慢性阻塞性肺疾病患者T淋巴细胞内细胞因子的变化

总结

慢性阻塞性肺病(COPD)的特点是对吸入颗粒物(主要是吸烟)产生过度炎症反应。T淋巴细胞是重要的调节细胞，分泌多种细胞因子并积极参与这种炎症反应。根据细胞因子分泌的模式，免疫应答分为细胞毒性或1型[干扰素(IFN)-γ-，白介素(IL)-2依赖]和体液性或2型(IL-4-， IL-5-， IL-10-和IL-13依赖)。本文旨在比较流式细胞术测定COPD患者、肺功能正常的吸烟者和从不吸烟者支气管肺泡灌洗液(BAL)和外周血T淋巴细胞中细胞因子表达的细胞内谱。我们发现，与从不吸烟或肺功能正常的吸烟者相比，COPD患者的BAL T淋巴细胞在分析的大多数细胞因子中具有更高的阳性染色细胞百分比。IL-4、IL-10、IL-13水平差异有统计学意义，CD8水平差异尤甚⁺T细胞。此外，大多数这些细胞因子的表达与气流阻塞的程度呈负相关，提示慢性阻塞性肺病患者T淋巴细胞的局部激活和/或选择性归家。这些观察结果在循环T淋巴细胞中没有重现。这些结果表明COPD患者的BAL T淋巴细胞比对照组产生更多的细胞因子，并倾向于表现出2型细胞因子表达模式，特别是Tc-2谱。这与气流阻塞的程度成反比。

简介

吸烟在所有吸烟者中都会引起气道和肺实质的炎症反应。然而，由于尚不完全清楚的原因，只有部分患者会发展为慢性气流阻塞[1］．因此，与患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的吸烟者相比，尽管吸烟习惯不同，但仍设法保持肺功能的吸烟者，这种炎症反应的性质、强度和/或定位可能有所不同[2］．

几种炎症细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，积极参与COPD的炎症反应[3.］．其中，T淋巴细胞及其产生的细胞因子在调节免疫反应类型中起着关键作用，可分为细胞毒性或体液性。前者主要由CD4产生干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-2⁺T辅酶(Th1)或CD8⁺T细胞毒(Tc1)淋巴细胞;后者与IL-4、IL-5、IL-10和IL-13(分别为Th2或Tc2)的产生有关[4］．

以前的一些研究已经试图描述COPD中淋巴细胞因子产生的模式，但结果是相互矛盾的。一些报道称COPD患者表现出主要的Th2/Tc2表型[5 - 7]，而其他人则发现了Th1/Tc1模式[8 - 10］．差异可能与不同的组织样本(血液，支气管，肺泡)，不同的T细胞亚群(CD4⁺, CD8⁺)和/或这些研究只关注有限数量的细胞因子。我们试图克服这些限制，并通过分析CD4和CD4细胞和T淋巴细胞的细胞内细胞因子表达模式来更精确地定义COPD患者的T淋巴细胞表达模式⁺和CD8⁺同时从外周血和支气管肺泡灌洗液中分离T淋巴细胞，并通过测定各种Th1/Tc1和Th2/Tc2细胞因子的表达模式。虽然这是一项描述性研究，但对COPD中淋巴细胞因子表达模式的详细描述对于更好地理解驱动这种毁灭性疾病的异常炎症反应的分子机制至关重要。

材料与方法

人口与伦理

我们研究了吸烟者(有或没有慢性阻塞性肺病)和从不吸烟者(表1)．所有参与者都是从我们机构的内窥镜部门连续招募的，从那些因临床原因(孤立性肺结节或咯血)需要进行支气管镜检查的患者中招募的。所有患者均在充分了解本研究的性质、特点、风险和潜在收益后，签署了书面同意书，并事先得到了我院伦理委员会的批准。COPD患者临床稳定，在过去3个月内没有发作。6名患者正在接受吸入类固醇治疗，但没有人接受口服类固醇治疗。我们排除了患有其他慢性肺部疾病(哮喘、支气管扩张和间质性肺疾病)、特异反应性、心脏、肝或肾衰竭的患者。为了避免急性吸烟的任何潜在影响，主动吸烟者在支气管镜检查前12小时不吸烟。采样前测定的所有受试者呼出一氧化碳浓度均低于10ppm (ppm)。

肺功能

强制肺活量测定(GS;Warren E. Collins, Braintree, MA, USA)在所有参与者中获得[11］．肺活量参考值为地中海人群的参考值[12］．

BAL和血液取样

使用柔性纤维支气管镜(Pentax 15v, Tokyo, Japan)进行支气管镜检查。在局部利多卡因作用下，在不含任何结节的肺中叶或舌部的一个肺段内灌注8份等份25 ml无菌生理盐水进行BAL [13］．将回收的液体过滤，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并在4°C的RPMI-1640介质中重新悬浮。在支气管镜检查前通过外周静脉穿刺采集肝素化血样。采用密度梯度离心法(Ficoll Hypaque)分离外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC细胞清洗两次，10点重悬⁶每毫升RPMI-1640培养基。

我们在BAL前使用无菌保护标本刷(PSB) (Mill-Rose, Lab Inn, OH, USA)排除气道细菌感染[14］．PBS样品的培养结果少于10^3.菌落形成单位(CFU)/ml。

T淋巴细胞的刺激、染色及流式细胞术分析

PBMC和BAL细胞分别用或不用(阴性对照)豆蔻酸磷酯(PMA;25 ng/ml)和离子霉素(1µg/ml)，在Brefeldin A(10µg/ml)的存在下，在37℃的5% CO中浸泡5小时₂湿润的气氛。

刺激后，收集细胞，用抗cd8和抗cd3单克隆抗体(Coulter Immunotech, Isaza, Madrid, Spain)进行染色，用抗il -2, IL-4, IL-10, IL-13，肿瘤坏死因子(TNF)-α(均来自Pharmingen Becton Dickinson, Madrid, Spain)和IFN-γ (Coulter Immunotech)藻红素(PE)偶联单克隆抗体进行固定、渗透和细胞内染色。分析在Epics XL流式细胞仪(Coulter Immunotech)中进行，使用Expo32软件(Coulter Immunotech)。T淋巴细胞被封闭在一边与CD3⁺点阴谋。我们分析了CD8⁺T淋巴细胞为CD3⁺CD8⁺和CD4⁺T淋巴细胞为CD3⁺CD8^{- - - - - -}T细胞。用同型匹配的pe偶联单克隆抗体和未受刺激的样品染色的细胞在背景水平之上建立阳性染色(图1)．

统计分析

结果以均数±均数标准误差(s.e.m.)表示。Mann-Whitney、Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较检验用于适当的组间比较。感兴趣的变量之间的相关性是通过Pearson相关检验来探索的。一个P-value小于0·05被认为是显著的。

结果

临床和功能发现

表1显示三组患者的主要临床及功能特点。COPD患者年龄略大于其他两组，但差异无统计学意义。COPD患者与肺功能正常的吸烟者吸烟史相似。COPD患者表现为中度气流阻塞(GOLD II期)，而根据定义，其他两组肺功能正常。

BAL T淋巴细胞内细胞因子表达模式

表2显示BAL的绝对细胞数和差异细胞数。如先前报道[15]， COPD患者BAL恢复降低;相比之下，慢性阻塞性肺病患者和肺功能正常的吸烟者的细胞总数更高。CD4的分布⁺和CD8⁺BAL样本中T细胞在各组间无差异(表3)，如上文所述[16］．

图2为BAL CD4百分比⁺和CD8⁺在COPD患者(暗柱)、肺功能正常的吸烟者(灰柱)和从不吸烟者(白柱)中，不同细胞因子细胞内染色阳性的T淋巴细胞(分别为图a和图b)。COPD患者对所研究的基本所有细胞因子均有较高的阳性染色趋势。在CD4⁺T淋巴细胞(a)， IL-13和IFN-γ的差异具有统计学意义，而CD8⁺T淋巴细胞(b) IL-2、IL-4、IL-10、IL-13差异有统计学意义。接受(或不接受)吸入类固醇治疗的患者的结果没有差异(数据未显示)。有趣的是，CD4的百分比⁺T细胞IL-10、IL-13、CD8染色阳性⁺IL-4、IL-10和IL-13染色阳性的T细胞与1 s用力呼气量(FEV)呈显著负相关₁)值(图3)．相比之下，I型细胞因子(IL-2和IFN-γ)与肺功能不相关(数据未显示)。

循环T淋巴细胞细胞内细胞因子表达模式

CD4的分布⁺和CD8⁺外周血样本中的T细胞在两组之间没有差异，尽管COPD患者表现出较高的CD8趋势⁺值(表3)．图4显示循环CD4的结果⁺(a)及CD8⁺T淋巴细胞(b)。与BAL液中观察到的结果相反，两组外周血中主要无差异，CD4均无差异⁺和CD8⁺T淋巴细胞。只有在TNF-α的情况下，我们观察到循环CD8的意外低染色⁺肺功能正常的吸烟者与不吸烟者或COPD患者的T淋巴细胞比较。

讨论

我们的主要研究结果表明:(1)COPD患者BAL T淋巴细胞产生的细胞因子比对照组多(图2)．在循环T淋巴细胞中则不是这样(图3)，提示T淋巴细胞局部活化和/或选择性归巢肺;(2)细胞因子的产生模式趋于Tc2型，如CD8的高百分比所示⁺T细胞IL-4, IL-10，特别是IL-13染色阳性(图2）;(3)几种2型细胞因子与气流阻塞程度呈负相关(图3)．总的来说，这些结果表明，肺T淋巴细胞中细胞因子的表达遵循2型模式，主要是Tc2，这与疾病的严重程度有关。

现在已经证实T淋巴细胞积极参与气道和肺实质的炎症反应，这是COPD的特征[1，3.，17，18］．先前的一些研究试图描述这些患者细胞因子产生的特征，但结果相互矛盾。Mattoli等．报道，与从不吸烟或肺功能正常的吸烟者相比，CD8⁺从COPD患者中获得的T细胞克隆呈现Tc2表型[5］．这些发现后来得到了Miotto的证实等．［6和朱等．［7]在支气管组织中。相反，Majori等．发现外周CD4⁺与肺功能正常的吸烟者和从不吸烟者相比，COPD患者的T淋巴细胞出现Th1表型[8]，与这些发现相一致的是，最近Di Stefano等．有报道称轻中度稳定型COPD患者支气管组织淋巴细胞呈Th1/Tc1模式[9]，尽管Th-2细胞因子(如IL-4或IL-5)从未被确定。此外，Tc2表型也与系统性硬化症患者的间质纤维化和肺功能下降有关[19］．最后，在最近的一篇论文中，Grumelli等．提示BAL T淋巴细胞的Th1模式基于IFN-γ的产生和趋化因子受体的表达[10］．与这些先前的研究相反，这些研究仅测量了细胞因子数量的减少，我们通过CD4和CD4两种方法筛选了细胞因子的产生⁺和CD8⁺T淋巴细胞，不仅从BAL中获得，而且从循环池中分离得到。我们的结果显示，COPD患者中产生细胞因子的BAL T淋巴细胞的百分比高于许多细胞因子的对照组(图2)，表明这些细胞在这些患者的肺部处于高度效应状态。有趣的是，循环T淋巴细胞中不存在这种情况(图4)，提示肺淋巴细胞被局部激活或选择性招募到肺。我们还发现BAL CD8⁺COPD患者的T淋巴细胞主要遵循Tc2模式，因为IL-4、IL-10和IL-13的产量高于其他两组(图2 b)．这种模式在CD4中不太明确⁺T淋巴细胞，显示出较高的IL-13和IFN-γ (图2一个)．然而,CD4⁺只有与从不吸烟者相比，T细胞IFN-γ染色阳性才具有统计学意义(图2一个)，这一观察结果可能表明烟草烟雾对这种细胞因子的产生有直接影响。因此，这些观察结果指向COPD的主要反应模式为Tc2。支持这一论点的事实是，已知COPD患者循环中的IL-6水平升高[20.]，而IL-6主要极化T细胞，导致2型免疫反应[21，22］．对这些结果的一种可能解释是，在慢性阻塞性肺病患者中，先天免疫系统的刺激诱导了IL-6的产生，这将促使T细胞产生2型细胞因子，这种模式是疾病的结果而不是原因。

从机械的角度讲，我们研究的另外两个方面值得评论。首先，几种2型细胞因子(IL-4、IL-10和IL-13)与气流阻塞程度呈显著负相关(图3)．其次，在筛选的不同细胞因子中，IL-13是COPD中上调幅度最大的细胞因子(均为CD4⁺和CD8⁺BAL T淋巴细胞(图2 a, b)．已知IL-13在转基因小鼠中过表达可引起肺气肿、粘液化生和炎症[23]，所有已知的慢性阻塞性肺病病理改变[1，3.，17，18］．因此，这些观察结果支持2型细胞因子在疾病发病机制中的作用，特别是IL-13。例如，CD8的比例越高⁺T细胞2型细胞因子染色呈阳性可使其更能抵抗凋亡[24]，从而增加它们的寿命和对肺部的破坏能力。

总之，我们的研究提供了CD4激活模式的全面描述⁺和CD8⁺慢性阻塞性肺病患者BAL和外周血T淋巴细胞的变化我们发现在BAL区室中差异显著(外周血中差异小得多)，细胞因子倾向于遵循2型模式，主要是Tc2型。最后，这似乎与疾病的严重程度有关，由气流阻塞的程度决定。

确认

这项研究部分得到了卫生调查Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS PI02/0986, FIS PI05/1059和Red respiratory - rtic 03/11C)， SEPAR, Govern Balear和ABEMAR的支持。作者感谢Carmen Santos和Francisca Bauza的技术支持。

参考文献