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1Virologie et Pathologie Humaine EA 4610年,大学Lyon1,将进医学院学习仅仅雷纳克,法国里昂。2Nouzilly INRA旅游,法国。3分子病毒学研究所ZMBE Westfalische-Wilhelms-University,德国明斯特。4Friedrich-Loeffler-Institute、免疫学研究所、德国图宾根大学医院。5免疫学研究所、Friedrich-Loeffler-Institut Greifswald-Insel Riems,德国。6INSERM U970、巴黎心血管中心,巴黎,法国。7巴黎第五大学,巴黎,法国。8心血管研究所,加州大学,旧金山,加州,美国。9实验室的血管生成和血管链接,Vesalius研究中心,VIB,比利时鲁汶。10实验室的血管生成和血管链接,Vesalius研究中心,KU鲁汶比利时鲁汶。11病毒学学系,荷兰鹿特丹的伊拉斯谟医学中心。
通信地址:贝雅特丽齐Riteau EMR 4610 VirPath Virologie et Pathologie Humaine,将进医学院学习仅仅雷纳克,大学Claude Bernard里昂1,里昂大学,f - 69008,法国里昂。电话:33.1.0478771008;传真:33.1.0478778751;电子邮件:beatrice.riteau@univ-lyon1.fr。
作者注:哈立德Khoufache和Fatma拜里造成了同样的工作。
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12月3日出版,2012年更多信息
流感导致实际发病率和病死率上升,高致病性和耐药菌株可能会在未来出现。Protease-activated受体1 (PAR1)是一个thrombin-activated受体,导致炎症反应在粘膜表面。PAR1在病毒感染的发病机制是未知的。在这里,我们表明,PAR1导致了流感病毒感染小鼠后有害的炎症反应。激活受体激动剂TFLLR-NH PAR1的管理2减少生存和增加流感感染后肺部炎症。重要的是,管理PAR1拮抗剂和PAR1缺乏保护小鼠免受感染a型流感病毒(IAVs)。与PAR1受体激动剂治疗并没有改变小鼠的生存缺乏纤溶酶原(身为),物这表明身为许可证和/或与PAR1函数在这个模型。为其他迹象PAR1拮抗剂在人体试验。我们的研究表明,PAR1对抗可能探索用于治疗流感,包括由高致病性H5N1型病毒对奥司他韦具有耐药性的H1N1病毒。
流感是一种根深蒂固的传染性疾病,发生在季节性流感和零星的大流行疫情,给人类和动物带来重大的发病率和死亡率(1- - - - - -3)。连续零星感染人类的高致病性禽流感病毒H5N1亚型和最近流行swine-origin H1N1病毒引起的强调这些病毒引起的永久性的威胁(4- - - - - -6)。甲型流感病毒(IAV)感染的发病机制并不完全理解,但涉及病毒特征和宿主免疫反应(3)。全面了解宿主反应可能援助发展的干预策略,针对这些宿主因素。
先天和适应性免疫系统的组件都是激活病毒感染后不久,它提供了一个有效的防御IAV (7)。然而,过度的炎症也可能导致肺损伤,限制呼吸能力,可能在人类(IAV占发病机理1,8,9)。招聘的炎症细胞发炎网站是由许多细胞组件,包括蛋白酶(10)。这些蛋白酶不仅分裂细胞外基质,但也通过protease-activated部分调节信号转导受体(PARs) (11- - - - - -14)。PAR1,联系当地的蛋白酶活性细胞反应参与血栓形成、炎症和cytoprotection (15,16),显示了增加表达式IAV-infected老鼠的航空公司(17)。的上下文中的角色PAR1 IAV感染还没有被研究过。我们报告的证据表明PAR1信号导致随后的有害的炎症流感病毒感染小鼠的方式依赖于纤溶酶原(身为)物。虽然政府PAR1受体激动剂的老鼠IAV感染的严重程度增加,PAR1缺乏保护小鼠免受致命的结果。管理PAR1拮抗剂SCH79797 (18)小鼠减少炎症和改善生存与多个IAV菌株感染后,包括高致病性禽流感H5N1病毒和2009年H1N1大流行性流感病毒。SCH79797改善生存的重要的是,政府在老鼠身上即使接种48或72小时后接种。PAR1拮抗剂目前正在临床试验潜在使用抗血栓药物(19- - - - - -22)。因为一个干预策略旨在将有效对抗宿主细胞蛋白质对现有抗病毒药物产生抗药性的病毒株,PAR1拮抗剂可能探索治疗IAV的额外的临床前模型,在适当的情况下,在人类身上。
PAR1有助于IAV感染的发病机理。调查的角色PAR1 IAV感染的发病机理、WT小鼠接种50或500微升的H1N1病毒株/公关/ 8/34(将此称为H1N1)和不及时治疗或刺激的50μM PAR1兴奋剂TFLLR-NH2(将此称为PAR1-activating肽;PAR1-AP)。老鼠接受PAR1-AP显示增强的减肥和更高的死亡率在感染后治疗控制老鼠相比,差异在统计上显著的剂量(图1A)。相比之下,治疗感染小鼠PAR1-AP并不影响生存或小鼠的体重(图1B),这表明PAR1-AP生存和减肥的效果需要IAV感染。此外,治疗与控制肽没有削弱生存或增加减肥IAV-infected老鼠(图1C),抵挡住肽的非特异性反应。因此,PAR1激活导致增加IAV的致病性感染。
PAR1激活和PAR1缺乏对IAV致病性的影响。(一个)时间的IAV-induced发病和死亡小鼠PAR1刺激的反应。经鼻内给小鼠接种甲型H1N1流感(50微升,n= 22 /组;500微升,n= 18 /组)和处理车辆或50μM PAR1-AP。(B)时间未感染的小鼠治疗与否与50μM PAR1-AP (n每组)= 13。(C)小鼠50微升的H1N1感染和治疗控制肽或车辆(n每组)= 10。结果平均百分比生存或减肥3独立实验。(D)的生存和减肥Par1- / -老鼠和WT同窝出生后感染100微升的H1N1病毒(n= 12 /组)。结果平均百分比生存或减肥2实验。P< 0.05,PAR1-AP与未经处理的或Par1- / -与WT, kaplan meier测试。
进一步探索在IAV PAR1发病机理中的作用,我们研究了PAR1不足的结果。Par1+ / -老鼠intercrossed生成WT和Par1- / -老鼠,感染了100微升的H1N1,减肥和存活率都是被监控的。与WT的同胞相比,Par1- / -小鼠抗感染IAV(图1D)。因此,PAR1导致死亡和减肥IAV感染所致。
PAR1-AP增加细胞因子释放和嗜中性粒细胞招募在肺部受感染的老鼠。因为PAR1可以引发内皮细胞因子的生产和其他细胞类型(14),我们接下来研究的影响PAR1-AP IAV感染引起的炎症反应。小鼠感染50微升的甲型H1N1流感治疗与否与50μM PAR1-AP,和支气管肺泡灌洗(巴尔斯)收集评估细胞因子和多形核中性粒细胞(中性粒细胞)在肺部接种后不同时间点。IAV感染导致增加水平的细胞因子检测(咆哮、il - 6和KC)时间course-dependent方式,和PAR1-AP治疗增强此响应(图2)。类似的结果当PAR1的影响与控制肽(补充图1;本文提供在线补充材料;doi:10.1172 / JCI61667DS1),确认PAR1-AP特异性。PAR1-AP治疗也增加了BAL的发生中性粒细胞24和48小时后感染,但在未受感染的老鼠(图影响很小2B)。通过72小时后感染,BAL PAR1-AP-treated和控制老鼠的中性粒细胞内容没有不同。这些结果表明,PAR1激活能增加IAV-induced细胞因子的生产,增加早期招募中性粒细胞在肺感染的老鼠。
PAR1-AP增加炎症和病毒复制在50微升的H1N1感染的老鼠。(一个)细胞因子在球被感染的小鼠与PAR1-AP与否是衡量ELISA 24日接种48和72小时后。第5 - 11数据均值±SD从每个小组从3实验动物个体。(B)从受感染的老鼠相对中性粒细胞数BAL治疗与PAR1-AP与否。中性粒细胞百分比由May-Grunwald-Giemsa决定染色24、48、72小时后接种。结果均值±SD从4 - 5个人每组小鼠从2个人实验。未感染的老鼠被用作控制(n每组)= 2 - 4。(C)H1N1病毒滴度在肺部感染小鼠后在指定时间治疗与否与50μM PAR1-AP。数据平均值±SD从3 - 5每组动物个体。*P< 0.05,治疗与不治疗,Mann-Whitney测试。
病毒复制的肺。然后我们调查的影响是否PAR1激活的结果IAV感染小鼠与增加肺病毒生产。为此,传染性病毒滴度测定肺收集从小鼠接受PAR1-AP(50μM)或控制肽在接种后不同时间点。在接种后24和48小时,几乎没有检测到病毒复制(101检出限的测定),但肺病毒滴度PAR1-AP治疗后显著增加(图2观察3 C)。没有显著差异,感染后5天。这些数据表明,PAR1激活促进早期病毒生产增加小鼠肺。
PAR1激活病毒生产的影响,体重,和生存IAV感染后身为依赖。破译PAR1加速体内病毒产生的机理,我们进行了体外实验评估的影响PAR1激活肺泡上皮细胞A549细胞的病毒复制。PAR1-AP触发这些细胞ERK的磷酸化,最大效应在大约40μM(图3一个);这个浓度是用于所有后续体外实验。因为HA蛋白水解乳沟IAV传染性是至关重要的,通过哈乳沟和身为促进IAV复制(23,24),我们检查的效果添加身为-单独或结合PAR1-AP病毒生产。正如所料,难以觉察的病毒生产在未经处理的A549文化中,但明显增加了添加身为(图3B)。重要的是,除了PAR1-AP增强这种效果8 - 24小时后感染。的影响时没有看到PAR1-AP胰蛋白酶作为替代蛋白酶用于IAV复制(数据未显示),以及PAR1信号并不影响病毒进入细胞(补充图2),但包含PAR1-AP似乎增加PLG-dependent HA的乳沟。因此,我们下一个受感染的A549细胞(MOI 0.5)身为的存在与否,有或没有PAR1-AP,通过免疫印迹分析和评估公顷乳沟16小时后感染。在缺乏身为,类似uncleaved哈(哈0在感染细胞)累积,PAR1-AP没有效果(图3C)。在身为面前,除了哈0,25-kDa带对应于哈2被观察到。重要的是,在PAR1-AP-treated文化中,HA的强度2增加,哈哈0降低相对于控制文化。因此,病毒HA在PLG-dependent裂解方式被PAR1-AP增强,与病毒增加生产。
身为和身为缺乏IAV生产和PAR1-AP效果。(一个)ERK的磷酸化后A549细胞的刺激PAR1-AP浓度表示。Anti-phospho-Erk和anti-Erk抗体。(B)传染性病毒滴度的上层清液感染细胞刺激后40μM PAR1-AP或控制肽在身为的存在与否。(C未感染(NI)或感染)(正)细胞被刺激40μM PAR1-AP或控制肽在身为的存在与否。细胞溶菌作用后,分析了蛋白质免疫印迹的乳沟。(D)时间IAV-induced的发病机理身为- / -和治疗后WT同窝出生或不是PAR1-AP (n= 9 - 10每小组从2实验老鼠)。(E感染后48小时)病毒滴度(50微升)在WT或肺身为- / -老鼠刺激与否与50μM PAR1-AP。数据平均值±2 SD从每组5个人的动物实验。*P< 0.05,治疗与不治疗,kaplan meier测试(D),曼惠特尼测试(B和E)。
身为肺部炎症的一个重要中介(25,26)和影响IAV毒性(27,28)。重要的是,身为绑定到细胞和活化可能是由PAR1控制信号(29日,30.)。结合上述研究结果,这些观察促使我们调查的影响是否PAR1信号IAV的致病性感染也取决于身为体内。因此我们接种身为- / -小鼠50微升的H1N1有或没有PAR1-AP治疗。WT老鼠相比,治疗身为- / -小鼠PAR1-AP没有增加死亡率,减肥,或者IAV后肺部感染的病毒滴度(图3,D和E)。
组织病理学检查显示治疗PAR1-AP肺部受感染细胞浸润增加WT老鼠,但不是身为- / -老鼠(补充图3)。这些结果表明,PAR1激活病毒早期产量的增加,炎症,感染IAV的致病性PLG-dependent时尚。值得注意的是,这种低50-PFU剂量使用时,几乎没有检测到病毒复制在WT或肺部身为- / -小鼠在接种后表示时间点(图3E)。此外,白细胞浸润在IAV-infected WT或身为- / -老鼠几乎没有可检测(补充图3)。然而,更高的病毒剂量用于接种时,白细胞浸润和肺病毒滴度身为- / -老鼠老鼠大大低于WT (f·拜里,未发表的观察),这表明身为促进IAV复制和炎症。而发现PAR1-AP HA PLG-dependent乳沟的增加体外表明PAR1信号可能通过增强身为/血纤维蛋白溶酶功能、促进病毒复制我们的数据不排除PAR1-independent宽容角色身为或PLG-independent角色IAV PAR1激活的感染和发病机理。
PAR1拮抗剂预防H1N1和H3N2感染。我们下一个调查是否药物抑制PAR1信号改变IAV的感染。PARs并不发达,药理学和抑制剂能够阻止PAR1函数在老鼠模型中没有对脱靶效应特征。尽管如此,SCH79797已经被用于探测PAR1函数在啮齿动物模型(31日- - - - - -33);因此,鼓励保护IAV中看到Par1- / -老鼠,我们研究了这种化合物的影响IAV的感染。SCH79797抑制PAR1-AP-induced ERK激活小鼠NIH3T3细胞(图4),这表明它有能力阻止信号通过鼠标PAR1同族体。SCH79797治疗预防减少生存和体重增加与政府相关的PAR1-AP IAV-infected老鼠(图4B)。更令人吃惊的是,当老鼠感染了致命剂量的H1N1病毒空斑形成单位(500和5000),SCH79797治疗保护小鼠免受减肥和死亡:生存,47%和16%,分别观察治疗控制老鼠,而84% - -94%的SCH79797-treated老鼠感染(图中幸存了下来4C)。此外,当SCH79797管理开始感染后2或3天,老鼠也显著防止H1N1和H3N2病毒/香港/ 68(此处指H3N2;图4,D和E)。治疗感染小鼠SCH79797并不影响他们的存活率或体重(补充图4),这表明PAR1拮抗剂不会引起副作用。因此,保护小鼠免受IAV SCH79797治疗感染,一致认为PAR1有助于IAV发病机理模型。
PAR1拮抗剂能保护小鼠免受感染H1N1和H3N2。(一个)治疗的NIH3T3细胞SCH79797阻塞ERK激活10μM PAR1-AP。(B)SCH79797治疗预防PAR1-AP-induced老鼠死亡率剂量依赖性的方式。(C)IAV-induced发病机理与SCH79797感染小鼠或不是。小鼠接种500空斑形成单位(n每组)或5000微升(= 17日至19日n每组= 14)H1N1和治疗与否与50μM SCH79797天0 - 2感染后。(D)SCH79797治疗感染后第2 - 4天5000微升的H1N1病毒(n每组)或100微升的H3N2 = 12 (n每组)= 7。(E感染后3 - 5个)SCH79797治疗天5000微升的H1N1病毒(n每组)或100微升的H3N2 = 7 (n每组)= 7。*P< 0.05,治疗和控制,kaplan meier测试。
炎症和病毒复制由SCH79797减毒。IAV期间因为PAR1激活促进肺部炎症感染,我们决定封锁PAR1信号是否会导致减少IAV-induced体内炎症。老鼠感染500微升的H1N1与SCH79797和治疗与否,和BAL收集接种后在不同的时间。SCH79797治疗显著降低水平的咆哮,il - 6,和KC BAL 24日,48岁和72小时后接种,以ELISA(图5接种)。5天后,细胞因子水平仍然高的球从未经处理的小鼠,但几乎没有检测到从SCH79797-treated老鼠(补充图5)落下帷幕。SCH79797治疗也显著降低中性粒细胞在球被感染的老鼠频率:接种后24和48小时,中性粒细胞几乎没有可检测SCH79797-treated落下帷幕的老鼠,而他们代表10%的细胞从未经处理的小鼠(图落下帷幕5B)。因此,组织病理学检查显示减少的细胞渗透治疗肺部感染的鼠SCH79797(补充图6)。
PAR1拮抗剂抑制肺部炎症和病毒复制。(一个)细胞因子在球被感染的小鼠与SCH79797与否是衡量ELISA 24日接种48和72小时后。从7 - 11数据平均值±SD每组动物个体,代表3实验。(B)从受感染的老鼠相对中性粒细胞频率BAL治疗与SCH79797与否。中性粒细胞百分比由May-Grunwald-Giemsa染色决定24日接种48和72小时后。从3 - 5个人数据平均值±SD鼠每组。未感染的老鼠被用作控制(n=每组3 - 5)。结果是2个人实验的代表。(C)病毒滴度的肺部感染小鼠后在指定的时间与SCH79797 500微升的H1N1感染和治疗。数据平均值±SD从3 - 5每组动物个体。*P< 0.05,治疗和控制,Mann-Whitney测试。
最后,减少肺病毒滴度观察24和48小时后500微升的甲型H1N1流感接种与未经处理的控制(图5C)。在接种后第三天,肺在SCH79797-treated类似的病毒滴度和未经处理的小鼠(大约104空斑形成单位/毫升),这表明SCH79797推迟,但并没有阻止,病毒生产。肺病毒滴度降至不到102空斑形成单位/毫升在5至7天SCH79797-treated和控制老鼠(图5C)。观察SCH79797抑制炎症的标志,但不是病毒滴度,在第三天表明抑制PAR1信号可能抑制炎症和病毒复制早期至少部分独立的机制。
SCH79797防止高致病性H1N1v和H5N1感染。PAR1信号的测试是否抑制SCH79797也影响与其他IAV菌株感染,老鼠感染高致病性H5N1型毒株或大流行H1N1v应变,获得性耐奥司他韦治疗期间的严重感染(见方法和参考。34),然后用SCH79797治疗与否。致命的感染后5000微升的H5N1和500微升H1N1v, 60%和100%的未经处理的控制老鼠死亡,分别,而几乎完全保护在SCH79797-treated的动物接种组(P< 0.05;图6A和B)。除了死亡率和体重,出现临床症状时也抑制感染h5n1病毒的小鼠SCH79797处理与未经处理的小鼠(数据未显示)。老鼠死亡率监测直到接种后21天,观察和持续生存SCH79797治疗后(数据未显示),这表明SCH79797保护是持久的。因此,抑制各种IAVs PAR1信号保护小鼠免受感染,包括高致病性毒株。
PAR1拮抗剂保护小鼠免受致命感染H5N1或H1N1v。经鼻内给小鼠接种(一个)5000微升的H5N1病毒(n每组)或(= 10B)500微升H1N1v (n第10 - 11 =每组)和治疗与否与50μM SCH79797。结果表示为百分数生存或减肥从2实验。*P< 0.05,治疗和控制,kaplan meier测试。
我们目前发现支持一个重要的角色在小鼠模型PAR1 IAV的感染。研究PAR1-AP表明PAR1激活增加炎症,病毒生产初期,减肥,感染后的死亡率(数字1和2),研究使用Par1- / -老鼠表明PAR1 IAV感染的发病机制(图1)。SCH79797的观察,药物抑制PAR1信号,减少炎症,病毒生产初期,减肥,感染后的死亡率是符合PAR1-AP和Par1- / -结果。此外,观察感染后SCH79797死亡率降低多个IAV菌株(甲型H3N2, H5N1病毒),甚至是有效剂量启动时在接种后第三天,表明PAR1抑制应该探索更多的临床前研究,在适当的情况下,人类作为一个可能的治疗流感。
据我们所知,一个角色的PAR1反应的发病机制、病毒感染没有先前描述。PAR1激活内皮细胞、成纤维细胞和其他细胞触发各种反应,其中许多是促炎(例如,趋化因子和细胞因子生产、粘附分子显示,前列腺素生产,和通透性增加;参考文献。14,15)。符合我们的观察,气管内的交付PAR1受体激动剂并不足以引起肺部炎症的否则正常小鼠(35),但也加剧通风创伤性肺水肿(36)。此外,Par1- / -老鼠从通风创伤性和保护bleomycin-induced肺损伤(36- - - - - -38)。像我们的结果,这些观察结果表明,PAR1信号有助于损伤肺部炎症反应,主要的目标在我们IAV感染模型。
PAR1激活没有加剧IAV感染的影响身为- / -老鼠(图3)。身为可能只是扮演一个宽容的角色PAR1激活IAV感染的效果;身为支持感染和损伤,和PAR1激活加剧的影响。然而,有趣的是,PAR1-AP促进肺上皮文化PLG-dependent公顷乳沟,暗示PAR1信号的相互作用与IAV成为传染的能力,因此复制。这些发现与之前是一致的观察,身为有助于IAV感染的发病机制27,28)。此外,PAR1信号可能促进身为激活血纤维蛋白溶酶(29日,30.),从而提供一个可能的链接增加HA乳沟和IAV生产。也有可能身为PAR1激活导致促炎作用(25,39- - - - - -41),通过促进血纤维蛋白溶酶或其他机制的转换。
额外的考虑建议PAR1激活的能力促进早期病毒复制和提高有害呼吸道的炎症反应,至少部分彼此独立的。PAR1-AP交付在感染后3天的时候,尽管肺相似的病毒复制,治疗仍有有害的影响(数据没有显示)。此外,基于临界残留在HA乳沟的血纤维蛋白溶酶,不太可能复制高致病性H5N1和2009年H1N1大流行性流感是通过控制调节血纤维蛋白溶酶(42),但SCH79797治疗仍然降低了死亡率。
如上所述,我们发现在IAV-infected A549细胞,激活PAR1增加PLG-dependent哈乳沟,病毒传染性的关键的一步。事实上,只有HA的裂解形式允许pH-dependent融合endosomal膜内的病毒信封和随后的基因组的释放到胞质和病毒复制。体内,PAR1也促进了病毒复制后不久感染。然而,在感染后48小时,PAR1-AP-stimulated之间没有观察肺病毒滴度的差异,如果老鼠,这表明HA乳沟可以补偿由招募或其他蛋白酶激活肺部的感染。
因此,我们提出一个模型(图7)身为PAR1促进活化的胞浆素。随后,血纤维蛋白溶酶作用于病毒复制通过HA乳沟,增强可能提高其为病原体通过炎症的分子模式。同时,血纤维蛋白溶酶还充当促炎介质,占有害的肺部炎症。此外,PAR1引发多种促炎反应,独立于身为和病毒,这可能加剧炎症和损伤。因为PAR1夫妇凝固炎症(14,15)和凝固纤维蛋白溶解(30.),还需要进一步的研究来调查的总体影响止血失调在IAV PAR1-mediated炎症感染。
提出了PAR1-mediated流感病毒发病机理模型。IAV感染期间,PAR1被激活并增加身为转化为胞浆素。一方面,血纤维蛋白溶酶裂解并激活病毒HA,促进IAV复制,导致炎症。另一方面,直接促进炎症血纤维蛋白溶酶,通过机制和PAR1促进炎症身为和病毒无关。这些可能与其他宿主对病毒感染的反应加剧炎症和损伤。
我们观察到一个PAR1受体激动剂(43,44)感染加剧IAV的影响表明,PAR1激活可以促进炎症和组织损伤在此设置。此外,我们的观察Par1- / -感染小鼠和SCH79797-treated老鼠免受IAV表明PAR1激活有助于IAV感染的发病机理,PAR1内生IAV感染期间激活。因此,自然PAR1激活凝血酶生成IAV-infected肺(45),高浓度的PAR1观察IAV-infected老鼠的航空公司(17)。然而,值得注意的是,SCH79797是已知脱靶效应细胞增殖和生存(46,47);因此,我们不能排除PAR1-independent SCH79797的效果。然而,SCH79797抑制PAR1信号(图的能力4和裁判。18),KO的一致性和抑制剂的研究,他们的影响是相反的PAR1-AP——表明SCH79797的影响在我们的模型中可能与块PAR1信号的能力。
除了PAR1外,其他部分可以参与IAV感染的发病机理(48- - - - - -50)。识别的确切性质和数量蛋白酶出席的感染,病毒株差异如何改变免疫应答及其与支护结构的相互作用,可以促进我们对IAV感染的发病机制的理解。
目前治疗IAV感染目标病毒蛋白质M2和NA。这些药物受到一些缺点,包括耐药病毒变异的快速发展的选择性压力,这凸显了需要新的药理策略对IAV感染。因为针对宿主蛋白质不会受到阻力,因为严重感染IAV有害宿主炎性反应,药物调节炎症吸引力作为潜在的治疗IAV感染(51,52)。在我们目前的研究中,阻塞PAR1信号几乎完全保护小鼠免受高致病性病毒对奥司他韦具有耐药性的2009年大流感H1N1v孤立从严重病变oseltamivir-treated病人(34)。此外,抑制小鼠接种后3天保护PAR1信号从感染各种IAVs有害的结果,包括H1N1和H3N2病毒株。因为H1N1和H3N2亚型IAVs目前流行的人口,它是合理的假设PAR1拮抗剂对季节性流感病毒最有可能也有效。有趣的是,研究了PAR1拮抗剂vorapaxar作为一个潜在的抗血栓形成的药物约40000患者3年以上(53,54)。最严重的副作用,增加颅内出血的发生率,主要发生在前史的患者中风。没有这样的历史,颅内出血的发病率的增加是每1000 treatment-years小于1。因此,短期PAR1对抗似乎是相对安全的。这个观察,考虑到与我们的研究结果,表明PAR1对抗应该进一步探索治疗IAV的额外的临床前模型,在适当的情况下,人体研究。
细胞、病毒株和试剂。NIH3T3鼠标细胞株是一份礼物从d Decimo (INSERM U758,里昂,法国)。人类肺泡II型(A549)和MDCK细胞株用于本研究从写明ATCC获得和发展(如前所述)(55)。甲型H1N1流感(病毒/公关/ 8/34)从写明ATCC获得。H3N2(应变/香港/ 2/68)是来自荷兰国家流感中心。压力最初获得的国家标准和控制研究所生物(NIBSC)。高致病性H5N1禽流感病毒株/野鸭/巴伐利亚/ 1/2006;也称为MB1)和大流行性流感病毒H1N1v(北威州的应变/ / 173/09)被用于这项研究。H1N1v从H1N1pdm09严重病例中分离,通过德国国家流感中心参考的罗伯特·科赫研究所期间获得性耐奥司他韦治疗(34)。H5N1型病毒在鸡蛋里传播了两天,和其他病毒的传播在汇合的MDCK细胞。2天后,细胞病理变化完成,和文化上层的收获,通过低速离心和存储在-80°C。肽(TFLLR-NH PAR1-AP和控制2和FTLLR-NH2分别从Bachem购买。PAR1拮抗剂(SCH79797盐酸盐)从轴突Medchem购买。身为从Sigma-Aldrich购买,使用下面的抗体:单克隆anti-HA (C102;圣克鲁斯生物技术),单克隆anti-tubulin (Sigma-Aldrich)和多克隆anti-ERK phospho-ERK(细胞信号技术)。
体外刺激。A549细胞preincubated 5分钟40μM PAR1-AP或控制肽或1小时5μM SCH79797。0.001细胞被感染了甲型H1N1流感(MOI)在MEM补充0.5μM身为(Sigma-Aldrich)的药物。在指定时间刺激后,病毒滴度分析古典斑块化验执行之前,用MDCK细胞(56)。
免疫印迹分析ERK激活和HA乳沟。A549 NIH3T3细胞被刺激或不与表示的浓度PAR1-AP 5分钟37°C。表明,细胞与SCH79797 preincubated 1小时。细胞细胞溶解,蛋白质的溶解产物进行了分析通过对ERK激活免疫印迹,如前所述(57)。HA劈理实验,A549细胞被刺激或不与40个μM PAR1-AP和感染IAV (MOI 0.5)存在与否的16个小时0.5μM身为。细胞细胞溶解,溶解产物的蛋白质免疫印迹分析,如前所述(57)。
老鼠。身为- / -老鼠(中断身为基因)和WT同窝出生的(58)和6 C57BL / 6雌性老鼠(查尔斯河实验室)被用于这项研究。Par1- / -老鼠(中断Par1基因)和WT同窝出生的是前面描述的(59)。杂合的老鼠交叉、WT KO的后代。老鼠的年龄范围从5周最多4个月,因为老鼠的数量可以得到有限。雄性和雌性小鼠被用于实验。WT组和KO小鼠分层对这些年龄和性别的差异。执行tail-tip基因组DNA聚合酶链反应(60)测定缺失或功能的存在身为或Par1基因。
老鼠感染和治疗。小鼠麻醉和接种鼻内25μl解决含有不同剂量的病毒存在与否的50μM PAR1-AP, 50μM控制肽,和/或50μM SCH79797。500年μM SCH79797也用于阻断实验图4b与PAR1-AP鼻内治疗,控制肽,和/或SCH79797也反复感染后2和3在天。此外,小鼠接种,SCH79797管理在感染后3 - 5天2 - 4或天。老鼠然后监测体重下降和死亡率。评估病毒复制,肺是来自老鼠乱划,传染性病毒滴度测定空斑实验如前所述(56)。
细胞因子检测ELISA和中性粒细胞招募。细胞因子的生产咆哮、il - 6和肺部KC是由ELISA(研发系统),利用老鼠的落下帷幕,如前所述(60)。中性粒细胞招募,BAL收集在PBS(表达载体)补充1毫米EDTA(表达载体)。cytocentrifugation后,中性粒细胞的百分比由计数每样本共有500个细胞的显微镜检查May-Grunwald——Giemsa-stained cytocentrifuge幻灯片。
肺组织学。在病毒接种和治疗3天后,老鼠被杀,和肺组织是收获,10%甲醛固定,随后嵌入石蜡。组织切片在12μM,部分检查与苏木精和伊红染色后组织病理学变化。
统计数据。Mann-Whitney测试是用于肺病毒滴度和细胞因子的统计分析ELISA结果。kaplan meier测试是用于统计分析的存活率。XLSTAT软件被用来分析组之间的差异;一个P被认为具有统计显著性值小于0.05。
研究批准。实验根据国家委员会的建议进行动物实验(CNEA)和全国委员会在动物实验的伦理反射(CNREEA)符合欧洲动物福利法规。动物实验委员会批准的协议是克劳德·伯纳德•里昂大学的我(不允许。BH2008-13)。所有动物实验也进行许可证颁发的权威下“la方向des服务Veterinaires”(认证号78 - 114)。所有的努力都是尽量减少痛苦。
我们感谢n . Lejal技术援助。这项工作是支持的国家de la矫揉造作的(ANR;b . Riteau);Inserm Avenir (e·卡默勒);居里夫人的动作(e·卡默勒);和长期的结构性funding-Methusalem弗拉芒政府(p . Carmeliet)。
利益冲突:哈立德Khoufache和比阿特丽斯Riteau专利有关PAR1拮抗剂对抗流感的使用。
参考信息:中国投资。2013,123 (1):206 - 214。doi: 10.1172 / JCI61667。