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研究文章血管生物学免费获取|10.1172 / JCI86249
1友谊医院INSERM UMR年代999年,玛丽•Lannelongue Le Plessis-Robinson法国。
2法国-比塞特尔大学,因为大学Paris-Saclay,。
3帮助Publique——Hopitaux巴黎、服务de Pneumologie中心de参考de l 'Hypertension Pulmonaire严重,部门Hospitalo-Universitaire胸腔创新,友谊医院Bicetre, Kremlin-Bicetre,法国。
4采用顶级de Pharmacologie de波尔多大学医疗中心法国波尔多。
5大学de波尔多INSERM U1219,波尔多,法国。
6服务生物医学研究院
7服务d 'Hematologie et d 'Oncologie,中心医院凡尔赛,Le Chesnay法国。
8大学de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines法国凡尔赛宫。
通信地址:克利斯朵夫Guignabert INSERM UMR_S 999 /大学,因为医院玛丽Lannelongue, 133大道de la抵抗,92350勒Plessis-Robinson,法国。电话:33.1.40948833;电子邮件:christophe.guignabert@inserm.fr。
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8月2日出版,2016年更多信息
肺动脉高压(PAH)是一种威胁生命的疾病,可引起的达沙替尼,双重Src和bcr - abl酪氨酸激酶抑制剂,用于治疗慢性粒细胞白血病(CML)。今天,关键问题仍然存在,有关机制参与dasatinib-induced PAH的长远发展。在这里,我们表明,慢性达沙替尼治疗引起肺血管内皮损伤人类和啮齿动物。我们发现,达沙替尼治疗减毒缺氧性肺血管收缩反应和增加对实验性肺动脉高压(PH)的老鼠,但这些影响老鼠的缺席与伊马替尼治疗,另一种bcr - abl酪氨酸激酶抑制剂。此外,达沙替尼治疗剂量依赖性的方式诱导肺动脉内皮细胞凋亡,而伊马替尼没有。达沙替尼治疗介导内皮细胞功能障碍通过增加活性氧的生产是独立于Src家族激酶。符合这些发现,我们观察到海拔标记的内皮功能障碍和血管损伤在CML患者的血清与达沙替尼治疗,相比之下,与伊马替尼治疗CML患者。综上所述,我们的研究结果表明,达沙替尼引起肺血管损伤,诱导ER压力,和线粒体活性氧的生产,从而导致增加对PH值的发展。
肺动脉高压(PAH)是一种严重的心肺疾病,具有很高的死亡率,而这个时候没有治愈(1)。肺动脉内皮细胞(EC)损伤和功能障碍以及异常的血管壁细胞积累强烈怀疑是启动和调节肺血管重建的关键因素在人类多环芳烃(2- - - - - -7)。此外,现在好了,遗传和环境因素之间复杂的相互作用促进了疾病的发病和进展(8)。
多环芳烃可以暴露于药物或毒素引起的,尤其是食欲抑制剂药物(即。,aminorex, fenfluramine derivatives, and benfluorex), amphetamines, and dasatinib, an oral ATP-competitive inhibitor of tyrosine kinases (TKI) (8,9)。达沙替尼目前批准用于一线治疗的费城阳性慢性粒细胞性白血病(CML)和所有阶段的费城阳性CML与阻力或不耐受疗法之前,包括伊马替尼。达沙替尼是一种比伊马替尼的第二代TKI bcr - abl, c - kit,和PDGFR,与伊马替尼,在Src家族激酶(10)。多环芳烃发生在患者的发病率最低暴露在法国的达沙替尼估计在2012年0.45% (9)。值得注意的是,快速临床、功能或血流动力学改善经常观察到的4个月内达沙替尼停药(9)。这些观察结果支持了这样的观点,即dasatinib-induced多环芳烃可能至少部分是可逆的。此外,特定的细胞事件和信号通路引发的结构性和功能性肺血管重建是未知的。因此,我们缺乏有效的概略介绍筛选策略和系统,对多环芳烃发生在dasatinib-treated病人的治疗方案。此外,更好的理解机制dasatinib-induced PAH不仅有助于改善dasatinib-treated病人的管理,但也会提高我们的知识pathomechanisms底层PAH的发展。
在这项研究中,我们确定是否与达沙替尼(a)慢性治疗大鼠引起肺血流动力学和肺血管结构的变化;(b)预处理大鼠的达沙替尼夸大了对野百合碱(MCT)管理和暴露于慢性缺氧(CHx), 2诱导的肺血管重建;(c)达沙替尼治疗引起肺EC障碍体内和体外使用人类肺ECs的主要文化;(d) dasatinib-induced肺EC损坏/障碍包括Src-dependent或独立的机制;(e)达沙替尼可能导致活性氧的生成在体外和体内;和(f)达沙替尼治疗可能导致肺内皮功能障碍或血管损伤人类,通过评估血清可溶性损伤的标记。为了回答这些问题,伊马替尼,另一个TKI作为一线治疗白血病但不与PAH,被用作TKI控制在我们的体内和体外研究。
预处理大鼠的达沙替尼对中华人民共和国交通部负责夸大了政府和暴露于慢性缺氧,2诱导的肺血管重建。确定体内达沙替尼对肺血流动力学参数和血管重建的影响,还是雄性Wistar鼠重100 g主要被分为2组:A组,长期治疗组,老鼠每天腹腔注射治疗的车辆(DMSO),达沙替尼,或者参伊马替尼(如前所述)。11,12(4周)图1一个);预处理组,B组的老鼠进行预处理与每日腹腔注射1周达沙替尼,伊马替尼,或车辆,然后随机分为2组肺动脉高压(PH)感应:MCT注射或慢性缺氧暴露3周(图1一个)。在此之前在体内研究中,达沙替尼的药代动力学研究在老鼠,表明1毫克/公斤/天达沙替尼ip接近临床相关的剂量(补充图1;本文提供在线补充材料;doi:10.1172 / JCI86249DS1)。剂量,观察达沙替尼的峰值浓度大约1小时后ip管理最高浓度(C马克斯92±21 ng / ml)。此外,达沙替尼回到水平相似的价值pre-dose后24小时(补充图1)。在上述的基础上观察和因为副作用通常瞬态和剂量相关,我们在研究中选择1×10×临床相关的剂量的达沙替尼,即1和10毫克/公斤/天。
预处理大鼠的达沙替尼赋予夸张对野百合碱(MCT)和慢性缺氧(CHx), 2诱导的实验性肺动脉高压体内。(一个啮齿动物模型用于研究体内达沙替尼对肺血流动力学参数和血管重建的影响:慢性治疗组(A组)和预处理组(B组)。B- - - - - -D)值平均肺动脉压(PAP) (B),富尔顿指数(C)、心输出量(D)车辆、达沙替尼,imatinib-treated老鼠。(E)代表的图像),α-smooth肌肉(SM)的远端肺动脉actin-stained部分车辆,达沙替尼和imatinib-treated老鼠。(F和G)量化muscularized肺动脉的比例(F和壁厚G)在车辆-肺,达沙替尼和imatinib-treated老鼠。水平线显示均值±SEM (n= 5 - 6)。* *P< 0.01,* * *P< 0.001 vs vehicle-treated老鼠;#P< 0.05,# #P< 0.01,# # #P< 0.001 vs vehicle-treated老鼠暴露在特定或CHx。酒吧规模:20μm。
我们证明dasatinib-pretreated老鼠(B组)开发了一个夸张的反应MCT -和慢性低氧诱导的PH值,与慢性治疗组(A组),没有观察血流动力学变化(图1中,B-G)。事实上,我们发现在dasatinib-pretreated老鼠,与汽车相比——或者imatinib-pretreated老鼠,大幅提高血液动力学(平均肺动脉压、肺动脉平均;图1 b)、右心室肥大(表示为富尔顿指数;图1 c),低心输出量(图1 d),增加肺血管重建(评估muscularized船只的百分比和壁厚;图1中,eg)。此外,我们指出CD3的积累+(T淋巴细胞)、CD45+(白细胞)和CD68+细胞(单核细胞/巨噬细胞)在大鼠慢性muscularized血管的血管周的区域处理达沙替尼(A组)与车辆-或imatinib-treated老鼠(补充图2左面板)。然而,我们发现在CD3显著增加+、CD45+和CD68+老鼠使用达沙替尼和暴露于特定细胞或慢性缺氧与汽车相比——或者imatinib-pretreated老鼠(B组;补充图2、中、右面板)。
综上所述,我们的研究结果表明,达沙替尼在临床相关的剂量(1×)不会导致PH值,但可以使它的发展,这种现象更明显的高剂量达沙替尼和伊马替尼(10×)而不是观察到。这些观察强烈支持这一概念,达沙替尼治疗调节PH-predisposing因素导致夸大了MCT -或慢性低氧诱导体内PH值。
达沙替尼治疗引起肺EC体内功能障碍。因为肺EC损坏/功能障碍可能是一个关键的病理生理学机制有害的疾病易感性和多环芳烃(肺血管重建的发展3,5),我们调查了体内达沙替尼对肺血管内皮功能的影响。
为了这个目标,我们首先检查车辆的影响,达沙替尼,和伊马替尼治疗急性缺氧性肺血管收缩(HPV)体内,一个重要的生理机制适应肺灌注区域通风主要取决于肺内皮的功能(13)。我们发现,老鼠接受达沙替尼(10×)表现出迟钝的人乳头状瘤病毒与老鼠处理车辆相比,低剂量的达沙替尼,伊马替尼(图2一个)。事实上,我们并没有发现显著增加肺动脉平均在大鼠急性缺氧暴露后治疗高剂量的达沙替尼与其他群体相比,它显示一个利用人乳头状瘤病毒(图2一个)。
达沙替尼治疗引起肺EC体内功能障碍。(一个)的平均肺动脉压力值(肺动脉平均)汽车,达沙替尼和imatinib-treated老鼠而通风房间的空气(基线)和10分钟后缺氧的通风气体混合物(急性缺氧(Hx))。肺动脉平均增加大鼠治疗车,达沙替尼(1×)和伊马替尼,但不是在大鼠治疗达沙替尼(10×)。(B)循环水平的量化可溶性形式的ICAM-1 (sICAM-1) VCAM-1 (sVCAM-1)和E-selectin (sE-selectin)车辆,达沙替尼和imatinib-treated老鼠。(C)共焦显微分析和双标签与ICAM-1 VCAM-1,和E-selectin endothelial-specific标记Tie2肺的车辆,达沙替尼和imatinib-treated老鼠。(D和E)代表西方印迹和量化glucose-regulated蛋白78 (GRP78) /β-actin比(D)和裂解的激活转录因子6 (ATF6) /β-actin比率,X-box-binding蛋白1 (XBP1) /β-actin比率,phospho-eukaryotic起始因子2α(eIF2α)/ eIF2α比(E)在车辆-肺,达沙替尼和imatinib-treated老鼠。水平线显示均值±SEM (n= 4 - 9日)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001 vs vehicle-treated老鼠或基线;#P< 0.05,# #P< 0.01和大鼠治疗达沙替尼(10×)。酒吧规模:20μm。人乳头状瘤病毒,缺氧性肺血管收缩;L,腔。
此外,我们发现体内慢性达沙替尼治疗导致水平的大幅增加的主要血清标记内皮功能障碍和血管损伤或伤害叫可溶性ICAM-1 (sICAM-1),可溶性VCAM-1 (sVCAM-1)和可溶性E-selectin (sE-selectin)在大鼠治疗1×达沙替尼与伊马替尼或vehicle-treated老鼠相比,这一现象更加明显的剂量10×(图2 b)。
血管功能障碍和损伤的一个方面是欧共体激活的特点是粘附分子的表达。共焦显微分析被用于调查他们的蛋白质含量在大鼠肺ECs肺标本。双标签与内皮标记Tie2 ICAM-1, VCAM-1或E-selectin显示大幅增加3粘附分子的表达dasatinib-treated老鼠相比,车辆或imatinib-treated老鼠(图2 c)。
ECs可以造成环境损害以来强调ER和诱导信号网络称为展开蛋白质反应(UPR)的发生和发展中发挥潜在作用的疾病(14- - - - - -18),我们下一个检查达沙替尼是否会导致这些鼠肺标本UPR激活处理达沙替尼相比,那些暴露于伊马替尼。我们发现,达沙替尼治疗导致增加分子伴侣glucose-regulated蛋白78 (GRP78)在大鼠肺匀浆(图2 d)。此外,我们的研究结果表明,体内达沙替尼治疗导致的表达显著增加的裂解形式激活转录因子6 (ATF6)和X-box-binding蛋白1 (XBP1)和显著减少的磷酸化形式真核起始因子(eIF2α)(图2 e)与车辆和伊马替尼治疗。这些结果强烈表明,达沙替尼治疗诱发异常的激活三个主要UPR-dependent途径,即ATF6,蛋白激酶RNA-like ER激酶(活跃),和inositol-requiring酶1α(IRE1α)轴,分别和伴侣蛋白GRP78参与这些途径。
完全,我们的体内研究表明,达沙替尼(1×10×)诱发肺EC功能障碍导致迟钝的人乳头状瘤病毒,粘附分子的异常表达,和ER应激现象没有找到与伊马替尼。
Dasatinib-induced细胞凋亡在培养人类肺ECs,独立行动的Src家族激酶。我们下一个评估dasatinib-induced肺EC障碍通过研究其直接影响人类肺ECs体外的主要文化。我们对培养肺ECs生成从人类肺标本,用车辆,达沙替尼(达沙替尼的剂量选择基于其药代动力学简介:4,40岁和400海里),或伊马替尼(如前所述)(19- - - - - -24)。有趣的是,我们表明,体外达沙替尼治疗导致剂量依赖性的方式(肺EC细胞凋亡图3)。显著增加凋亡细胞被发现在40纳米,甚至更加明显在400 nM评估caspase-3/7活动(图3 b赫斯特染色(图3 c碘化),染色膜联蛋白V和propidium通过流式细胞术(图3 d)和TUNEL (图3 e),与车辆-和imatinib-treated细胞。一直与这些发现,我们注意到在细胞数量大量减少在16小时dasatinib-treated细胞与车辆和imatinib-treated细胞(补充图3)。
Dasatinib-induced人类肺ECs体外的细胞凋亡。(一个)代表图像的人类肺EC层(通过< 5)治疗后2小时车,达沙替尼,或伊马替尼。(B)测定caspase-3/7活动在人类肺ECs处理车辆,达沙替尼、伊马替尼。(C量化的凋亡细胞的比例使用赫斯特33342染色和代表图像。(D)量化的膜联蛋白V和propidium碘(PI)双重标记在人类肺ECs处理车辆,达沙替尼,伊马替尼和流式细胞仪代表点的情节。(E)量化TUNEL-positive人类肺细胞ECs处理车辆,达沙替尼,伊马替尼和代表图像。水平线显示均值±SEM (n= 5)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * * *P< 0.0001 vs vehicle-treated细胞;# #P< 0.01,# # # #P< 0.0001和人类肺ECs 400海里达沙替尼治疗。酒吧规模:20μm。
然后我们调查了潜在的分子机制负责dasatinib-induced在肺血管内皮细胞凋亡。因为众所周知,达沙替尼强烈抑制Src激酶,我们首先研究Src家庭酪氨酸激酶的作用dasatinib-induced肺EC细胞凋亡。我们使用Src家族的选择性抑制剂酪氨酸激酶Src inhibitor-1,抑制Src激酶活性在肺ECs暴露于生长因子鸡尾酒(图4中,A和B)。把培养人类控制肺部Src inhibitor-1 ECs隔绝,我们没有观察到任何凋亡效应评估凋亡细胞的数量评估赫斯特染色(图4 c),caspase-3/7活动(图4 d碘化),膜联蛋白V / propidium coimmunostaining (图4 e)。
Dasatinib-induced细胞凋亡在培养人类肺ECs独立于它的行动Src家族激酶。(一个)直接量化的Src的活动在人类肺ECs处理车辆,达沙替尼,伊马替尼或Src inhibitor-1。(B)代表西方印迹和量化phospho-Src / Src比和phospho-ERK1/2 / ERK2比人类肺ECs暴露于生长因子鸡尾酒和处理车辆,达沙替尼,伊马替尼或Src inhibitor-1。(C- - - - - -E33342)肺部EC凋亡的量化使用赫斯特(C),caspase-3/7活动(D),双重染色膜联蛋白V和propidium碘(PI)通过流式细胞术(E)在肺ECs处理车辆,达沙替尼,伊马替尼或Src inhibitor-1。水平线显示均值±SEM (n= 4 - 6)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001,* * * *P< 0.0001 vs vehicle-treated细胞;#P< 0.05,# #P< 0.01和人类肺ECs 400海里达沙替尼治疗。FGF-2,纤维母细胞生长因子2(基本);PDGF,血小板源生长因子;表皮生长因子、表皮生长因子。
因此,这些结果强烈支持dasatinib-induced肺EC凋亡Src抑制无关。
达沙替尼在人工培养的肺ECs凋亡的线粒体活性氧的生产。自氧化应激是一个重要的决定因素的内皮功能障碍和血管损伤和细胞内ROS强有力地刺激EC粘附分子表达(25,26),我们假设达沙替尼可能导致肺血管内皮细胞内ROS增加,从而诱导EC细胞凋亡。双染色对大鼠肺血管内皮标记vWF和8-oxo-2′脱氧鸟苷(8-oxo-dG), DNA氧化的一个标志,表明体内达沙替尼治疗导致肺ECs 8-oxo-dG表达增加与汽车相比,imatinib-treated老鼠(图5一个)。与之前的研究(27),我们还发现显著水平的提高氧化蛋白质(蛋白质羰基产品)、谷胱甘肽从大鼠肺匀浆处理达沙替尼与车辆或伊马替尼(图5 b),剂量依赖性的方式。此外,细胞内ROS也测量了两种不同的检测方法,即fluorogenic探针(CellRox)和dihydroethidium,在培养人类肺ECs,证实存在剂量依赖的相关性dasatinib-induced增加内皮细胞活性氧(图5 c)。
达沙替尼刺激线粒体ROS生产体内和体外。(一个)代表通过共焦显微图像分析和双标签8-oxo-2′脱氧鸟苷(8-oxo-dG)和endothelial-specific标记vWF肺从车辆,达沙替尼和imatinib-treated老鼠。(B)量化氧化谷胱甘肽/总谷胱甘肽比和肺部和血清蛋白质羰基产品的车辆,达沙替尼,分别和imatinib-treated老鼠。(C)代表图像和量化细胞内ROS生成使用fluorogenic探针(CellRox)和dihydroethidium(她)治疗肺ECs与车辆30分钟,达沙替尼、伊马替尼。(Dpro-oxidative酶)基因表达分析(NADPH氧化酶4 (NOX4),没有合酶2 (NOS2),血红素加氧酶1 (HMOX1) GA-binding蛋白α链[GABPA], flavin-containing单氧酶2 (FMO2))和抗氧化的酶(过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶1 (GPX1),超氧化物歧化酶1 [SOD1])在大鼠肺处理车辆,达沙替尼,伊马替尼。(E)线粒体贴上MitoTracker绿(绿色)和线粒体ROS MitoSOX红色(红色)。(F- - - - - -G)定量流式细胞仪分析膜联蛋白V和propidium碘(PI)双重标签和量化caspase-3/7活动肺ECs预处理为16小时N乙酰半胱氨酸(NAC) 5毫米和400海里达沙替尼暴露与否。(H)代表图像和TUNEL染色的量化肺ECs进行预处理或不与南汽在5毫米和暴露1小时或400海里达沙替尼。水平线显示均值±SEM (n= 4 - 9日)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001 vs vehicle-treated细胞或治疗大鼠;#P< 0.05,# #P< 0.01,# # #P< 0.001和肺ECs处理400海里达沙替尼或大鼠治疗达沙替尼(10×)。酒吧规模:20μm。
测试是否这活性氧产量的增加是由于细胞内改变了赞成和抗氧化酶之间的平衡,我们测量的mRNA水平NADPH氧化酶4 (NOX4),没有合酶2 (NOS2)、血红素加氧酶1 (HMOX1) GA-binding蛋白α链(GABPA) flavin-containing单氧酶2 (FMO2)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶1 (GPX1)和超氧化物歧化酶1 (SOD1)在大鼠肺匀浆。我们体内没有发现区别车辆,达沙替尼,和伊马替尼治疗,表明活性氧增加,我们观察到体内和体外由于肺ECs (dasatinib-induced增加生产图5 d)。然后,我们假设在肺ECs达沙替尼诱导线粒体ROS增加生产。为了验证这个假设,我们接受培养的肺ECs线粒体ROS荧光探针,用荧光染色线粒体标记。我们发现,达沙替尼体外治疗导致线粒体ROS增加存在剂量依赖的相关性生产(图5 e)。我们接下来检查功能ROS生产的重要性。我们发现dasatinib-induced ROS生产造成肺EC细胞凋亡,与车辆,imatinib-treated ECs:的确,预培养的肺ECs与抗氧化剂16小时N乙酰半胱氨酸明显抑制dasatinib-induced肺EC细胞凋亡(图5中,F-H)。
总体而言,我们的研究结果提供体外证据表明,达沙替尼刺激线粒体ROS生产方式存在剂量依赖的相关性,从而导致肺EC细胞凋亡在体外。
CML患者治疗达沙替尼显示增加血清sICAM-1 sVCAM-1, sE-selectin浓度。最后,我们验证我们的结果支持,达沙替尼可能潜在作用为人类肺动脉内皮细胞毒性的诱导物。我们测量的循环水平sICAM-1、sVCAM-1 sE-selectin患者慢性粒细胞性白血病(CML) (PAH)在诊断,在CML患者TKIs不到3个月,与伊马替尼,达沙替尼和健康受试者。我们发现CML患者达沙替尼显示更高水平的sICAM-1, sVCAM-1,和sE-selectin与CML患者诊断相比,imatinib-treated CML患者或健康受试者(图6)。这些结果,始终与我们的体内和体外数据,支持了这样的观点,即达沙替尼诱导内皮功能障碍,因此可能导致dasatinib-induced多环芳烃。
CML患者治疗达沙替尼显示sICAM-1血清浓度的增加,sVCAM-1, sE-selectin。量化sICAM-1 (一个),sVCAM-1 (B)和sE-selectin (C)在CML患者诊断(n= 17),在CML患者达沙替尼和伊马替尼治疗(小于3个月后n分别为= 24和14),在健康受试者(n= 39)。水平线显示均值±SEM。* *P< 0.01,* * * *P< 0.0001与健康受试者;#P< 0.05,# #P< 0.01,# # # #P< 0.0001与CML患者达沙替尼。
我们目前的报告表明,预处理达沙替尼增加对实验老鼠的PH值,密切模仿结果中观察到的人类。我们研究大鼠治疗或者没有达沙替尼和伊马替尼治疗,有或没有接触特定或慢性缺氧,2已知抗病诱导剂的博士我们进行体外研究主要early-passage ECs的文化隔绝人类的肺组织。有趣的是,我们发现,达沙替尼导致增加水平的循环内皮功能障碍或血管损伤的标志在人类和啮齿动物和诱导慢性ER应激和氧化应激与伊马替尼。我们还发现在体外,达沙替尼诱发肺EC细胞凋亡在时尚存在剂量依赖的相关性,通过活性氧的生产。为了识别机制(s)负责肺血管dasatinib-treated病人安全问题,我们检查了血清标本CML患者达沙替尼和伊马替尼。我们sVCAM-1显示重要的循环sICAM-1海拔和sE-selectin CML患者血清的达沙替尼与CML与伊马替尼治疗的患者相比,进一步支持了这种观点,即达沙替尼可能导致血管损伤和电子商务功能障碍和损害。
众所周知,药物引起的多环芳烃的达沙替尼是一个原因,除了证据支持其有利影响在实验模型(8,28):2006年11月至2010年9月,9例治疗达沙替尼的PAH诊断被确定在法国注册(PH值9)。这些发表的病例dasatinib-associated多环芳烃被快速的临床特征,功能,和血流动力学改善达沙替尼的4个月内中止8例(9)。然而,平均随访9个月后,大多数患者没有展示完全恢复,2例死亡。今天,超过100例dasatinib-induced PAH已经提交了欧洲制药警惕和关键问题仍然是关于PAH血液动力学和机制的长期演进(s)。因此,我们缺乏有效的概略介绍筛选策略和系统,对多环芳烃发生在dasatinib-treated病人的治疗方案。
我们的研究结果,显示直接引起的内皮细胞毒性达沙替尼,强烈支持的假设达沙替尼可能增加的风险发展中多环芳烃的存在至今未被第二(即“打击”。,基因和/或环境因素)(补充图4)。事实上,增加肺EC损伤和细胞凋亡是已知的作为触发启动多环芳烃(29日- - - - - -31日)。符合这个概念,我们表明,预处理大鼠的达沙替尼(1×10×)的剂量,但不是伊马替尼,增加MCT -和慢性低氧诱导博士相比之下,伊马替尼的有益MCT - PH值和慢性低氧诱导指出,一个观察,与先前的研究的结果是一致的(22,28,30.,32)。总的来说,我们的工作因此支持这样的看法,即可能存在剂量反应关系之间的剂量的达沙替尼和血管dasatinib-treated患者中观察到的安全问题。然而,显然是需要进一步的研究来验证这一观点。此外,我们的观察与预处理达沙替尼获得患者老鼠还表明,达沙替尼可能更容易开发PH响应其他环境风险因素,如缺氧或某些其他毒素。
因为等离子体达沙替尼药物动力学变化随着时间的推移,口服后血浆浓度峰值(0.5 ~ 90 nM)口服后3小时(33),不同受体的抑制和/或nonreceptor酪氨酸激酶可以负责血管dasatinib-treated患者的安全问题。的确,达沙替尼迅速吸收和分布在血管外的空间和高度蛋白结合的(~ 94%),导致大量分布的2505 L和半衰期为3 - 5小时(34)。此外,达沙替尼是广泛在肝脏代谢,主要由细胞色素P450 3 a4 (CYP3A4) (34,35)。因此,为了解决机制(s)负责血管dasatinib-treated病人安全问题,我们使用初级early-passage(< 5)文化的人类肺ECs暴露不暴露增加剂量的达沙替尼。此外,伊马替尼,达到的浓度大约5μM病人血浆被用作TKI控制在我们的实验中33,36)。我们的数据表明,达沙替尼治疗诱发肺EC细胞凋亡存在剂量依赖的相关性,而伊马替尼没有明显的影响。为了识别特定受体和/或nonreceptor酪氨酸激酶负责这一现象,我们集中我们的注意力在Src激酶。事实上,Nagaraj et al。(37)表明,抑制Src与30μM PP2或100μM达沙替尼灌注孤立导致人民行动党大幅增加小鼠肺部通过控制2域钾通道的家人在人类肺动脉平滑肌细胞(37)。然而,在此,我们发现HPV明显减毒老鼠接受高剂量的达沙替尼。符合我们的发现,我们证明在肺ECs dasatinib-mediated凋亡并不依赖于Src激酶抑制。二端口域已知钾离子通道也是潜在的监管机构的凋亡细胞死亡;因此我们不能排除他们的抑制可能也在一定程度上有助于dasatinib-mediated细胞凋亡在肺ECs (38- - - - - -42)。与伊马替尼,我们有趣的演示,达沙替尼治疗导致活性氧生成快速增加存在剂量依赖的相关性,可能引起细胞凋亡的诱导存在剂量依赖的相关性。这一事实有重大的个人间的变化反应和对氧化应激的敏感性的存在与否的另一个环境风险因素多环芳烃可以部分解释多环芳烃发生在患者的发病率达沙替尼。此外,个别病人可变性在吸收,分布,代谢和遗传或个体之间的人口差异也可能影响患者血管dasatinib-treated发现的安全问题。大量的工作有待完成,以便更好地理解达沙替尼的机制导致线粒体ROS的生成保护肺内皮。
相比起来,我们的工作凸显了达沙替尼,伊马替尼,引起肺血管损伤和加剧实验PH值通过线粒体活性氧的生产,提供承诺的角度更好地理解和管理患者的达沙替尼。
研究人口。血液样本取自CML患者诊断(精神,ClinicalTrials.gov NCT00219739)或CML与标准剂量的达沙替尼或伊马替尼治疗的患者不到3个月(OPTIM达沙替尼,EudraCT 2008-006854-17和OPTIM伊马替尼,EudraCT 2010-019568-35) (补充表1)。所有患者知情同意了之前的研究。
动物和体内治疗。雄性Wistar鼠(100克;Janvier实验室)治疗日常使用单个ip注入达沙替尼,伊马替尼,或车辆(DMSO) 4周(a组),另一个群老鼠1周预处理达沙替尼(1或10毫克/公斤/天),伊马替尼(20毫克/公斤/天),或车辆(DMSO)和研究3周后一个南卡罗来纳州注入MCT(40毫克/公斤;Sigma-Aldrich)或车辆,或3周后慢性暴露于低氧(10%氧气)或在室内空气(B组)。一个合理的超高效液体chromatography-tandem质谱方法用于量化的达沙替尼活跃在大鼠血浆代谢物(43)。动物与异氟烷麻醉。介绍了聚乙烯醇导管进入右颈静脉和推行右心室肺动脉。心输出量的老鼠使用热稀释法测定方法。血流动力学参数的测量后,胸腔打开,左肺立即删除并冻结。正确的肺与缓冲福尔马林固定膨胀状态。右心室肥大是由富尔顿评估指数(重量比右心室和左心室(+隔]),和壁厚的百分比(内侧壁厚/外径][2××100)和muscularized船舶计算(如前所述)(19,20.,22,23)。
评估人乳头状瘤病毒。在麻醉大鼠肺血管反应性评估,首次与室内空气通风(基线),然后暴露于10分钟的通风与低氧气体混合物(10%的氧气,90%的氮)。连续三个类似缺氧挑战重复在每个老鼠。
人类肺ECs的隔离和文化。分离、培养人类肺ECs如前所述(19- - - - - -24)。在体外研究中,我们使用肺标本中获得叶切除术或本地化的肺癌患者全肺切除术治疗对照组。这些控制患者的术前超声心动图进行排除博士肺标本收集控制距离肿瘤病灶。没有tumoral渗透回顾性成立在所有组织部分的组织病理学分析。
乙酰化低密度脂蛋白的孤立肺ECs强烈积极的耦合Alexa 488 vWF、CD31和Ulex europaeusagglutinin-1α-smooth肌肉肌动蛋白和消极。这些细胞被用于一段不到5。
实时定量PCR。肺mRNA水平编码NOX4、NOS2 HMOX1, GABPA, FMO2,猫,GPX1,用实时定量PCR检测SOD1根据以前描述的方法(23,44,45)。
免疫印迹、ELISA和免疫染色。在这项研究中使用的主要抗体中列出补充表2。细胞和组织是均质和用里帕缓冲区中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂,和30μg蛋白质被用来检测phospho-ERK1/2, ERK2, XBP1, GRP78, ATF6, eIF2α(圣克鲁斯生物技术),phospho-Src, Src, phospho-eIF2α(细胞信号技术)和β-actin (Sigma-Aldrich)如前所述19- - - - - -24)。Src的活性在30μg细胞溶解产物决定使用Src激酶分析工具包(CycLex有限公司)。sICAM-1浓度、sVCAM-1 sE-selectin在人类血清进行评估使用特定的酶联免疫试剂盒(研发系统)根据制造商的指示。sICAM-1浓度、sVCAM-1 sE-selectin,蛋白质羰基在大鼠血清和肺匀浆中谷胱甘肽是评估使用ELISA包鼠sICAM-1 (BosterBio) sVCAM-1,和sE-selectin (Cusabio),蛋白质羰基(细胞生物学实验室)、谷胱甘肽(恩佐生命科学)根据制造商的指示。包含IHC染色和immunocytofluorescent ICAM-1、E-selectinα-smooth肌肉肌动蛋白、CD68、和8-oxo-dG(圣克鲁斯生物技术),VCAM-1 (Abcam)和CD3和CD45 (BD Pharmingen)如前所述执行(19,20.,22,23)。
细胞凋亡检测。细胞数使用显微镜拍照。细胞数/字段。赫斯特33342(热费希尔科学)是用于检测细胞凋亡。细胞(10000 /毫升)被播种在4 Lab-Tek室幻灯片和处理达沙替尼(4,400海里的媒体有1%血清)和伊马替尼(5μM媒体中含1%血清)2小时37°C。细胞被固定在冰冷的甲醇10分钟。照片拍摄尼康Eclipse 80我显微镜(尼康仪器欧洲BV)。核是得分为正常(不凝结的染色质亮蓝色荧光)或凋亡(亮蓝色荧光高度凝聚染色质)。
测量活动caspase-3/7使用Apo-ONE工具包(Promega),细胞被播种在96孔板。达沙替尼和伊马替尼治疗后2小时在媒体含1%血清的特定试剂添加在每个制造商推荐的。为N乙酰半胱氨酸治疗,细胞接触400海里达沙替尼之前进行预处理。的荧光被设想(PerkinElmer)监控。荧光细胞凋亡成正比的意思。
的膜联蛋白V-FITC试验是用于验证细胞凋亡的存在。收集漂浮细胞贴壁细胞收获胰蛋白酶/ EDTA处理和沾膜联蛋白V-FITC (BD生物科学),然后通过流式细胞术分析MACSQuant (Miltenyi研究)。在每个示例中,至少有10000通过流式细胞仪分析细胞数。
此外,我们进行TUNEL染色使用ApopTag红色原位细胞凋亡检测设备(Chemicon)根据制造商的指示。TUNEL-positive核的数量每核的计算总数。
荧光检测活性氧。超氧化物指标dihydroethidium(她;热费希尔科学)是用来评估细胞内ROS在培养人类肺ECs。细胞(10000 /毫升)被播种在Lab-Tek室幻灯片和处理达沙替尼(4,400海里的媒体含1%血清)和伊马替尼(5μM媒体中含1%血清)30分钟37°C。她(10μM)添加和孵化20分钟37°C。孵化后,细胞与PBS洗两次,与ProlonGold Lab-Tek室下滑是安装不变色reageant(热费希尔科学)。的意思是荧光细胞内过氧化物生产成正比。
CellRox(热费希尔科学)被用来估计胞质过氧化物生产培养肺ECs。细胞(10000 /毫升)被播种在Lab-Tek室幻灯片和处理达沙替尼(4,400海里的媒体含1%血清)和伊马替尼(5μM媒体有1%血清)30分钟37°C。CellRox(10μM)添加和孵化30分钟37°C。孵化后,细胞用PBS和Lab-Tek室幻灯片与ProlonGold安装。的意思是荧光胞质过氧化物生产成正比。荧光是我显微镜监控尼康Eclipse 80。
MitoSOX红(热费希尔科学)是用于检测线粒体超氧化物生产。短暂,5.0μM MitoSOX用于mitochondrial-selective荧光标签的存在MitoTracker绿色(200海里;热费希尔科学)25分钟。随后,细胞被洗在哈佛商学院和ProlonGold安装。图像被使用一个LSM700共焦显微镜(蔡司)。
统计数据。使用非参数Mann-Whitney统计显著性进行了测试U测试或双向方差分析与Bonferroni事后测试。被认为在一个重要的区别P值小于0.05。连续数据表示为均值±3独立SEM试验,每一式三份或五倍的执行。一个P被认为具有统计显著性值小于0.05。5.0分析使用GraphPad棱镜。
研究批准。所有动物都是依法处理指导实验室动物保健和使用的通过INSERM,获得了大学的伦理委员会批准,因为Le Plessis-Robinson法国。此外,所有的实验与人类标本经当地伦理委员会批准(拉西德保护des人(CPP)巴黎七世,比塞特尔勒,法国;普瓦捷,cpp从里尔和波尔多,法国)。所有患者知情同意了之前的研究。
CG,啊,CP, LT, RT, CS, MLH, EMJ进行实验和分析数据。CG、LT和CP设计并进行实验和分析数据。DM,啊,操作系统、GS和MH分析dasatinib-induced PAH的情况下从法国注册表。某人,BM,毫米,公关参与样品收集在CML患者接受伊马替尼,达沙替尼和药代动力学测量。CG,啊,DM, MH写的手稿。CP, LT, MLH,欧美,MCC,某人,BM,毫米,公关阅读和修正手稿。所有作者同意最后的手稿。
作者感谢克劳德Preudhomme(法国地区德里尔大学医疗中心)和弗朗索瓦Guilhot (INSERM中投1402 Oncologie Hematologique et Therapie Cellulaire,普瓦捷大学医疗中心法国)为他们的帮助CML患者诊断样本的收集和处理(STI571前瞻性随机试验(精神),NCT00219739[项目医院矫揉造作的倩碧2002年,2006年和030482年EudraCT])。这项研究支持由法国国家健康与医学研究院(INSERM),大学,因为腿Poix(巴黎Chancellerie des版);法国国家研究机构(格兰特ANR_12_JSV1_0004_01);法国国家安全范围du药剂(ANSM格兰特VIGIAPATH);和部分部门Hospitalo-Universitaire胸腔创新和LabEx LERMIT(格兰特anr - 10 - labx - 0033 LERMIT)。刘日东(RESPIRE2 - 2013 - 4919)是接收方的欧洲呼吸学会/欧盟RESPI188bet官网地址RE2居里夫人研究奖学金。法国支持的PAH患者协会高血压arterielle pulmonaire (HTAP)法国。EMJ是收件人巴黎Publique-Hopitaux Annee-Recherche奖学金的帮助。CS和CP支持法国昏聩de赠与矫揉造作的en桑特Respiratoire-Fondation du蛋奶酥。
利益冲突:在过去的3年,d . Montani Actelion股价担任顾问,百时美施贵宝(BMS),拜耳,葛兰素史克(GSK),诺华制药和辉瑞。在过去的3年,o . Sitbon Actelion股价担任顾问,拜耳,葛兰素史克公司,辉瑞。在过去的3年,g . Simonneau Actelion股价担任顾问,拜耳,葛兰素史克公司,辉瑞。在过去的3年,m·亨伯特Actelion股价担任顾问,拜耳,葛兰素史克,诺华制药和辉瑞。p . Rousselot接到BMS的研究资助。m . Molimard担任顾问Allergologisk公司København, BMS,葛兰素史克,诺华,辉瑞,Stallergen。
参考信息:中国投资。2016,126 (9):3207 - 3218。doi: 10.1172 / JCI86249。