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文章免费获取|10.1172 / JCI16112
1医学系的生理,心血管研究所,加州大学,旧金山,旧金山,加州,美国2Laboratorio di遗传Molecolare,史詹妮娜Gaslini,意大利热那亚
通信地址:艾伦·s . Verkman 1246健康科学东塔,心血管研究所,加州大学,旧金山,旧金山,加利福尼亚94143 - 0521,美国。电话:(415)476 - 8530;传真:(415)665 - 3847;电子邮件:verkman@itsa.ucsf.edu。
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2002年12月1日出版更多信息
分泌性腹泻是发展中国家的婴儿死亡的主要原因,成年人发病率的主要原因。囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)所需的蛋白质是流体在肠道和呼吸道分泌物,当缺陷,导致致命的遗传病囊性纤维化。我们筛选了50000多元化合物化学抑制营地/ flavone-stimulated Cl- - - - - -运输在上皮细胞表达雌性生殖道。确定了六个雌性生殖道2-thioxo-4-thiazolidinone化学类的抑制剂。最有效的化合物筛选发现的结构类似物,雌性生殖道异烟肼-172年,可逆地抑制雌性生殖道短路电流在不到2分钟voltage-independent的方式K我约300海里。雌性生殖道异烟肼-172年是无毒的高浓度的细胞培养和小鼠模型。在浓度完全抑制雌性生殖道,雌性生殖道异烟肼-172并没有阻止海拔移动营地或抑制non-CFTR Cl- - - - - -渠道,多药耐药性蛋白1 (MDR-1) ATP-sensitive K+渠道,或者其他一系列的转运蛋白。一个雌性生殖道的腹腔内注射异烟肼-172(250μg /公斤)在小鼠减少90%以上霍乱toxin-induced流体在小肠分泌6小时。Thiazolidinone雌性生殖道抑制剂可能是有用的在发展大型动物实验的囊性纤维化和减少肠道流体损失霍乱和其他分泌类腹泻。
囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道蛋白质cAMP-activated Cl- - - - - -通道表示在哺乳动物气道上皮细胞,肠,胰腺和睾丸。世袭的致命疾病囊性纤维化(CF)是由CFTR突变检测。观察人类CF患者和CF小鼠模型显示功能雌性生殖道肠道和胰腺流体运输的重要性,以及在男性生育能力(1,2)。然而,有缺陷的机制仍不清楚雌性生殖道产生呼吸道疾病,这是发病率和死亡率的主要原因在CF (3)。CF的主要困难在理解呼吸道疾病包括CF小鼠模型的不足,体现了很少或没有呼吸道疾病,CF,缺乏大型动物实验和有限的可用性的人类CF航空公司没有受到慢性感染和炎症。高亲和性,CFTR-selective抑制剂没有可用来研究气道疾病机制CF或创建的CF表型的大型动物实验。
除了药理的CF表型,高亲和性雌性生殖道分泌抑制剂有潜在的临床应用治疗类腹泻和囊性肾脏疾病,抑制男性生育能力。化合物diphenylamine-2-carboxylate (DPC)和5-nitro-2 (3-phenylpropyl-amino)苯甲酸(NPPB)在高浓度抑制雌性生殖道,但非特异性的抑制作用(4- - - - - -6)。最好的雌性生殖道抑制剂用于电生理和其他细胞的研究中,格列本脲,通常使用的浓度大于100μM (7,8),它还能抑制其他Cl- - - - - -转运蛋白以及K+通道(9- - - - - -11)。我们推测,小分子的高亲和性雌性生殖道抑制剂可能存在,基于强大的可用性为其他离子转运蛋白抑制剂,以及证明雌性生殖道Cl -电导小序列的敏感性变化诱变实验。
本研究的目的是识别和描述雌性生殖道的抑制剂氯离子通道的功能。因为有限的雌性生殖道的信息结构和铅化合物可用抑制剂的不足,我们筛选了一批不同druglike化合物利用细胞荧光分析发达国家在我们的实验室(12- - - - - -15)。CFTR大规模筛选试验旨在识别检测与雌性生殖道直接交互的抑制剂。CFTR几个小分子检测抑制剂被确定,属于一种新型化学类。结构类似物的最佳抑制剂的筛选是电生理,机械,毒理学分析和显示效果在小鼠模型的霍乱toxin-induced分泌性腹泻。
细胞系、老鼠和化合物。费舍尔大鼠甲状腺(FRT)细胞coexpressing人类野生雌性生殖道和卤化物指示器YFP-H148Q生成如前所述(14)。细胞被镀在96 -斯达克微型板块(Corning-Costar Corp .)、康宁、纽约、美国)20000细胞的密度在黑人与5% FCS的F12培养基补充修改,2毫米l谷氨酰胺、100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升。化验是在电镀后48小时,在这段时间里,细胞被只是支流(∼40000细胞/好)。最初的筛选是通过使用不同的50000 druglike化合物ChemBridge研究实验室(美国加州圣地亚哥),获得10毫米股票的解决方案在DMSO和稀释在96孔酶标1毫米。结构活性分析做了类似物从ChemBridge购买研究实验室和ChemDiv(美国加州圣地亚哥)。野生型和CF(ΔF508)突变纯合子小鼠饲养的CF动物核心设施在加州大学旧金山分校。动物协议是加州大学旧金山分校委员会批准的动物研究。
2-thioxo-4-thiazolidinone类似物的合成。雌性生殖道的合成异烟肼-172年(见图1trifluoromethyl c)和类似物与不同位置的取代基,羧基是通过诺文葛耳2-thioxo-3凝结- [一个-trifluoromethylphenyl] 4-thiazolidinone (一个= 2、3或4)b-carboxybenzaldehyde (b= 2、3或4)哌啶的存在。沉淀过滤后,用乙醇洗净,晒干,再结晶两到三倍的乙醇给亮黄色晶体(70 - 85%的收益率)。结构经1 h - nmr。纯度大于99%根据薄层色谱和高效液相色谱法。
鉴定雌性生殖道抑制剂的高通量筛选。(一个)筛查方法的示意图。雌性生殖道中最大限度地刺激了多个受体激动剂稳定转染人类雌性生殖道上皮细胞coexpressing和一个黄色荧光蛋白(YFP)与荧光敏感Cl- - - - - -/我- - - - - -。添加测试化合物后,我- - - - - -添加一个引起我涌入- - - - - -包含解决方案。(b从单个井)代表原始荧光数据显示控制(没有催化剂,没有测试化合物)和测试井。(c):CFTR 2-thioxo-4-thiazolidinone检测抑制剂的化学结构。底部:结构类似物有最大的雌性生殖道抑制活动。相对的效能是0.2(雌性生殖道异烟肼-020),0.3(雌性生殖道异烟肼-029),1.0(雌性生殖道异烟肼-172),0.2(雌性生殖道异烟肼-185),0.1(雌性生殖道异烟肼-214)和0.1(雌性生殖道异烟肼-236)。
筛选过程。化验是使用一个自定义筛选系统(贝克曼库尔特公司,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)组成的3米机械手臂,有限公司2孵化器、档板、合成工作站,条形码阅读器,解封装车站,和两个FLUOstar荧光platereaders (BMG Labtechnologies,达勒姆,北卡罗莱纳,美国),每个配备两个注射器泵和HQ500/20X(500±10海里)激发和HQ535/30M(535±15海里)排放过滤器(美国佛蒙特州浓度,伯瑞特波罗)(ref的细节。15)。机器人系统是综合使用萨米3.3版本软件(贝克曼库尔特公司)两个platereaders修改。定制软件是微软用VBA (Visual Basic应用程序)来计算base-line-subtracted规范化荧光斜坡(给卤化物流入利率)从存储数据文件。
我们建立的试验加载孵化器(37°C,湿度90%,5%股份有限公司2包含FRT)与40 - 96 -孔板的细胞,和加载旋转木马96 -孔板包含测试化合物和一次性塑料吸管技巧。启动试验,每一个96孔板在PBS洗了三次(300μl /洗),留下50μl PBS。10毫升CFTR-activating鸡尾酒(5μM forskolin, 100μM IBMX (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),25μM芹黄素在PBS)补充说,5分钟后一个测试化合物1毫米DMSO溶液(0.5μl)被添加到每个好给10μM最终浓度。10分钟后,96 -孔板被转移到一个platereader荧光测定。我们化验每个单独连续CFTR-mediated I -运输记录荧光(每点200 ms) 2秒(基线),然后在12秒后快速(< 0.5秒)的165年μl isosmolar PBS的137毫米Cl -取代了我。
化验的细胞内(营)、磷酸酶和毒性。(营)和磷酸酶化验报告之前完成(14)。细胞毒性是由dihydrorhodamine化验的方法在细胞培养24小时后0 - 1000μM抑制剂。动物毒性评估测量血清化学和血液学分校临床实验室)在小鼠5天每日腹腔内注射后0 - 1000μg抑制剂/公斤。
MDR-1活动。我们评估多药耐药性蛋白1 (MDR-1)活动通过测量3 h-vincristine积累在一个永生的人类气管细胞系,9 hteo - / Dx, MDR-1内源性表达的调节通过选择增加阿霉素浓度(16)。细胞被播种在24-well微型板块(200000细胞/)。48小时后,细胞被清洗解决方案包含(130毫米)氯化钠,氯化钾,1 KH2阿宝42 CaCl22 MgCl210 Na-HEPES (pH值7.3),和10个葡萄糖,孵化为1小时37°C和200μl相同的解决方案包含3 h-vincristine(0.7μM;1μCi /毫升)。细胞被洗了三次冰冷的解决方案和细胞溶解在0.25 M氢氧化钠。长春新碱含量是由闪烁计数。
短路电流。Snapwell插入包含CFTR-expressing FRT细胞或人类支气管上皮细胞被安装在一个我们室系统。FRT细胞,hemichambers满心5毫升的氯化钠75毫米和75毫米葡萄糖酸钠(顶端)和150毫米氯化钠(基底)(pH值7.3)和基底外侧膜是permeabilized 250μg /毫升两性霉素B (14,15)。支气管上皮细胞和T84细胞,hemichambers包含克雷布斯碳酸氢盐溶液(15)。Hemichambers不断沸腾了空气(FRT细胞)或5%股份有限公司2在空气中(支气管和T84细胞)和维持在37°C。短路电流持续记录使用" - 1000电压钳(世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)与Ag / AgCl电极和1 M氯化钾琼脂桥梁。
膜片箝分析氯离子通道的活动。膜在全细胞电流测量配置。的录音Cl -频道,细胞外(浴)解决方案包含(150毫米)氯化钠,1 CaCl21 MgCl2葡萄糖、10、10甘露醇和10 te (pH值7.4),和细胞内(吸管)解决方案包含120年中海,1 MgCl2,0.5 EGTA 10 TEA-Cl 1 Mg-ATP, 10玫瑰(pH值7.3)。雌性生殖道被forskolin激活(5μM)在细胞外的解决方案。膜电导的时间进程监控对交流电压脉冲的-100 + 80 mV。在定义的时间产生电流电压关系的协议被打断(从-100年到+ 100 mV在偏置电压脉冲增量)。Volume-sensitive Cl -通道被激活低渗的溶液(细胞外氯化钠下降到120毫米氯化钠;250 mosM /公斤)。Calcium-sensitive Cl -通道被激活100年人类支气管上皮细胞除了μM UTP的细胞外的解决方案。
膜片箝ATP-sensitive K +通道的分析。膜电位记录在胰腺β细胞行INS-1,细胞外(浴)的解决方案包含(毫米):130氯化钠,氯化钾,1 KH2阿宝42 CaCl22 MgCl210 Na-HEPES (pH值7.3)和10个葡萄糖。包含的吸管(毫米):140氯化钾,1 CaCl22毫米MgCl2,10 EGTA, 0.5 Mg-ATP, 10 K-HEPES (pH值7.3)。全细胞实现配置后,放大器是转向current-clamp模式。
肠道液体分泌和短路电流。在第一个三个化验,积液回肠循环测量(17,18)。老鼠(年龄8 - 10周,体重25 - 35 g)在CD1遗传背景(或ΔF508纯合子小鼠)是饥饿24小时与腹腔内氯胺酮麻醉(40毫克/公斤)和甲苯噻嗪(8毫克/公斤)。体温维持在手术36-38°C使用加热垫。一个小腹部切口暴露小肠,和关闭回肠循环(长度20 - 30毫米)近端盲肠被孤立的缝合线。循环注入100μl PBS的单独或PBS含有霍乱毒素(1μg)。在一些实验抑制剂(150μg /公斤)是由腹腔内注射。腹部切口和缝合关闭,和老鼠被允许从麻醉中恢复过来。在小鼠麻醉6小时,肠道循环的世间,循环长度和重量测定肠系膜切除后和结缔组织。
密封的成年小鼠模型的分泌性腹泻,老鼠强饲法与霍乱毒素(10μg)在0.1毫升的7%碳酸氢钠缓冲(或缓冲独自)使用orogastric喂养针(19,20.)。四个实验组,每组控制(缓冲),cholera-treated,治疗霍乱加抑制剂(250μg /公斤腹腔内2分钟前填喂法),并与抑制剂治疗。6小时后,小鼠安乐死和小肠(从幽门盲囊)形象化和剥夺相关肠系膜和结缔组织。小肠重量,然后打开腔内液体(通过印迹)和纵向删除重了。液体积累从肠道重量的比率计算前腔内液体清除肠道后体重。短路电流的测量,条鼠结肠被孤立,被钝性剥离的肌肉层,安装在我们室(面积0.7 cm2),和沐浴在含氧碳酸氢盐林格氏溶液包含10μM吲哚美辛。短路电流测量后抑制Na +当前阿米洛利(10μM),紧随其后的是刺激,forskolin(20μM)和随后的抑制剂。
主屏幕设计确定化合物抑制雌性生殖道Cl -电导直接CFTR-inhibitor交互。雌性生殖道中prestimulated CFTR-expressing FRT细胞的激活包含forskolin鸡尾酒,IBMX,芹黄素(图1)。雌性生殖道的理由由多个机制激活CFTR(营高程、磷酸二酯酶抑制和直接检测绑定)是确定抑制剂阻止雌性生殖道Cl -运输途径直接而不是阻塞更近一步(s)的激活途径。FRT细胞coexpressed黄色荧光蛋白质Cl - /我传感器提供了一个定量荧光读出的抑制能力(12,13)。在雌性生殖道prestimulation和化合物,细胞受到一个内在指导我-梯度驱动我涌入和生产减少荧光。每个试验包括记录的基线荧光2秒钟,紧随其后的是12秒后荧光的连续记录包含I -快速的解决方案。化合物测试分别在96 - 10μM浓度格式使用一个完全自动化的大规模筛选器(见方法)。
图1b代表曲线从主屏幕显示50000种化合物。作为量化后的斜率减小荧光-而且,49993种化合物的动力学无显著影响I -涌入斜率下降(< 10%)。七个化合物产生一个小的减少负斜率(10 - 52%),其中几乎所有类似的核心结构组成的2-thioxo-4-thiazolidinone杂环取代phenylmethylene和苯基(图半个1c,顶部)。250多核心结构类似物有thiazolidinone随后CFTR识别最有效的检测抑制剂的筛选。图1c(底部)显示最有效的化合物,3 - [(3-trifluoromethyl)苯基]5 - [(4-carboxyphenyl)亚甲基]2-thioxo-4-thiazolidinone(雌性生殖道异烟肼-172),连同五类似物具有较低的抑制效力。抑制要求3-trifluoromethyl替换环1和消极或极性取代基(s)在环2。有趣的是,由五名成员组成的杂环和trifluoromethyl取代基在雌性生殖道异烟肼-172人出现在几个高亲和性雌性生殖道活化剂确认最近的大规模筛选(15)。检查的影响环取代基位置trifluoromethyl和羧基,八个雌性生殖道的类似物异烟肼-172年合成的环上取代基被转移到每一个独特的立场1 (trifluoromethyl)和2(羧基)。而雌性生殖道异烟肼-172(1.0效力),相对抑制效力的3 - ((一个-trifluoromethyl)苯基]5 - [(b-carboxyphenyl)亚甲基]2-thioxo-4-thiazolidinone类似物是0.69 (一个= 2,b= 2),0.70 (一个= 2,b= 3),0.66 (一个= 2,b= 4),0.74 (一个= 3,b= 2),0.90 (一个= 3,b= 3),0.67 (一个= 4,b= 2),0.64 (一个= 4,b= 3),0.56 (一个= 4,b= 4)。作为最强有力的雌性生殖道抑制剂,雌性生殖道异烟肼-172年进一步表征。
图2一个显示了雌性生殖道dose-inhibition数据异烟肼-172年由荧光测定。显著抑制被认为在0.3 - -0.6μM雌性生殖道异烟肼-172年。图2b显示抑制雌性生殖道异烟肼-172年完成大约10分钟(t1/24分钟),后被逆转冲刷t1/2大约5分钟(插图)。图2c显示,雌性生殖道异烟肼-172有效地抑制雌性生殖道由多个类型的受体激动剂激活不激活鸡尾酒中包含用于初步筛选,包括染料木黄酮、CPT-cAMP, 8-cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (CPX) 8-methoxypsoralen (8-MPO),和强有力的benzoflavone雌性生殖道活化剂uccf - 029和- 853 (CFTR benzimidazolone检测活化剂uccf14)。同时,雌性生殖道异烟肼-172年抑制雌性生殖道激活四个最近描述雌性生殖道活化剂(雌性生殖道行为-05、-09、-11、-16;ref。15)结构无关,可能激活雌性生殖道的直接相互作用机理(没有显示)。
描述的雌性生殖道抑制雌性生殖道异烟肼-172年。(一个)雌性生殖道功能化验如图1b表示[雌性生殖道异烟肼-172]。(b显示CFTR-mediated我)时间的抑制- - - - - -运输率在不同时间后添加2 CFTRμM检测异烟肼-172年。插图:抑制逆转显示我的时间- - - - - -运输率在不同时间冲刷后1 CFTRμM检测异烟肼-172年。均值±SE显示三组的实验。(c)抑制雌性生殖道刺激后不同的受体激动剂,包括benzoflavone和benzimidazolone UCCF化合物(14),染料木素,CPT-cAMP 8-methoxypsoralen (8-MPO)和8-cyclopentyl-1 3-dipropylxanthine (CPX)(全部50个μM) (SE;三组实验)。黑条,受体激动剂;白色的酒吧,受体激动剂+ 5μM雌性生殖道异烟肼-172年。
电生理学是为了建立雌性生殖道的抑制能力和特异性异烟肼-172年。图3(左)显示了快速、剂量依赖性抑制短路电流在CFTR-expressing FRT与雌性生殖道细胞异烟肼-172年沐浴顶端细胞表面添加到解决方案。图3(右)显示了平均dose-inhibition雌性生殖道的关系异烟肼-172 (Kd∼∼300海里,希尔系数1)和格列本脲(Kd∼200μM)在相同的条件下测试。类似的抑制效力被发现在本地表达野生型雌性生殖道细胞,包括T84人类支气管上皮细胞的细胞和小学文化,以及在转染FRT细胞表达G551D-CFTRΔF508-CFTR(低温校正后)(没有显示)。为研究支气管细胞,与阿米洛利Na +渠道受阻,以便当前主要CFTR-dependent基线。CPT-cAMP CFTR最大检测激活后,雌性生殖道的应用异烟肼-172年从顶端抑制短路电流(图3b,左)。雌性生殖道异烟肼-172年显然是更弱的基底外侧(图的补充道3b);这可能与减少访问通过多孔过滤器,或者,不太可能,其微分渗透率在顶端与等离子体基底外侧膜或在上皮细胞分隔现象。
电生理分析雌性生殖道的抑制。(一个)左:雌性生殖道异烟肼-172年抑制短路电流(我sc人类雌性生殖道)permeabilized FRT细胞表达。雌性生殖道刺激100μM CPT-cAMP。右:Dose-inhibition雌性生殖道的数据异烟肼-172年(圈)和格列本脲(广场)(SE;n= 3组实验)。(bCFTR)检测异烟肼-172年主要抑制短路电流的文化人类支气管上皮细胞(nonpermeabilized)。抑制剂在顶端添加解决方案(左)或基底外侧,然后洗澡顶端(右)的解决方案。(c左):全细胞膜片箝的CFTR-expressing FRT细胞显示膜电流引起+ 80 mV(圆圈)和-100 mV(圆圈)。雌性生殖道刺激了5μM forskolin添加2 CFTRμM检测紧随其后异烟肼-172年。交替刺激被打断(》)的应用分级膜电位(中间)。右:基底条件下电流电压关系(控制,打开圈),后forskolin刺激(圆圈),和下面的0.2μM雌性生殖道异烟肼-172给大约50%抑制(三角形)开放。我米膜电流;V米膜电位。
全细胞膜片箝膜电流测量的CFTR-expressing FRT细胞(图3c,左)。产生的膜电流刺激5μM forskolin 381±47 pA / pF (n= 4)+ 100 mV(总膜电容21±3 pF)。电流电压关系是线性的,作为一个纯粹的预期雌性生殖道电流(图3c,对吧)。细胞外灌注2μM雌性生殖道异烟肼-172年生产的膜电位迅速减少电流,暗示voltage-independent雌性生殖道抑制。缺乏voltage-dependence通道块CFTR确认使用低浓度的检测异烟肼-172(0.2μM)获得约50%抑制(图3c,对吧)。
雌性生殖道的特异性异烟肼-172年抑制雌性生殖道进行了研究。两个non-CFTR Cl -通道进行了研究。雌性生殖道异烟肼-172年5μM没有抑制钙离子激活的Cl -分泌由添加UTP(100μM)顶端沐浴在极化人类支气管上皮细胞(图的解决方案4左)。最大UTP-dependent短路电流分别为9.9±0.5μA /厘米2和10.0±0.2μA / cm2在雌性生殖道的缺失和存在异烟肼-172年,分别(SE;n= 4),雌性生殖道异烟肼-172年5μM也没有阻止volume-activated Cl -电流引起FRT细胞通过细胞外灌注250 mosM /公斤低渗的解决方案(图4右)。
雌性生殖道的特异性抑制雌性生殖道异烟肼-172年。(一个替代Cl)- - - - - -频道。左:UTP(100μM)刺激2 +端依赖Cl- - - - - -分泌量在短路电流测量气道上皮细胞没有出现5μM雌性生殖道异烟肼-172年。右:Volume-activated Cl- - - - - -当前H(低渗的250 mosM /公斤2O)以全细胞膜片钳实验FRT细胞。电流记录没有,存在5 CFTRμM检测异烟肼-172年。(b)MDR-1活动。39 hteo H-vincristine积累——/ Dx细胞调节MDR-1表达式。测定了细胞内长春新碱和维拉帕米(100μM)或雌性生殖道异烟肼-172(5μM) (SE;n= 3)。c)ATP-sensitive K+频道。左:代表膜电位记录从胰腺β细胞灌注(INS-1)与雌性生殖道细胞外地异烟肼-172年,氯甲苯噻嗪(100μM),和格列本脲(glib;10μM)。右:平均膜电位的变化(ΔmV)表示动作造成的(SE;n= 4)。PD,电位差。
雌性生殖道的活动相同器官,磷酸腺苷盒式运输车MDR-1,测量9 hteo - / Dx细胞,MDR-1过表达(16)。长春新碱积累,这是逆相关活性药物MDR-1挤压,强烈增加MDR-1抑制剂维拉帕米(100μM)(图4b)。雌性生殖道异烟肼-172(5μM)并不影响长春新碱积累,因此没有抑制MDR-1。雌性生殖道的另一个同族体是磺脲受体(SUR),负责监管的活动ATP-sensitive K +通道(钾离子通道;ref。21)。SUR1胰腺β细胞中表达,它控制膜电位和胰岛素释放。磺脲和格列本脲引起胰岛素释放(低血糖反应)通过阻断钾离子通道和膜去极化。雌性生殖道是否异烟肼-172块钾离子通道,膜电位在大鼠胰腺β细胞,INS-1,测量(图4c)。与格列本脲,导致大型膜去极化,雌性生殖道异烟肼-172(2和5μM)没有去偏光膜电位。雌性生殖道异烟肼-172年5μM引起了一场小远低于造成的超极化钾离子通道激活剂氯甲苯噻嗪(100μM)。额外的研究(图中未显示)表明雌性生殖道异烟肼-172 5μM没有阻止水通道(AQP1),一个尿素运输车(UT-B),一个Na + / H +换热器(NHE3)和Cl - / HCO3换热器(AE1)。
进一步分析表明,5 CFTRμM检测异烟肼-172年并不影响细胞营地生产或磷酸酶活动。FRT细胞、基底营内容是225±22 fmol /嗯,30分钟后刺激增加了20μM forskolin 1290±190 fmol /(没有抑制剂)和1140±50 CFTR(+检测异烟肼-172)(n= 3)。根据使用dihydrorhodamine化验,雌性生殖道异烟肼-172年是无毒FRT细胞浓度高达100μM 24小时后。在小鼠,腹腔内注射雌性生殖道1000μg /公斤异烟肼-172每天7天没有造成明显的毒性。食物和水摄入没有减少,血清电解质浓度、葡萄糖、肝功能指标,血清肌酐,淀粉酶,比容没有改变。此外,一个非常大的系统性CFTR剂量的检测异烟肼-172(10毫克/公斤)没有造成明显的毒性。
雌性生殖道的功效异烟肼-172年霍乱检测体内使用两个化验toxin-induced肠道分泌液体,在孤立的肠和短路分析。在第一个化验,一系列的封闭循环体内小肠被创建,和交替循环的流明注射生理盐水的小卷或盐水含有霍乱毒素。6小时后腔的流体积累决心。视觉上看,标志着霍乱toxin-treated循环流体积累和扩张,而相邻的控制(生理盐水)循环保持空(图5雌性生殖道的),一个政府异烟肼前-172(250μg /公斤腹腔内)霍乱毒素注入有效防止积液toxin-treated肠循环。一系列的实验数据图进行了总结5b。雌性生殖道异烟肼-172年显著降低液体分泌,在盐水控制回路,而一个不活跃的雌性生殖道异烟肼-172年模拟没有抑制液分泌。建议从先前的数据(22),霍乱toxin-treated肠循环从纯合子ΔF508-CFTR老鼠也仍然是空的,表示在肠道液体分泌雌性生殖道的参与。第二测定肠道液体分泌物是由口服霍乱毒素(10μg),和雌性生殖道异烟肼-172年是管理系统。6小时后标记流体积累,以整个小肠重量。雌性生殖道异烟肼-172年政府明显减少肠道液体积累,如视觉和量化肠道重量的比率腔的流体之前和之后删除(图5c)。
抑制肠道液体分泌。(一个)的照片孤立鼠标回肠循环腔内注射后6小时1μg霍乱毒素没有(上)和(中)腹腔内注射雌性生殖道异烟肼-172(250μg /公斤)。盐水控制(没有霍乱毒素)显示比较(底部)。(b)回肠循环体重6小时。均值±SE (n= 6 - 8老鼠)和14 - 16循环的研究。不活跃的模拟,4-carboxyphenyl取代基在雌性生殖道异烟肼-172年取代3-methoxy-4-methoxyvinylphenyl (SE;六到八每组小鼠;*P< 0.001,方差分析)。(c)整个小肠的重量比之前和之后在6小时后口服填喂法去除腔的流体(SE;四只老鼠每组;*P< 0.001)。(dCFTR)检测异烟肼-172年抑制短路电流经过forskolin阿米洛利加法和刺激(20μM)在隔离大鼠结肠粘膜。雌性生殖道异烟肼-172年是添加到浆膜粘膜表面表示。一次实验中典型的四所示。
图5d显示雌性生殖道异烟肼-172年抑制短路电流在完整的大鼠结肠粘膜。后抑制Na +当前阿米洛利,forskolin产生短路电流迅速增加。雌性生殖道异烟肼-172解决方案添加到粘膜抑制短路电流比雌性生殖道更大的功效异烟肼-172添加到浆膜的解决方案;这可能是相关的访问通过剩余结肠上皮细胞受损粘膜下组织。添加5 CFTRμM检测异烟肼-172年到粘膜独自解决方案减少了超过80%的短路电流(没有显示)。这些结果提供电生理学证据雌性生殖道Cl -通道抑制雌性生殖道异烟肼-172年的肠。
本研究的目的是为应用程序识别的高亲和性雌性生殖道抑制剂的研究CF疾病机制和分泌类腹泻的治疗。我们筛选了一批小,使用试验药物类化合物设计识别与雌性生殖道直接交互的雌性生殖道抑制剂。因为多个雌性生殖道活化剂,工作在不同的激活途径包括,我们认为,任何抑制化合物应该达到或接近雌性生殖道交互Cl -运输途径。50000多元化合物的主要筛选确定一组小的假定的2-thioxo-4-thiazolidinone化合物类的抑制剂。这些化合物结构无关的已知雌性生殖道活化剂和雌性生殖道抑制剂diphenylamine-2-carboxylate (DPC) 5-nitro-2 (3-phenylpropyl-amino)苯甲酸(NPPB)和格列本脲。最有效的雌性生殖道抑制剂筛选确定的结构类似物有一个图书馆K我约300海里Cl -电流的抑制人工气道细胞。抑制是快速、可逆,voltage-independent。在浓度在雌性生殖道Cl -电导是几乎完全封锁,抑制剂没有抑制其他Cl -渠道,MDR-1, ATP-sensitive K +通道,或其他转运蛋白。在老鼠抑制剂是无毒的,系统管理剂量抑制霍乱toxin-induced 100倍液分泌是耐受性良好。
雌性生殖道的新类抑制剂发现这里发展可能有用的药物阻止肠道液体分泌在霍乱和其他分泌类腹泻,如艾滋病腹泻和旅行者的(大肠杆菌)腹泻。分泌性腹泻是发展中国家的婴儿死亡的最大原因,每年约有500万人死亡(23)。一些研究,包括那些在CF老鼠,表明雌性生殖道的最后共同通路肠道Cl -(因此流体)分泌,以应对各种受体激动剂(22,24,25)。这里使用肠道液体分泌的小鼠模型表明雌性生殖道抑制剂的抑制系统政府无毒剂量有效地阻止了霍乱毒素引起的肠道液体分泌。抑制剂测试需要在较大的动物模型,使用生活粪便产出分析霍乱弧菌(26)。
的药理创建CF表型在人类组织和动物模型可能促进的机制缺陷的说明雌性生殖道引起肺部疾病和临床发病率在CF。有越来越多的证据表明,有缺陷的液体和大分子由气道黏膜下腺体分泌导致黏膜纤毛的功能受损和细菌在CF间隙;然而,人类呼吸道腺体功能研究一直局限于严重病变的航空公司获得了肺移植的时候(27)。急性雌性生殖道抑制应该允许雌性生殖道的作用测定水、盐和高分子通过黏膜下腺体分泌。有相当大的兴趣,但到现在为止的进展CF的识别或创建的大型动物实验。高亲和性雌性生殖道抑制剂可能允许药理创建一个CF动物模型,模拟人类CF表型。CF的大型动物模型将是很有价值的病理生理学的阐明在CF呼吸道疾病的发生和发展,并且在评估CF疗法的疗效。
这项工作是支持的药物发现的囊性纤维化基金会的资助(CFF)和赠款hl - 60288 hl - 59198 eb - 00415,是- 13574,从美国国立卫生研究院和dk - 35124 (A.S. Verkman)。L.J.V. Galietta支持CFF和Telethon-Italy (GP0296Y01)。jr Thiagarajah CFF奖学金支持。
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利益冲突:作者宣称没有利益冲突的存在。
使用非标准缩写:囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道);囊性纤维化(CF);费舍尔大鼠甲状腺(FRT);多药耐药性蛋白1 (MDR-1)。