗下的对照和受试者之间的分布差异很大（p <0.001）以及对照组对照vs复发（p <0.001，chi²测试)。对于那些没有复发的患者，与对照组没有差异。

该研究的主要结果是，空气传播酶的高活性表明真菌细胞团在持续或复发结节病患者家中明显更常见。

这项研究有一些局限性。这些测量只进行了一次。为了进行完整的环境评估，还应该在工作场所或在受试者花费了大量时间的其他环境中进行测量。另一方面，以前研究的经验[11]建议，某个房间的模液水平在一年内相对较少，特别是在具有高水平模具的建筑物中。只要在采样之前关闭测量的房间中的窗户和门，值反映了居民的暴露，而不断地是室外条件。

尽管存在这些缺点，但在结节病患者家中空气中酶的水平与对照组之间发现了相当大的差异。复发性结节病患者家中NAHA活性高的比例较大。从接触的角度来看，这是合乎逻辑的，因为与在有限时间内发生且在疾病治疗后不再存在的接触相比，持续接触病原体将具有复发风险。有疾病史但未复发的受试者值较低的原因可能是由于家庭清洁、建筑相关湿度问题的修复或搬迁。本研究未对这些可能性进行系统评估。

空气样品的分析包括测定NAHA作为真菌生物量的一种方法。真菌细胞制剂的测量比用肉眼检测真菌更为精确[12］．以前的研究报道NAHA代表真菌生物量在生长和稳定期[13- - - - - -15］．在空气样本和生物燃料工厂生物质产生的灰尘中发现，NAHA和总孢子数之间存在显著相关性[16，17］．在营养琼脂生长的真菌物种中的真菌生物量（重量）和NaHA之间发现强相关性，并在模具污染石膏板上的Ergosterol和NaHA活性之间的真菌物种9］．NAHA与黑曲霉生物量之间有线性相关的报道[18］．

NAHA是由包括细菌、真菌、原生动物和哺乳动物细胞在内的一系列生物体产生的，因此对真菌没有特异性。另一方面，当真菌在潮湿的室内条件下生长时，没有理由相信其他来源的NAHA，如花粉或哺乳动物细胞也会繁殖。此前的一项研究表明，真菌对建筑物的检测灵敏度和特异性都非常高[19而NAHA可能的混杂来源并没有起到重要作用。尽管细菌通常存在于真菌生长的环境中，但与真菌成分(如β-葡聚糖)引起的肉芽肿性炎症相比，细菌的细胞壁制剂(如内毒素)引起的其他类型的免疫反应。

调查的结节病病例没有任何真菌感染的迹象，证据是对普通真菌的低滴度和肺活检或肺灌洗培养阴性。这表明，如果真菌促进了结节病的发展，这种影响可能是由其他机制介导的，而不是感染。有几个真菌细胞成分可能影响先天免疫系统。其中β-葡聚糖的信息可从实验和现场研究中获得[8］．在低剂量(类似于环境中存在的剂量)时，主要的初始效应是免疫抑制和Th2偏离的淋巴细胞反应，重复暴露可能会偏离Th1驱动的反应[20.］．即使真菌细胞死亡，这种效应也会存在，因为众所周知，β-葡聚糖在真菌细胞解体数周后仍留在组织中[8］．

复发性疾病组家中NAHA活动量高的患者比例较大。这表明它们一直暴露在真菌中。因此，在家中清除真菌生长可能是防止结节病复发的一种措施。

室内环境包括暴露于各种各样的介质，其中一些介质有可能对呼吸道造成刺激。即使这里研究的主要因素是真菌细胞团块，也不能排除诸如烹饪燃料或环境烟草烟雾等因素可能会影响暴露结果，从而导致疾病的风险。营养因素是另一个重要的环境影响的例子。抗氧化状态也与结节病有关，尽管尚不清楚它是否是结节病的结果[21］．

作为真菌生物量标记物的NAHA酶的测量显示，在结节病患者家中，特别是在复发性疾病患者家中，其活性显著升高。这表明接触真菌有助于疾病的病理。应考虑对结节病患者的真菌暴露环境进行评估，特别是对复发结节病患者。结节病患者的常规检查应包括在家中或工作场所潜在真菌暴露的信息，并建议采取清洁行动。

那霸:

N-acetylhexosaminidase

首席技术官:

千核苷酸异常

SACE：

血清血管紧张素转换酶

鲍克：

brochoalveolar灌洗

FEV.₁：

强迫呼气量在一秒钟内

ns：

非显着

瑞典大学医疗中心，卢布尔雅那和生物致约环保健康研究中心收到资金

从属关系

1. 斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医疗中心呼吸系统疾病和过敏门诊

   Marjeta Terčelj, Barbara Salobir & Matevz Harlander

2. 瑞典莱勒姆生物事实环境健康研究中心

   莱格瑞兰德

相应的作者

对应到Marjeta Terčelj．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

m.t.， b.s.和M.H.负责临床问题。R.R.负责NAHA的测量和手稿的结构。所有作者都对数据分析做出了贡献，并阅读并批准了最终的手稿。

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