Anti-fibroblast检测到细胞ELISA抗体在系统性硬化提高溶胶原的活动和矩阵metalloproteinase-1生产真皮成纤维细胞

文摘

目标。抗体结合成纤维细胞的表面(anti-fibroblast抗体:AFA)中描述的系统性硬化症(SSc)。我们旨在评估阿发的影响细胞外基质(ECM)营业额和阿发是否与anti-topoisomerase-I抗体有关。

方法。免疫球蛋白是从AFA-positive纯化和AFA-negative在20名SSc和20名健康人血清选中,和测试在正常皮肤成纤维细胞,在蛋白质和mRNA水平,为他们的能力产生胶原蛋白沉积或退化。

结果。成纤维细胞刺激与AFA-positive而AFA-negative和控制免疫球蛋白g显示增加胶原蛋白消化能力矩阵和生产metalloproteinase-1(金属蛋白酶- 1),而总胶原蛋白的生产,I型胶原蛋白和组织抑制剂metalloproteinase-1 (TIMP-1)不受影响。金属蛋白酶- 1的稳态mRNA水平,COL1A1 TIMP-1平行的蛋白质水平。AFA-positive免疫球蛋白g没有诱导Smad 2/3磷酸化,表明这种转变增长factor-β信号通路没有涉及。il - 1和肿瘤坏死因子(TNF)中和没有扭转增强金属蛋白酶- 1的生产,建议直接阿发对成纤维细胞的影响。最后,anti-topoisomerase-I抗体出现在11 12 AFA-negative免疫球蛋白,和一个anti-topoisomerase-I单克隆抗体未能提高金属蛋白酶- 1生产,从而表明阿之间缺乏相关性和anti-topoisomerase-I抗体。

结论。这些结果表明,SSc抗体绑定成纤维细胞增强矩阵退化和MMP的生产事件,可能有利于炎症但不直接影响肝纤维化的发展。

介绍

系统性硬化症(SSc)是一种来历不明的疾病,其特征是自身抗体的存在,fibroproliferative血管病变和细胞外基质(ECM)过度沉积,导致皮肤和内脏器官的纤维化(1]。成纤维细胞发挥核心作用在ECM生产和退化2]。它们合成ECM分子,其中包括一些胶原蛋白(特别是I型胶原蛋白,皮肤最丰富),表达降解酶如基质金属蛋白酶(MMPs)和组织MMP抑制剂(TIMPs) [3,4]。SSc成纤维细胞在许多方面不同于正常成纤维细胞产生更多的胶原蛋白(5],既定的结缔组织生长因子(CTGF)过表达促进成纤维细胞增殖和ECM生产(6),以及α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA) [7]。矩阵转换增长factor-β(TGF-β)刺激生产和诱发自身合成和CTGF的(8]。TGF-βSmads是细胞内的感受器,组织纤维化的主要中介(9]。在硬皮病成纤维细胞,Smad3和Smad4显示核本地化和高浓度的磷酸化Smad2/3没有外生TGF-β,暗示Smad通路的组成性激活(9]。

无处不在的抗体细胞self-components典型出现在超过90%的SSc病人和与不同的临床相关的子集10]。此外,自身抗体,特别结合成纤维细胞已被描述。我们报道的存在anti-fibroblast抗体(AFA),能够绑定成纤维细胞的细胞表面和诱导pro-adhesive炎性表型,调控细胞间黏附分子1的表达(ICAM-1)和il - 6 (11在超过40%的SSc的病人。其他人发现阿SSc anti-topoisomerase-I抗体,患者大多受到疾病的扩散形成的影响,表明他们强烈与anti-topo-I Ab (12,13]。,免疫球蛋白的SSc患者肺动脉高压(PAH)是识别纤维母细胞组件显示不同于那些主要PAH (14]。此外,non-ubiquitous自身抗体的抗原目标有可能修改ECM营业额包括fibrillin-1、非结构性矩阵组件和血小板源生长因子(PDGF)受体(15,16]。刺激抗体PDGF-R不限于SSc但也被发现在慢性移植物vs宿主病(17]。此外,成纤维细胞激活也一直与抗体cross-recognize人类CMV-derived蛋白质UL94和粘附分子NAG-2 [18,19]。

阿发致病事件导致纤维化的贡献在SSc仍然有争议。在目前的研究中,我们问阿能否影响ECM营业额。我们的发现表明SSc AFA-positive免疫球蛋白优先诱导ECM降解而不是沉积,在肿瘤坏死因子(TNF)和IL-1-independent方式。因此,SSc病人的一个子集港口自身抗体结合ECM沉积的成纤维细胞,抑制自己的潜力。

材料和方法

病人和控制

二十SSc患者(17个妇女和3个男人,意味着±其中。49岁±11岁)和20岁——sex-matched健康献血者参加这项研究。所有患者实现美国风湿病学院SSc分类标准(20.),只有一个是anti-topoisomerase-I抗体阳性。唯一anti-topo-I-negative核仁的安娜方面。没有anti-centromere抗体。患者的外周血和皮肤活检获得和控制通知书面同意后根据《赫尔辛基宣言》。这项研究是日内瓦大学医院的伦理委员会批准。

试剂

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),非必需氨基酸溶液100×,丙酮酸钠、青霉素和链霉素获得GIBCO(表达载体);α-ketoglutaric酸,β-amino丙腈和胎牛血清(FCS)σ(圣路易斯,密苏里州,美国);重组体人TGF-β1 (rhTGF-β₁),重组人类interleukin-1-β(rhIL-1β)anti-intercellular粘附分子1 (ICAM-1)单克隆抗体,重组人类TNF-α(rhTNF-α)从系统研发(明尼阿波利斯,美国);老鼠从Immunovision anti-topo-I单克隆抗体,(美国美国AR);重组体人interleukin-1受体antagonist-1 (rhIL-1Ra)和可溶性肿瘤坏死因子受体我(anti-TNF-α)安进(美国博尔德有限公司);鲎变形细胞溶解产物Endochrome, multitest瓶从查尔斯河Endosafe内毒素(美国查尔斯顿,SC)。

培养条件

从前臂皮肤活检被局部麻醉下正常的个体。成纤维细胞生长在100毫米文化菜在37°C公司5%₂调湿大气与100 U DMEM /毫升青霉素,链霉素100μg /毫升、2毫米谷氨酰胺,1%的非必需氨基酸,1%与10% FCS丙酮酸钠补充,并使用从通道3 - 10所示。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

SSc血清筛查anti-topo-I Ab的存在,ELISA (QuantaLite™sci - 70, Inova诊断,圣地亚哥,美国)。总免疫球蛋白是从12 SSc纯化血清(8 AFA-positive和四个AFA-negative)和八个正常人血清(NHS)由蛋白质G-sepharose色谱(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)。检测阿发和ICAM-1成纤维细胞表面表达,我们执行一个细胞ELISA(描述11]。血清免疫球蛋白和测试在一式三份。积极控制,成纤维细胞被刺激肿瘤坏死因子(10 ng / ml)和IL-1β(50 ng / ml)。

I型胶原蛋白,金属蛋白酶- 1和TIMP-1蛋白质生产试验

成纤维细胞是镀在96孔托盘2×10⁴细胞/好,与免疫球蛋白serum-starved隔夜培养之前,或细胞因子,或中等独自一个额外的48 h中补充1% FCS 25μg /毫升l抗坏血酸,3.4μg /毫升α-ketoglutaric酸和50μg /毫升β-amino丙腈为了支持正常的胶原蛋白fibrillogenesis [21]。在需要时,IL-1Ra(2μg /毫升)和anti-TNF (10⁻⁸米)之前加了1 h IL1-β(10 ng / ml),肿瘤坏死因子(10 ng / ml)或免疫球蛋白g(300μg /毫升)。上层清液的收集和储存在−20°C到蛋白质的决心。所有实验条件都是一式三份。TIMP-1 ELISA(研发)和pro-MMP-1(结合位点,伯明翰,英国)和氨基端前肽的RIA测定I型胶原(PINP-1)(猎户座Diagnostica,埃斯波,芬兰)根据制造商的说明进行。总胶原蛋白是评估在上层清液的成纤维细胞培养24、48和72 h 100毫米菜肴与25μg /毫升DMEM补充维生素C,在缺乏FCS, Syrcol TM化验(英国Biocolor有限公司、新Townabbey)。

胶原酶测定

在I型胶原酶活性评估ELISA小腿皮肤胶原蛋白(σ)涂布7天96 -孔板,所述[22]。样本与胰蛋白酶激活100μg /毫升为20分钟37°C,将潜在的胶原酶转化为活性形式,其次是5倍过量添加大豆胰蛋白酶抑制剂(美国新泽西州沃辛顿,不动产)和测试了一式三份。型的未消化的胶原蛋白被发现我胶原蛋白小鼠单克隆抗体(美国Calbiochem拉霍亚,CA)其次是碱性phosphatase-labeled anti-mouse羊免疫球蛋白抗体(接头,西切斯特,PA,美国)。一个单位的胶原酶被定义为胶原蛋白的活性溶解1μg 1分钟。

西方墨点法

表示时报成纤维细胞无血清培养系统在不同实验条件下细胞溶解在裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂。20微克的总蛋白提取分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶electophoresis减少的条件下,electroblotted硝化纤维素膜(Hybond™ECL™Amersham法玛西亚生物技术,英国)。墨迹是孵化与抗体磷Smad 2/3 (ser) 465/467(美国细胞信号,贝弗利,MA)和β-tubulin(σ)。HRP-conjugated抗血清主要被用来揭示绑定和使用ECL系统检测到化学发光(Amersham)。

间接immunoflurescence (IIF)

真皮成纤维细胞生长在玻璃盖玻片80%融合,在无血清条件。细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下30分钟,皂素透水或不0.1%,1% BSA在PBS 30分钟,随后孵化用鼠标anti-topo-I马伯(20μg /毫升)或AFA-positive免疫球蛋白,AFA-negative免疫球蛋白或NHS免疫球蛋白(300μg /毫升)1 h,紧随其后的是反人类免疫球蛋白FITC(美国圣地亚哥Inova诊断CA)或Alexa萤石488山羊anti-mouse免疫球蛋白(分子探针,尤金,或者美国)。非特异性结合的评估测试二级抗体的绑定(反人类和anti-mouse)。幻灯片是安装在Vectashield荧光介质(向量实验室,伯林盖姆、钙、美国),和图片是使用蔡司荧光显微镜配备AxioCam彩色CCD相机。

COL1A1 mRNA水平测定,金属蛋白酶- 1,MMP-9, TIMP-1, CTGF和α-SMA

成纤维细胞总RNA,饿死在一夜之间无血清培养基和培养24,48和72 h免疫球蛋白和细胞因子,被孤立RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA),根据制造商的指示。样品均质在卡塔尔投资局碎纸机列(试剂盒)RNA隔离之前,和对待RNAse-free DNAse组(试剂盒)去除DNA在RNA净化。RNA的质量检查了安捷伦科技2100年生物分析仪(292年版本A02.12 SI)。实时定量rt - pcr测定的mRNA水平。TaqMan测定试剂(通用PCR主混合缓冲)人类金属蛋白酶- 1和引物,MMP-9, TIMP-1, CTGF,α-SMA COLA1A GADPH和18 s rRNA来自应用生物系统(福斯特城、钙、美国)。引物和探针对人类真核翻译延长因子1-α1 (EEF1A1)(向前,5′-AGCAAAAATGACCCA CCAATG-3′和反向,5′-GGCCTGGATGGTTCAGGATA-3′),和人类的转铁蛋白受体(TFRC)(向前,5′-CATTTGTGAGGGATCTGAACCA-3′和反向,5′-CGAGCAGAATACAGCCACTGTAA-3′)基因组提供的平台,NCCR遗传学前沿,日内瓦大学。GeNorm程序是用于选择两个最好的管家基因GAPDH, 18岁,EEF1A1 TFRC TBC),基于稳定响应实验治疗(23]。结果规范化的几何平均两个管家基因(EEF1A1和TFRC)。PCR是一式三份使用ABI棱镜7900 HT序列检测系统(应用生物系统)在最后一卷10μl。热循环条件如下:50°C 2分钟,50周期为10米95°C,那么95°C的15秒和60°C 1 m。互补脱氧核糖核酸合成反应没有RNA或互补脱氧核糖核酸合成反应没有逆转录酶被用作控制和放大产品的负面。

统计分析

学生的t以及用于分析两组之间的差异。单向方差分析测试(Dunnett方法)被用来评估群体之间的差异。一个P被认为具有统计显著性值≤0.05。

结果

Antifibroblast抗体识别

血清样本从20 SSc报告病人的临床特点表1和20个健康人(NHS)测试能结合人类皮肤成纤维细胞在细胞分析11]。绑定到观察成纤维细胞在8的20 SSc和所有的20名健康控制血清(表1)。AFA-positive不如AFA-negative个体免疫抑制治疗。两个八个AFA-positive低剂量强的松(< 6个月10毫克/天),而九十二AFA-negative患者低剂量强的松从6个月到7年(表1)。SSc患者免疫球蛋白纯化AFA-positive定义绑定成纤维细胞观察时,和AFA-negative时。总免疫球蛋白是由蛋白质纯化G-sepharose色谱法从八AFA-positive,四个AFA-negative和八NHS。所有八个AFA-positive免疫球蛋白g显示绑定成纤维细胞存在剂量依赖的相关性,half-maximal绑定在59.7±6.4μg /毫升的浓度;相比之下AFA-negative免疫球蛋白,NHS免疫球蛋白,一个准备商业人类免疫球蛋白(Redimune贝林AG)没有显示显著的绑定。在所有情况下,免疫球蛋白结合导致ICAM-1老年病虽然察觉绑定成纤维细胞导致缺乏ICAM-1老年病先前报道(11]。实验中执行多粘菌素B的存在给了类似的结果,和在所有免疫球蛋白制剂检测内毒素水平低于阈值(< 0.25欧盟/毫升)(数据没有显示)。

AFA-positive免疫球蛋白增强金属蛋白酶- 1生产和真皮成纤维细胞溶胶原的活动,但不是I型胶原蛋白和TIMP-1

然后我们评估是否免疫球蛋白g可能影响生产和降解ECM之间的平衡。虽然总胶原蛋白生产没有修改,成纤维细胞培养的溶胶原的活动在AFA-positive但不是AFA-negative免疫球蛋白明显增强(P< 0.05)(图1A和B)。值得注意的是,AFA-positive免疫球蛋白是强有力的10 ng / ml的TNF诱导成纤维细胞溶胶原的活动(图1B)。为了证实这些结果,我们确定的金属蛋白酶及其抑制剂TIMP-1除了i型胶原蛋白(PINP-1)由成纤维细胞暴露于免疫球蛋白制剂。一致,AFA-positive但不是AFA-negative也NHS免疫球蛋白增强剂量依赖性的方式生产金属蛋白酶- 1,而TIMP-1和PINP-1没有影响(图1碳氢键)。在300μg /毫升,AFA-positive免疫球蛋白增加了三倍金属蛋白酶- 1生产(P< 0.05)(图1F),感兴趣的,在相同的培养条件,TGF-β用作pro-fibrotic控制增强PINP-1 TIMP-1和减少金属蛋白酶- 1生产(图1C、E和G)。因此,AFA-positive免疫球蛋白专门支持ECM降解。

AFA-positive免疫球蛋白增加稳态mRNA水平的金属蛋白酶- 1,MMP-9,但不是COL1A1, CTGF,α-SMA TIMP-1

确定变化观察到蛋白质水平平行基因转录的变化,我们通过定量rt - pcr检测免疫球蛋白是否会诱发COL1A1的改变,金属蛋白酶- 1和TIMP-1 mRNA稳态水平。而金属蛋白酶- 1 mRNA显著增加了AFA-positive免疫球蛋白,峰值在24小时(图2B), COL1A1和TIMP-1没有(图2北部),也得到类似的结果污点和核糖核酸酶保护分析(数据没有显示)。在白明胶酶MMP-9 mRNA在成纤维细胞也增加了AFA-positive免疫球蛋白(图2C),而CTGF和α-SMA mRNA水平,它们存在于pro-fibrotic条件和SSc成纤维细胞过度表达,没有修改(图2D和E)。AFA-negative和NHS免疫球蛋白g并不影响基因转录的研究(图2a e)。总之,AFA-positive免疫球蛋白增加金属蛋白酶- 1的mRNA水平稳态和MMP-9,但不会影响那些与纤维化相关基因如i型胶原蛋白,TIMP-1, CTGF和α-SMA。

AFA-positive免疫球蛋白不诱导Smad 2/3磷酸化

因为有越来越多的证据表明,改变在TGF-β信号通路,特别是在Smad 2/3的水平可能导致ECM异常沉积,据报道,硬皮病成纤维细胞显示一个增强的磷酸化Smad 2/3,也没有TGF-β[9),我们测试了phospho-Smad 2/3的表达蛋白免疫印迹。AFA-positive免疫球蛋白g没有引起任何探测Smad 2/3磷酸化,TGF-β相比,作为积极的控制(图3)。这一发现与缺乏一致pro-fibrotic AFA-positive活动对成纤维细胞免疫球蛋白。

AFA-positive金属蛋白酶- 1诱导的免疫球蛋白不是由TNF和il - 1

TNF和il - 1的主要监管者炎症反应,有效诱导基质金属蛋白酶(24,25]。来测试假设AFA-positive免疫球蛋白可以诱导金属蛋白酶- 1间接诱发的自分泌il - 1、TNF的生产,AFA-positive的活性免疫球蛋白是在anti-TNF IL-1Ra和评估。虽然IL-1Ra废除金属蛋白酶- 1生产IL-1β和anti-TNF所诱导的肿瘤坏死因子(图4B),两种抑制剂的影响引起的金属蛋白酶- 1 AFA-positive免疫球蛋白(图4)。这一强烈表明AFA-positive免疫球蛋白不采取行动通过诱发自分泌il - 1、TNF的生产。

Anti-topoisomerase-I抗体不绑定到纤维母细胞表面,不诱导金属蛋白酶- 1生产

直接绑定anti-topo-I auto-Ab细胞表面的成纤维细胞,诱导单核细胞粘附和激活患者据报道SSc [12,13]。测试的可能性topo-I可能被阿发,我们筛选AFA-positive AFA-negative SSc血清anti-topo-I反应。八个八AFA-positive 12 AFA-negative血清阳性的血清和11 anti-topo-I auto-Ab (表1),从而指示的离解AFA-positive和anti-topo-I在个体的血清免疫球蛋白。我们进一步评估鼠标anti-topo-I马伯能否结合成纤维细胞细胞表面和诱导金属蛋白酶- 1生产。成纤维细胞的小鼠anti-topo-I马伯核显示荧光渗透,但未能结合完整的质膜细胞(图5板3和4)。这是来自AFA-positive截然不同的免疫球蛋白g显示核细胞内荧光渗透和表面荧光在完整的成纤维细胞(图5板2和3)。缺乏约束力anti-topo-I马伯的成纤维细胞表面的浓度100μg /毫升证实细胞ELISA(数据未显示)。而且没有ICAM-1 (图5B)和金属蛋白酶- 1 (图5C)规定在anti-topo-I马伯的存在,与AFA-positive免疫球蛋白。整体而言,这些结果表明,抗体针对topo-I不同于AFA-positive免疫球蛋白结合成纤维细胞和生物功能。

讨论

SSc的发病机理仍然知之甚少,没有统一的理论阐明了自身免疫之间的相互作用和纤维化。在这项研究中,我们解决这个问题是否自身抗体绑定成纤维细胞表面(AFA)可能诱导成纤维细胞代谢的变化影响ECM沉积。我们的数据强烈表明,阿发提高溶胶原的成纤维细胞的活动有利于金属蛋白酶- 1和MMP-9基因转录和金属蛋白酶- 1生产而不影响其生产TIMP-1和空泡包括I型胶原蛋白。此外,阿发未能诱导CTGF和α-SMA基因转录和Smad 2/3信号,目前被认为是成纤维细胞积极参与ECM沉积的标记。在寻找分子机制引发了阿发在诱导金属蛋白酶- 1,我们探讨了il - 1、TNF可能的贡献。事实上,il - 1、TNF是已知有效的诱导基质金属蛋白酶(24,25)和由AFA-activated成纤维细胞自分泌的细胞因子可以解释我们的发现。此外,虽然直接测试我们的免疫球蛋白制剂检测il - 1、TNF失败,我们不能排除污染的分钟,但生物活性,这些细胞因子。获得的结果与生物制剂能够中和il - 1、TNF,然而,事实证明,这些细胞因子并没有参与金属蛋白酶- 1生产在我们的实验。因此,这些发现表明直接阿发对成纤维细胞的影响。

我们还没有确定了自身抗原被阿。几个不同,non-ubiquitous自身抗原最近被SSc患者免疫球蛋白。感兴趣的,抗体识别fibrillin-1已被证明激活成纤维细胞和金属蛋白酶- 1基因表达是上调(15]。在方差与我们的研究结果,然而,fibrillin-1-specific免疫球蛋白也诱导胶原蛋白基因上调TGF-β-dependent的方式(15]。此外,自身抗体,PDGF-R绑定,可以激活成纤维细胞,有利于胶原蛋白沉积(16]。巨细胞病毒肽抗体cross-recognizing UL94, NAG-2,纤维母细胞表面粘附分子表达,也支持胶原蛋白合成18,19]。因此,大型面板与假定不同的特异性自身抗体,在SSc血清,似乎正在为特征,诱发各种重叠的纤维母细胞反应,这可能参与事件与SSc发病机制有关。在这个品种,anti-fibroblasts抗体富集我们通过细胞ELISA检测免疫球蛋白与主要溶胶原的活动。在这方面,有趣的是,在他们参与矩阵消化,MMP的阿发可以通过增强或抑制调节炎症引起的生物活性介质,包括细胞因子和趋化因子(26]。调制的炎症可能会影响肝纤维化的发展(27]。

一直缺乏增强胶原蛋白沉积,我们不能检测SMAD刺激成纤维细胞磷酸化阿。在初步实验中,我们观察到,阿发其他激活胞内信号通路包括MAP激酶ERK 1/2,和转录因子NF-κB AP-1。

样品我们测试了来自异构患者临床表现和不同的疾病持续时间。之前也有可能治疗影响了阿发水平。然而,免疫球蛋白的生物学活性是健壮的和一致的各种化验预制(本文和Fineschiet al。在准备,手稿)。在我们的手中,最重要的特征,预测生物活性免疫球蛋白g的容量与纤维母细胞表面细胞ELISA检测。事实上,绑定总是伴随着大量的生物活性,而没有绑定与或生物活性很低。在这方面,有趣的是,大多数免疫球蛋白anti-topo-I-positive我们测试了来自个人,但是绑定成纤维细胞没有与anti-topo-I积极性。此外,鼠标anti-topo-I马伯未能诱导金属蛋白酶- 1或ICAM-1暴露成纤维细胞,因此强烈建议anti-topo-I Ab并不直接参与纤维母细胞激活,尽管他们可能,他人建议,参与单核细胞招聘导致一连串的事件相关SSc发病机理(12,13]。

总之,我们的数据一致与其他报道表明anti-fibroblast抗体不仅可以是一个附带现象造成的损失宽容,但可能致病的相关性。因此,阿发可能参与,至少在SSc个人的一个子集,间接的事件,有利于炎症,或直接通过重组成纤维细胞基因表达,导致SSc的病理变化特点。

确认

我们感谢博士Agneta Scheja(风湿病学,大学医院,隆德,瑞典)慷慨地提供纤维母细胞细胞系来自健康人。我们感谢蒙特塞拉特小姐Alvarez熟练的技术援助,帕特里克Descombes和玛丽莲博士Docquier, NCCR前沿遗传学、基因组平台,卡耐基-梅隆,日内瓦,rt - pcr的支持。

资金:这个工作已经支持部分由格兰特31000 - 100479和310000 - 112180/1从瑞士国家科学基金会和协会Romande des Sclerodemiques。

公开声明作者宣称没有利益冲突。

引用