曲霉菌病的PCR诊断:临床注意事项及技术要点

摘要

的标准化曲霉属真菌聚合酶链式反应(PCR)技术不断发展，基于血液的分析有效性已经正式确立。仍然有必要考虑如何在实践中使用这些测试以最大限度地提高临床效用。为了确定最佳的诊断策略和对患者管理的影响，需要考虑几个因素，包括患者群体，侵袭性曲霉菌病(和其他真菌疾病)的发病率，以及当地的抗真菌处方政策。技术问题，如标本类型、取样的便便性、检测频率、检测中心的可及性和报告时间，也将影响PCR在临床实践中的使用。所有诊断测试的解释都依赖于临床情况，分子分析也不例外，但建议将其纳入曲霉属真菌PCR纳入第二次修订的定义侵袭性真菌疾病的共识指南，对分子检测的接受和理解应得到提高。

简介

欧洲曲霉属真菌聚合酶链反应倡议(EAPCRI)的形成是为了标准化曲霉属真菌聚合酶链式反应(PCR)方法，以确定准确的分析性能和临床有效性(www.eapcri.eu)．在此过程中，它允许将标准化方法纳入定义侵袭性真菌疾病(IFD)的修订指南，最终目标是改善IFD风险患者的诊断和后续管理。EAPCRI在标准化方面取得了重大进展曲霉属真菌乙二胺四乙酸(EDTA)-全血、血清和血浆的PCR检测，确定核酸提取步骤是控制最佳PCR性能的限速步骤。^{1 - 5}已经发表了一系列取决于样本类型的技术建议，但关于如何在临床实践中最好地使用这些建议和解释结果的信息有限。这篇综述将探讨在不同的临床背景下分子诊断策略的实施和结果的解释。

临床考虑

患者群体

任何检测的性能都将受到人群中疾病流行的严重影响，而对于机会性感染，如侵袭性曲霉菌病(IA)，在很大程度上取决于几个公认的危险因素的存在(表2)1)．这些包括中性粒细胞减少症、高剂量皮质类固醇治疗、移植物抗宿主病和遗传易感性。大多数研究都集中在患有恶性血液病的成年患者和那些接受有侵袭性疾病风险的造血干细胞移植的患者。其他患者群体包括患有其他恶性肿瘤、接受实体器官移植或患有需要重症监护治疗的危重疾病的患者，但这些群体的数据较为有限，儿科人群的表现数据较少。初步数据显示，两者的表现不相上下，但儿童的发病率往往低于成人。

总的来说，IA是一种罕见的感染性疾病，发病率很低，据报道在恶性血液系统疾病中低于5%。⁶然而，由危险因素的存在和研究设计决定的报告患病率范围很广。由于难以准确诊断，队列研究可能低估患病率，而基于尸检的研究可能高估疾病，因为分母已经偏向疾病。^7，8广义上，患者可分为低、中、高风险(表2)1)．必须认识到，个别患者可能会从一个风险类别转移到另一个风险类别，这取决于化疗干预的侵略性和对治疗的反应。使用霉菌主动预防，如泊沙康唑，有望显著降低某些患者组的风险。

这一策略

PCR可用于两种主要方法:第一，排除曲霉菌病;第二，诊断IA。

排除IA利用了测试的高阴性预测值。⁹根据该试验是否用于无症状患者的筛查试验，或作为发热中性粒细胞减少症患者的发热驱动方法的一部分，可以进一步细化，这可以显著减少难治性发热期间抗真菌药物的经验性使用。对于这两种方法，都需要经常进行测试。检测血液时，半乳甘露聚糖和β- d -葡聚糖的特异性均高于PCR，而PCR的敏感性较高。^3.这种敏感性赋予高的阴性预测值(NPV)，这样阴性的测试可以排除诊断。阳性表现出较好的特异性，但患病率低导致IA诊断的阳性预测价值低。人们越来越认识到PCR阳性可以反映暴露曲霉属真菌可能在疾病过程明显或其他生物标记物可检测到之前很久就呈阳性。¹⁰多种阳性结果可提高诊断效用，并可用于启动预防性治疗和触发进一步的诊断检查。⁹结合分子和血清学分析可以增强这些方法，提高特异性时，两种分析都是阳性。⁹

筛查最好只适用于高危类别的患者(表2)1)，因为定期对感染发生率较低的病人进行检测，不太可能具有成本效益。只有当结果报告的时间短到足以影响患者管理(通常小于24小时)时，筛查才可能是可行的。如果周转时间较长，特别是如果标本被送往参考中心进行检测，在某些情况下可能需要经验性治疗。在这些情况下，经验性治疗应被认为是一种保留措施，直到有结果，如果检测结果为阴性，可以停止治疗。在经验性治疗开始时或开始前应采集样本。

聚合酶链反应不应该用来排除已经在进行霉菌活性抗真菌治疗的患者的疾病，无论是作为预防还是经验性治疗(下文将进一步讨论)。这不仅是因为有效的化学预防可以降低疾病的风险，而且还因为抗真菌药物有可能将真菌负担降低到检测范围以下。

第二,曲霉属真菌在有感染体征和症状的患者中，PCR可用于诊断IA(表2)2)．在这些情况下，疾病的测试前概率已经增加。然而，目前还没有单一的生物标志物在诊断中表现出最佳的表现，PCR应与其他基于抗原的生物标志物(半乳甘露聚糖或β- d -葡聚糖)联合使用。诊断试验可应用于难治性发热性中性粒细胞减少症或非特异性临床症状(如胸膜炎性胸痛，咯血)时，并可推动预防性治疗曲霉属真菌在疾病的特定放射学征象出现之前就已感染。

该诊断方法还可以应用于具有侵袭性真菌疾病的特定放射学征象(肺结节、CT晕圈、空化病变等)的患者，通过提供致病生物的证据来确认诊断和优化靶向治疗。

此外，诊断测试可能有助于发现突破曲霉属真菌对霉菌感染患者采取主动预防或监测对治疗的反应，尽管关于这些适应症的数据很少。¹¹筛查、发烧驱动和诊断策略见图1- - - - - -2．

标本类型

EAPCRI已被验证曲霉属真菌全血清和血浆PCR检测以及支气管肺泡灌洗液(BALF)的验证工作正在进行中。脑脊液、尿液和组织标本的验证数据较少，但EAPCRI方案确定的原则和关键步骤很可能适用。

血液标本很容易获得，适用于筛查和诊断策略。全血处理是非常劳动密集型的，²使用血清或血浆在技术上要求较低，更适合常规实验室。⁴虽然与全血相比，血清的敏感性略低(但无统计学意义)，但针对游离DNA的血清假阳性较少。¹²使用血浆作为标本避免了在血栓形成过程中由于捕获而导致的游离DNA的潜在损失，并可能改善临床表现。^1，13

侵入性标本，如BAL液体和组织，应被视为诊断标本，在采取单一样本进行诊断确认时，特别是在已经开了治疗处方时，更可取于血液标本。在这里，特异性是最重要的，以便确认诊断并进行靶向治疗。元分析表明曲霉属真菌PCR检测BALF具有临床应用价值，特异性明显大于半乳甘露聚糖检测BALF。^3.，14，15

技术建议

EDTA全血曲霉菌DNA提取

从EDTA全血(WB)中提取核酸(NA)的方法如图所示3.．样本量是至关重要的，至少应使用3毫升全血。^2，5在低疾病负担(10 cfu/ml)情况下，使用2-ml和1-ml样本量与3 ml相比，检测的重复性降低≥70%，这一建议的要求是至关重要的。⁵唯一适合样本的抗凝剂是EDTA，因为肝素与抑制曲霉属真菌PCR和柠檬酸钠真空吸收剂有较高的率曲霉属真菌污染。^16，17该过程以完整细胞内的DNA为目标。冷冻样品不仅能保存游离DNA，还能帮助红细胞裂解。红细胞裂解后，使用SDS和蛋白酶K裂解白细胞颗粒，以释放任何被吞噬的真菌细胞，并释放任何可能干扰PCR扩增效率的人类DNA。人类DNA将在随后的离心步骤中大大减少。潜伏期取决于颗粒大小，这是由病人的白细胞计数驱动的。如果颗粒持续存在，可能需要增加蛋白酶K浓度或使用额外的95°C与50 mM NaOH孵育步骤。打珠是真菌细胞裂解的首选方法，比酶裂解(如重组裂解酶)更快、更便宜和更有效。如果没有打珠器，每个样品可以以最大速度旋转30秒。推荐使用罗氏MagNA Lyser陶瓷绿珠，因为它们被分配成一次性使用的比例，最大限度地减少污染风险。打珠后，在用与商业NA提取试剂盒(例如，分子级水)兼容的试剂清洗珠-样品混合物之前，必须对管进行脉冲离心。 The volume of the wash reagent should be sufficient to cover the beads but equate to a volume that is suitable for extraction by the downstream process. Washing involves 10 agitations with a pipette ensuring the tip is at the bottom of the tube so that maximal washings can be transferred to the final extraction. A range of commercial, manual, and automated extraction processes have been successfully utilized (Fig.3.)，但DNA在< 100 μl洗脱是至关重要的。

从血清和血浆中提取曲霉菌DNA

从血清和血浆中提取NA的方法如图所示4．同样，样品体积是至关重要的，至少应使用0.5 ml，体积越小，灵敏度越差(P= 0)⁴．与完全符合EAPCRI建议的方法相比，使用样本量<0.5 ml将使检测10个基因组/ml (ge/ml)的重现性降低21.1%，并且在负荷< 10 ge/ml时证实了这一差异。⁴理论上，实际可提取的样本量越大，对低负荷的检测就越好。不幸的是，在EAPCRI研究中，没有足够的体积范围来确定这个假设是否准确。¹更大样本量的使用还应与商业的，特别是自动化的NA提取系统的局限性以及可能产生更高浓度的抑制化合物相平衡。在进行NA提取时，已经成功地使用了一系列人工和自动的商业试剂盒(图2)。4)，通过将NA提取与EAPCRI建议相结合，完全标准化的协议是可行的。EAPCRI最初的调查有一个有趣的发现曲霉属真菌血清PCR检测结果显示，两种检测方法在样品和洗脱量上完全符合EAPCRI的建议，但阳性率低于标准，均由Promega (Wizard Genomic DNA和Maxwell, Madison, WI, USA)制造。⁴

与WB一样，洗脱量是关键，应<100 μl。≥100 μl洗脱NA的方法与EAPCRI兼容方法相比，10 ge/ml NA的检出率降低了37.5%(图2)。4)．

参与血清研究的各个平台的假阳性率如图所示4而且似乎分布在一系列制造商中，这表明污染可能与物理过程有关，而不是单个制造商。然而，如前所述，>50%的假阳性与使用Qiagen试剂盒有关。¹⁸

EAPCRI对血清的建议似乎同样适用于血浆，但检测血浆会避免血凝块的形成，而血凝块有可能捕获生物标志物。血浆中的某些化合物，如纤维蛋白原，可能会影响PCR性能。如果洗脱NA中存在高浓度，则会干扰MgCl₂在聚合酶链反应主混合物的浓度和阻止有效扩增。¹

其他技术考虑因素

除性能外，任何工艺的技术复杂性在实现为常规服务之前都需要考虑。毫无疑问，血清/血浆的处理技术要求比WB低，并且允许使用商业上可用的选项，消除了细胞裂解的额外步骤的需要。虽然WB可以直接通过商业试剂盒进行处理，但样品体积和打珠要求以及浓度因子(≥3 ml样品= <100 μl洗脱液)使这种方法不切实际。实际操作时间远远长于检测血清/血浆(表3.)，其复杂性意味着可靠的提取效率需要有经验的用户。使用自动化处理器和协议，减少了依赖于人力的步骤，减少了性能的可变性，并标准化了周转时间(表3.)．完全自动化的程序将增加设备成本，但这些仪器在一般分子诊断实验室中是常规的，使用这些设置可能会减轻成本压力。

PCR扩增

任何曲霉属真菌PCR检测结合DNA分离和qPCR扩增。这两个步骤必须兼容并优化敏感性和特异性。DNA分离方案是最关键的步骤，因为它可以确保目标DNA以足够的浓度用于扩增，但含有最少的抑制化合物。

PCR目标

EAPCRI进行的测试表明IA的定量PCR (qPCR)检测应该针对多拷贝基因。单拷贝基因不建议使用，因为它们不像核糖体靶标那样敏感。²最常见的靶点是18S, 28S和内部转录间隔区(ITS)，在分析特异性方面，以28S基因为靶点获得最好的结果。¹⁹qPCR检测应使用探针;这增加了成本并使设计复杂化，但这些都被检测特异性的好处所抵消。水解探针(Taqman, Foster City, CA, USA)，蝎子和杂交FRET探针都已经过测试，均表现良好。²Light-Cycler使用的杂交FRET探针可以生成熔体曲线，如果它们是由不同物种产生的，则可以用于区分阳性样品。^20.

确定PCR检测的靶点范围是很重要的。一些研究中心可能只关注单个物种，或多个相关物种，或采用泛真菌方法。泛真菌扩增后的PCR产物测序提供了鉴定的确定性，但可能比其他策略更昂贵，并可能延迟结果。针对多个物种也存在问题，EAPCRI已经对此进行了审查。¹⁹曲霉属真菌是一个多系属。一些曲霉属真菌物种之间的关系更密切青霉菌而不是其他曲霉属真菌物种。因此，不能产生一个真正的泛曲霉属真菌未扩增非目标物种的检测。然而，在多中心测试中，EAPCRI发现针对曲霉属真菌属是较好的、最可靠的检测方法答:来自烟更大的检测范围带来的好处比任何潜在的交叉反应都更显著。¹⁹

模板和测定量

有必要确定最佳模板和最终测定量。增加模板体积增加低丰度真菌DNA扩增的概率。然而，大的模板体积增加了PCR抑制剂的转移。重要的是，在确保足够的检测量的同时，最大限度地增加模板的添加量，以最大限度地减少PCR抑制剂的影响。更大的模板量可能需要更大的主混合量，并且与增加的检测量相关的财务成本，因此需要平衡。通常，使用更大的模板DNA体积可以提高性能，前提是这些分析将模板DNA体积保持在≤总分析体积的30%。^2，19

测试分析灵敏度和特异性

在任何实验室中，确定测定方法的分析灵敏度和特异性以确保适当的性能是至关重要的。检测分析灵敏度包括用真菌DNA或分生孢子检测样品(血液、血清、血浆或BAL液);该方法检验了从DNA分离到PCR扩增的整个检测方法的有效性。这确保了检测方法在相关实验室有效地发挥作用。用于评估的DNA校准器曲霉属真菌Lyon等人描述了PCR检测的性能，并且最适合用于针对血清/血浆或qPCR元件的检测。²¹校准器允许实验室之间的比较和质量控制。对于针对完整真菌细胞的分析，如全血DNA分离，可以通过QCMD或EAPCRI独立获得面板。^3.

分析特异性测试确定了目标物种的检测范围，并确定了PCR检测与非目标物种之间潜在的交叉反应。如果不对PCR产物进行测序，对常见环境真菌的扩增将很难解释PCR结果，这增加了成本和时间。

污染和控制

以pcr为基础的IA诊断策略的成功实施依赖于对污染源的有效控制和识别。研究表明，吸血器可能含有真菌DNA污染，¹⁷这就造成了某些样本类型的假阳性问题。这可以通过应用Cq截止值来解决，但由于血液中的阳性通常处于qPCR背景污染的功能极限，可能会掩盖实际的真菌感染。

自动和手动DNA分离试剂盒中的试剂此前已被发现受到真菌DNA的污染。假阳性和污染仍然是执行时的一个问题曲霉属真菌PCR和已与许多来源联系起来，包括商业提取平台。^{1，17，18，22，23}这可能是因为生产实践忽视了排除真菌污染的必要性。重要的是要确定供应商的试剂对真菌污染是阴性的。这也延伸到寡核苷酸供应商，建议通过执行量化目标的验收测试来监测由于批次变化而导致的分析性能差异。

确保的有效性曲霉属真菌PCR检测，必须包括对照。理想情况下，阴性DNA提取对照将是一个充满健康供体血液的真空容器。这将有助于确保DNA分离程序和真空吸尘器都不受污染。从长远来看，这可能是不切实际的，而且由于真空吸尘器批次的变化，很难监控。因此，一个负控制的形式，在一个管只包含提取试剂可以用来监测提取携带的污染。阳性DNA提取对照，包括供者EDTA全血加分生孢子(ca20分生孢子毫升⁻¹)或加入20个基因组等量物的供体血清/血浆曲霉属真菌DNA确保DNA分离方案在所需的水平上发挥作用。

从DNA提取，到PCR制备，再到PCR扩增，DNA分离应从制备PCR检测的单侧流动进行空间分离。PCR试剂和母品混合液应在横向流动罩中制备，该罩与添加模板DNA的地方分开。来自模板DNA或PCR扩增DNA的微气溶胶会污染实验室环境并导致假阳性结果。

内部控制(IC) PCR是必需的，可以采取加标主混合的形式来监测PCR抑制。对于全血提取，从细菌(例如，芽孢杆菌Sp .)，以监测整个提取过程的效率以及抑制作用。另外，除了抑制作用外，还可以在击珠后加入定量DNA来监测最终清理的效率。任何IC PCR的浓度都应与疑似目标相似，但可提供可重复的检测(例如，Cq: 35循环)。不建议使用人类DNA作为抑制的指标，因为在患者样本中表现出不同的浓度。考虑到血清/血浆中唯一可能的DNA来源是游离DNA (DNAemia)，那么提取方案允许在提取之前将IC目标纳入样品，从而监测每个样品的提取效率，并且在原则上消除了阳性提取控制的必要性。IC应采用定量DNA的形式，并应遵循WB概述的靶点和浓度建议。qPCR检测还应包括无模板控制(NTC)和阳性扩增控制，以确保PCR试剂清洁并符合规范。

商业分析

现在有许多商业上可用的用于IA和IFD诊断的PCR检测方法，而不是建立内部检测方法。这可以实现实验室间的标准化，缩短诊断中心的制备时间，并实现试剂的独立质量控制。产品包括MycAssay Aspergillus (Microgen Bioproducts Ltd, Camberley, UK)， AsperGenius (pathonotics, Maastricht，荷兰)，MycoReal Aspergillus (Ingenetix GmbH，维也纳，奥地利)，Affigene曲霉示踪剂(Cepheid, Rolling Meadows, IL, USA)， Bruker Fungiplex Aspergillus (Billerica, MA, USA;之前是Renishaw Fungiplex)， Aspergillus spp. Q-PCR Alert (Nanogen, Torino, Italy)和Septifast (Roche, Clifton, NJ, USA)。迄今为止，虽然这些测定方法的临床有效性(敏感性/特异性)普遍良好，但临床效用评价有限，很少有面对面的评估。^24-31具有检测与唑耐药相关标志物能力的商业PCR检测方法的发展，为培养阳性有限的疾病的管理提供了显著优势。^{24 - 26日，32}

qPCR分析

PCR扩增最少应重复进行，即使是单一的阳性复制也应被认为是潜在的重要复制。有必要对阳性结果进行定期测序，以确保分析特异性不受影响，并监测分离株的遗传漂变曲霉属真菌建议使用该方法以确保PCR检测没有被目标区域内的突变所破坏。下一代(全基因组)测序的使用也将有助于监测生物体的进化。

在扩增方面，Cq阈值为43个循环时，敏感性和特异性分别为85.6%和94.7%，阳性≤34个循环时特异性为100%。⁴然而，重要的是要记住，Cq值可能在不同的测定中有所不同。事实上，不同的实时扩增平台将使用不同的算法生成Cq值，甚至在不同平台上的相同分析也可以提供不同的Cq值。

性能比较

遵守EACPRI建议的好处已经被独立的元分析验证曲霉属真菌PCR方法检测血液标本。³³在本研究中，当使用符合EAPCRI的方法时，有提高敏感性的趋势，但特异性有显著提高。该研究的一个缺点是它没有区分测试不同血液馏分的测定，因此不可能确定用于筛选目的的最佳样本。³³

表中显示了最近三篇比较适用于血清、WB和血浆检测方法的手稿的汇总性能概述4．血浆PCR检测似乎是最佳的(诊断优势比[DOR]: 30 -超过任何其他样本的两倍)。即使在IA发病率(测试前概率)高达15%的人群中，PCR阴性也会将所有样本类型的IA发病率降低到2%(表2)4)．可预见的是，如分析研究所确定的，当将不服从的影响应用于临床表现时，所有测定都显示敏感性和在阴性时排除疾病的能力降低。这在测试WB时是最明显的。对于WB PCR阴性发生率为5-10%的典型人群，使用非依从性方法只降低了1-2%的疾病概率，因此很难反对使用经验性治疗。在特异性的基础上，没有一个单一的检测，无论是否符合，足以确认IA的诊断(表4)．在对性能数据进行整理的原始手稿中，得出的结论是，将分子检测与血清学生物标志物(GM-EIA或β- d -葡聚糖)相结合是诊断疾病的必要条件。这已经得到了系统回顾和综合分析评价的支持曲霉属真菌PCR和GM-EIA检测。^3.，34在IA动物模型中比较生物标志物测试时，一个有趣的发现是，虽然GM-EIA指数和β- d -葡聚糖浓度的增加与疾病进展相对应，但血清或WB的PCR阳性反映了暴露和提供早期感染证据的潜力。³⁵然而，该研究也证实了联合生物标志物检测的必要性。

解释标准

决策可能基于单个或多个结果。与所有可用的生物标记物一样，相对较高的假阳性结果与较低的患病率相结合，限制了预测疾病的能力，因此需要多个阳性结果或最好是不同生物标记物结果的组合来确定疾病，³⁶然而，在该时间点，单一的阴性结果可能足以排除疾病。对于PCR，一项系统综述报告的平均敏感性和特异性为80.5%(95%置信区间[CI];73.0 ~ 86.3)和78.5%(67.8 ~ 86.4)，连续两次阳性为58.0%(36.5 ~ 76.8)和96.2%(89.6 ~ 98.6)。³⁷联合试验似乎显示出最佳的临床效用，从而改善和早期诊断，减少抗真菌药物的使用(主要是经验性使用的减少)，并在一项研究中减少与真菌相关的死亡。^10，38，39由于在感染从暴露到定植再到侵袭性疾病的演变过程中可以检测到不同的标记物，因此在同一标本中同时存在不同的生物标记物并不是诊断标准的先决条件。³⁵同样，生物标记物的水平可能处于检测的极限，特别是在感染的早期阶段，标本可能间歇性呈阳性。在个体风险期间多次阳性可能比连续阳性更有用。

测试的可用性和得到结果的时间

并不是所有的中心都有在自己的机构进行检测的设施，可能需要将样本发送到参考中心。对于所有策略(筛查、发热驱动和诊断)，如果要直接影响患者管理并实现先发制人和有针对性的治疗，就需要在24-48小时内获得结果。如果没有这个周转时间，经验性抗真菌治疗仍将是难治性发热风险患者护理的一个组成部分。然而，仍应采用风险分层，如果随后发现结果为阴性，应决定停止经验性药物。⁴⁰在将样品送到其他中心进行测试时，需要考虑过境条件的影响。对于GM-EIA和β- d -葡聚糖，生物标志物目标是相对稳定的，而对于PCR样品，需要通过将样品冷冻或最好冷冻来避免降解。

抗真菌暴露的影响

据报道，无论是用于预防还是经验性治疗，使用有效的霉菌活性抗真菌药物都会降低生物标志物测定的敏感性。大部分数据都用于半乳甘露聚糖的检测，⁴¹但也有研究表明，PCR也会受到类似的影响。^42，43

使用的不同药物的范围和有效预防措施的解释阻碍了研究。霉菌活性唑包括伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑，现在还有异伏康唑，尽管只有泊沙康唑在预防曲霉菌病方面有强有力的证据基础，⁴⁴大多数三唑类药物都需要治疗监测。⁴⁵棘白素预防和脂质体两性霉素B间歇给药方案也被使用，尽管证据基础有限。

预防性抗真菌药物不太可能影响检测的真正分析敏感性和特异性，而是会将疾病发病率(因此预检测概率)降低到影响效用的水平，并阻止筛选策略的成本效益或可行性。从理论上讲，检测方法仍可用于检测突破性感染，也可用于监测对治疗的反应，但实际数据有限。抗真菌药物对不同样本类型(BALF与血液)生物标志物水平的影响研究较少，但似乎任何水平的降低都可能在循环样本中最大。

总之

欧洲和澳大利亚所取得的进展在为曲霉菌病的PCR诊断提供标准和在血液学人群中进行临床评估方面取得了长足的进展。这导致了广泛的共识，即PCR是一种有用的诊断工具，应该有助于达成共识的定义。^3.缺乏FDA推荐的检测方法限制了许多国家的临床应用。最近的指南是谨慎的，尽管他们仍然强烈推荐使用曲霉属真菌聚合酶链反应“与其他诊断测试和临床背景相结合”。⁴⁶了解临床背景仍然是关键因素，增加对这一点的理解和认识应该会使曲霉菌PCR得到更广泛的接受。

权益声明书

RAB是EAPCRI的创始成员，获得了吉利德科学和辉瑞的教育拨款和科学奖学金，是吉利德科学、默沙东、安斯泰来和辉瑞的顾问委员会和发言人局的成员，并由吉利德科学和辉瑞赞助参加国际会议。

PLW是EAPCRI的创始成员，获得了来自Bruker, Myconostica, Luminex和Renishaw diagnostics的项目资助，由Myconostica, MSD, Launch diagnostics, Bruker和Gilead Sciences赞助参加国际会议，并为Gilead Sciences提供了发言人局，并为Renishaw diagnostics Limited和Gilead Sciences提供了咨询服务。

TRR是Gilead Sciences和Basilea的顾问委员会成员。他还获得了辉瑞爱尔兰医疗保健公司、MSD爱尔兰公司和吉利德科学公司的讲课费和差旅费。

JL是EAPCRI的创始成员，获得了辉瑞公司的教育拨款和科学奖学金，并由安斯泰来赞助参加国际会议。

JPD是EAPCRI的创始成员，曾获得Astellas, Gliead, MSD和辉瑞的资助，为吉利德，辉瑞和Viamet提供咨询，并获得吉利德，MSD，辉瑞和Basilea的讲座酬金。COM和MC:没有冲突声明。

参考文献