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文章细胞生物学免费获取|10.1172 / JCI18847
病理学系,美国密歇根州安阿伯市密歇根大学
通信地址:Sem h .表象,密歇根大学医学院病理学系安阿伯市密歇根48109 - 0602,美国。电话:(734)763 - 6454;传真:(734)936 - 1938;电子邮件:shphan@umich.edu。
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1月15日,2004年出版更多信息
成纤维细胞在肺纤维化的来源被认为是肺内的,但他们的肺外的起源,特别是从骨髓(BM)推导祖细胞并没有被排除。直接研究这种可能性,成年老鼠经久地分离出的BM道表达增强绿色荧光蛋白转基因小鼠。感应这种嵌合体小鼠的肺纤维化气管内博来霉素(BLM)注入大量的GFP引起的+在活跃的纤维化病变细胞出现,而只有少数GFP+细胞可以识别控制肺部。Flow-cytometric肺细胞的分析证实了BLM-induced GFP的增加+细胞嵌合体小鼠和显示绿色荧光蛋白显著增加+细胞也表达I型胶原蛋白。绿色荧光蛋白+肺成纤维细胞与嵌合体小鼠胶原蛋白和端粒酶逆转录酶表达但不是α-smooth肌肉肌动蛋白。治疗孤立GFP+成纤维细胞与TGF-β未能诱导myofibroblast分化。培养的肺成纤维细胞表达趋化因子受体CXCR4 CCR7和回应chemotactically同源配体,基质细胞衍生factor-1α和二级淋巴趋化因子,分别。因此collagen-producing肺成纤维细胞在肺纤维化也可以来自BM祖细胞。
干细胞在成人传统上被认为是限制在他们的潜在的分化和再生组织他们居住。然而,最近的进步需要复议的当前知识成人干细胞的潜力(1)。移植后的造血干细胞或骨髓(BM) nonhematopoietic间充质干细胞,肌肉(2)、心(3),肝脏(4)、肺(5,6)细胞供体来源已发现。对特定的重新的肺细胞,大约20%的移植II型pneumocytes从单个BM-derived干细胞已经证明(5)。
特发性肺纤维化(IPF)是一种毁灭性的疾病不存在有效的治疗(7,8)。病灶是成纤维细胞病灶代表活跃的病灶部位纤维发生剧烈的纤维母细胞的复制和旺盛的细胞外基质沉积,这可能会导致闭塞远端空气空间。这导致了更大的关注成纤维细胞和他们的直接参与纤维通路本身(9)。
成纤维细胞代表间质胶原蛋白的主要来源,但这些细胞被称为异构对许多表型特征(10)。虽然它假定它们源自肺内的细胞,有最近的证据循环血细胞(称为“纤维细胞”)拥有呈属性和可chemotactically招募网站的组织损伤11)。结合上面所提到最近的证据BM干细胞的可塑性,这提供了一个令人信服的理由复审的成纤维细胞的起源在肺纤维化,特别是肺外起源的可能。这种可能性将对我们目前的发病机制的理解产生深远的影响和未来发展的新的治疗方法控制或管理肺纤维化。
这些因素让我们调查BM-derived细胞是否可以代表的一个重要来源肺成纤维细胞在肺纤维化动物模型,如果是这样,以确定可能的招募了成纤维细胞和各种纤维母细胞表型之间的关系被描述在肺纤维化病变。使用BM嵌合体小鼠表达只在BM-derived增强型GFP细胞而不是在其他组织细胞,我们发现大量的纤维母细胞迁移到肺bleomycin-induced BM-derived (BLM-induced)肺纤维化。超过27%的GFP+纤维化肺组织细胞表达了I型胶原蛋白(Col I),增加了五倍以上saline-treated控制老鼠。这些细胞构成的80%以上坳I-expressing细胞纤维化肺,表明主要collagen-producing细胞纤维化源自BM和迁移到肺以响应信号释放反应肺损伤和纤维化。这些信号可能是趋化因子表达在BLM-induced肺纤维化。值得注意的是,绿色荧光蛋白的体外分析+从BLM-treated小鼠肺成纤维细胞培养显示,除了我上校,这些细胞也表达端粒酶逆转录酶(叔)组件而不是α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)。因此BM-derived细胞似乎产生激活成纤维细胞表型和代表的主要来源坳我表达BLM-induced肺纤维化。
材料。DMEM和抗生素(100 U /毫升青霉素、链霉素100μg /毫升、和0.25μg /毫升二性霉素b)来自英杰公司公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。从Cocalico Plasma-derived血清(PDS)生物制品有限公司(美国宾夕法尼亚州Reamstown)。人类PDGF重组,重组人表皮生长因子,重组小鼠基质细胞衍生factor-1α(SDF-1αCXCL12)和重组鼠标二级淋巴趋化因子(SLC CCL21)来自研发系统公司(美国明尼苏达州明尼阿波利斯市)。胰岛素、转移和硒(它的)液体媒体补充,明胶,30% (w / w) H2O2来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。胶原酶III型和DNase来自卫氏生化公司(美国新泽西州莱克伍德)。兔子biotin-conjugated anti-Col我抗体和山羊FITC-conjugated反GFP抗体来自洛克兰(美国宾夕法尼亚州Gilbertsville)。鼠标biotin-conjugated anti-α-SMA抗体(克隆1 a4)从视觉实验室公司(美国加州弗里蒙特)。鼠标biotin-conjugated anti-mouse CD45.2抗体(104年克隆),鼠phycoerythrin-conjugated (PE-conjugated) anti-mouse Mac-3抗体(克隆M3/84) streptavidin-Cy-Chrome (SAv-Cy-Chrome), Fc块(克隆2.4 g2),和BD Cytofix / Cytoperm工具包来自BD生物科学(美国加州圣地亚哥)。老鼠PE-conjugated anti-mouse F4/80抗体(克隆CI: A3-1)从Caltag实验室Inc .(美国加州伯林盖姆)。兔多克隆抗体anti-TERT来自圣克鲁斯生物技术有限公司(美国加州Santa Cruz)。Streptavidin-CY3 (SAv-Cy3)从酶实验室Inc .(美国加州旧金山南部)。Histochoice MB是Amresco Inc .(美国俄亥俄州梭伦)。Tyramide信号放大(TSA)生物素系统是从PerkinElmer(美国马萨诸塞州波士顿)。 The Vector M.O.M. Immunodetection Kit was from Vector Laboratories Inc. (Burlingame, California, USA). BLM was from Faulding Pharmaceutical Co. (Elizabeth, New Jersey, USA). Superscript One-Step RT-PCR with platinumTaq工具包是英杰公司生命技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。配角Transwell从康宁合演corp .)(剑桥,麻萨诸塞州,美国)。
老鼠。女6 - 8-week-old C57BL / 6 (B6)老鼠从杰克逊实验室购买(美国缅因州巴尔港)。GFP-transgenic (Tg)在C57BL / 6小鼠背景请提供美国里拉(先灵葆雅研究院,进军,新泽西,美国)(12)。所有动物研究已经被大学委员会进行审核和批准使用和密歇根大学的照顾动物。
BM嵌合体小鼠。BM嵌合体是准备与次要的修改(如前所述13,14)。BM细胞收集从股骨和胫骨的捐赠者GFP Tg或野生型B6小鼠愿望和冲洗。收件人B6小鼠暴露于两剂5 Gy隔3小时使用137年Cs辐照器,然后保持在酸化水和热压处理过的随意。辐照后,4×106BM细胞GFP Tg和B6小鼠200年卷μl无菌注射麻醉下retro-orbitally PBS。
器官移植受者的样本分析。验证成功的移植和大英博物馆的重建移植小鼠,BM、外周血和脾脏样本收集和分析后56天28和骨髓移植(BMT)。短暂,血液从retro-orbital静脉在PBS抗凝,收集和红细胞溶解氯化Tris-ammonium缓冲区。轻轻脾脏样本均质和枯竭的血红细胞与血液样本。股BM和PBS细胞被洗。有核细胞从这些样本然后沾biotin-conjugated anti-mouse CD45.2抗体表达所有收件人B6小鼠白细胞,然后被后续染色流式细胞术与SAv-Cy-Chrome枚举。
小鼠肝纤维化模型。后耐用BM移植成立以来,引起肺纤维化是气管内注射BLM之前(15)。短暂,BLM悬浮在无菌生理盐水1 U /毫升。BM嵌合体小鼠治疗0.0015个单位/ g体重BLM在无菌生理盐水稀释或同样体积的无菌生理盐水只在BMT后28天。的天BLM政府指定为BMT 28天/ BLM天0。分别表示,B6小鼠没有BM重建被同样对待BLM或盐水的肺成纤维细胞趋化性的研究。
形态分析。在28天BLM注射后(BMT 28天/ BLM 28天),BM嵌合体小鼠安乐死与生理盐水灌注肺都彻底清除血液从肺部血管床前(15)。肺被从胸腔中删除和清除多余的组织。肺部固定在4%多聚甲醛在冰上6小时,通过分级蔗糖脱水洗24小时,最后固定在10月化合物(英里Inc .,印第安纳州的埃尔德哈特,美国)。连续低温恒温器部分(4μm厚)然后沾)或离开清白的荧光显微镜评估分布或GFP的本地化+细胞。
流式细胞术分析全部肺细胞。21天BLM注射后(BMT 28天/ BLM 21天),从BM嵌合体小鼠肺部移除如上所述,用于获得单细胞悬浊液flow-cytometric分析如前所述15)。短暂,切碎后,样本与胶原酶消化和DNase,然后过滤获得单细胞悬浮体。与Fc块适当的洗涤和阻塞后,这些细胞被固定,permeabilized BD Cytofix / Cytoperm装备,沾的适当稀释biotin-conjugated anti-Col我抗体或biotin-conjugated isotype-matched控制免疫球蛋白,并与SAv-Cy-Chrome被后续的染色。一些细胞被沾染了老鼠PE-conjugated anti-mouse F4/80抗体,鼠PE-conjugated anti-mouse Mac-3抗体,或鼠PE-conjugated isotype-matched控制免疫球蛋白之前固定。死细胞和红细胞被排除在分析适当的控制。Flow-cytometric分析是使用一个史诗XL-MCL机(贝克曼库尔特公司,迈阿密,佛罗里达,美国)。收集的数据进行了分析使用Winlist软件(真实软件房子Inc . Topsham,缅因州,美国)。
鼠肺成纤维细胞的文化。鼠肺成纤维细胞被剁隔离肺组织,酶消化如前所述(15)。过滤后,释放细胞离心,水洗,在完全培养基和培养(CM)组成的DMEM补充10% PDS,人类重组PDGF (5 ng / ml),重组人表皮生长因子(10 ng / ml),其液体媒体补充(1:10 0)和抗生素。细胞在文化和通过维护之前15)。成纤维细胞在这项研究中使用第二次。
表示,纤维母细胞单层膜处理10 ng / ml TGF-β24小时,然后收获评估GFP mRNA的rt - pcr(见下文)通过流式细胞术或α-SMA表达式。α-SMA的表达进行了分析通过流式细胞术使用相同的协议分析坳我全部肺细胞。
培养的成纤维细胞的免疫细胞化学。免疫染色过程都是如前所述的一些修改使用TSA生物素系统(16)。除非另有规定,孵化和清洗过程通常在室温下进行。分析培养成纤维细胞,这些细胞被暂停在1×10厘米和镀5细胞/毫升到eight-well Lab-Tek室滑动系统(Nalge Nunc国际Naperville,伊利诺斯州,美国)。24小时后,幻灯片被风干,固定在Histochoice MB 20分钟解决方案。内源性过氧化物酶活性灭活0.3% H2O2在甲醇30分钟,清洗后,幻灯片在PBS沉浸在0.2% Triton x - 100 15分钟。与阻断缓冲区阻塞非特异性蛋白结合后(TSA生物素系统工具包中提供),一夜之间,幻灯片被孵化在4°C适当稀释的兔子biotin-conjugated anti-Col我抗体,鼠biotin-conjugated anti-α-SMA抗体,或兔子anti-TERT抗体。消极的控制,每个主要抗体与适当的物种被替换下场,isotype-matched免疫球蛋白。当鼠标使用单克隆抗体,向量M.O.M. Immunodetection工具包使用根据制造商的建议。对叔疣状,第二个山羊生物素化的anti-rabbit使用免疫球蛋白。所有幻灯片都按顺序孵化与streptavidin-peroxidase复杂,biotinyl tyramide, SAv-Cy3,洗在每个孵化。检测到GFP表达与山羊FITC-conjugated anti-GFP抗体。部分的安装方面山(Shandon Lipshaw Inc .,匹兹堡,宾夕法尼亚州,美国)。至少每样5随机选择大功率领域进行数感兴趣的细胞表达抗原细胞总数至少到100。细胞阳性坳我、α-SMA或叔GFP+和绿色荧光蛋白- - - - - -细胞数和表示为一个百分比的总细胞数为每个样本。总共五个样本检查(17)。
PCR分析GFP的表达、趋化因子和趋化因子受体。从肺组织肺总RNA分离或隔离肺成纤维细胞(如前所述)(15)。如前所述(半定量PCR分析18)。实时PCR进行TaqMan ABI 5700序列检测系统(美国加州福斯特城PE生物系统,)。使用TaqMan一步法rt - PCR大师混合试剂,100 ng孤立的总RNA是反向转录48°C 30分钟,并在95°C串行变性后10分钟,互补脱氧核糖核酸是放大如下:50两步PCR程序的周期在95°C 15秒和60°C 60秒钟。下面的寡核苷酸引物(200海里)和探测器(200海里):鼠标SDF-1α(基因库加入L12029数量;英国石油公司347年- 417年)意义(5′-AGTAAGCACAACAGCCCAAAGG-3′)和反义(5′-CTTGCATCTCCCACGGATGT-3′),内部fluorescence-labeled探针(FAM) (5′-TTCCAGTAGACCCCCGAGGAAGGC-3′);鼠标SLC / CCL21(基因库加入NM_011335数量;英国石油公司518年- 586年)意义(5′-CAGGCAAAGAGGGAGCTAGAAA-3′)和反义(5′-TGGACGGAGGCCAGCAT-3′),和内部调查(FAM) (5′-TCAGGAGCCCAAAGCAGCCACC-3′)。这些引物和探针获得体育生物系统。mRNA水平正常化GAPDH信使rna信号使用TaqMan啮齿动物GAPDH控制试剂(19)。在初步实验中,我们证实了PCR产品,成品使用目标gene-specific引物,没有污染的从基因组DNA扩增片段通过比较有和没有逆转录酶生成的产品。
rt - pcr分析mRNA GFP和趋化因子受体CXCR4和CCR7执行使用上标一步法rt - pcr和白金Taq装备。引物序列用于GFP和趋化因子受体如下:增强型绿色荧光蛋白(475 -英国石油产品),感觉(5′-AAGTTCATCTGCACCACCG-3′),反义(5′-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3′) (20.);趋化因子受体CXCR4(480 -英国石油产品),感觉(5′-ACCATCTACTTCATCATCTTC-3′),反义(5′-CACCATCCACAGGCTATC-3′);CCR7(586 -英国石油产品),感觉(5′-TGGTGGTGGCTCTCCTTGTC-3′),反义(5′-TCCTCGCCGCTGTTCTTCTG-3′)。GAPDH(308 -英国石油产品),引物的意义(5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3′)和反义(5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGAT-3′) (21)。积极控制,RNA样本脾脏。PCR产品强度衡量柯达1 d图像分析软件(柯达科学成像系统,纽黑文,康涅狄格州,美国)。趋化因子受体CXCR4的mRNA水平和CCR7规范化为GAPDH信号。
纤维母细胞趋化性分析。趋化性分析进行使用合演Transwell插入(8-μm孔隙大小),预镀0.1%明胶,基本上如前所述(11,22,23)。孤立的鼠肺成纤维细胞在停牌1×106包含0.1% BSA细胞在DMEM /毫升。介质本身(负控制)或介质包含SLC或SDF-1α(600μl)在指定的浓度添加到个人井24-well板。Transwell设备被插入,成纤维细胞(100μl)分层的膜的参议院Transwell插入(3井条件)和孵化在潮湿的5%股份有限公司37°C2/ 95%空气气氛。4小时后,细胞的顶部过滤被刮移除。过滤器与甲醇固定10分钟,然后用苏木精染色QS(向量实验室Inc .)。棋盘分析SLC -或SDF-1α-directed成纤维细胞的趋化性,SLC在250 ng / ml或SDF-1α500 ng / ml被添加到底层和顶层的房间。迁移是评估通过计算细胞的数量在五大功率领域光学显微镜。与不同文化的细胞复制实验在不同的场合。
统计分析。结果分析了使用Mann-Whitney测试任意两组之间的比较,并通过方差分析的非参数对应多个比较。P< 0.05被认为是显示统计学意义。
创建GFP BM嵌合体小鼠。成功的移植需要足够毁灭的接收者BM其次是生存和移植的移植的细胞。在这个BMT协议,辐照接受者B6小鼠没有BMT(仅注射PBS)在21天内死亡。来验证是否耐用BM移植成立以来,我们检查CD45.2的程度+也在BM GFP阳性细胞、外周血和脾脏通过流式细胞术BMT后28天,56。如图1在28天,超过92%的CD45.2+在BM和血液细胞GFP+,而在脾脏GFP超过77%+。这些百分比的绿色荧光蛋白+细胞都基本没有白天56在BM和外周血BMT后,而脾的水平提高到88%以上。这些数据表明收件人B6小鼠已经充分辐照,以及完全经久地重组和BM细胞GFP Tg鼠标起源。
动力学GFP的移植+BM细胞。BM、外周血和脾脏从收件人收集小鼠移植后28天,56的BM GFP Tg老鼠。有核细胞从这些样本应用与biotin-conjugated anti-mouse CD45.2 SAv-Cy-Chrome然后被后续的染色。GFP的百分比+细胞在CD45.2+流式细胞术测定细胞在这些样品。数据显示表示从6 - 12组意味着±SEM嵌合体小鼠。
我们给收件人B6小鼠两剂5 Gy每隔3小时达到最大的效果对BM调整同时最小化辐照的不良影响(例如,肺部和其他重要组织)。因为辐射可能引起肺炎可能影响端点进行了BLM模型,我们首先评估的影响辐照GFP BM嵌合体小鼠的肺没有BLM治疗。组织学检查H&E-stained肺部分显示基本正常肺架构没有证据表明炎症或纤维化BMT后28天(图2BMT后56天)。类似的评估并没有发现显著变化从28天,尽管一些分散的炎症细胞现在可以看出(图2b)。这些发现支持的嵌合体小鼠的肺正常的结果和本地化的GFP荧光显微镜评估存在+在这些小鼠肺细胞。这些显示一些绿色荧光蛋白+细胞的串行部分肺,即使在BMT(图后56天2c和d)。尽管在肺组织学检查发现收件人B6小鼠与野生型B6 BM移植细胞类似于GFP嵌合体小鼠,它们并没有显示出任何GFP+在荧光显微镜下细胞肺(数据没有显示)。因此,BMT的过程中创建BM嵌合体小鼠肺形态学上没有显著影响。
肺形态学BM嵌合体小鼠。代表GFP BM嵌合体小鼠的肺部分从检查28天(一个和c)和56天(b和dBMT后),通过光学显微镜(一个和bH&E-stained部分)和荧光显微镜(c和d)。BMT后28天(一个),肺GFP BM嵌合体小鼠显示本质上没有正常的肺架构和肺炎的证据。在56天BMT后(b),肺也出现基本正常,除了少数分散炎症细胞。只有少数GFP+细胞在肺部分在这两天(28日c)和56 (dBMT后)。Insets的c和d显示light-microscopic清白的部分用于荧光显微镜的图像。所有图片拍摄100×。
BM-derived GFP+细胞BLM-induced肺纤维化。评估GFP的涌入+细胞进入肺部BLM-induced纤维化,我们首先评估嵌合体小鼠的肺组织学BLM治疗后28天(即。BMT 28天/ BLM 28天)。结果表明,肺从BLM-treated GFP BM嵌合体小鼠表现出严重的肺纤维化,失去正常的肺泡结构、突出的杂乱无章的增厚,肺泡隔和崩溃的肺泡空间通过组织炎性浸润和纤维母细胞(图3a和b)。这些组织学变化BLM-treated GFP BM嵌合体小鼠的肺与那些BLM-treated B6与野生型小鼠移植B6 BM(数据没有显示)。当同一GFP BM嵌合体小鼠的肺组织被荧光显微镜分析,大量的细胞元素被发现表达绿色荧光蛋白,尤其是人口聚集在细胞地区活跃的纤维化(图3c)。相比之下,saline-treated GFP BM嵌合体小鼠的肺显示基本正常肺架构有一些分散的炎症细胞(图可见3、d和e)和很少的GFP+细胞明显的荧光显微镜(图3f),因此大量活跃的纤维化病变的细胞是来自大英博物馆。
形态学的BLM-induced BM嵌合体小鼠肺纤维化。从BLM-treated代表肺部分(一个- - - - - -c)或saline-treated (d- - - - - -f)GFP BM嵌合体小鼠评估在BLM或生理盐水治疗后28天。H&E-stained部分显示严重失真的肺肺泡结构由于广泛的纤维化(一个和b,分别为40××200)。(c)大量的绿色荧光蛋白+细胞在人口细胞纤维化病变被荧光显微镜在肺BLM-treated容易识别。×200。相比之下,H&E-stained saline-treated GFP BM嵌合体小鼠的肺部分显示正常的肺架构(d和e,分别为40××200),和一些分散GFP+用荧光显微镜观察细胞(f×200)。Insets的c和f显示各自的light-microscopic外观部分由荧光显微镜检查。×200。
BM-derived纤维化肺细胞的表型。炎症/免疫细胞会将渗透GFP的一部分+细胞BLM-treated嵌合体小鼠。评估其他细胞类型的可能性也可能来自大英博物馆,全部肺细胞被隔绝BLM -或者saline-treated GFP BM嵌合体小鼠在BMT 28天/ BLM 21天,然后通过流式细胞术分析(图4)。具体来说,细胞的人口生产坳我全部肺细胞检查,由于沉积坳我发现在肺纤维化的关键特征。结果证实了GFP的人数显著增加+BLM-treated嵌合体小鼠的肺细胞,71%以上的细胞被BM-derived而不是saline-treated控件(表中不到17%1)。正如预期的那样,有超过三倍增加的百分比坳+相对于saline-treated BLM-treated嵌合体小鼠肺细胞嵌合体小鼠,虽然60%以上的GFP+细胞不表达我上校(表1和图4)。然而,令人惊讶的是,80%以上的坳+细胞GFP+BLM-treated GFP BM嵌合体小鼠,代表27.5%的全部肺细胞分析。相比之下,只有4.76%的细胞被坳+和绿色荧光蛋白+在saline-treated控制。这些数据表明,BM-derived细胞代表的大部分坳I-producing细胞BLM-induced肺纤维化,因此纤维发生中可能发挥重要作用。排除BM-derived巨噬细胞可能的贡献已经退化的胶原蛋白,细胞表达F4/80或Mac-3的人口,这都是巨噬细胞的特殊标记,也是评价GFP+全部肺细胞。我只有6.7%的上校+细胞,GFP的2.7%±0.76%+细胞分析,表达了F4/80(图4e),而14.5%的上校+细胞,GFP的代表5.5%±0.4%+细胞,表达了Mac-3(图4f)。因此,我最多只有不到15%的坳+细胞可以识别为巨噬细胞可能降解胶原蛋白。
Flow-cytometric分析全部肺细胞GFP BM嵌合体小鼠。全部肺细胞被隔绝BLM-treated (一个和c)或saline-treated (b和d后21天)GFP BM嵌合体小鼠在BLM或生理盐水治疗。适当的免疫染色后,通过流式细胞仪分析细胞GFP我坳表达式(c和d)浇注后完整活细胞(地区由R1)表示根据侧散射(对数刻度所示,ssLOG)和向前散射(FS) (一个和b)。细胞治疗的分析结果isotype-matched控制免疫球蛋白anti-Col我抗体的insets所示c和d。此外,绿色荧光蛋白+从这些BLM-treated小鼠细胞分析我和上校F4/80或Mac-3浇注后GFP的表达+细胞在R1地区(地区R2的插图所示e)(e和f)。上校,我+和F4/80+代表2.7%±0.76%的GFP细胞+细胞(e)。上校,我+和Mac-3+代表5.5%±0.4%的GFP细胞+细胞(f)。插图在f展示了细胞沾isotype-matched控制免疫球蛋白。代表运行显示每组的8 BLM-treated或saline-treated GFP BM嵌合体小鼠,分别。总结了定量结果表1。
进一步评估这些BM-derived坳I-expressing细胞的表型对其潜在的身份与之前已经确定纤维母细胞表型,肺成纤维细胞被孤立的额外的体外研究。大多数肺成纤维细胞分离BLM-treated GFP BM嵌合体小鼠GFP+并显示正常,主要是纺锤状呈形态(图5a)。积极的疣状的分布在培养细胞GFP(绿色)是一致的与内在GFP荧光没有疣状(图5b)。所有的培养细胞染色积极坳我(红色)细胞(图5c)。双免疫染色GFP(绿色)和坳我(红色)显示,几乎所有的这些GFP+纤维母细胞表达坳(出现黄色图5d),成纤维细胞被认为是一个主要生产国(24)。这些结果证实,BM-derived纤维母细胞可以直接导致胶原蛋白的沉积在肺纤维化。
对培养的肺成纤维细胞。肺成纤维细胞分离BLM-treated GFP BM嵌合体小鼠分析了荧光显微镜(一个- - - - - -f)。细胞表现出典型的成纤维细胞形态,许多被星状或纺锤状(一个)。平均80%的这些细胞表达绿色荧光蛋白(绿色荧光一个在×100;插图在×400)。细胞染色与anti-GFP(绿色)和anti-Col我(红色)抗体b- - - - - -d。相同的微观领域被拍到与绿色(b)或红色(c同时)过滤器,或两者兼而有之(d)。Colocalization GFP和坳我表达了黄色d。插图在d展示了细胞沾anti-GFP抗体(绿色)和isotype-matched控制免疫球蛋白坳(红色)。细胞也沾anti-GFP(绿色)和anti-α-SMA(红色)抗体(e)。Colocalization GFP和α-SMA应该出现黄色,但两个α-SMA+细胞在这个领域没有出现表达绿色荧光蛋白(e)。最后,细胞也沾anti-GFP(绿色)和anti-TERT(红色)抗体。Colocalization GFP和叔出现黄色,和大多数的细胞在这一领域叔和GFP表达(f)。放大×200b- - - - - -f。一个代表性的例子显示至少有三个独立的实验。
确定这些BM-derived myofibroblasts细胞,这些细胞也应用α-SMA,分化myofibroblasts的标志(25)。一些细胞显示myofibroblasts的形态特征和彩色积极为α-SMA(红色)(图5e)。然而,通过双重免疫荧光,α-SMA被认为主要的阳性染色细胞为阴性或为GFP(图只显示背景染色5e)。这些研究结果表明,大部分,如果不是全部,myofibroblasts并非源自BM-derived纤维母细胞的肺纤维化模型。
另一个成纤维细胞表型,最近描述出现在肺纤维化是叔的表达(17),端粒酶的重要组成部分。以确定TERT-expressing成纤维细胞可能来源于GFP+细胞外,我们还进行了对叔疣状。双免疫染色GFP和叔显示,大多数的这些细胞GFP+(图5f)。这证实了计数细胞表达抗原,揭示叔的百分比+细胞GFP之间+细胞和细胞总数分别为66%和64%,分别。因此,很大一部分TERT-expressing纤维母细胞表型BLM-induced肺纤维化是来自BM前体细胞。
TGF-β对BM-derived肺成纤维细胞的影响。Double-immunofluorescence分析α-SMA和GFP表达表明肺myofibroblasts在这个模型中没有来自BM祖细胞(图5e)。这将表明,这些细胞可以抵抗TGF-β,著名的和强大的myofibroblastα-SMA表达的诱导成纤维细胞和分化(24- - - - - -26)。评估这种可能性,培养从BLM-treated GFP嵌合体小鼠肺成纤维细胞有或没有TGF-β孵化,然后分析α-SMA表达式通过流式细胞术。结果表明,只有不到1%的GFP (0.6%±0.1%)+细胞(即。,BM-derived) expressed α-SMA, and this result did not change when the cells were treated with TGF-β (0.40% ± 0.1%). In contrast, similar treatment of naive lung fibroblasts from B6 mice under identical conditions showed almost a doubling in the proportion of cells expressing α-SMA (from 11.4% ± 2.3% to 19.1% ± 3.1%). To rule out the possibility that TGF-β could downregulate the expression of GFP, cultured lung fibroblasts from GFP Tg mice were incubated with or without TGF-β in vitro, and then GFP expression was evaluated by RT-PCR. The results showed that TGF-β treatment had no significant effect on GFP expression (data not shown), thus ruling out this possibility as the reason for failure to detect α-SMA expression in the BM-derived fibroblasts. These results confirmed that the bulk, if not all, of the lung myofibroblasts induced in this model did not appear to arise from BM-derived progenitor cells.
趋化因子和趋化因子受体的表达。已知BM-derived炎症细胞迁移到BLM-induced肺纤维化病变,造成这一结果的部分原因是他们回应chemotactically趋化因子的分泌。也有证据表明外围血液成纤维细胞可以表达一些趋化因子受体(纤维细胞),尤其是趋化因子受体CXCR4和CCR7和chemotactically应对各自的配体(11)。是否也有类似的机制在招聘BM-derived前体的肺成纤维细胞BLM-induced受伤,我们首先检查表达式SDF-1α和SLC的肺,趋化因子受体CXCR4和CCR7的配体,分别。结果表明,SDF-1αmRNA在未经处理的小鼠的肺可检测(图6a)。在BLM或生理盐水治疗后第七天,BLM-treated肺SDF-1αmRNA水平显著增加的价格相比saline-treated肺(4倍和1.6倍增加高于未经处理的控制肺,分别)。这在BLM-treated SDF-1α表达升高小鼠肺维持治疗后14天以上(3.5倍和1.9倍增加治疗肺saline-treated老鼠)。而肺SLC mRNA在BLM-treated也显著增加小鼠肺相对于生理盐水对照组,动力学是不同的,增加不明显,直到第14天BLM治疗后(图6b)。在第七天没有明显差异的肺的表达SLC盐水-和BLM-treated老鼠——结果与未经处理的小鼠。因此这两种趋化因子可能参与招聘BM-derived前体BLM-injured肺成纤维细胞。
趋化因子和趋化因子受体的表达,成纤维细胞迁移。肺RNA从saline-treated或BLM-treated老鼠获得在指定的时间点(生理盐水或BLM治疗几天后,天0指示预处理值)和分析SDF-1α(一个)和SLC (b使用实时PCR) mRNA。数据显示在每个时间点代表意味着从六BLM-treated或±SD saline-treated小鼠,分别代表两个独立的实验。(cCCR7 mRNA)趋化因子受体CXCR4的rt - pcr分析结果和培养BLF或SLF。在左面板c显示了一个代表electropherogram表示产品使用RNA样本:脾(巷1),BLF(通道2 - 4)和SLF(道5 - 7)。正确的面板c总结了定量结果正常化后GAPDH信号。数据显示代表意味着±SD (n= 3),代表三个独立的实验。BLF迁徙活动向表示趋化因子分析(d)。增加上(细胞被加载)或下室表示。肺成纤维细胞,对SLC和SDF-1α的趋化作用和SDF-1α也是弱chemokinetic。数据显示表示意味着±SD。实验重复一次类似的结果。星号表示统计上的显著差异(P< 0.05)表示,两组之间通过连接线路上面各自的酒吧。
分析CXCR4和CCR7表达进行下确认由肺成纤维细胞的趋化因子受体表达,允许他们chemotactically做出反应。结果(图6c和d)表明,趋化因子受体CXCR4 mRNA水平从BLM-treated B6小鼠肺成纤维细胞(BLF)超过了两倍,从saline-treated B6小鼠(SLF)。CCR7 mRNA在BLF也升高,增加SLF超过6倍以上。确认这些表达受体功能,体外趋化作用进行化验。如图6d, BLF可以迁移到SDF-1α(CXCR4配体)和SLC (CCR7配体)。SLC的剂量与先前显示活动对纤维细胞(11)。棋盘分析证实,成纤维细胞的迁移是由于这些趋化因子趋化现象的反应,尽管SDF-1α有轻微chemokinetic活动。因此BLM-injured显示肺组织趋化因子表达增加,肺成纤维细胞表达趋化现象的活动他们同源受体。
在肺纤维化肺成纤维细胞的潜在肺外起源优点调查,因为最近的证据表明多能前体细胞在BM可以重新填充远端器官(1- - - - - -6)和循环纤维细胞可以迁移到愈合网站作为来源成纤维细胞和myofibroblasts通常参与修复过程(11)。在这项研究中,这一可能性BM-derived前体细胞可以作为来源成纤维细胞在BLM-induced肺纤维化。虽然没有完全令人满意的人类IPF的动物模型,BLM-induced模型特征相对较好,也表现出某些特性在人类疾病中找到。然而,这个模型有明显的局限性的自限性的性质,其发展的速度,密切与炎症伴随肺损伤(15,17)。然而模型仍然有用的识别机制和致病的可能与人类疾病相关的线索。找到这样的线索可能是有用的在为人类提供基础研究,以证实他们的相关性。
区分清楚BM-derived细胞的潜在作用与居民建立纤维化肺内的成纤维细胞,我们设计了一个GFP Tg BMT模型小鼠的供体细胞来源(12)。因此所有BM-derived细胞GFP BM嵌合体小鼠可以很容易地区别于居民肺细胞由于GFP表达绿色荧光。这种方法的一个问题是使用致命剂量的辐射之前消灭接受者的BM注入捐赠者BM。虽然辐射可能会导致肺损伤和肺炎(26- - - - - -28),我们已经仔细效价降低辐射剂量,BMT推荐(13,14),把总剂量分成两个剂量隔3小时。这减少了总剂量,其分裂成两个相等的剂量,没有造成呼吸窘迫,可检测肺损伤,或纤维化,老鼠表现出正常的身体体重增加和活动。与先前的研究一致(29日,30.),成功完成,耐用BM调整是通过使用这个协议没有证据表明肺部病理学BMT后56天。
在这些嵌合体小鼠正常肺组织的荧光显微分析发现,只有少数细胞,GFP+,对白细胞血管内定位相一致,以及那些与肺泡pneumocytes上皮分布一致。重新BM-derived肺泡上皮细胞的前体细胞之前已经报道过(31日)。相比之下,从BLM-injured嵌合体小鼠表现出肺细胞表达绿色荧光蛋白的数量大大增加,几乎所有的集群地区进行积极的纤维化。这些GFP的很大一部分+细胞可能代表浸润白细胞,如前所述在这个模型(32)。在后期减少炎症(15),荧光显微镜显示相当大数量的GFP+细胞主要分布在细胞方面进行积极的纤维化。这些细胞的血管外的和间质本地化,以及他们的形态,与成纤维细胞是一致的。Flow-cytometric分析确诊的肺组织分解细胞GFP增加四倍以上+BLM-injured与完整的肺细胞,细胞在肺纤维化的GFP的27.5%+我表示坳,成纤维细胞的标记(33)。形成鲜明对比的是,超过5%的肺细胞表达GFP和坳我控制。因此增加胶原蛋白表达在肺纤维化的主要是由于BM-derived前体细胞,因此主张主要对这些细胞的直接作用在纤维化的发病机制。
额外的表型分析这些BM-derived细胞在体外显示主要是典型的纺锤状纤维母细胞形态类似于以前培养的主要鼠肺成纤维细胞(15),让人想起分化外围血液纤维细胞(11,34)。几乎所有的绿色荧光蛋白+细胞纤维化肺表达我坳双重免疫荧光,但没有表达α-SMA myofibroblasts的一个标志,表明后者没有BM的起源。成纤维细胞表达α-SMA和胶原蛋白都是由TGF-β,纤维化的关键中介(35- - - - - -37)。然而,BM-derived成纤维细胞抵抗TGF-β-induced myofibroblast分化。缺乏应对TGF-β的基础尚不清楚在这个时候但并不是由于TGF-β限制GFP的表达方式的能力,这将产生明显的印象,α-SMA表达诱导同时GFP表达被抑制。因此myofibroblasts纤维化肺似乎不是BM的起源,但也许派生本地(即。,intrapulmonary origin) from quiescent fibroblasts normally found in the peribronchial and perivascular adventitia as previously suggested (36)。这将显示一个基本居民肺成纤维细胞表型差异和那些来自BM祖细胞。
这种差异显然没有延长端粒酶表达。诱导成纤维细胞的端粒酶表达另一个表型特性描述细胞BLM-induced肺纤维化(17)。叔是关键组件的端粒酶复杂的端粒酶活性与感应不正常的成年体细胞表达这种活动(17,38),比如在其诱导肺损伤和纤维化(17,39)。精确的端粒酶在肝纤维化中的作用还不清楚,但可能与增强纤维母细胞增殖潜能和生存的能力(40)。本研究的发现表明,与α-SMA表达式,很大比例的叔+细胞GFP+因此来自BM前体细胞。
BM-derived细胞进入肺的涌入在肺纤维化要求一些诱导信号能够招募这些肺外的细胞,可能的白细胞招募在肺部炎症。最近BM-derived前体细胞和直接相关,外围血液显示纤维细胞表达趋化因子受体CCR7和趋化因子受体CXCR4等,并可能对SLC迁移,CCR7配体(11)。在这项研究中我们证明了SDF-1α的水平(CXCR4配体)和SLC mrna BLM治疗后明显高于saline-treated控制老鼠,这表明他们可以作为招聘的信号BM-derived前体细胞的肺部受伤。这种可能性是支持的数据显示,从BLM-treated小鼠肺成纤维细胞表达的同源受体这些趋化因子,在更高层次上比从saline-treated控制老鼠的细胞。确定这些受体表达功能,我们由体外趋化性分析显示,这些细胞可以chemotactically SLC和SDF-1α做出回应。这些研究结果综合起来,将符合的可能性增加这些趋化因子的表达BLM-induced肺纤维化可导致迁徙招聘BM-derived前体细胞进入肺部,导致积极的纤维化病变的形成。先前的研究的基础上(41- - - - - -43),这些趋化因子的可能的细胞来源可能是居民肺成纤维细胞或内皮和上皮细胞。
总之,我们已经表明,大多数collagen-expressing以及TERT-expressing肺成纤维细胞在这个模型的肺纤维化来自BM前体细胞,也许趋化因子的影响下,如SDF-1α和反思。这一发现首次直接证明了BM-derived成纤维细胞在肺纤维化的发病机制中的重要性。因此,修改当前的思维和方法肺纤维化的治疗和管理,也许在其他器官纤维化,是必要的,以适应这一发现肺外/ BM来源成纤维细胞的纤维化后适当考虑已知的限制BLM-induced纤维化作为人类的肺纤维化模型。
我们承认丽莎·里格斯的优秀的技术援助。这项工作被授予HL28737支持部分,HL31963, HL52285来自美国国立卫生研究院。
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利益冲突:作者宣称没有利益冲突的存在。
使用非标准缩写:骨髓(BM);博来霉素(BLM);特发性肺纤维化(IPF);I型胶原蛋白(Col);端粒酶逆转录酶(叔);α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA);plasma-derived血清(PDS);基质细胞衍生factor-1α(SDF-1α);二级淋巴趋化因子(SLC);胰岛素,转铁蛋白和硒(它的); phycoerythrin (PE); streptavidin-Cy-Chrome (SAv-Cy-Chrome); streptavidin-CY3 (SAv-Cy3); Tyramide Signal Amplification (TSA); C57BL/6 mice (B6 mice); transgenic (Tg); bone marrow transplantation (BMT); complete medium (CM); lung fibroblasts from BLM-treated B6 mice (BLF); lung fibroblasts from saline-treated B6 mice (SLF).