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2002年3月1日发布 -gydF4y2Ba更多信息gydF4y2Ba
囊性纤维化的特征是炎症细胞早期持续流入气道并释放蛋白酶。炎症的解决通常与通过细胞识别受体(如磷脂酰丝氨酸受体、CD36和αv整合素)将死亡的凋亡炎症细胞有序清除有关。因此,在诸如囊性纤维化气道的持续性炎症反应中,凋亡炎性细胞的清除可能会受到损害。囊性纤维化和非囊性纤维化支气管扩张患者的痰检显示大量凋亡细胞,超过慢性支气管炎患者。在体外,囊性纤维化和支气管扩张气道液以中性粒细胞弹性酶依赖的方式直接抑制肺泡巨噬细胞对凋亡细胞的清除,提示弹性酶可能损害体内凋亡细胞的清除。流式细胞术显示中性粒细胞弹性蛋白酶可切割磷脂酰丝氨酸受体,但不切割CD36或CD32 (FcγRII)。中性粒细胞弹性酶切割磷脂酰丝氨酸受体特异性地破坏了凋亡细胞的吞噬,暗示了在体内延迟凋亡细胞清除的潜在机制。因此,囊性纤维化和支气管扩张中凋亡细胞的气道清除缺陷可能是由于弹性酶介导的吞噬细胞磷脂酰丝氨酸受体的切割,并可能导致持续的气道炎症。gydF4y2Ba
通过除去染死的凋亡炎症细胞来通常完成急性炎症的分辨率(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在囊性纤维化(CF)肺中,炎症持续存在,坏死细胞在气道内积聚(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba),表明可能损害正常的凋亡细胞去除机制。鉴别凋亡细胞以多种方式促进炎症的分辨率。凋亡细胞的吞噬作用导致其有效的去除,然后在血浆膜破坏之前的血浆膜和潜在有害的细胞内含量的溢出。去除凋亡细胞也积极抑制通过产生抗炎信号,例如TGF-β(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这些抗炎信号抑制炎症介质生产,随后加强回应的分辨率(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
凋亡细胞通过表达表面配体,特别是磷脂酰丝氨酸(PS) (gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。去除过程中涉及多种受体,特别是最近克隆的PS特异性受体(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。其他识别分子包括CD36 (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)、其他清道夫受体(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)、CD14 (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)、各种整合素(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),以及溶解的桥接分子如血压素(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),收集素(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)或C1q (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。然而,PS表达的要求(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)和PS受体的主导作用(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)提示这种相互作用在凋亡细胞的识别和摄取中起主要作用。PS受体在凋亡细胞识别的抗炎作用和TGF-β产生的启动中也发挥了关键作用(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和体内(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
从正在发育的组织或炎症部位清除死亡的凋亡细胞通常是一个高效的过程。例如,在胚胎发育过程中从肢体中移除凋亡细胞,在变态过程中蝌蚪尾巴收缩,以及在正常或类固醇诱导的胸腺退化过程中丢失凋亡的胸腺细胞(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。尽管有显著的凋亡正在进行,但由于凋亡细胞的快速清除,在任何时间点都能在这些组织中检测到非常少的凋亡细胞(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在人类呼吸道中,在分离炎症期间的细胞去除与高效。在急性呼吸窘迫综合征中性粒细胞(PMN)迁移到肺部大量达到7.4×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba/毫升(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba);但是,其中只有1.6%是凋亡(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。同样,在社区获得性肺炎中,pmn达到1.1 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/毫升(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),但只有0.3%的细胞凋亡(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。这表明炎症细胞挤入气道腔内本身并不是导致凋亡细胞聚集的充分原因。gydF4y2Ba
因此,在炎症部位(如CF和非CF支气管扩张患者的气道)检测到大量凋亡细胞,可能提示清除异常。CF中凋亡炎性细胞的异常清除,通过(a)允许细胞凋亡后坏死的发展以及随后促炎物质的释放,以及(b)改变正常情况下积极抑制促炎介质产生的机制,促进气道炎症的持续或增强。gydF4y2Ba
在CF气道中,炎症始于新生儿期,一直延续到成年期,并与慢性细菌感染、IL-8、TNF-α增加、PMN内流和PMN蛋白酶释放(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。婴儿的婴儿已经证明了气道炎症的证据,并且在没有感染的情况下,1岁以下的婴儿有很大比例的婴儿(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。不管最初的刺激是什么,其结果是大量炎症细胞涌入呼吸道,在那里它们死亡,释放细胞内蛋白酶,压倒抗蛋白酶防御(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),并使未逐渐造成伤害气道的蛋白酶和损害主体防御。CF Airway中的这种复杂的炎症内部Milieu可能被认为是一种蛋白酶/抗滴油性不平衡模式的极端表现,所述蛋白酶/抗脂肪酶不平衡似乎代表各种慢性气道炎性疾病,如支气管扩张(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba), 慢性支气管炎 (gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),哮喘(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)和α1抗胰蛋白酶缺乏症(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们试图确定凋亡细胞是否在CF患者的呼吸道中积累了凋亡细胞在慢性气道炎症的其他疾病中,并发现CF和非CF支气管扩张患者的气道凋亡细胞显着增加。我们进一步展示了来自这种气道的流体诱导的凋亡细胞吞噬的损害,并且证明这可能是由于活性弹性蛋白酶从吞噬细胞从PS受体切割。gydF4y2Ba
材料。gydF4y2Ba纯化的人体弹性蛋白酶(21u / mg蛋白),人组织蛋白酶G(3u / mg蛋白)和特定的弹性蛋白酶抑制剂Meosuc-Ala-Ala-Pro-Val-CMK(Nei)是从Calbiochem-Novabiochem Corp获得的。(圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。特定的组织蛋白酶G抑制剂(CGI),Z-Gly-Leu-Phe-CMK从酶系统产品公司获得(Livermore,California,USA)。Dupont Pharmaceuticals Co.(Wilmington,Delaware,USA)友好提供DMP777,PMN弹性蛋白酶特异性抑制剂及其无活性对映体SJ527)。从Elastin Products(Upensville,Missouri,USA)获得人蛋白酶3(13.5 U / Mg蛋白)。如前所述在该实验室中制备小鼠单克隆抗PS受体IgM(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。Ab’s obtained from PharMingen (San Diego, California, USA) included mouse monoclonal anti-human CD36 IgM, mouse monoclonal anti-human CD45 IgG, mouse monoclonal anti-human CD32 (FcγRII) IgG, mouse monoclonal anti-keyhole limpet hemocyanin IgM, and mouse IgG. Ab’s obtained from Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, Pennsylvania, USA) included rabbit anti-mouse IgG, Cy-3 goat IgG anti-mouse IgM, and Cy-3 goat IgG anti-mouse IgG. Human α1-antitrypsin was obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA).
人类的主题。gydF4y2Ba该研究经批准,按照我们的机构审查委员会对人类实验的道德标准进行批准。从每个主题获得书面知情同意书。慢性支气管炎患者是目前吸烟者或之前熏制的烟熏,在连续几年内至少有3个月的痰液产生。使用高分辨率计算断层扫描的患者记录了支气管扩张,没有是杂合或纯合的,对于86名已知的CF突变(Genzyme Corp.,Massachusetts,USA)。支气管扩张患者包括四个历史gydF4y2Ba分枝杆菌饲养骨髓内细胞gydF4y2Ba,一例支气管肺过敏gydF4y2Ba曲霉病gydF4y2Ba, 1例为特发性支气管扩张。除1例ΔF508/R553X为复合杂合子外,所有CF患者均为ΔF508 CF跨膜调节剂突变纯合子。gydF4y2Ba
在以咳嗽和痰液增多为定义的临床恶化期间,从所有三组患者中收集痰液。痰培养以鉴定细菌或真菌病原体。所有患者在研究后一个月内进行了肺活量测定。gydF4y2Ba
痰中凋亡细胞的评估。gydF4y2BaFirst morning sputum was collected on ice and processed immediately with Sputolysin (Caldon Biotech Inc., Carlsbad, California, USA), centrifuged onto slides (Cytospin; Shandon Inc., Pittsburgh, Pennsylvania, USA), stained with modified Wright’s Giemsa (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA), and analyzed blindly for apoptosis using nuclear condensation or a modified TUNEL assay per the manufacturer’s recommendations (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Sputum alveolar macrophages (AMs) were also examined blindly for ingestion of apoptotic cells and quantitated using a phagocytic index, as described previously (6gydF4y2Ba)。使用透射电子显微镜评估一些样品进行细胞凋亡(飞利浦400T双镜片;飞利浦,埃因霍温,荷兰)。gydF4y2Ba
CF和非CF支气管扩张溶胶的制备。gydF4y2Ba使用先前描述的协议(以上)由CF或非CF支气管扩张痰溶胶制成溶胶(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。从住院病人身上收集第一天早晨的痰液,置于冰上,立即用超离心分离成水溶胶和凝胶馏分(50,000gydF4y2BaggydF4y2Ba90分钟)。从6名患者中提取CF溶胶,从3名患者中提取非CF支气管扩张溶胶。用meosu - ala - ala - pro - val -的弹性酶裂解方法测定弹性酶和组织蛋白酶G的活性gydF4y2BapgydF4y2Ba-Nitroanilide(Calbiochem-Novabiochem Corp.)和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe的组织蛋白酶G裂解 -gydF4y2BapgydF4y2Ba-硝基苯胺(Calbiochem-Novabiochem Corp.),如前所述(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
细胞分离和培养。gydF4y2Ba使用Percoll梯度离心分离人单核细胞来源的巨噬细胞(HMDMs)和PMNs,如前所述(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。单核细胞在24孔组织培养板(Becton Dickinson和Co.,Franklin Lakes,New Jersey,USA)中镀,并通过在X-Vivo媒介(Biowhittaker Inc.,Walkersville,Maryland,Maven,USA)中培养来达到巨噬细胞%人血清从五个供体中汇集,在37°C为10%COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba6 - 8天。大约5 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba每口井都有hmdm。gydF4y2Ba
人AMS与正常科目分离。进行支气管镜检查,受试者在室温下用240ml 0.9%盐水灌洗。AMS在X-Vivo(Biowhittaker Inc.)中,培养,在10个96孔板中培养gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/孔37°C, 5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba30分钟后,洗涤去除非晶体细胞,然后在实验前培养2小时。gydF4y2Ba
人T淋巴细胞Jurkat细胞是从美国型文化收集(Manassas,Virginia,USA)中获得的,人骨髓细胞PLB985细胞是Christina Leslie(国家犹太医学和研究中心,丹佛,科罗拉多州,美国)的善良礼物。两种细胞系在RPMI(Mediatech Inc.,Herndon,弗吉尼亚州,USA)中培养,其中10%热灭活的FBS(Gemini Bio Products,Calabasas,Calabasas,USA),并补充了2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba-Glutamine,100u / ml青霉素和100μg/ ml链霉素(Sigma Chemical Co.)。gydF4y2Ba
诱导细胞凋亡。gydF4y2BaJurkat细胞和PLB985细胞分别在254 nm紫外线照射下分别培养10分钟和5分钟,Jurkat细胞和PLB985细胞分别培养3.5小时和2小时。人PMNs暴露于254nm紫外线照射10分钟,在1%低内毒素BSA的RPMI中培养2.5小时(Sigma Chemical Co.)。如前所述,在实验时,所有细胞约有70%的核浓缩凋亡(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
吞噬作用分析。gydF4y2Ba6 - 8天龄的HMDMs与凋亡的Jurkat细胞或PLB985细胞共培养,悬浮在500 μl X-vivo (BioWhittaker Inc.)中,37°C, 10% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在没有人血清的情况下,以5:1的比例(凋亡细胞与HMDM)维持1小时。在一些实验中,活细胞或igg调理细胞(仅Jurkat细胞)被用作靶细胞。Jurkat细胞用小鼠单克隆抗人CD45 IgG进行调理,然后用兔多克隆抗小鼠IgG进行调理,如前所述(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。然后用HBSS轻轻地清洗hmdm,去除未摄入的细胞,固定,并用改良的Wright’s Giemsa染色(Fisher Scientific)进行染色。吞噬作用通过目视检查样品来确定,并以吞噬指数表示(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。每个条件都进行重复测试,并对至少400个hmdm进行盲法计数。经台普兰蓝排除后评估,无论CF溶胶是否存在,HMDMs的存活率都大于99%。新鲜AMs与凋亡PMNs共培养方式类似,但实验是在96孔板上进行的。gydF4y2Ba
用PS重构质膜外叶子。gydF4y2BaPLB985细胞膜用脂质体重组,脂质体含有PS与磷脂酰胆碱(PC)的50:50 molar ratio (both from Avanti Polar lipids Inc, Alabaster, Alabama, USA),或100% PC,如前所述,并立即使用(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
流式细胞仪分析。gydF4y2BaHMDMs或AMs悬浮在含2%胎牛血清的HBSS中(Gemini Bio Products)。hmdm或AMs (10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)与1 μg初级Ab冰上孵育30分钟,洗2次,再与1:50稀释的次级Ab冰上孵育30分钟。使用FACScan流式细胞仪,使用PCLysys软件(Becton Dickinson and Co.)对洗涤后的巨噬细胞进行分析。gydF4y2Ba
统计数据。gydF4y2Ba使用ANOVA进行分析的手段以进行多种比较;当ANOVA表明意义时,所有对的Tukey-Kramer诚实的差异(HSD)测试用于比较群体(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba, e和f,图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在所有其他有内部控制的实验中,都使用了邓尼特方法。所有数据都使用JMP(版本3)统计软件进行分析(SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA),并呈现正负SEM。gydF4y2Ba
CF气道中凋亡细胞清除缺陷。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)赖特的CF痰(×100)的Giemsa染色(×100),显示具有浓缩核(张开箭头)和正常PMNS(箭头)的凋亡细胞。(gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba) CF患者痰透射电镜图(×6,300;柱:1 μm)显示早期凋亡(gydF4y2BabgydF4y2Ba),晚期凋亡(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和凋亡后坏死(gydF4y2BadgydF4y2Ba)。箭头(gydF4y2BabgydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba)示凋亡核浓缩。箭头(gydF4y2BadgydF4y2Ba)显示坏死时膜完整性丧失。(gydF4y2BaegydF4y2BaCF或支气管扩张患者痰液中凋亡细胞含量高于慢性支气管炎。每组6例,凋亡细胞百分率(核浓缩及TUNEL染色)±SEM。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba核浓缩引起的细胞凋亡与慢性支气管炎明显不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba**gydF4y2BaTunel染色的细胞凋亡与慢性支气管炎有显着差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。(gydF4y2BafgydF4y2BaCF患者气道巨噬细胞摄入的凋亡细胞较少。每组6例患者痰中巨噬细胞的平均吞噬指数±SEM。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba吞噬指数与慢性支气管炎(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
CF溶胶抑制HMDM以弹性蛋白酶依赖性方式摄取凋亡但不是IgG-Opsonized Jurkat细胞的影响。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在存在或不存在10%CF溶胶的情况下将HMDMS与凋亡,Opsonize或可行的Jurkat细胞一起聚集。每组3个重复,平均吞噬指数为对照组±SEM的百分比。控制平均吞噬指数:28.6±4.4。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与媒体预处理的凋亡Jurkat细胞显着不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。(gydF4y2BabgydF4y2Ba)在培养基(对照),10%CF溶胶,10%CF Sol加上DMP777(100μM),10%CF Sol加上SJ527(100μm),或10%CF Sol Plus(100μm),或10%CF Sol Plus甲基纤维素(MC)。平均吞噬指数作为对照±SEM的百分比显示为每组三到五重复。控制平均吞噬指数:52.8±10.2。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与对照组有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。(gydF4y2BacgydF4y2Ba) HMDMs、凋亡Jurkat细胞或两者在共培养前分别用培养基(Control)、10% CF溶胶、10% CF溶胶加DMP777 (20 μM)或单独DMP777 (20 μM)预处理30分钟。预处理后,在DMP777 (20 μM)的存在下进行共培养,以防止弹性酶活性的转移。每组3个重复,平均吞噬指数为对照组±SEM的百分比。对照组平均吞噬指数:51.4±6.0。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与对照组有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba**gydF4y2Ba与10% CF溶胶预处理的HMDMs (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba***gydF4y2Ba显着不同于10%CF溶胶 - 预处理的HMDMS和凋亡Jurkat细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
研究的患者。gydF4y2Ba患者人口统计资料汇总见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.CF患者年龄较轻,通过1秒用力呼气量(FEV)测量的呼气气流阻塞较少gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),更有可能用粘液殖民gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba.支气管扩张患者更有可能被感染gydF4y2Bam . avium intracellularegydF4y2Ba.gydF4y2Ba
CF和非CF支气管扩张患者增加痰凋亡细胞。gydF4y2Ba用核浓缩法定量痰液中凋亡细胞(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa) TUNEL染色。透射电镜显示CF痰液中存在早期凋亡、晚期凋亡和坏死的PMNs(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba罪犯)。所有患者组均有痰中凋亡细胞(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).通过核缩合评估,与慢性支气管炎患者相比,CF和非CF支气管扩张患者的凋亡细胞更大。TUNEL染色证实了这些结果;然而,支气管扩张和慢性支气管炎之间的差异没有达到显著性。痰标本也检测AM摄入的凋亡细胞(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baf). CF AMs中凋亡小体的含量低于慢性支气管炎患者。这些数据证实,在CF、非CF支气管扩张和慢性支气管炎患者的临床加重期间,气道中存在凋亡细胞,但凋亡细胞的相对丰度取决于基础疾病。此外,CF AMs对凋亡细胞的清除存在缺陷。gydF4y2Ba
CF溶胶以弹性蛋白酶依赖的方式损害巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。gydF4y2Ba我们进行了实验来测试CF气道液是否损害了HMDMs摄取凋亡细胞的能力(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种)。这些实验证明,通过HMDMS,但不是IgG-Opsonize或可行的Jurkat细胞摄取凋亡Jurkat细胞,得到10%CF溶胶。gydF4y2Ba
丝氨酸蛋白酶,存在于CF和非CF支气管扩张患者的气道分泌物中,被认为是sol介导的凋亡细胞清除延迟的可能原因。CF索尔包含3 U /毫升的中性粒细胞弹性蛋白酶和28亩/毫升的组织蛋白酶g . Non-CF支气管扩张索尔包含10 U /毫升的中性粒细胞弹性蛋白酶和77亩/毫升的组织蛋白酶g .两个特定抑制剂的中性粒细胞弹性蛋白酶,DMP777(20μM)和NEI(100μM),完全特别是抑制弹性蛋白酶活动10% CF和支气管扩张索尔(数据没有显示)。此外,一种组织蛋白酶G的特异性抑制剂CGI (10 μM)在两种溶胶制剂中完全和特异性地抑制了组织蛋白酶G的活性(数据未显示)。gydF4y2Ba
特定PMN弹性蛋白酶抑制剂DMP777用于测试ELASTASE是否有助于CF SO1的抑制作用(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)。用凋亡Jurkat细胞培养的HMDMS在CF溶胶存在下,摄取较少的凋亡细胞,但不在DMP777的存在下。既不是无活性对映体,SJ527也不是甲基纤维素载体阻止CF溶胶介导的凋亡细胞摄入的降低。类似地,具有10%CF溶胶的HMDMS的预处理在与对照(22.5±5.5)相比的凋亡Jurkat细胞(8.5±3.0)中减少了吞噬细胞的吞噬指数(8.5±3.0),但未遵循天然丝氨酸蛋白酶抑制剂,α1-antikrypsin的溶胶预孵育,100μg/ ml(15.8±0.3)或1,000μg/ ml(16.5±2.5)。gydF4y2Ba
我们进行了实验,以确定CF溶胶对凋亡细胞的吞噬作用是由于对吞噬细胞、凋亡细胞或两者的作用(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).这些数据表明,在HMDMs、凋亡Jurkat细胞或两者预处理后,CF溶胶减少了凋亡细胞的摄入。DMP777部分地阻止了CF sol对所有三组测试的吞噬作用,但在Jurkat细胞凋亡的情况下,没有达到统计学意义。我们还检测了CF HMDMs在摄取凋亡细胞时存在本质缺陷的可能性。然而,与正常的HMDMs相比,这些实验并没有证明CF患者的HMDMs摄入凋亡细胞的能力存在任何缺陷(数据未显示)。gydF4y2Ba
这些数据表明,CF溶胶通过弹性酶依赖机制减少巨噬细胞对凋亡细胞的摄食,而不是igg调理细胞。此外,CF溶胶似乎通过作用于巨噬细胞和靶凋亡细胞来减少对凋亡细胞的吞噬。gydF4y2Ba
PMN弹性酶和组织蛋白酶G损害巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,但不损害igg调理细胞。gydF4y2Ba我们评估了CF和非CF支气管扩张患者气道分泌物中已知的三种丝氨酸蛋白酶(弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3),以确定它们对HMDM摄入凋亡Jurkat细胞的影响(图)gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).与对照组相比,Elastase (1 μM, 0.6 U/ml)和cathepsin G (1 μM, 70 mU/ml)降低了HMDM对凋亡Jurkat细胞的摄入。相比之下,蛋白酶3在测试浓度中没有影响。与对照组(9.8±2.3)相比,1 μM弹性蛋白酶(13.0±2.5)和1 μM组织蛋白酶G(9.8±1.8)对HMDMs摄入igg调理后的Jurkat细胞的能力无影响。gydF4y2Ba
弹性蛋白酶,或组织蛋白酶G,抑制凋亡细胞的摄入。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在培养基或增加浓度的弹性蛋白酶,组织蛋白酶G或蛋白酶3的情况下,用凋亡Jurkat细胞与凋亡Jurkat细胞一起获得HMDM。平均吞噬指数作为对照±SEM的百分比显示为每组三到六重复。控制平均吞噬指数:44.1±8.5。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba明显不同于媒体(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。(gydF4y2BabgydF4y2Ba用培养基(Control)、1 μM PMN弹性蛋白酶(NE)加或不加特异性弹性蛋白酶抑制剂(NEI, 100 μM)、1 μM组织蛋白酶G (Cat G)加或不加特异性CGI (10 μM)预处理后,将人AMs与凋亡的PMN共培养。在DMP777 (20 μM)存在下共培养,以防止弹性酶活性的转移。每组有3或4个重复,平均吞噬指数为对照组±SEM的百分比。对照组平均吞噬指数:8.4±1.9。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与对照组有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
在气道中,AM是最可能参与清除凋亡炎症细胞的专业吞噬细胞。因此,我们试图测试丝氨酸蛋白酶是否干扰人AM摄入凋亡PMNs(图)gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).从正常人中分离AMs,并与凋亡的人pmn共培养。Elastase (1 μM, 0.6 U/ml)和cathepsin G (1 μM, 70 mU/ml)抑制人对凋亡的PMNs的AM吸收,相应的特异性抑制剂可逆转这一作用。这些结果证实,人AMs摄入凋亡的PMN,这种摄入被PMN弹性酶或组织蛋白酶G抑制。gydF4y2Ba
这些数据在一起建立了弹性蛋白酶和组织蛋白酶G通过HMDM和AMS干扰凋亡细胞的吞噬作用。gydF4y2Ba
来自CF和非CF支气管扩张的溶胶以弹性蛋白酶依赖的方式抑制人AM摄入凋亡PMNs。gydF4y2Ba进行实验以确定溶胶衍生的丝氨酸蛋白酶是否破坏AMS除去凋亡PMN的能力。这些实验表明,来自CF的溶胶(图gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)和非cf型支气管扩张患者(图gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)抑制人AM对凋亡的人PMNs的清除,这种溶胶效应被两种特定的弹性酶抑制剂所阻止。相比之下,一种特定的组织蛋白酶G抑制剂本身并不能阻止溶胶对凋亡细胞去除的影响。这些结果强烈提示,存在于CF或非CF支气管扩张患者气道中的弹性蛋白酶有能力干扰AMs清除凋亡PMNs。gydF4y2Ba
CF和非CF支气管扩张sol源性弹性蛋白酶破坏人AM摄入凋亡的人PMNs。人AMs与凋亡的人PMNs共培养,经培养基(Control)、10% CF (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或10%非CF支气管扩张(BR)(gydF4y2BabgydF4y2Ba)溶胶,含或不含DMSO, DMP777 (20 μM), NEI (100 μM), CGI (10 μM),或NEI和CGI。在DMP777 (20 μM)存在下共培养,以防止弹性酶活性的转移。每组3 ~ 4个重复,平均吞噬指数为对照组±SEM的百分比。控制平均吞噬指数:(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)7.9±1.7;(gydF4y2BabgydF4y2Ba) 7.7±1.4。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba指出的群体与对照有显着差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
CF SOL以弹性酶依赖性方式切割PS受体。gydF4y2Ba流式细胞术用于测试CF溶胶对凋亡细胞吞噬作用癌的巨噬细胞受体的影响(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在这些实验中使用HMDMS;然而,测试的所有受体也存在于人AMS上(数据未显示)。CF溶胶没有改变CD32(FcγRII),CD36或VITRONECTIN受体的染色(数据未显示)。相反,CF溶胶对PS受体的染色降低,但不存在于弹性蛋白酶抑制剂DMP777的存在下。这些数据表明,CF Sol弹性蛋白酶可以通过PS受体的降解干扰凋亡细胞的吞噬作用。为了进一步测试该假设,将HMDM与弹性蛋白酶,组织蛋白酶G或蛋白酶3一起孵育,并评估PS受体和CD36的染色(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。在测试的浓度下,只有弹性酶能切割PS受体。gydF4y2Ba
CF溶胶以弹性酶依赖的方式切割PS受体(PSR)。HMDMs用培养基(Control)、10% CF溶胶或10% CF溶胶加DMP777 (20 μM)孵育2小时。采用流式细胞术检测CD32 (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba),CD36(gydF4y2BacgydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba)及PSR (gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BafgydF4y2Ba)。每个受体的直方图显示在左边的面板上,而每个受体±SEM染色的hmdm的百分比显示在右边的面板上(每组4到6个重复)。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与对照组有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
可切割细胞表面PSR的是弹性酶,而不是组织蛋白酶G或蛋白酶3。HMDMs与培养基(Control)、弹性蛋白酶(1 μM)、组织蛋白酶G (1 μM)或蛋白酶3 (1 μM)孵育2小时。流式细胞术检测PS受体(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)及CD36 (gydF4y2BacgydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba)。每个受体的直方图示于左面板中,并且每个受体±SEM的染色的HMDM的百分比显示在右侧面板中(每组三重复)。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与对照组有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
CF Sol弹性蛋白酶损害PS受体介导的凋亡细胞吞噬作用。gydF4y2Ba为了测试CF溶胶对PS受体介导的吞噬作用的影响,使用PLB985骨髓细胞系。PLB985细胞经历典型的核形态学和生物化学变化的细胞凋亡特征(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。然而,未分化的PLB985细胞在凋亡过程中并没有将PS从内膜小叶外化到外膜小叶(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。因此,它们不会与巨噬细胞表面上的PS受体相互作用以驱动摄取。用PS的质膜外叶重建,但不是PC,通过与PS受体的特异性相互作用增加巨噬细胞识别和摄取凋亡PLB985细胞的能力(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
使用活的和凋亡的PLB985细胞检测CF溶胶通过PS受体对凋亡细胞的吞噬作用(图)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。在一些PLB985细胞中,在共培养之前重构膜PS或对照PC。与可行的PLB985细胞相比,膜PS重构膜PS,但不是PC增加了凋亡PLB985细胞的HMDM。相反,除了DMP777存在之外,PS对凋亡细胞的重构未通过CF溶胶 - 预处理的HMDMS吞噬。因此,这些结果意味着CF溶胶弹性蛋白酶通过HMDMS直接损害PS受体的降解直接损害凋亡细胞间隙。gydF4y2Ba
CF溶胶以弹性蛋白酶依赖的方式干扰ps介导的凋亡细胞摄入。HMDMs用培养基、10% CF溶胶或10% CF溶胶加DMP777 (20 μM)预处理30分钟,然后与活的或凋亡的PLB985细胞共培养。通过磷脂转移将PS或PC插入部分凋亡的PLB985细胞外膜。HMDMs与活的PLB985细胞(Control)、凋亡的PLB985细胞、凋亡的PLB985细胞+ PC或凋亡的PLB985细胞+ PS共培养1小时。在DMP777 (20 μM)存在下共培养,以防止弹性酶活性的转移。每组5个重复,平均吞噬指数±SEM。gydF4y2Ba*gydF4y2Ba与对照组有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
我们评估了三种以慢性气道炎症为特征的人类疾病,以确定气道凋亡细胞清除是否异常。我们的数据表明,三组患者的痰液中都存在凋亡细胞,但与慢性支气管炎患者相比,CF和非CF支气管扩张患者的痰液中凋亡细胞更多。在这种情况下,多种潜在的机制可能有助于凋亡炎性细胞的积累。然而,本文提出的数据表明,气道弹性酶通过直接作用于巨噬细胞PS受体而抑制凋亡细胞的清除。发现大量未清除的、死亡的炎症细胞可能对持续的气道炎症有重要影响。gydF4y2Ba
CF和非CF支气管扩张患者气道中凋亡细胞的增加表明正常的凋亡细胞清除动力学受损,因为在其他以pmn为主的炎症性肺部疾病中,有效的清除导致凋亡细胞数量非常低(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。急性呼吸窘迫综合征气道PMN负荷(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)和社区获得的肺炎(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)类似于临床稳定的CF患者(1.9×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba/ml)和CF患者临床加重(1.3 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/ ml)(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba)。然而,与急性呼吸窘迫综合征和社区获得的肺炎相反,据报道,不到2%的灌洗细胞是凋亡(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),发现CF痰液中超过25%的炎性细胞凋亡,支气管扩张组为19%,慢性支气管炎组为3%。这一观察结果表明,CF、支气管扩张、可能还有慢性支气管炎所特有的因素可能会破坏正常的凋亡细胞清除机制。gydF4y2Ba
由于CF和非CF支气管扩张气道内壁液明显阻断凋亡细胞进入巨噬细胞,因此这些气道中的抑制物质被认为是产生这种效果的主要候选物质。然而,对于凋亡细胞的积累有很多其他的解释,应该加以考虑。(a)我们不认为所观察到的凋亡炎性细胞的增加主要是加速凋亡的功能。我们发现CF患者外周血PMNs在体外自发或紫外线诱导的细胞凋亡中没有缺陷,通过形态学和PS表达(数据未显示)来测量。局部气道环境(如高渗)可增加PMN凋亡率(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。然而,有能力的证据表明,可以使用正常的清除机制方便地清除巨大的细胞凋亡(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。因此,通过任何方法加速细胞凋亡似乎不太可能仅考虑观察到的凋亡细胞的积累。(b)通过受损粘液粘液和/或受损的粘蛋白自动扶梯的凋亡细胞抑制凋亡细胞可能有助于降低间隙。然而,CF Airways的活组织检查证明了气道墙壁中凋亡细胞的存在,表明这些因素不是对凋亡细胞积累的必需细胞(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。(c)由于体内大多数细胞类型,包括上皮细胞(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)可以摄取凋亡细胞,在与改变的CF跨膜调节器功能相关的气道上皮的水平上可能存在缺陷。这可能与早期炎症特别相关。然而,当时炎症过程已经变得持续存在,由于肺泡巨噬细胞,大部分间隙更可能。我们对具有CF的个体的单核细胞衍生巨噬细胞的研究显示凋亡细胞吞咽中的内在异常(数据未显示)。(d)最后,观察到肺部收集素的降低,例如表面活性剂蛋白A和表面活性剂蛋白D(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),也可能有助于凋亡细胞间隙不良,因为收集素有涉及凋亡细胞去除(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
本文所述的实验表明,气道衬里流体含有能够抑制凋亡细胞间隙,特别是弹性蛋白酶和组织蛋白酶G.各种蛋白酶存在于CF气道衬里流体中,包括弹性蛋白酶(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)、组织蛋白酶G (gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)、蛋白酶3 (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)、细菌蛋白酶等gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Baelastase(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)和金属蛋白酶(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)。虽然这些蛋白酶中的任何一种都可能干扰凋亡细胞的吞噬作用,但我们检测了PMN丝氨酸蛋白酶,因为它们是最丰富的。这些研究表明,CF和非CF支气管扩张溶胶中含有高浓度的弹性蛋白酶和组织蛋白酶G,与其他测量值相似(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。然而,CF和非CF支气管扩张液仅以弹性蛋白酶依赖的方式损害巨噬细胞摄取凋亡细胞的能力。单独测试时,纯化的弹性蛋白酶和组织蛋白酶G都能抑制巨噬细胞对凋亡细胞的摄取,而蛋白酶3则没有。这个观察到的差异的有效性sol-derived组织蛋白酶G和纯化组织蛋白酶G可能可以解释为较低的活动中组织蛋白酶G 10% CF索尔(2.8亩/毫升)和10% non-CF支气管扩张索尔(7.7亩/毫升)与纯化的活动组织蛋白酶G(70亩/毫升)是必要的,以抑制细胞凋亡吸收。相比之下,抑制凋亡细胞摄取所需的纯化弹性酶(0.6 U/ml)浓度与10% CF溶胶(0.3 U/ml)和10%非CF支气管扩张溶胶(1.0 U/ml)中发现的浓度相似。虽然我们认为溶胶主要作用于巨噬细胞,但我们的数据也证实,CF溶胶通过直接作用于凋亡细胞而破坏清除。这种CF溶胶效应的凋亡细胞靶点尚不清楚;然而,可能性包括蛋白酶乳沟糖蛋白的配体或直接封锁外部化PS。这种影响溶胶蛋白酶是符合我们当前的知识中存在的蛋白酶/ antiprotease失衡CF和non-CF支气管扩张气道,蛋白酶存在超过他们的主要抑制剂(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。由于蛋白酶/抗滴发酶不平衡也是慢性支气管炎的特征(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),我们预计慢性支气管炎溶胶也会损害凋亡细胞的清除,但可能比CF或非CF支气管扩张溶胶的程度要小。gydF4y2Ba
未随机的气道蛋白酶通过损伤支气管上皮细胞,破坏细胞外基质组分,切割免疫球蛋白,纤维蛋白(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。丝氨酸蛋白酶也可以切割细胞表面分子和损害多种细胞功能,包括吞噬。例如,弹性蛋白酶抑制嗜中性粒细胞的吞噬gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba通过切割CR1和C3BI,创建“Opsonin受体不匹配”(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。Elastase还剪切细胞表面抗原(CD4和CD8),导致T淋巴细胞介导的细胞毒性受损(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),组织蛋白酶G降解单核细胞上的CD14 (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。我们的数据表明,CF和非CF支气管扩张溶胶中的弹性蛋白酶通过切割巨噬细胞表面PS受体来干扰吞噬作用。PS受体是最近克隆的,小的,跨膜吞噬细胞受体,存在于HMDMs (gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)和AMs(数据未显示),它们通过凋亡细胞外表面PS的立体特异性识别来驱动凋亡细胞的摄入。它在跨膜区域附近具有潜在的弹性酶裂解位点,这将导致假定的分子ps结合区域的丢失(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。组织蛋白酶G干扰凋亡细胞摄取的机制仍然未知;然而,CD14的裂解,已知参与凋亡细胞去除的受体是一种可能性。或者,PS受体可以通过组织蛋白酶G切割,但可以通过使用的技术来检测裂解。gydF4y2Ba
由于死亡炎症细胞的清除是炎症解决的一个重要步骤,这一过程的失败可能对CF和非CF支气管扩张患者的气道产生促炎后果。吞噬细胞通过PS受体识别凋亡细胞,积极抗炎,诱导TGF-β、前列腺素EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),在某些情况下,IL-10(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba);这些可以用自分泌/旁静脉方式起作用以抑制产生宿主的促炎细胞因子(TNF-α),趋化因子(IL-8),生长因子和脂质介质(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),类似于CF气道中增加的炎症介质(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。PS受体的分裂有望阻断这一作用。相比之下,巨噬细胞去除溶解的PMNs在诱导TGF-β和抑制炎症介质方面的效果要差得多,部分原因是其弹性蛋白酶的含量(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。有证据表明CF气道中的PMNs也发生了凋亡后坏死。预计这将最终导致细胞内具有强大炎症潜能的内容物的释放,包括被提议参与凋亡细胞清除的封锁的弹性酶。gydF4y2Ba
这个概念提出了潜在的悖论。在正常的急性炎症反应中,预期PMN的早期涌入可能导致弹性蛋白酶的一些释放(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba(尽管细胞外弹性蛋白酶的分泌实际上并不是PMN激活的主要事件)。PS受体的分裂会限制抗炎细胞因子的产生。那么,为什么所有的急性炎症反应都没有进展?似乎关键限制因素是功能性抗蛋白酶的可用性(内流),在“正常”炎症反应中将蛋白酶平衡恢复正常,允许PS受体介导的抗炎介质的生成,适当清除凋亡的炎症细胞,以及响应的解决方案。gydF4y2Ba
这些结果表明,在以蛋白酶/抗蛋白酶失衡为特征的疾病中,受损的凋亡细胞清除有助于增强炎症反应,并可能加速持续的炎症和进行性气道损伤。因此,针对缓解这种失衡的治疗可能通过防止凋亡细胞的积聚、随后的凋亡后坏死和炎症溶解缺陷来减少进行性肺功能下降。gydF4y2Ba
我们感谢G. Smith和J. Henson在透射电子显微镜方面的技术援助,D. Riches的建议和讨论,J. Nick对手稿的严格审查,以及杜邦制药公司好意提供DMP777。囊性纤维化基金会(给R.W. Vandivier)和NIH (GM-48211和HL-60980到P.M.亨森)支持这项工作。gydF4y2Ba