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1微生物学,免疫学和分子遗传学系,和2医学科学家培训计划,大卫·格芬医学院,加州大学加州,洛杉矶,加利福尼亚,美国。3.G.W.Hooper基金会,UCSF,旧金山,加利福尼亚,美国。4肺和危重病护理医学司5美国加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院分子生物学研究所。
通讯地址:Jane C. Deng, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California, Los Angeles, 10833 Le Conte Ave., 37-131 CHS, Los Angeles, California, 90095, USA。电话:(310)983 - 3446;传真:(310)206 - 8622;电子邮件:jdeng@mednet.ucla.edu.
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2009年6月1日出版-更多信息
流感相关并发症仍然是全世界死亡的主要原因。由于机制不清楚,大量流感相关死亡是由细菌重叠感染引起的,尤其是继发性肺炎球菌肺炎。在这里,我们报告了我们认为是流感诱导的I型干扰素致敏的一种新机制ze是继发性细菌感染的宿主。缺乏I型IFN-α/β受体信号的流感感染小鼠(IFNAR.- / -小鼠)提高了中学的存活率和清除链球菌引起的肺炎来自肺部和血液的感染,与类似感染的野生型动物相比。在野生型小鼠中,较不有效的反应似乎可归因于继发刺激后中性粒细胞趋化剂KC(也称为Cxcl1)和Mip2(也称为Cxcl2)的产生受损肺炎链球菌.这导致中性粒细胞对宿主防御早期患者反对继发性细菌感染的反应不足。实际上,流感感染的野生型小鼠在肺施用外源Kc和MIP2后清除次生肺炎球菌肺炎,而CXCR2的中和,KC和MIP2的共同受体,逆转观察到的保护表型IFNAR.- / -老鼠。这些数据可能强调了I型IFN抑制途径对CXC趋化因子产生的重要性。总的来说,这些发现强调了我们认为的一种新的机制,通过这种机制,对流感的抗病毒反应使宿主对继发性细菌性肺炎敏感。
流感肺炎是在美国每年的传染性原因和第8次死亡原因死亡的主要原因(1)虽然流感感染本身可能致命,但大量感染后死亡是由于继发性细菌性肺炎,最常见的原因是肺炎链球菌,金黄色葡萄球菌,和肺炎克雷伯菌(2- - - - - -4)然而,人们对流感使患者对继发性细菌感染敏感的机制知之甚少。鉴于流感大流行的迫在眉睫的威胁和抗生素耐药性的增加,确定免疫靶点以预防感染后细菌性肺炎具有重大的临床影响。
完整的固有免疫反应,包括由常驻肺泡巨噬细胞和招募的中性粒细胞介导的免疫反应,对于清除肺部细菌病原体至关重要(5- - - - - -7)早期的研究报告了流感感染后巨噬细胞和中性粒细胞反应的损害(8- - - - - -18),但这些缺陷背后的分子途径尚未完全阐明。尽管多种因素,包括流感感染期间血小板激活因子受体和抗炎细胞因子IL-10的上调,都与流感后继发性肺炎球菌肺炎的发生有关,但试图修改这些因素对细菌清除的影响有限(19- - - - - -21).
I型干扰素是抗病毒防御的核心,是一大类抗病毒细胞因子,包括多个IFN-α蛋白和一个IFN-β蛋白。I型干扰素通过共同受体IFN-α/β受体(IFNAR)发出信号,导致促炎基因的表达,这些基因不仅抑制病毒复制,而且增强适应性免疫的各个方面(22- - - - - -25).虽然I型干扰素对抗病毒防御的重要性已经得到了很好的证实,但它们在细菌防御中的作用还比较模糊。因此,我们在实验室建立了一个序列流感和肺炎球菌肺部感染的模型,使用具有缺陷IFNAR信号的转基因动物(IFNAR.- / -小鼠)探讨I型IFNS在肺宿主防御过程中诱导的I IFNS的疗效。有趣的是,我们发现,在流感肺炎期间肺部肺部IFNS的诱导对次要肺炎球菌攻击后的间隙和生存率显着存在有害影响。这似乎至少部分地归因于I IFN介导的KC(也称为CXCL1)和MIP2(也称为CXCL2)产生的IFN介导的衰减,导致中性粒细胞应答受损。因此,我们发现抗病毒宿主反应抵消了通过特定炎症基因的特定调节来抵消宿主清除后续细菌攻击的能力。
流感增强小鼠对肺炎链球菌继发感染的敏感性。本研究以C57BL/6小鼠为实验对象,采用气管内感染PR8对不同剂量的流感病毒株及其存活率进行了检查。我们发现,对200个感染单位的PR8流感病毒株可重复导致亚致死性肺炎。先前在该领域的研究表明肺炎链球菌在最初流感感染后5至7天内最致命(15,20)此外,大多数继发性细菌感染发生在原发性流感感染的前两周内(26).因此,我们建立了一个组合感染模型,首次流感感染后5天,给动物喂食肺炎链球菌信息技术。(图1A) .我们的初步研究表明,在未出生的动物中,2000 CFU的剂量是亚致死的(<20%死亡率),但仍足以导致轻度炎症内流,这与在患者中较轻的肺炎球菌肺炎病例中观察到的情况相似(数据未显示)然而,在先前感染流感的动物中,在2000 CFU的细菌挑战后肺炎链球菌,早在继发感染后24小时,肺部细菌负荷就增加了4-log肺炎链球菌,显著差异持续48小时(图1同样,在双重感染的动物中发现了明显更高的菌血症率(在PR8- 在24小时时,盐水预处理的动物与盐水预处理的动物为50%,在48小时内为75%vs.25%)(图1b)。此外,观察到显着的死亡率PR8/肺炎链球菌- 活化的动物而不是盐水/肺炎链球菌- 或者PR8/盐水处理的动物(图1C)。当随后用肺炎球菌接种物攻击低至100 CFU(数据未显示)时,在具有先前流感感染的动物中观察到具有先前流感感染的动物的增强的死亡率。
初级流感肺炎增强对次级肺炎球菌感染的敏感性。(一个)野生型C57BL/6动物组合感染模型的实验装置。给小鼠注射i.t.流感疫苗(PR8(200pfu)或生理盐水,5天后行静脉滴注。肺炎链球菌(服务提供商)或生理盐水。(B)在生理盐水中测量肺部细菌负荷和菌血症发生率/肺炎链球菌- - -PR8/肺炎链球菌-感染动物在继发性细菌攻毒(2000 CFU)后的第1和第2天。(C)以下3组在首次i.t.激发后的3周内检查存活率:PR8/生理盐水,生理盐水/肺炎链球菌和PR8/肺炎链球菌.N=每组4–8只动物。数据代表2个独立实验。
Influenza-infected Ifnar- / -小鼠对继发性细菌性肺炎有抵抗力。为了更好地理解流感致敏小鼠继发性肺炎球菌肺炎的机制,我们分析了体内对病毒感染的免疫反应动力学。我们首先检查了肺中I型IFN的诱导,发现IFN-α水平在感染后第5天达到峰值PR8感染(图2A),升高的水平持续到第10天,这在以前的研究中与次级药最大易感性的时间有关肺炎链球菌感染(即流感感染后5-7天)(15,20).虽然I IFNS IFNS被认为是响应于感染的先天和适应性免疫反应的重要激活因子,特别是在病毒感染期间,我们希望确定I IS IFNS的肺部是否在流感感染的动物的肺部矛盾的敏感性增加对二次细菌肺炎的敏感性.因此,具有靶向缺失的普通型I IFN受体的动物(IFNAR.- / -),年龄和性别匹配IFNAR.+/+动物感染了病毒PR8然后在第5天用肺炎链球菌.我们也被感染了IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物与PR8或肺炎链球菌与之前的报告类似,我们发现IFNAR.- / -小鼠在第5天或第7天的肺部病毒负荷或其他疾病参数(如流感感染后体重减轻)与对照组相比没有显著差异IFNAR.+/+同行后PR8感染(27)(补充图1;本文在线提供的补充材料;doi:10.1172/JCI35412DS1),表明I型干扰素介导的应答在病毒清除方面存在冗余。此外,在肺细菌负荷方面未观察到明显差异IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物在48小时后肺炎链球菌仅感染一例(图2B) .连续感染PR8和肺炎链球菌, 然而,IFNAR.- / -与野生型对应物相比,小鼠似乎较少(例如,较少的嗜睡和荷叶毛皮)。在I.T.之后48小时。肺炎链球菌感染,肺部PR8/肺炎链球菌–感染IFNAR.- / -小鼠的CFU数量减少了近4倍肺炎链球菌与IFNAR.+/+动物(图2B;P <0.01)。此时,我们无法检测出阳性的血培养肺炎链球菌在PR8/肺炎链球菌–感染IFNAR.- / -老鼠,而75%IFNAR.+/+动物均为菌血症(图2C;P<0.05)。这些肺部和全身细菌负荷的差异持续到第4天(补充图2),并与患者死亡率增加相关IFNAR.+/+动物(图2D) 。存活到第7天的动物开始表现出从肺部和血液中清除细菌的能力,尽管在第7天仍然有轻微的延长菌血症的趋势IFNAR.+/+组(补充图2)。因此,I型IFN信号的存在显著增加了流感感染宿主肺部继发性细菌感染的易感性。
流感感染Ifnar - /- - - - - -小鼠对继发性肺炎球菌肺炎有抵抗力。(一个)静脉注射流感后干扰素-α诱导的动力学。PR8.IFNAR.+/+C57BL/6小鼠经静脉注射。PR8第0天,在指定的时间点采集肺组织,通过ELISA评估肺匀浆中的IFN-α水平(B和C)清除肺炎链球菌受流感感染IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物。两种基因型的年龄和性别匹配的动物均经静脉注射。PR8或生理盐水,5天后用it。肺炎链球菌(2000 CFU).肺(B)血(C)在第2天之后收获。肺炎链球菌感染,用于CFU评估。N=每组8-11只(B),N=每组4只(C).Arunachal Pradesh,P< 0.01。数据代表了3个独立的实验。(D)以下信息。PR8和肺炎链球菌给药间隔5天,14天后评估生存情况肺炎链球菌感染。生存率为70%IFNAR.- / -与之相比,老鼠的死亡率为33%IFNAR.+/+14天时的小鼠*P= 0.05,日志排名测试。N=每组10-12只。数据来自2个单独的实验。(E)用MAR1-5A3中和野生型动物的IFNAR中和的动物中的肺CFU。P< 0.05,单尾Mann-WhitneyU测试。水平线表示统计中间值。
为了排除大脑发育异常IFNAR.- / -将小鼠作为混杂因素,用IFNAR中和抗体(MAR1-5A3)治疗野生型动物(28)或小鼠IgG,然后如上所述进行感染。继i.t。PR8感染后,与IgG处理的动物相比,MAR1-5A3处理的小鼠明显增强了继发性肺炎球菌激发的肺清除率(图2E) 48小时,这与在实验室中观察到的结果一致IFNAR.- / -动物。
因为我们最近证明,在LPS刺激巨噬细胞后,I型IFNs介导IL-10的上调(29),我们希望检查IL-10是否负责在我们的模型中观察到的I IS IFNS的损害。我们的初步研究发现,流感感染导致IL-10生产的上调,第7天达到峰值PR8感染(补充图3a)。与以前公布的报道一起携带,显示IL-10可以发挥可损性的清除作用肺炎链球菌(19,30),这让我们检查是否Il10- / -动物能够在流感后清除细菌IFNAR.- / -动物做了。我们无法辨别出显着的差异Il10+/+和Il10- / -肺炎球菌肺负担的动物在I.T.施用这种传染性剂量(2,000 cfu),无论是天真的吗(即,在第5天之前的盐水预处理。肺炎链球菌)或以前的甲型感染(即,给予I.T.PR8i.t.前5天。肺炎链球菌;补充图3 b)。因此,这些数据表明,在我们的模型中,I型ifn介导的IL-10上调不太可能是I型ifn对抗菌免疫的影响。
Influenza-infected Ifnar- / -与IFNAR相比,动物的KC和MIP含量较高+/+继发性肺炎球菌感染后的早期时间点的动物。鉴于我们的研究结果,I IFNS敏化小鼠对二次细菌肺炎,我们接下来检查我们是否可以在肺部中找到细胞因子水平的任何差异PR8-已感染IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物以应对挑战肺炎链球菌.由于肺炎球菌感染后48小时肺部细菌负荷存在显著差异,这可能会影响细胞因子水平,因此我们重点关注早期时间点炎症细胞因子反应的差异,而在早期时间点,两组之间存在显著差异IFNAR.+/+和IFNAR.- / -有细菌负荷的动物不太可能出现(即16小时)。从盐水预处理或流感感染获得的肺匀浆IFNAR.+/+和IFNAR.- / -在继发性肺炎球菌感染后16小时,对动物进行细胞因子和趋化因子表达分析。与先前的报道一致,与仅感染肺炎球菌的动物相比,流感和肺炎球菌感染的动物体内普遍存在较高水平的炎性细胞因子(31),这可能是由于肺部细菌负荷明显增高所致PR8/肺炎链球菌–与生理盐水相比,受感染的动物/肺炎链球菌–受感染的动物。以下肺炎链球菌单是感染,我们没有发现两组间炎症细胞因子产生的显著差异IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物。然而,在受流感感染的动物中,我们发现IFNAR.- / -动物能够对继发的KC和Mip2趋化因子产生更强的响应肺炎链球菌挑战,与他们相比IFNAR.+/+同行。有趣的是,我们没有发现GM-CSF、G-CSF、IL-6和IP10等炎性细胞因子的表达有显著差异,提示I型ifn可能导致KC和Mip2的选择性衰减(图)3.).这是特别重要的,因为这些趋化因子已被证明是对中性粒细胞招生和肺部细菌病原体的清除,包括肺炎球菌(32)因此,在流感感染宿主中,I型干扰素的存在似乎在流感感染宿主对继发性细菌感染的早期反应中减弱了KC和Mip2反应。
肺组织匀浆PR8/肺炎链球菌–感染IFNAR.- / -小鼠含有较高含量的KC和MIP2。在继发性肺炎球菌感染反应中产生KC和Mip2,通过ELISA分析确定IFNAR.+/+和IFNAR.- / -小鼠与先前流感感染。通过多重细胞因子蛋白质分析确定其他炎性细胞因子的水平。获得肺匀浆并在次要攻击后16小时分析肺炎链球菌。N≥ 每组4只。
I型干扰素抑制Kc和Mip2的产生。据我们所知,I型IFNs对KC和Mip2表达的调控尚未见报道。鉴于这些趋化因子在PR8/肺炎链球菌- 生育的动物,我们希望确定I型IFNS是否可以直接抑制KC和MIP2的表达。将来自野生型动物的骨髓衍生的巨噬细胞(BMMS)用IFN-α预处理30分钟并随后用PAM3CYS(P3C)激活,用于TLR2的细菌配体,其识别革兰氏阳性细菌。有趣的是,IFN-α预处理对大多数炎症分子的表达几乎没有影响,例如Tnfa,il1b.和Ikba,我们观察到对P3C诱导的效率抑制Kc和Mip2转录物(图4一种)。减少诱导Kc记录了多个时间点的记录(图4b)。通过P3C刺激后24小时通过ELISA分析测量,还通过ELISA分析测量的KC和MIP2蛋白质产生(图4C).因此,I型ifn在细菌配体反应中似乎没有全面抑制炎症基因的上调,而是选择性地削弱炎症基因的表达Kc和Mip2对巨噬细胞中TLR信号的响应
I型IFNS抑制生产Kc和Mip2但不是Tnfa或IkbaP3C中的转录物刺激BMMs。(一个IFN-α预处理BMMs 30分钟,TLR2配体P3C刺激。Kc,Mip2,Tnfa和IkbaP3C刺激后4小时定量PCR检测表达。数据代表了4个独立进行的实验。米,媒体。(B重组IFN-α刺激BMMs 30分钟,然后P3C刺激。通过定量PCR检测P3C刺激后不同时间点的KC表达水平。所有值都归一化为L32表达水平(C)通过ELISA评估细胞培养上清液中KC和Mip2蛋白水平的产生。在收集上清液进行分析之前,BMM暴露于IFN-α、P3C或IFN-α和P3C 24小时。
Influenza-infected Ifnar- / -小鼠响应于肺炎肺炎,对PMN募集到肺组织中。我们还试图确定KC和MIP2表达的损伤是否与细胞炎症之间的功能差异有关IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物。为了评估气道细胞的细胞组成,我们对患者进行了支气管肺泡灌洗(BAL)IFNAR.+/+和IFNAR.- / -在感染之前的动物,在14小时后。管理肺炎链球菌进入肺PR8-受感染动物。基线检查时,未经治疗IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物的总细胞数相似。这些细胞在形态上超过95%是巨噬细胞(补充图4)。有趣的是,来自PR8/肺炎链球菌–感染IFNAR.- / -与...相比,小鼠包含明显更高的PMN百分比和百分比IFNAR.+/+老鼠 (P<0.05;数字5A和补充图4)。
IFNAR.- / -小鼠有较高数量的空域中性粒细胞i、 t.PR8和肺炎链球菌.(一个)双重感染患者中浸润性中性粒细胞的总数和百分比IFNAR.+/+和IFNAR.- / -在继发性肺炎球菌激发后14小时对动物进行BAL分析。(B)在双重感染患者的肺匀浆中评估MPO活性IFNAR.- / -和IFNAR.+/+小鼠继发性刺激24小时后肺炎链球菌(P< 0.05)。N= 3. 数据代表至少2个独立进行的实验。(C)双重感染患者的肺匀浆CFUIFNAR.+/+和IFNAR.- / -术后4小时和16小时的动物肺炎链球菌挑战。(D)双感染肺匀浆中MPO活性的变化IFNAR.+/+和IFNAR.- / -在二次试验后4小时和16小时对动物进行测定肺炎链球菌挑战。(E) MPO活性的平均变化(16小时- 4小时)除以Log CFU的平均变化(16小时- 4小时)。
除BAL外,还测定了流感感染小鼠肺匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性,作为继发性肺炎球菌感染后肺中性粒细胞活性的另一种测定方法IFNAR.- / -动物,MPO活动明显高,相比显着升高IFNAR.+/+动物(P<0.01;图5B).由于在这个时间点细菌差异更明显,我们在更早的时间点检测MPO活性。感染后4小时,在细菌负荷的差异变得明显之前(图5C),IFNAR.- / -小鼠的MPO活性水平略高(图)5D).在感染后16小时,IFNAR.- / -与野生型小鼠相比,小鼠显示出明显更高的MPO水平(图5实际上,对于CFU在4到16小时之间的单位对数倍变化,IFNAR.- / -小鼠的MPO活性高于类似感染的野生型动物约5倍(图)5E)。
来自双重感染动物的肺部H&E染色显示IFNAR.- / -与小鼠相比,小鼠具有更强烈的炎性细胞浸润IFNAR.+/+(补充图5和7)。相比之下,在两组小鼠中均表现出较为温和的炎症反应PR8或肺炎链球菌单独使用,两种方法之间没有差异IFNAR.+/+和IFNAR.- / -动物(数据未显示)。肺组织切片MPO染色显示,肺组织感染区MPO阳性细胞数量较多IFNAR.- / -在这个时间点的小鼠(补充图7)。这些研究统称,表明这一点IFNAR.- / -具有先前流感感染的动物能够在继发性肺炎球菌攻击后对上升细菌滴度进行更有效的中性粒细胞反应。
KC和MIP2在流感感染动物中发挥肺部肺部肺部清除的关键作用。观察到I IS IFNS对KC和MIP2的产生的抑制作用,随着双感染的野生型动物的这些细胞因子的降低,它仍然不清楚I IFN介导的KC和MIP2的抑制是否是主要机制野生型小鼠与次肺肺炎肺炎肺炎的敏感性增强。我们预测,如果KC和MIP2是观察到的继发性肺炎骨膜炎的增强的显着介质IFNAR.- / -动物,对受体的中和会显着提高流感感染的敏感性IFNAR.- / -老鼠。以前的报告表明,损伤介导的中性粒细胞向肺中募集需要Cxcr2,这是两种细胞因子的主要受体(33).因此,我们使用cxcr2阻断抗体来衡量这些细胞因子在继发性肺炎球菌感染中清除细菌的重要性。为了评估消耗的有效性,测量了肺MPO活性,发现α-Cxcr2抗体治疗的动物肺MPO活性降低(图)6A) .Cxcr2耗竭导致显著增加(超过3000倍;P<0.05)在肺部的细菌负担中IFNAR.- / -小鼠在第二次实验后24小时肺炎链球菌挑战(图6A). cxcr2中的细菌计数耗尽IFNAR.- / -老鼠和老鼠惊人地接近PR8/肺炎链球菌–感染IFNAR.+/+用正常山羊血清(NGS)治疗的小鼠。有趣的是,CXCR2的抑制没有显着改变肺部细菌负担IFNAR.+/+动物(约10倍,P=0.23;数字6A)表明KC和Mip2在野生型动物中以功能不足的水平表达。
KC和Mip2在清除继发性细菌感染中起着关键作用。(一个)IFNAR.+/+和IFNAR.- / -给动物注射。PR8, 5天后由i.t跟进。肺炎链球菌.施用抗CXCR2抗体或正常山羊血清I.P.在I.T.之前24小时。肺炎链球菌挑战。左:继发24小时后检测肺匀浆CFU肺炎链球菌(*P<0.05,N=每组4–6只动物)。右图:术后24小时评估肺匀浆的MPO活性肺炎链球菌感染。NGS,正常山羊血清(B(给动物注射。PR8, 5天后由i.t跟进。肺炎链球菌.在肺炎球菌给药时给予重组小鼠KC和Mip2。在继发感染后24小时肺炎链球菌取肺匀浆并测定CFU(左;Arunachal Pradesh,P< 0.01;N=每组5–8只小鼠)和MPO活性(右侧)。数据代表2个独立实验。载体,盐水载体。左侧面板中的水平条代表统计中间值。
相反,我们希望看到外源性KC和Mip2是否足以拯救流感感染者IFNAR.+/+动物继发感染肺炎球菌。因此,在单独的实验中,IFNAR.+/+同时给感染流感病毒的小鼠注射2000 CFU肺炎链球菌和单剂量KC加Mip2或载体溶液。用于比较,PR8-已感染IFNAR.- / -在继发细菌感染时用载体溶液处理动物。感染后24小时,用KC和MIP2治疗在肺匀浆中均上调MPO的表达,并在相比之下,通过2个原木在感染小鼠的肺部渗透地减少了细菌负担。IFNAR.+/+用盐水载体治疗的小鼠(图6B;P<0.005)。有趣的是,在KC+Mip2处理的野生型动物中观察到的细菌负载量与载体处理的野生型动物非常相似PR8/肺炎链球菌–感染IFNAR.- / -老鼠。因此,治疗流感感染IFNAR.+/+小鼠早期单剂量KC和Mip2足以恢复对继发性肺炎球菌肺炎的耐药水平IFNAR.- / -动物。总之,这些发现突出了KC和Mip2在清除继发性肺炎球菌肺炎中的关键重要性,并提示I型ifn介导的这些细胞因子抑制是增强继发性肺炎球菌肺炎易感性的主要机制。
虽然流感感染非常常见,但单纯由原发性病毒感染导致的死亡相对少见。许多与流感相关的死亡可归因于继发性病毒感染肺炎链球菌以及其他细菌,由于抗生素耐药性的出现和感染的严重程度增加,这些细菌面临着独特的挑战。流感感染已被证明会损害肺中的巨噬细胞和中性粒细胞功能,这两种细胞都是先天性肺宿主防御细菌病原体的关键细胞成分。在这里,我们报告了一种机制,其中抗病毒反应的核心成分,I型干扰素,通过损害中性粒细胞反应来损害先天性免疫应答对继发性细菌挑战。重要的是,我们发现了这一点IFNAR.- / -在流感后环境中,小鼠对继发性细菌性肺炎更具抵抗力,与双重感染小鼠相比,肺和血液细菌负荷显著降低,存活率增加IFNAR.+/+相对应的人。此外,IFNAR的中和作用足以保护感染流感的宿主免受继发性肺炎球菌肺炎的影响。这些发现表明,在流感感染期间在肺部诱导的I型干扰素在流感后时期使宿主对细菌感染敏感方面起着重要作用。
I型干扰素的抑制作用似乎至少部分通过选择性损伤KC和Mip2的产生来介导,随后导致体内二次细菌激发后中性粒细胞反应减弱。在I型干扰素的情况下,有足够的中性粒细胞反应对于有效的肺宿主防御至关重要n细菌负荷超过肺泡巨噬细胞的抗菌能力。最近,Sun和Metzger发现II型干扰素是流感感染后巨噬细胞功能障碍的介质,包括清道夫受体MARCO的下调,以及巨噬细胞介导的细菌吞噬和清除功能受损(34).尽管我们发现I型IFNs导致肺泡巨噬细胞MARCO表达下调,但我们无法令人信服地发现这导致了巨噬细胞吞噬能力的改变,无论是在体内还是体外(我们未发表的观察结果)。目前尚不清楚I型ifn是否会促进流感感染宿主对荚膜亚型的易感性肺炎链球菌这更依赖于巨噬细胞的间隙,细菌感染的更高滴度通常需要中性粒细胞招募以进行有效清除(35).CXCR2及其配体(KC和MIP2)似乎是对细菌病原体的宿主防御中嗜中性粒细胞募集的重要介质,包括肺炎链球菌(36- - - - - -39).由于肺泡巨噬细胞功能在流感感染期间减弱,因此有足够的中性粒细胞被招募到肺部以抵消不断增加的细菌负荷是至关重要的。因此,I型干扰素调节的中性粒细胞反应损伤可能对流感后细菌性肺部感染的发展起到重要作用,wh脑出血往往比新发细菌性肺炎更严重。
在这里,我们报告了I型干扰素对巨噬细胞中TLR2(革兰氏阳性)细菌配体激发产生CXC趋化因子的新的负调节作用。在体内,IFNAR.+/+动物未能达到与其不断增长的细菌负荷相称的足够的中性粒细胞应答(图)5,汉英),而IFNAR.- / -动物能够产生更强的中性粒细胞反应。确实,Cxcr2受体在流感感染中的中和作用IFNAR.- / -小鼠抑制继发性细菌感染的能力受到限制,而给药KC和Mip2可抑制继发性细菌感染IFNAR.+/+动物对流感后肺炎球菌感染具有保护性优势,证明Cxcr2活性确实在I型干扰素下游发挥作用。这可能为Didierlaurent等人最近报道的有趣发现提供了分子基础。Didierlaurent等人描述了流感诱导的肺泡巨噬细胞脱敏,包括ing降低了流感感染后鞭毛蛋白(TLR5配体)激发产生的Mip2和KC(40).总的来说,这些研究的结果表明,对流感的抗病毒反应似乎损害了两种关键的抗菌细胞防线——由II型ifn介导的巨噬细胞损伤和由I型ifn介导的Cxcr2趋化因子表达抑制导致的中性粒细胞反应不足。
除了流感后的巨噬细胞和中性粒细胞功能障碍,先前的研究已经确定了几个被认为增强流感感染小鼠继发性细菌感染易感性的其他因素。这包括对呼吸上皮的损伤,促进细胞粘附的因子(如血小板聚集因子)的上调肺炎链球菌IL-10 (15,20,21,41)然而,试图操纵其中一些变化对宿主控制继发性肺炎球菌感染的能力影响不大(19,20).在目前的研究中,我们发现Il10- / -和野生型小鼠在流感感染后继发肺炎球菌肺部感染的清除能力相当(补充图3)。这并不排除在流感挑战后的时间点上,IL-10可能有助于流感感染宿主的细菌易感性的可能性。尽管最近公布的数据表明情况并非如此(34)。可能在流感感染后的不同时间,多种机制有助于流感感染宿主对继发性细菌感染的致敏性,这取决于最初流感感染的严重程度和宿主抗病毒反应的性质。需要进一步研究以阐明抗病毒药物如何l免疫反应随时间改变抗菌防御。
我们的研究还揭示了I型干扰素对抗菌防御的复杂作用。虽然I型干扰素在清除病毒病原体方面发挥着重要作用,但在细菌感染的情况下,它们似乎具有相互矛盾的作用,促进了某些细胞内病原体的清除(例如。,沙门氏菌,军团菌),同时抑制对他人的清除(例如,李斯特菌,分枝杆菌) (42- - - - - -44).与已发表的研究一致,我们的数据显示IFNAR.- / -小鼠以一种类似于IFNAR.+/+动物(补充图1),展示了在某些病毒中抗病毒防御中I型IFNS的冗余性质。此外,缺乏IFNAR信号传导在止血的接种剂量中单独在肺中显着改变肺炎球菌的清除(图2b)。然而,在流感感染之后,I型IFNS似乎具有对肺中抗菌防御有害的免疫调节作用。I型IFNS已被证明在各种细胞中诱导细胞凋亡,包括脾细胞,这可能有助于细胞内细菌的损害,例如李斯特菌(42).然而,我们的初步研究表明,在肺组织学部分中可以观察到凋亡细胞没有显着差异IFNAR.- / -动物比较IFNAR.+/+动物后PR8虽然细胞凋亡可能在较高的病毒接种中发挥作用(研究仍在进行中),但在我们目前的模型中,它似乎对I型ifn的有害影响没有显著贡献。
虽然多种机制可能共同导致流感诱导的抗菌天然免疫反应的损害,但我们的发现揭示了一种我们认为是一种新的机制,亚致死性流感感染通过I型干扰素介导的中性粒细胞反应减弱使宿主对继发性细菌感染敏感。为什么存在这种调节途径尚不清楚。我们假设,尽管中性粒细胞在宿主防御细菌感染中起着关键作用,但它们的存在也可能是有害的,尤其是在肺部。如果不加以检查,激活的中性粒细胞可导致严重的肺损伤(45)因此,在病毒感染期间,I型干扰素可能是机体调节中性粒细胞反应的一种潜在机制。这表明,在原发性病毒感染后,免疫系统试图控制炎症的特定方面,而不是像内毒素耐受所观察到的那样,全面抑制炎症我们的研究结果支持以下免疫机制模型:在流感感染期间,当宿主试图限制病毒复制时,I型IFN被诱导。虽然I型IFN通过上调抗病毒基因保护宿主,但它们似乎特异性地抑制KC和Mip2的进一步产生,而KC和Mip2可能没有什么蛋白质保护作用清除原发性病毒感染的有效值(46)可以介导肺损伤。然而,这些变化导致宿主损害宿主对进入的细菌病原体来安装适当的中性粒细胞应答,最终在次生细菌肺炎中。
总的来说,这些发现提供了一种机制,通过该机制,对流感的免疫应答易于宿主到二次细菌肺炎,从而为逆转病毒诱导的免疫抑制提供潜在的治疗靶标。进一步的研究需要检查I型IFNS调节中性粒细胞对初级流感和继发细菌感染的反应。最近,已经证明了Th17细胞因子是细菌肺炎期间肺中肺中介菌反应的重要介质(47)我们和其他人最近报道了由IFNAR激活的I型IFN和STAT1抑制Th17细胞发育(48,49)我们目前正在研究I型干扰素介导的Th17型应答损伤是否有助于限制原发性流感感染引起的肺损伤,同时削弱宿主抵抗继发性细菌感染的能力。
哺乳动物的先天免疫系统一直面临着多种多样、复杂的致病生物。虽然常见的介质是在病毒或细菌攻击后诱导的,但这项研究表明,抗病毒和抗菌反应经常是彼此不一致的。这一点在呼吸道流感感染中表现得最为明显,呼吸道流感感染往往因继发性细菌感染而复杂化。控制I型ifn介导的抑菌反应为防治复杂流感肺炎和继发性细菌感染提供了独特的研究方向。
试剂。ELISA中使用的重组鼠抗-TNF-α、-Mip2、-IL-12p70、-KC、-IL-1β、-IL-12和-IFN-γ抗体从研发系统购买。整个研究中使用的IFN-α抗体从PBL Biomed购买。如前所述,P3C从Sigma Aldrich购买(50).髓过氧化物酶检测试剂盒从Cytostore购买,并根据制造商的协议使用。
老鼠。殖民地IFNAR.- / -在C57BL/6背景下培育的小鼠在室内建立。年龄和性别匹配的特定病原体-无IFNAR.+/+所有实验均使用小鼠。所有动物均被安置在加州大学洛杉矶分校动物设施内的特定无病原体条件下,直至献祭之日。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院关于实验动物人道护理和使用的政策进行,并得到加州大学洛杉矶分校动物研究委员会的批准。
流感病毒和空斑试验。的PR8流感病毒株在MDCK细胞单分子膜上生长L.-(甲苯胺-2-苯基)乙基氯甲基酮(tpck处理)胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)。3天后,将覆盖介质清除细胞碎片,并将其保存在-80°C。50%组织培养感染剂量50通过电镀MDCK细胞在96孔板中进行测定并进行2倍的病毒原料稀释,然后在TPCK胰蛋白酶存在下与MDCK细胞一起孵育2天。通过使用鸡红细胞进行血凝素活性测定来确定病毒的存在。据报道,TCID50作为稀释,其中50%的感染孔对病毒呈阳性。
通过将MDCK单分子膜与全肺匀浆在6孔板中于37°C下孵育1小时来进行菌斑测定,全肺匀浆在病毒稀释缓冲液(含10%BSA、CaCl的PBS)中连续稀释2,以及氯化镁2).病毒生长培养基由MEM (Invitrogen), BME维生素(Sigma-Aldrich), NaHCO组成3., 10% BSA, 1% DEAE右旋糖酐,tpck处理的胰蛋白酶(0.7 μg/ml)和2%琼脂糖覆盖层。在34°C和5% CO条件下培养72小时2通过晶体紫色染色枚举斑块之前。
细菌制备和i.t.接种。类型3.肺炎链球菌(ATCC 6303临床分离株,荚膜血清3型)用于我们的研究。选择这种血清型,因为它是小鼠的毒性,并且通常导致人类疾病。细菌在37℃下用酵母提取物(Difco实验室)在Todd-Hewitt肉汤中生长8小时或直至对数相。通过测量600nm处的吸光度,然后在已知的CFU值产生的标准曲线上绘制OD来确定肉汤中细菌的浓度。然后将细菌培养物稀释至所需的浓度。用I.P麻醉小鼠。注射氯胺酮和木嗪混合物。接下来,暴露气管,通过无菌26尺针给药30μl接种物。使用缝合线关闭皮肤切口。
全肺均质CFU。在指定的时间点,小鼠被i.p.戊巴比妥安乐死。肺切除前,将1ml含5 mM EDTA的PBS注入右心室,灌注肺血管。整个肺被切除,小心地切除淋巴结。肺用含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的1ml PBS均质(罗氏应用科学)。匀浆在PBS中按1:5稀释,并在血琼脂上镀以测定肺CFU。
外周血CFU测定。在指定的时间点用肝素注射器从右心室采血,PBS按1:2顺序稀释,并在血琼脂上涂片,测定血CFU。
巴尔。进行BAL以评估白细胞积聚并获得用于体外研究的空气空间白细胞。暴露气管并使用外径为1.7 mm的聚乙烯导管插管。BAL通过将10 ml含有5 mm EDTA的PBS滴入1 ml等分液中进行,得到8 ml回收的灌洗液。从e在用低渗溶液溶解后,收集每组动物并计数。制备Cytospins(Shandon Inc.,Thermo Electron Corp.)以使用改良Wright染色法测定BAL差异。灌洗细胞由95%以上的肺泡巨噬细胞组成IFNAR.+/+和IFNAR.- / -处于基线的小鼠(数据未显示)。
HA活性测定。通过在1:1 Vol / Vol比中孵育连续的2倍稀释液的肺匀浆稀液体进行HA活性测定。测量活性作为抑制红细胞沉淀的最低稀释度。
组织学和免疫荧光。福尔马林固定的,石蜡包埋的5μm肺部用于免疫组化。在脱氨基化和再水化之后,通过在柠檬酸钠缓冲液中沸腾15分钟来进行抗原检索。使用马血清(载体印象抗兔套件)封闭切片60分钟,用兔抗MPO(ABCAM;目录AB15484)孵育1小时,然后用抗兔二抗孵育40分钟(载体印象试剂抗兔套件)在室温下。每一步都在PBS中进行两次5分钟的洗涤。含有DAPI(Vectashield,Vector Laboratories Inc.)的荧光的安装介质被施加到幻灯片上作为最终步骤。根据制造商的协议(德克萨斯红套件; Roche)进行4μm厚的肺截面的TUNEL染色。
小鼠细胞因子ELISA。MIP2和KC ELISA试剂盒购自R&D Biosciences。根据制造商的说明测量细胞因子水平。如前所述进行IFN-αELISA(50).简单地说,用大鼠抗ifn -α抗体(PBL生物医学实验室)包被NUNC平板。用1%的BSA在PBS和0.05% Tween中封闭板,并将样品孵育过夜,使捕获抗体平衡结合。采用兔抗小鼠IFN-α抗体(PBL生物医学实验室)孵育1小时,然后用酶标山羊抗兔抗体孵育。根据制造商的方案,使用Luminex 22-Plex小鼠细胞因子检测系统(Millipore)进行其他细胞因子分析。
mRNA和实时RT-PCR的分离。用TRI法提取巨噬细胞总RNAzol(Invitrogen),反转录成cDNA(iScript;BioRad),然后使用测试细胞因子的特异性引物进行扩增。根据核糖体蛋白L32的表达对所有值进行标准化。所检测基因的引物序列如下:mKC-forward、caagaacatccagagcttgaggt;反向,GTGGCTAGATTCGGTTTGG;mMip2转发,AGCTACACAG;反向,aaagccatcgactgcatct;mTNFα正向,ggtgcctatgtctcagctctt;反面,CGATCACCCGAAGTTCAGTA;Iκbα正向,ctgcaggcaactacaa;反面,cagcaagtcaccaagt。使用Applied Biosystems Power SYBR Green Supermix在单色实时PCR机上进行半定量PCR。所有实验均一式三份进行。
骨髓来源的巨噬细胞。从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓,并在含有DMEM的10%FBS中存在M-CSF的情况下进行分化。第7天,按照本文所述刺激细胞。在用P3C(100 ng/ml)或CpG(100 nM)刺激前30分钟,将重组IFN-α4(1000 U/ml)添加到培养基中.4小时后用Trizol试剂收集细胞总RNA,并在用氯仿萃取和异丙醇沉淀后分离。
抗体介导的中和和细胞因子重建。IFNAR1中和是在第0天(流感感染当天)通过注射1.5 mg MAR1-5A3(Leinco Technologies)抗体进行的,然后在第2天和第4天增加剂量0.75 mg。正常小鼠IgG用作对照。第5天,小鼠感染肺炎链球菌,在第6天采集肺部。对于Cxcr2中和实验,如前所述,用一次性300μl i.p.注射山羊抗Cxcr2血清或非特异性山羊血清耗尽流感感染小鼠(51- - - - - -53).小鼠随后被感染肺炎链球菌第二天。继发性细菌感染24小时后,处死小鼠,测量肺部细菌负荷,并对肺匀浆进行MPO测定。对于Mip2+KC重组,流感感染的动物用单剂量的i.t.KC+Mip2(各1μg)处理,再悬浮在PBS中0.1%的BSA中。根据鲎变形细胞裂解物分析(R&D Systems)测定,KC和Mip2所含内毒素低于1.0 U/1μg细胞因子。模拟处理的动物接受PBS和0.1%BSA。同时进行细菌接种。在感染后24小时评估肺部细菌负荷和肺匀浆MPO活性。
统计数据。生存曲线比较采用log-rank检验。对于其他数据,使用双尾未配对确定统计学意义T.双尾Mann-Whitney检验U检验(用于CFU数据),或在适当的情况下对多重比较进行校正的单因素方差分析。一个P0.05或更小的值被认为具有统计学意义。所有计算都是使用Windows的Prism软件程序(GraphPad software Inc.)完成的。CFU数据中的所有条形图都显示为生物重复的中位数。所有图表中的误差条表示扫描电镜和生物复制。
这项工作得到了NIH拨款T32 AI007323-19和GM08042(给A.Shahangian)、K08 HL081229(给J.C.Deng)以及1R01 AI056154和1R01 AI069120(给G.Cheng)的支持。我们感谢Paul W.Dempsey提供了宝贵的反馈和讨论,并感谢Tess E.Lin为研究提供的技术援助。
作者注:日红程和简邓邓邓。邓先生贡献了这项工作。
利益冲突:作者声明不存在利益冲突。
使用的非标准缩写:落下帷幕,支气管肺泡灌洗;BMM,骨髓源性巨噬细胞;IFNAR.IFN-α/β受体;MPO,髓过氧化物酶。
参考信息:j .中国。投资。119: 1910 - 1920(2009)。doi: 10.1172 / JCI35412