洛匹那韦/利托那韦或干扰素-β1b治疗改善了普通狨猴非人灵长类模型中MERS-CoV感染的结局

摘要

冠状病毒多次跨越物种壁垒，造成具有重大社会经济影响的流行病[1］．中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)是2012年发现的一种新的人畜共患谱系C β冠状病毒[2］．人类MERS- cov感染，简称MERS，通常表现为严重急性呼吸道疾病，常伴有急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭[3.，4］．中东呼吸综合征比严重急性呼吸系统综合症(萨斯)的临床恶化和死亡发生得很快，而且早几天[3.］．中东呼吸综合征的病死率是所有人类冠状病毒感染中最高的，超过35% [3.，5］．有效的抗病毒治疗，特别是早期给予有发展为严重疾病风险的患者，可能改善中东呼吸综合征的临床结果。一些新的药物化合物，如针对MERS-CoV刺突糖蛋白S1亚基受体结合结构域的人源化或人源单克隆抗体和针对MERS-CoV刺突糖蛋白S2亚基七tad重复2结构域的抗病毒肽，最近已被开发出来，并在体外显示出强大的抗MERS-CoV活性[6- - - - - -9］．然而，它们的发展仍处于临床前阶段。另一个可能的治疗方案是恢复期血浆治疗。这种方法以前曾用于治疗其他严重的病毒性呼吸道感染，包括SARS和大流行性流感，具有良好的临床和病毒学反应[10- - - - - -12］．然而，这也不是现成的，因为它的制备需要招募大量的恢复期患者与高血清抗体滴度。在非典型肺炎的体外和动物实验中观察到，具有低血清抗体滴度的恢复期血浆可能与免疫增强有关，这可能导致结果恶化[13，14］．

为了在这些新型药物和恢复期血浆疗法可用之前找到立即可用的中东呼吸综合征治疗方法，我们和其他人应用了高通量筛查来识别可能被重新用于治疗中东呼吸综合征患者的现有药物[15- - - - - -17］．使用这种药物发现方法鉴定的药物实例包括病毒进入抑制剂、网格蛋白介导的内吞作用、神经递质、雌激素受体、激酶信号、脂质代谢、蛋白质加工和DNA合成/修复[3.，15- - - - - -19］．尽管它们都表现出体外抗中东呼吸综合征冠状病毒活性，但只有少数可能与临床相关，因为大多数要么与严重不良反应相关，要么具有抗中东呼吸综合征冠状病毒半最大有效浓度(EC₅₀)在临床上无法达到治疗剂量。先前的研究已经确定霉酚酸酯(MMF)、利巴韦林、洛匹那韦、干扰素-α和干扰素-β作为进一步体内评估的潜在候选物[15- - - - - -17，20.］．用利巴韦林和干扰素-α治疗已在体外和感染MERS- cov的轻度疾病恒河猴身上显示出一些效果，但对MERS患者的益处不明显[20.- - - - - -22］．在这项研究中，我们评估了MMF、洛匹那韦和干扰素-β对mers - cov感染的普通绒猴的治疗效果。这种最近描述的非人灵长类动物模型是中东呼吸综合征所有现有动物模型中最能代表严重人类疾病的动物模型[3.，23］．重要的是，我们发现洛匹那韦/利托那韦和干扰素-β1b，而不是MMF，改善了mers - cov感染的普通绒猴的结局。这些发现为未来对这种高致命性疾病进行临床试验提供了基础。

方法

病毒株和滴定

MERS-CoV (EMC/2012株)由Ron Fouchier (Erasmus Medical Center)提供。病毒在添加10%胎牛血清和100单位/mL青霉素+ 100µg/mL链霉素的杜尔贝科改良Eagle's培养基(DMEM)中VeroE6细胞(ATCC)中繁殖。如前所述，所有涉及中东呼吸综合征冠状病毒活体实验均遵循生物安全3级设施批准的标准操作程序[24- - - - - -28］．50%组织培养感染剂量(TCID₅₀)在VeroE6细胞中检测MERS-CoV，如前所述[25］．

绒猴常见感染模型及治疗

所有涉及普通绒猴的实验均按先前所述进行，并经机构动物护理及使用委员会批准[ 23， 26， 29］．简而言之，12只健康雄性绒猴(Callithrix jacchus；3岁;230 ~ 395 g)用5 × 10接种⁶TCID₅₀500 μ L DMEM气管内注射MERS-CoV ( 图1)．以非盲法将动物随机分配到4个治疗组中的1组( 表1)．每个治疗组3只动物。他们接受假手术治疗，MMF (CellCept, Roche Pharmaceuticals, Inc)，洛匹那韦/利托那韦(4:1)(Kaletra, Abbot Laboratories)，或重组干扰素-β1b (Betaferon, Bayer Schering Pharma, Germany)，使用先前描述的剂量[ 30.- - - - - - 32］．我们分别采用了MMF腹腔注射和干扰素-β1b皮下注射，而不是静脉注射或口服，因为普通狨猴的小静脉阻止了通过静脉途径可靠的药物输送，而且因为重症MERS患者通常需要肠外治疗。洛匹那韦/利托那韦仅用于口服制剂。我们在接种后8小时(hpi)开始使用MMF和干扰素-β1b治疗，根据先前描述的使用mers - cov感染的恒河猕猴的治疗模型[ 21］．洛匹那韦/利托那韦治疗始于6 hpi，因为与MMF和干扰素-β1b相比，洛匹那韦/利托那韦需要更长的时间才能达到其峰值血清浓度(Cmax)。每天对动物进行两次临床体征观察，并使用先前描述的临床评分系统进行评分，其中包括总体外观、皮肤和皮毛外观、分泌物(口腔、鼻腔和/或眼部)、呼吸频率和食物摄入量[ 23］．本研究中的其他临床检查包括测量体温(每天两次)和体重(0、24和72 hpi)，以及采集血液进行血液学测试(0 hpi和尸检)。如前所述，对麻醉动物(0、24和72 hpi)进行背腹侧胸x光片(CXR) [ 29］．如前所述，在72 hpi或临床评分≥35时安排尸检[ 21， 23］．收集坏死组织进行组织病理学、免疫组织化学和病毒载量研究。

表1。

本研究中使用的治疗组和药物方案

集团．	常见的绒猴．	治疗方案．
1	U1 u2 u3	未经治疗(假手术治疗与对照组相当 无菌生理盐水每公斤体重容积)
2	M1 m2 m3	CellCept (25mg /kg MMF给予ip一次，8 hpi)
3.	K1 k2 k3	Kaletra(洛匹那韦12 mg/kg/天+利托那韦3 mg/kg/天 每天口服一次，在6、30和54个小时)
4	B1 b2 b3	β aferon(0.267万IU/kg干扰素-β1b 给定sc在8 hpi和56 hpi时)

集团．	常见的绒猴．	治疗方案．
1	U1 u2 u3	未经治疗(假手术治疗与对照组相当 无菌生理盐水每公斤体重容积)
2	M1 m2 m3	CellCept (25mg /kg MMF给予ip一次，8 hpi)
3.	K1 k2 k3	Kaletra(洛匹那韦12 mg/kg/天+利托那韦3 mg/kg/天 每天口服一次，在6、30和54个小时)
4	B1 b2 b3	β aferon(0.267万IU/kg干扰素-β1b 给定sc在8 hpi和56 hpi时)

缩写:hpi，接种后数小时;ip,腹腔内;MMF，霉酚酸酯;sc,皮下。

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表1。

本研究中使用的治疗组和药物方案

集团．	常见的绒猴．	治疗方案．
1	U1 u2 u3	未经治疗(假手术治疗与对照组相当 无菌生理盐水每公斤体重容积)
2	M1 m2 m3	CellCept (25mg /kg MMF给予ip一次，8 hpi)
3.	K1 k2 k3	Kaletra(洛匹那韦12 mg/kg/天+利托那韦3 mg/kg/天 每天口服一次，在6、30和54个小时)
4	B1 b2 b3	β aferon(0.267万IU/kg干扰素-β1b 给定sc在8 hpi和56 hpi时)

集团．	常见的绒猴．	治疗方案．
1	U1 u2 u3	未经治疗(假手术治疗与对照组相当 无菌生理盐水每公斤体重容积)
2	M1 m2 m3	CellCept (25mg /kg MMF给予ip一次，8 hpi)
3.	K1 k2 k3	Kaletra(洛匹那韦12 mg/kg/天+利托那韦3 mg/kg/天 每天口服一次，在6、30和54个小时)
4	B1 b2 b3	β aferon(0.267万IU/kg干扰素-β1b 给定sc在8 hpi和56 hpi时)

缩写:hpi，接种后数小时;ip,腹腔内;MMF，霉酚酸酯;sc,皮下。

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图1所示。

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普通绒猴MERS-CoV接种、检查、治疗及尸检时间表^一个K3在24 hpi麻醉时意外死亡，这可能与麻醉过程有关，因为普通狨猴非常小且脆弱。缩写:hpi，接种后数小时;中东呼吸综合征冠状病毒;MMF，霉酚酸酯。

组织病理学和免疫组化

将坏死组织切片用苏木精和伊红染色进行光镜检查，并在4℃下用小鼠抗MERS-CoV核衣壳蛋白抗体(1:200)免疫组织化学染色过夜，以免疫荧光检查MERS-CoV核衣壳蛋白的表达，如前所述[27，29，33］．

病毒载量研究

如前所述，对坏死的肺、肾、肝、脾和心脏组织进行RNA提取和定量实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) [25- - - - - -27］．从每个解剖器官中获得三个宏观病变最严重的区域，用于病毒载量研究。简单地说，总RNA和病毒RNA分别使用Trizol (Life Technologies)和viral RNA Mini kit (QIAGEN)分离。RNA定量后，用随机六聚体将1µg RNA逆转录为互补DNA (cDNA)。采用新型冠状病毒2012 Real-Time RT-PCR法(CDC;目录# KT0136)。用引物5′- gctcactggcatggccttccgctgttga -3′(GAPDH)和5′- cccctgaatgcggctaatcc -3′和5′- ACACGGACACCCAAAGTAGT -3′(肠病毒71)将病毒RNA归一化至甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和刺入对照肠道病毒71 (SZ/ HK08-5)的信使RNA表达水平。对于每个反应，将等量的cDNA与FS Universal SYBR Green Master Rox (Roche)混合，再加上5 pmol正向和反向引物。在7900 real-time PCR检测系统(ABI)中，在95℃15秒、60℃1分钟的条件下扩增55个循环。

统计分析

由学生进行不同组间的统计比较t测试使用GraphPad Prism 6。一个P值<。05was considered statistically significant.

结果

临床和放射学结果

在接种MERS-CoV后不久，未经治疗和接受mmf治疗的动物出现了严重的疾病，呼吸频率增加，运动减少，食欲不振。在12 hpi时，未经治疗和mmf治疗的动物的平均临床评分均为18.3 ( 图2)．它们的平均临床评分在36 hpi时达到峰值，此时2只未经治疗(U2和U3)和2只接受mmf治疗(M1和M2)的动物出现严重的呼吸困难伴发绀，几乎不活动，并有带血的口腔分泌物。当临床评分超过35时，他们在36 hpi时被安乐死。被安乐死的动物在尸检时体温严重过低(≤34.5°C)，这提示有严重疾病伴休克( 补充数据)．这4只动物在尸检前的CXR显示双侧间质浸润，这表明广泛的肺炎( 图4 一个而且 图4 B)．其余未经治疗(U1)和mmf治疗(M3)的动物存活，但仍有严重症状，临床评分≥15 ( 图2)和温度≤37.5°C(低于基线水平)，在剩余的研究期间( 补充数据)．24hpi和72hpi的CXR显示双侧肺基底间质浸润(数据未显示)。在24 hpi时，未处理和mmf处理的动物体重分别下降了9.0%和9.3% ( 图3)．在72 hpi时，其余未处理和mmf处理的动物体重减轻分别增加到15.0%和12.9%。相比之下，洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组的动物都没有出现严重症状。然而，1只洛匹那韦/利托那韦治疗(K3)的动物在麻醉24 hpi时意外死亡，这可能与麻醉程序有关，因为普通狨猴非常小且脆弱。由于我们无法获得在研究中添加另一只动物的伦理批准，因此在24 hpi后只评估了K1和K2。在36 hpi时，未治疗组和mmf治疗组的总死亡率为67%，洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组的总死亡率为0%-33%。洛匹那韦/利托那韦治疗动物的平均临床评分在24 hpi达到峰值，并逐渐改善，而干扰素-β1b治疗动物的平均临床评分在36 hpi达到峰值，然后改善( 图2)．在整个研究过程中，它们的平均临床得分始终低于未处理(50.9%-95.0%)和mmf处理(50.9%-93.3%)的动物。他们的体温趋势与临床评分密切相关，最低温度出现在36 hpi左右，随后在72 hpi恢复到基线水平( 补充数据)．在24 hpi时，洛匹那韦/利托那韦治疗的动物有一些体重减轻(6.0%)，显著低于未治疗的动物(P= .038) ( 图3)．在72 hpi时，减重略有增加，达到7.5%。干扰素-β1b处理的动物在24和72 hpi时体重也分别轻微减轻了7.9%和8.7%。洛匹那韦/利托那韦治疗的动物CXR外观基本正常，而干扰素-β1b治疗的动物在24和72 hpi时仅出现轻度基底间质浸润( 图4 C而且 图4 D)．4个治疗组在0 hpi和尸检时获得的平均白细胞、红细胞和血小板计数没有明显差异(数据未显示)。然而，其他时间点的变化可能被忽视了，因为动物的小体积阻止了连续和频繁的采血[ 23］．

图2。

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感染mers - cov的普通狨猴接种病毒后不同时间点的平均临床评分。普通绒猴的尸检安排在72 hpi或临床评分≥35时进行。在每个时间点上，条形图上方表示实验中剩余的动物数量。学生t当每组3只动物均可食用时，进行试验比较。^一个K3在24 hpi麻醉时意外死亡，这可能与麻醉过程有关，因为普通狨猴非常小且脆弱。缩写:hpi，接种后数小时;中东呼吸综合征冠状病毒;MMF，霉酚酸酯。

图3。

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感染mers - cov的普通绒猴体重的连续测量。与0 hpi时的基线体重相比，24和72 hpi时体重减轻的平均百分比。在每个时间点上，条形图上方表示实验中剩余的动物数量。^一个K3在24 hpi麻醉时意外死亡，这可能与麻醉过程有关，因为普通狨猴非常小且脆弱。＊P< . 05。缩写:hpi，接种后数小时;中东呼吸综合征冠状病毒;MMF，霉酚酸酯。

图4。

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感染中东呼吸综合征冠状病毒的普通绒猴肺部的代表性放射学表现和宏观病理。在尸检前立即进行胸部背侧-腹侧x线检查。圆圈代表间质浸润区域，提示肺炎。箭头表示肺坏死的大体病变。一个，未经处理的普通绒猴(U2)在36 hpi。B， mmf处理的普通绒猴(M2)在36 hpi。C，洛匹那韦/利托那韦治疗的普通绒猴(K1) 72 hpi。D，干扰素-β1b处理普通绒猴(B2) 72 hpi。缩写:D，背侧;现病史;小时postinoculation;L，左边;中东呼吸综合征冠状病毒;MMF，霉酚酸酯。

组织病理学和免疫组化

宏观上看，未经治疗和mmf治疗的动物的坏死肺显示广泛的多叶出血病变。肺部僵硬，充满液体，有液体漏出( 图4 一个而且 图4 B)．相比之下，洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组坏死肺的大体病变局限于1-2个叶( 图4 C而且 图4 D)．与洛匹那韦/利托那韦治疗动物的轻微症状和正常CXR结果相印证，它们肺部的肉眼病变是最轻微的。显微镜下，未经治疗和mmf治疗的动物的肺坏死显示严重的、多灶性到合并性急性支气管间质性肺炎( 图5 一个而且 图5 C)．肺泡被大量炎症细胞浸润，以巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞为主。肺泡间质增厚，可见水肿、纤维蛋白和出血。免疫组化染色检测到大量MERS-CoV核衣壳蛋白表达( 图5 B而且 图5 D)．相反，洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组的肺坏死表现为局限于1-2叶的轻度至中度支气管间质性肺炎，伴少量炎症细胞浸润、水肿和出血( 图5 E而且 图5 G)．免疫组化染色显示少量和局灶性MERS-CoV核衣壳蛋白表达( 图5 F而且 图5 H)．4个治疗组肺外组织的组织病理学变化相似，被认为是与低氧损伤相关的非特异性变化，或如所述的普通绒猴的偶然发现(数据未显示)[ 23］．

图5。

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感染中东呼吸综合征冠状病毒的普通绒猴肺组织坏死的组织病理学检查和免疫组化染色的代表性显微照片。重症急性支气管间质性肺炎，以终支细支气管为中心，未治疗者的坏死肺组织苏木精、伊红(H&E)染色，肺泡间质增厚，肺泡内充斥大量炎症细胞浸润、水肿、出血(一个)及mmf处理(C)动物在36 hpi(放大100倍)下采集。小鼠抗MERS-CoV核衣壳蛋白(1:200)抗体(绿色)和碘化丙啶反染色(红色)在未处理的小鼠坏死肺组织中检测到大量的MERS-CoV核衣壳蛋白表达。B)及mmf处理(D)动物(放大，100倍)。这些病理变化广泛地出现在未治疗和mmf治疗的动物的坏死肺的多个叶。轻度急性支气管间质性肺炎，少量炎症细胞浸润，经h&e染色的洛匹那韦/利托那韦治疗的肺组织坏死组织学结构保留(E)动物在72 hpi(放大100倍)下采集。轻至中度急性支气管间质性肺炎，h&e染色肺坏死组织中有中度炎症细胞浸润和出血，干扰素β1b治疗(G)动物在72 hpi(放大100倍)下采集。在洛匹那韦/利托那韦治疗(F)和干扰素-β1b处理(H)动物(放大，100倍)。这些病理改变仅在洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组坏死肺的1-2叶内可见。h&e染色的肺组织坏死(我)(放大100倍)无MERS-CoV核衣壳蛋白表达(J)没有感染的对照动物。缩写:现病史;小时postinoculation;中东呼吸综合征冠状病毒;MMF，霉酚酸酯。

病毒载量研究

坏死肺的平均病毒载量在mmf治疗的动物中最高，在洛匹那韦/利托那韦治疗的动物中最低( 图6)．mmf处理动物坏死肺的平均病毒载量为0.44 log₁₀拷贝/GAPDH高于未处理动物。洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组坏死肺的平均病毒载量显著低于未治疗组1.06 (P= .036)和0.59 (P= .048) log₁₀分别/ GAPDH副本。mmf处理的动物肾脏、肝脏和脾脏的平均病毒载量也最高，为0.15-0.54 log₁₀拷贝数/GAPDH高于未处理动物。而洛匹那韦/利托那韦治疗组和干扰素-β1b治疗组的肺外组织平均病毒载量均较未治疗组降低0.11 ~ 1.29 log₁₀/ GAPDH副本。接受洛匹那韦/利托那韦治疗的动物死后肾脏组织的平均病毒载量显著低于未接受治疗的动物0.90 log₁₀拷贝/ GAPDH (P= .032)。值得注意的是，3只干扰素-β1b处理的动物中，有2只在坏死肾组织中未检测到病毒载量，尽管有0.90 log，但标准差值较大，明显没有统计学意义上的差异₁₀拷贝数/GAPDH减少，与未处理动物相比。

图6。

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感染mers - cov的普通绒猴尸检时不同组织的平均病毒载量及标准差值。＊P< . 05。^一个干扰素-β1b处理的3只动物中有2只在坏死肾组织中未检测到病毒载量，与未处理动物的平均病毒载量相比标准偏差值较大，差异无统计学意义。缩写:GAPDH，甘油醛3-磷酸脱氢酶;中东呼吸综合征冠状病毒;MMF，霉酚酸酯。

讨论

与新出现病毒引起的大多数其他流行病一样，新型抗中东呼吸综合征冠状病毒药物的从头开发落后于中东呼吸综合征流行病的迅速蔓延[3.］．韩国最近发生的涉及180多名感染者和5000多名密切接触者的大型卫生保健相关疫情再次强调，迫切需要找到有效的抗中东呼吸综合征冠状病毒治疗方法。药物再利用是一种特别有利的方法，因为再利用的药物通常具有众所周知的药代动力学、药效学、副作用和给药方案。这些数据将有助于重度中东呼吸综合征患者的药物使用，这些患者通常有合并症或伴有多器官功能障碍。然而，在过去3年里，缺乏合适的动物模型一直是评估MERS对策的主要障碍。BALB/c小鼠、叙利亚仓鼠和雪貂不易感染中东呼吸综合征冠状病毒，而感染中东呼吸综合征冠状病毒的恒河猕猴只会出现非常轻微的自限性疾病[3.，21，34- - - - - -36］．鼻内注射编码人二肽基肽酶-4 (DPP4)受体的腺病毒载体已被用于转导BALB/c和C57BL/6小鼠，并使其对MERS-CoV感染易感[37］．利用该动物模型，证明了聚肌苷-聚胞苷酸和含有抗mers - cov刺突糖蛋白抗体的血清样本过过性转移在加速肺部病毒清除方面的治疗作用[37］．然而，感染相对较轻，局限于呼吸道。具有更严重的肺部和弥散性肺外疾病的dpp4转基因小鼠模型肯定更好，但它仍然不是非人灵长类动物模型[38］．最近，研究人员建立了普通绒猴模型，模拟严重的播散性MERS-CoV人类感染[23］．这是首次报道使用这种新的非人灵长类动物模型来评估用于中东呼吸综合征的药物的治疗效果。

与MERS常见绒猴模型原始描述中的发现一致，我们研究中未经处理的动物在接种MERS- cov后出现严重疾病[23］．相比之下，我们未经治疗的动物出现症状和死亡的时间略早于Falzarano报告中描述的[23］．这可能与动物的不同年龄有关(我们的研究，3年;Falzarano的研究，2-6年)和病毒接种途径。而不是联合鼻内(8 × 10⁵TCID₅₀)，气管内(2 × 10⁶TCID₅₀)，结膜(4 × 10⁵TCID₅₀)、口服(2 × 10⁶TCID₅₀)接种(总接种量:5.2 × 10⁶TCID₅₀)，采用气管内接种(5 × 10⁶TCID₅₀)，这可能导致病毒更直接地传递到下呼吸道，疾病发作速度更快。尽管如此，我们未经治疗的动物的总体临床、放射学、病理学和病毒学结果与前面描述的相似，并模拟了人类严重的MERS。

我们之前已经证明了MMF的体外抗mers - cov活性[15］．然而，到目前为止，MMF的免疫抑制作用限制了它在MERS患者中的使用。与利巴韦林相比，MMF表现出更低的EC，利巴韦林对MERS患者的疗效尚不确定₅₀(MMF, 0.17µg/mL;利巴韦林，10-40µg/mL)，在常规临床剂量下明显低于其峰值血清水平(10-50µg/mL) [15］．因此，假设低免疫抑制剂量的MMF可用于治疗中东呼吸综合征。我们的灵长类动物研究表明，单剂量具有较长半衰期的MMF并不能改善普通狨猴的MERS-CoV感染，而且可能会恶化。这可能部分解释了为什么使用MMF的肾移植受者仍会出现严重或致命的中东呼吸综合征[39，40］．

洛匹那韦是一种蛋白酶抑制剂，可抑制MERS-CoV的3c样蛋白酶，调节人细胞凋亡[17，41］．Kaletra是一种利托那韦增强的洛匹那韦制剂，通常用作抗人类免疫缺陷病毒药物。洛匹那韦与EC具有抗mers - cov活性₅₀8.0µM，低于单次口服500 mg Kaletra (400 mg洛匹那韦/100 mg利托那韦)后达到的Cmax [17，42］．我们之前已经证明了洛匹那韦/利托那韦在SARS患者体内的治疗效果。与接受利巴韦林治疗21天的对照组SARS患者相比，另外接受洛匹那韦/利托那韦500 mg每日2次，持续14天的患者病情较轻，腹泻、发烧复发、淋巴细胞减少、医院感染、鼻咽病毒载量、粪便RT-PCR阳性率和21天不良结局[43］．大多数患者对洛匹那韦/利托那韦短期疗程耐受良好，但也有部分患者出现胃肠不适、肝功能紊乱、头痛、视力模糊、贫血和无症状心动过缓[43］．一名中东呼吸综合征患者接受洛匹那韦-利托那韦、聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合治疗2天后病毒血症消失[44］．我们目前的研究表明，洛匹那韦/利托那韦治疗改善了mers - cov感染的普通绒猴的临床、放射学和病理特征。洛匹那韦/利托那韦治疗的动物在尸检时肺和大多数肺外组织中平均病毒载量最低。这些发现为重度MERS患者使用洛匹那韦/利托那韦提供了进一步的支持。

MERS-CoV减弱干扰素反应以逃避宿主的先天免疫系统[45］．在体外，MERS-CoV对聚乙二醇干扰素-α的敏感性是SARS-CoV的50-100倍[46］．因此，在体外和少量患者中考虑和评估了用干扰素治疗MERS。在Vero/Vero6细胞中，干扰素-β1b (Betaferon)表现出较低的EC₅₀:Cmax比干扰素-α2a， -α2b， -β1a [15，47］．这可能部分解释了为什么干扰素-α2a、-α2b和-β1a对一小群MERS患者生存率的治疗效果不明显[22，48- - - - - -50］．在这项研究中，我们发现，与未治疗的动物相比，使用干扰素-β1b治疗的感染mers - cov的普通绒猴的疾病较轻，死皮肺和肺外组织的平均病毒载量较低。值得注意的是，由于洛匹那韦/利托那韦治疗动物和干扰素-β1b治疗动物的病变局限于1-2个叶，这些动物与未治疗动物之间的总体平均病毒载量差异可能被低估了。干扰素-β1b常用于治疗多发性硬化症患者，通常耐受性良好[32］．使用干扰素-β1b治疗的单克隆性γ病患者很少会出现全身毛细血管渗漏综合征[32］．其他不常见的副作用包括过敏、胰腺炎、抑郁、细胞减少、心肌病、肝脏和甲状腺功能障碍[32］．鉴于干扰素-β1b良好的安全性，以及我们的体外和体内实验结果，应考虑在无干扰素治疗禁忌症的MERS患者的临床试验中使用它。

我们没有评估2种或2种以上药物联合治疗的效果，因为很难获得使用更多灵长类动物的批准。尽管如此，这项非人灵长类动物研究的发现对于使用单一疗法或与这些重新用途的药物联合治疗的MERS患者进行临床试验是令人鼓舞的。在体内抗mers - cov的作用以及洛匹那韦/利托那韦与干扰素-β1b之间缺乏药物相互作用使其成为未来临床试验中一个有吸引力的组合。相比之下，目前尚不确定干扰素-β1b和/或洛匹那韦/利托那韦与低剂量MMF的组合是否可以提供更好的病毒载量抑制，以克服后者药物的有害影响。值得注意的是，MMF和干扰素-β1b联合在体外对MERS-CoV的抑制中表现出协同作用[15］．如果这种组合在普通狨猴中被证明有效，它可能成为对干扰素-β1b和/或洛匹那韦/利托那韦不耐受的患者的替代治疗选择。其他可能有效的治疗方案，如利巴韦林联合干扰素-β1b和/或洛匹那韦/利托那韦也应在普通绒猴模型中进行评估。虽然高剂量利巴韦林的使用受到其严重副作用的限制，但低剂量利巴韦林联合干扰素-β1b和/或洛匹那韦/利托那韦可能具有协同作用，仍应考虑使用。最后，中东呼吸综合征患者从症状出现到死亡的中位时间间隔比SARS患者短，这强调了早期使用这些抗病毒组合治疗中东呼吸综合征的重要性。这是因为MERS-CoV不仅抑制了宿主固有的干扰素反应，还通过感染CD3有效抑制了适应性免疫反应⁺高比例外周血和脾淋巴细胞通过内源性和外源性途径诱导淋巴细胞凋亡[26］．因此，在疾病早期未能控制中东呼吸综合征冠状病毒复制可能导致适应性免疫反应受损，结果较差。

笔记

致谢感谢朱华和徐彦峰的技术支持。

财政支持。本研究由呼吸道病毒研究基金会有限公司捐赠;荣智健;惠会周先兰慈善基金有限公司;及普罗维登斯基金有限公司，以纪念已故吕学明博士;以及由卫生署加强新发传染病实验室监察顾问服务、香港卫生及医学研究基金拨款(14131392);香港研究资助局(N_HKU728/14);香港特别行政区研究资助局主题研究计划(T11/707/15);国家传染病科技重大专项(2012ZX10004501-004)。资金来源在研究设计中没有作用;数据的收集、分析或解释; or writing of the report.

潜在的利益冲突。所有作者:无冲突报告。

所有作者都提交了ICMJE潜在利益冲突披露表。编辑认为与稿件内容相关的冲突已被披露。

参考文献

作者指出