嗜碱细胞扩张防止侵入性肺炎球菌病的老鼠

文摘

链球菌引起的肺炎是最常见的病原体引起社区获得性肺炎(CAP)。帽是经常向侵入性肺炎球菌病(IPD), 10%的死亡率-30% (1]。据世界卫生组织统计,大约有160万人,特别是儿童< 5岁,每年死于肺炎球菌病和IPD,主要在发展中国家(2,3]。世界范围内的传播耐药克隆的肺炎链球菌一起观察,尽管适当的抗生素治疗,死亡率由于帽仍然很高,特别感兴趣的发展出现了普遍适用的和负担得起的预防策略。到目前为止,两个不同的肺炎球菌疫苗被批准:23-valent多糖疫苗和13-valent结合疫苗(4,5]。尽管共轭疫苗的使用大大有助于降低死亡率在小儿肺炎球菌感染,临床数据证明疫苗血清型替代增加了nonvaccine种血清型,从而提高重要的未来的问题使用共轭疫苗(6]。此外,因为只有一部分> 90种不同的肺炎链球菌血清型是由当前可用的预防策略,迫切需要有一个疫苗接种方法,优化,提供保护所有的肺炎链球菌血清型。特别是,肺炎链球菌蛋白质疫苗使用的所有已知的血清型肺炎球菌抗原表达肺炎链球菌已成为目前多糖或共轭疫苗的合理选择。肺炎链球菌表面蛋白(PspA)表达的几乎所有临床肺炎链球菌隔离,也已经有了很广泛的研究对肺炎球菌感染其防护性能。PspA小鼠的免疫原性,PspA-specific抗体已被证明增加补充细菌细胞表面的沉积,使其保护作用[7]。尽管PspA是一种不同的蛋白,它显示了可交叉反应的和cross-protective属性(8,9]。事实上,PspA免疫接种是预防鼻肺炎链球菌马车、焦肺炎和IPD小鼠(10]。此外,在与重组PspA 1期临床试验,显示安全性和免疫原性的蛋白质在人类中,从接种疫苗和抗血清孤立的个人保护小鼠免受肺炎球菌感染(11]。在一起,这些发现让PspA未来有价值的候选人蛋白质疫苗接种方法。

嗜碱粒细胞是最丰富的粒细胞人口,创作< 1%的粒细胞血液、脾和骨髓。他们贡献过敏反应和寄生虫感染主要由高亲和性FcεRI-receptor FcεRI-bound时被激活的免疫球蛋白E抗原(IgE)交联,导致的后续版本的促炎介质和白细胞介素的颗粒12,13]。

我们发现之前消耗的嗜碱粒细胞前二次PspA免疫导致显著降低PspA-specific抗体滴度和减少致命IPD小鼠后生存14),从而支持观点,嗜碱粒细胞作为细胞免疫佐剂增强辅助存储器完整蛋白质抗原的免疫反应。另一方面,它没有被检查是否嗜碱细胞计数的短暂扩张前二次PspA免疫将进一步提高对IPD小鼠保护性免疫。因此,我们确定实验是否增加嗜碱细胞池大小引起的白细胞介素3 (IL-3)复杂的预处理或收养嗜碱细胞输血会进一步提高PspA protein-dependent免疫功效在老鼠和保护小鼠免受致命的IPD。

方法

老鼠

野生型(WT) C57BL / 6 n(女,8周大)老鼠从查尔斯河购买。CD45.1-alloantigen表达B6.SJL -Ptprca老鼠从杰克逊购买。B6; 129 s4 -Fcgr2b^tm1Ttk/ J (FcγRIIB-KO)老鼠请Gessner教授提供的汉诺威医学院。动物实验都是由当地政府机关批准的汉诺威医学院和下萨克森州政府为保护消费者和食品安全办公室。

研究设计

如前所述(生成重组PspA生产33]。0天,老鼠收到主要免疫接种10µg PspA腹腔内无佐剂。25天后,老鼠收到二次免疫接种20µg PspA /鼠标。嗜碱细胞池大小的扩张前二次免疫是通过两种不同的实验方法。在一个方法中,小鼠腹腔内注射治疗的小鼠IL-3重组或IL-3 anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)中所描述的补充数据。控制老鼠收到车辆(磷酸盐(PBS) / 0.1%人类血清白蛋白)。在其他方法中,老鼠接受静脉输血PspA-reactive嗜碱粒细胞或FcγRIIB-blocked PspA-reactive嗜碱粒细胞收集从IL-3C-pretreated小鼠骨髓和脾脏,所述辅助方法。二次免疫后表示时间点PspA-specific抗体滴度,细胞因子水平和浆细胞数量测定中所描述的补充数据。与血清型感染实验,小鼠挑战orotracheally 3肺炎链球菌(A66.1)制备基本上如前所述[14]。除非另有说明,3×10⁶6×10⁶菌落(cfu)的A66.1慢慢灌输给50μL PBS的总量,如前所述[34]。

在选定的实验中,小鼠腹腔内注射被动免疫的合用抗血清收集从之前PspA-immunized老鼠。因为PspA-immunized老鼠已经保护IPD的高度,我们被动免疫小鼠的应用仅10µL汇集的抗血清,允许存活率差异组织的有效监控。两个小时后被动免疫,老鼠与挑战肺炎链球菌在3×10⁶4×10⁶cfu /鼠标。后肺炎链球菌感染,老鼠每天监测为菌血症和生存发展。试剂信息,流仪分析,染色的细胞,体外cfu决心,刺激细胞的补充数据。

统计分析

数据表示为平均数±标准差。利用SPSS软件计算了显著差异(IBM)。对于≥2的对比组,克鲁斯卡尔-沃利斯检验,Mann-Whitney一起U测试使用。生存分析是使用生存率较相比。两组之间的显著差异被认为P值< . 05。

结果

IL-3和IL-3C治疗在血液嗜碱细胞计数,脾和骨髓的老鼠

在最初的实验中,我们分析了影响IL-3在血液嗜碱细胞计数,脾、和治疗组小鼠的骨髓IL-3 3、5或7天连续。嗜碱粒细胞被封闭的根据他们的前进,边撒特征(P1, 补充数据),其次是subgating CD117^负的排除细胞肥大细胞(P2, 补充数据)。随后,嗜碱粒细胞作为一种独特的识别,CD49b^pos,FcɛRI^pos人口(P3, 补充数据)。在基线条件下,嗜碱粒细胞约占0.4%,0.1%,和0.6%的总白细胞血液、脾和骨髓。IL-3治疗3天明显增加脾和骨髓嗜碱细胞数量而不是血( 图1 一个- - - - - -C),进一步显著增加观察到所有器官系统观察天治疗后5 - 7。在此基础上观察,当治疗小鼠IL-3包裹着anti-IL-3抗体(IL-3C) 5天,我们观察到显著的嗜碱细胞计数增加血液、脾和骨髓,相比之下,汽车或IL-3治疗方案( 图1 D)。Fluorescence-activated细胞嗜碱细胞计数排序分析显示大约100倍的血液和脾脏和骨髓嗜碱细胞数量大约30倍的IL-3C治疗小鼠,与基线条件( 图1 E- - - - - -G)。符合一个以前的报告 15),略和无意义的肥大细胞数量的增加在腹膜灌洗和骨髓的老鼠IL-3C治疗5天后(数据没有显示)。

图1所示。

打开新标签 下载幻灯片

嗜碱细胞数量的确定血液、脾和骨髓的老鼠接受白介素3 (IL-3)或IL-3 anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)。一个- - - - - -C小鼠治疗3、5或7天连续与IL-3 (200 ng腹腔内/鼠标每天2次)。控制老鼠收到车辆(磷酸盐(PBS) / 0.1%人类血清白蛋白)各自的时间。随后,嗜碱细胞在血池大小(一个)、脾(B)和骨髓(C)使用流仪分析量化。D- - - - - -G嗜碱细胞数的比较分析小鼠IL-3或IL-3C治疗5天后。D,代表点块流仪嗜碱细胞分析。Subgating根据CD49b FcɛRI细胞表面表达描述车辆(PBS) IL-3和IL-3C-treated老鼠。嗜碱细胞总数显示血(E)、脾(F)和骨髓(G)。中的数据一个- - - - - -C和E- - - - - -G显示为平均数±标准差。在面板数据得了来自3 - 7小鼠和代表2个独立的实验。所示的实验板E- - - - - -G进行了3次,和数据是为9 - 12每个治疗组小鼠。*P< . 05,* *P< . 01和* * *P<措施表示显著增加,而接受pbs老鼠。^{+ +}P< . 01和^{+ + +}P<措施表示显著增加,相比之下,3天(B)或5天(E- - - - - -G)IL-3治疗。

图1所示。

打开新标签 下载幻灯片

嗜碱细胞数量的确定血液、脾和骨髓的老鼠接受白介素3 (IL-3)或IL-3 anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)。一个- - - - - -C小鼠治疗3、5或7天连续与IL-3 (200 ng腹腔内/鼠标每天2次)。控制老鼠收到车辆(磷酸盐(PBS) / 0.1%人类血清白蛋白)各自的时间。随后,嗜碱细胞在血池大小(一个)、脾(B)和骨髓(C)使用流仪分析量化。D- - - - - -G嗜碱细胞数的比较分析小鼠IL-3或IL-3C治疗5天后。D,代表点块流仪嗜碱细胞分析。Subgating根据CD49b FcɛRI细胞表面表达描述车辆(PBS) IL-3和IL-3C-treated老鼠。嗜碱细胞总数显示血(E)、脾(F)和骨髓(G)。中的数据一个- - - - - -C和E- - - - - -G显示为平均数±标准差。在面板数据得了来自3 - 7小鼠和代表2个独立的实验。所示的实验板E- - - - - -G进行了3次,和数据是为9 - 12每个治疗组小鼠。*P< . 05,* *P< . 01和* * *P<措施表示显著增加,而接受pbs老鼠。^{+ +}P< . 01和^{+ + +}P<措施表示显著增加,相比之下,3天(B)或5天(E- - - - - -G)IL-3治疗。

IL-3效果——或者IL-3C-Elicited嗜碱细胞计数增加PspA-Specific抗体滴度

我们下一个检查是否扩大嗜碱细胞计数将导致PspA增强适应性免疫反应。因此,老鼠受到主要PspA免疫0天,紧随其后的是二次免疫接种PspA 25天。嗜碱细胞扩张实现了在老鼠IL-3或IL-3C管理主PspA免疫后从19到23天。随后,老鼠被允许休息2天前二次免疫与PspA中概述 图2 一个。所示 图2 B- - - - - -D,IL-3C治疗小鼠显著升高PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1)和IgG2a抗体滴度在等离子体5和10天与PspA引发刺激后,而IL-3-treated老鼠反应显著提高免疫球蛋白M和无意义的高架PspA-specific IgG1和IgG2a二级PspA免疫抗体滴度。没有PspA免疫,所有老鼠死于肺炎球菌挑战72小时内。然而,IL-3C治疗,虽然提供anti-PspA抗体滴度升高,未能保护PspA-immunized老鼠对IPD ( 图2 E)。

图2。

打开新标签 下载幻灯片

肺炎链球菌表面蛋白(PspA)特殊抗体滴度和生存分析小鼠受到PspA免疫和预处理与白介素3 (IL-3)或IL-3 anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)。一个实验研究设计PspA免疫和IL-3 IL-3C-elicited嗜碱细胞在小鼠的扩张。最初小鼠免疫PspA 0天然后磷酸盐处理(PBS;黑条),IL-3(白酒吧),或IL-3C二级PspA免疫之前(冲酒吧)。五天(30天)和10天(每天35)二次免疫后,PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1;B)和IgG2a (C)和免疫球蛋白M (IgM;D)抗体滴度测定。生存分析中,老鼠也接受PBS(黑线),IL-3(虚线),或IL-3C二级PspA免疫前(虚线)。之前没有收到PspA免疫控制老鼠链球菌引起的肺炎感染(虚线,虚线)。所有老鼠都orotracheally感染肺炎链球菌10天之后引发刺激,生存是监控为14天。抗体滴度提出了均值±SD从2独立进行实验(n = 5 - 8每治疗组小鼠)。*P< . 05和* *P< . 01,相比之下,接受pbs老鼠。生存分析曲线作为比例每治疗组10只小鼠中生存。

图2。

打开新标签 下载幻灯片

肺炎链球菌表面蛋白(PspA)特殊抗体滴度和生存分析小鼠受到PspA免疫和预处理与白介素3 (IL-3)或IL-3 anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)。一个实验研究设计PspA免疫和IL-3 IL-3C-elicited嗜碱细胞在小鼠的扩张。最初小鼠免疫PspA 0天然后磷酸盐处理(PBS;黑条),IL-3(白酒吧),或IL-3C二级PspA免疫之前(冲酒吧)。五天(30天)和10天(每天35)二次免疫后,PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1;B)和IgG2a (C)和免疫球蛋白M (IgM;D)抗体滴度测定。生存分析中,老鼠也接受PBS(黑线),IL-3(虚线),或IL-3C二级PspA免疫前(虚线)。之前没有收到PspA免疫控制老鼠链球菌引起的肺炎感染(虚线,虚线)。所有老鼠都orotracheally感染肺炎链球菌10天之后引发刺激,生存是监控为14天。抗体滴度提出了均值±SD从2独立进行实验(n = 5 - 8每治疗组小鼠)。*P< . 05和* *P< . 01,相比之下,接受pbs老鼠。生存分析曲线作为比例每治疗组10只小鼠中生存。

被动免疫接种效果PspA-Specific抗血清对菌血症和老鼠的生存挑战肺炎链球菌

在第二组实验中,我们旨在确定被动免疫与抗血清IL-3C-treated老鼠将保护天真的老鼠对菌血症,改善他们的生存与入侵后致命的挑战肺炎链球菌。所示 图3 一个和 3 B,天真的老鼠与肺炎双球菌感染导致菌血症100%感染后的第二天,感染后的第三天100%的死亡率。相比之下,天真的小鼠被动免疫与抗血清从接受pbs PspA-immunized老鼠表现出无意义的延迟菌血症诱导和死亡率10天的观察期间( 图3 一个)。然而,重要的是,被动免疫天真的小鼠抗血清从IL-3C-treated PspA-immunized老鼠完全保护小鼠免受致命的肺炎球菌挑战前4天感染( 图3 一个和 3 B)。在这个实验组中,我们观察到显著降低菌血症诱导40%的存活率提高的50%,与此同时在为期10天的观察期间,与两对照组相比。在一起,天真的被动免疫小鼠的抗血清IL-3C-treated老鼠施加重大致命剂量的保护的挑战肺炎链球菌。

图3。

打开新标签 下载幻灯片

生存和菌血症小鼠被动免疫治疗与抗血清收集鼠白介素3 (IL-3)多元anti-IL-3抗体(IL-3C)或磷酸盐。小鼠被动免疫与肺炎链球菌表面蛋白(PspA)特殊抗血清与PspA-specific IL-3C-treated老鼠(虚线)或从接受pbs小鼠抗血清(虚线)。控制老鼠收到任何被动免疫(黑线)。随后,所有老鼠orotracheally感染链球菌引起的肺炎和生存(一个)和菌血症(B13天)监控。生存和菌血症分析提出了老鼠生存的百分比或开发菌血症每个治疗组小鼠(n = 6 - 9)。P< . 01表示老鼠收到IL-3C-treated小鼠抗血清之间的显著差异,而老鼠收到接受pbs小鼠的抗血清。

图3。

打开新标签 下载幻灯片

生存和菌血症小鼠被动免疫治疗与抗血清收集鼠白介素3 (IL-3)多元anti-IL-3抗体(IL-3C)或磷酸盐。小鼠被动免疫与肺炎链球菌表面蛋白(PspA)特殊抗血清与PspA-specific IL-3C-treated老鼠(虚线)或从接受pbs小鼠抗血清(虚线)。控制老鼠收到任何被动免疫(黑线)。随后,所有老鼠orotracheally感染链球菌引起的肺炎和生存(一个)和菌血症(B13天)监控。生存和菌血症分析提出了老鼠生存的百分比或开发菌血症每个治疗组小鼠(n = 6 - 9)。P< . 01表示老鼠收到IL-3C-treated小鼠抗血清之间的显著差异,而老鼠收到接受pbs小鼠的抗血清。

PspA-Reactive Flow-Sorted嗜碱粒细胞反应与辅助2型(Th2)细胞因子释放和PspA-Specific刺激抗体复合物

基于发现IL-3C治疗PspA-immunized老鼠,虽然提供改进的保护肺炎链球菌在被动免疫的实验中,在IPD的模型是无效的,我们下一个检查嗜碱细胞过继转移是否会带来改善保护PspA-immunized老鼠入侵肺炎链球菌。为了防止他们的激活,嗜碱粒细胞被纯化IL-3C-treated小鼠的脾脏和骨髓高速流分类。闸门的嗜碱粒细胞是根据他们的前进,边撒特征(P1, 补充数据),其次是分层subgating CD49b^高,CD11b^低(P2), CD49b^高,CD117^负的人口(P3) ( 16]。Flow-sorted细胞(纯度> 96%)与ige染色阳性( 图4 一个)和anti-FcεRI(数据没有显示)和被发现表现出典型的嗜碱细胞形态( 17在Pappenheim-stained cytocentrifuge准备( 图4 B)。这样flow-sorted嗜碱粒细胞孵化与anti-PspA抗血清产生PspA-reactive嗜碱粒细胞强烈彩色正面PspA-fluorescein异硫氰酸酯(FITC),确认分类细胞嗜碱粒细胞表示。

图4。

打开新标签 下载幻灯片

流分类,α-pneumococcal表面蛋白(PspA)抗体绑定,在体外激活,和嗜碱粒细胞的过继转移。一个和B,描述flow-sorted细胞嗜碱粒细胞是由积极的免疫球蛋白E (IgE;一个)和Pappenheim (B)染色的细胞分类。C,骨髓和脾嗜碱粒细胞孵化PspA-specific抗血清(α-PspA)和绑定的PspA-specific抗体染色嗜碱细胞表面进一步验证的分类与荧光素细胞isothiocyanate-conjugated PspA。D和E嗜碱粒细胞排序,不及时治疗或与PspA孵化,α-PspA或PspAα-PspA体外。24小时后,上层清液的收集,游离和白介素4 (il - 4;D)和白介素6 (il - 6;E)水平测定。作为一个积极的控制、嗜碱粒细胞与α-FcεRI抗体MAR-1孵化。F、嗜碱粒细胞CD45.1^pos供体小鼠白介素处理3 (IL-3) anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)流分类并通过尾静脉注入CD45.2过继转移^pos收件人老鼠。24小时输血后,血液、脾和骨髓嗜碱粒细胞CD45.1受体小鼠进行了分析^pos嗜碱粒细胞。代表点情节从接受者老鼠所示。门根据FcɛRI CD49b, CD117是描述的方法。抗体阳性染色的封闭的细胞CD45.1验证供者型嗜碱粒细胞。细胞因子水平面板D和E介绍了n = 5 - 6决定的平均数±标准差。星号表示统计上显著的差异从所有其他组织。缩写:FITC,异硫氰酸荧光素。

图4。

打开新标签 下载幻灯片

流分类,α-pneumococcal表面蛋白(PspA)抗体绑定,在体外激活,和嗜碱粒细胞的过继转移。一个和B,描述flow-sorted细胞嗜碱粒细胞是由积极的免疫球蛋白E (IgE;一个)和Pappenheim (B)染色的细胞分类。C,骨髓和脾嗜碱粒细胞孵化PspA-specific抗血清(α-PspA)和绑定的PspA-specific抗体染色嗜碱细胞表面进一步验证的分类与荧光素细胞isothiocyanate-conjugated PspA。D和E嗜碱粒细胞排序,不及时治疗或与PspA孵化,α-PspA或PspAα-PspA体外。24小时后,上层清液的收集,游离和白介素4 (il - 4;D)和白介素6 (il - 6;E)水平测定。作为一个积极的控制、嗜碱粒细胞与α-FcεRI抗体MAR-1孵化。F、嗜碱粒细胞CD45.1^pos供体小鼠白介素处理3 (IL-3) anti-IL-3抗体复合体(IL-3C)流分类并通过尾静脉注入CD45.2过继转移^pos收件人老鼠。24小时输血后,血液、脾和骨髓嗜碱粒细胞CD45.1受体小鼠进行了分析^pos嗜碱粒细胞。代表点情节从接受者老鼠所示。门根据FcɛRI CD49b, CD117是描述的方法。抗体阳性染色的封闭的细胞CD45.1验证供者型嗜碱粒细胞。细胞因子水平面板D和E介绍了n = 5 - 6决定的平均数±标准差。星号表示统计上显著的差异从所有其他组织。缩写:FITC,异硫氰酸荧光素。

我们下一个质疑flow-sorted嗜碱粒细胞会回应PspA抗原抗体复合物和Th2细胞因子释放体外刺激。所示图4D和4E与纯化,PspA-reactive嗜碱粒细胞孵化24小时PspA表现出显著增加释放白介素4 (il - 4)和白介素6 (il - 6)在细胞培养上清液,而flow-sorted嗜碱粒细胞治疗PspA或α-PspA只有没有回应这样的细胞因子释放(图4D和4E)。这些数据表明,flow-sorted嗜碱粒细胞应对PspA antibody-antigen复合物与il - 4和il - 6的分泌细胞因子释放出体外。

最后,评估的命运过继转移PspA-reactive体内嗜碱粒细胞,嗜碱粒细胞从IL-3C-treated CD45.1 alloantigen-expressing供体老鼠流分类和随后收养输血到CD45.2 alloantigen-expressing接受者老鼠。所示图4F嗜碱细胞转移后24小时,CD45.1^pos,CD49b^pos施滞血中嗜碱粒细胞(图4F)、脾脏和骨髓CD45.2(数据未显示)^pos收件人老鼠。

影响的过继转移PspA-Reactive嗜碱粒细胞PspA二级自适应免疫反应

我们下一个质疑的嗜碱细胞池大小通过过继转移增加PspA-reactive嗜碱粒细胞将改善在受体小鼠体液免疫反应和生存与侵入性的挑战肺炎链球菌。因此,flow-sorted PspA-reactive嗜碱粒细胞PspA引发刺激(之前被立即输血到老鼠 图5 一个)。重要的是,3×10的输血⁵嗜碱粒细胞显著增加IgG1抗体滴度在受体小鼠血浆,与控制老鼠相比,二次PspA免疫7和10天后,这是进一步强调1×10的输血⁶PspA-reactive嗜碱粒细胞( 图5 B)。相比之下,没有IgG2a抗体滴度的差异观察实验群体之间(数据没有显示)。

图5。

打开新标签 下载幻灯片

嗜碱细胞过继转移的影响在继发肺炎链球菌表面蛋白(PspA)免疫PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1)浓度、细胞因子白介素6 (il - 6)的水平,浆细胞和小鼠骨髓嗜碱粒细胞。一个实验研究设计PspA免疫辅助PspA免疫前和嗜碱细胞过继转移。总共3×10⁵(黑条)或1×10⁶(冲酒吧)flow-sorted PspA-reactive嗜碱粒细胞被过继转移到PspA-immunized老鼠前1小时二级PspA免疫。控制老鼠重振PspA但是没有收到一个过继转移的嗜碱粒细胞(白色的酒吧)。十二小时后引发刺激,il - 6水平上层的脾匀浆测定(C)。七天(32)和二次免疫后10天(35天)天,PspA-specific IgG1抗体滴度(B)测定。在39天,PspA-specific浆细胞(D)和嗜碱粒细胞(E)分析骨髓细胞的染色PspA-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)。il - 6水平,提出了抗体滴度,和浆细胞的平均数±标准差值9到16每治疗组小鼠从3独立进行实验。*P< . 05和* * *P<措施,而控制。

图5。

打开新标签 下载幻灯片

嗜碱细胞过继转移的影响在继发肺炎链球菌表面蛋白(PspA)免疫PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1)浓度、细胞因子白介素6 (il - 6)的水平,浆细胞和小鼠骨髓嗜碱粒细胞。一个实验研究设计PspA免疫辅助PspA免疫前和嗜碱细胞过继转移。总共3×10⁵(黑条)或1×10⁶(冲酒吧)flow-sorted PspA-reactive嗜碱粒细胞被过继转移到PspA-immunized老鼠前1小时二级PspA免疫。控制老鼠重振PspA但是没有收到一个过继转移的嗜碱粒细胞(白色的酒吧)。十二小时后引发刺激,il - 6水平上层的脾匀浆测定(C)。七天(32)和二次免疫后10天(35天)天,PspA-specific IgG1抗体滴度(B)测定。在39天,PspA-specific浆细胞(D)和嗜碱粒细胞(E)分析骨髓细胞的染色PspA-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)。il - 6水平,提出了抗体滴度,和浆细胞的平均数±标准差值9到16每治疗组小鼠从3独立进行实验。*P< . 05和* * *P<措施,而控制。

因为脾嗜碱粒细胞是已知的主要来源il - 6后重新与抗原(14),我们下一个分析是否过继转移PspA-reactive嗜碱粒细胞也会触发免疫小鼠细胞因子反应增加。的确,上层清液从游离脾脏basophil-transfused匀浆,PspA-immunized老鼠收集12小时后引发刺激了il - 6浓度显著高于non-basophil-transfused, PspA-immunized老鼠(图5C)。此外,老鼠接受输血的3×10⁵或1×10⁶嗜碱粒细胞约2-3-fold展出更多的比non-basophil-transfused PspA-specific浆细胞,PspA-immunized控制老鼠,根据细胞内染色与PspA-FITC骨髓细胞(图5D)。此外,我们发现骨髓嗜碱粒细胞分析引发刺激后14天仍能够绑定PspA-FITC (图5E)。总的来说,这些数据表明,嗜碱细胞过继转移导致大幅增加二级体液完好的记忆反应蛋白质抗原对小鼠肺炎球菌。

嗜碱细胞输血效果与侵入性小鼠的生存挑战肺炎链球菌

有显示过继转移PspA-reactive嗜碱粒细胞增加小鼠的体液免疫反应对PspA触发,我们下一个检查嗜碱细胞输血的功效保护小鼠免受侵入性肺炎球菌感染。组的小鼠或没有收到PspA-reactive嗜碱细胞输血前二次PspA免疫被感染后10天引发刺激PspA入侵肺炎链球菌。所示 图6 一个PspA-immunized小鼠与正常嗜碱细胞计数显示,大约40% - -50%的生存在12天的观察期,而老鼠身上PspA-reactive嗜碱粒细胞表现出显著提高80%的生存挑战与肺炎双球菌( 图6 一个)。重要的是,只有12%的basophil-transfused发达菌血症小鼠观察期间,与之相比,大约有40%的菌血症诱导PspA-only免疫小鼠表现出正常的嗜碱细胞计数( 图6 B)。Basophil-transfused老鼠还演示了显著降低细菌菌落的支气管肺泡灌洗液体相对于non-basophil-transfused, PspA-immunized老鼠( 图6 C)。验证观察改善生存的确是嗜碱的依赖,在控制输血实验中,相同准备flow-sorted嗜酸性粒细胞输血到PspA-immunized接受者老鼠随后被质疑肺炎链球菌。然而,嗜曙红细胞输血改善生存和菌血症PspA-immunized小鼠观察期间( 图6 D和 6 E)。这些数据提供了证据表明,扩大嗜碱细胞池大小大幅提高体液记忆反应PspA通过提升PspA-specific抗体滴度,从而发挥对小鼠的生存受到IPD主要保护作用。

图6。

打开新标签 下载幻灯片

嗜碱细胞过继转移效应与嗜酸性粒细胞转移生存,菌血症,细菌负荷小鼠的挑战链球菌引起的肺炎。总共2×10⁵3×10⁵flow-sorted,肺炎链球菌表面蛋白(PspA)活性嗜碱粒细胞或同样治疗嗜酸性粒细胞输血到老鼠PspA-immunized前1小时二级PspA免疫所示图5一个。控制老鼠免疫PspA但没有收到一个细胞过继转移。所有小鼠气管内的感染4×10⁶6×10⁶菌落(cfu)肺炎链球菌在10天之后引发刺激(35),和生存(一个和D)和菌血症(B和E)监测在14天的观察期。cfu在支气管肺泡灌洗(BAL)测定在天在感染后1和2 (C)。细菌菌落呈现为12 - 13平均数±标准差每个时间点和治疗组小鼠从3独立完成实验,在实验面板而生存和菌血症一个和B在16个监控每治疗组小鼠2独立进行实验。在面板生存和菌血症D和E代表9每个治疗组小鼠。实验重复了2次得到了类似的结果。*P< . 05,与对照组相比。

图6。

打开新标签 下载幻灯片

嗜碱细胞过继转移效应与嗜酸性粒细胞转移生存,菌血症,细菌负荷小鼠的挑战链球菌引起的肺炎。总共2×10⁵3×10⁵flow-sorted,肺炎链球菌表面蛋白(PspA)活性嗜碱粒细胞或同样治疗嗜酸性粒细胞输血到老鼠PspA-immunized前1小时二级PspA免疫所示图5一个。控制老鼠免疫PspA但没有收到一个细胞过继转移。所有小鼠气管内的感染4×10⁶6×10⁶菌落(cfu)肺炎链球菌在10天之后引发刺激(35),和生存(一个和D)和菌血症(B和E)监测在14天的观察期。cfu在支气管肺泡灌洗(BAL)测定在天在感染后1和2 (C)。细菌菌落呈现为12 - 13平均数±标准差每个时间点和治疗组小鼠从3独立完成实验,在实验面板而生存和菌血症一个和B在16个监控每治疗组小鼠2独立进行实验。在面板生存和菌血症D和E代表9每个治疗组小鼠。实验重复了2次得到了类似的结果。*P< . 05,与对照组相比。

影响Basophil-Directed FcγRIIB封锁Basophil-Mediated PspA-Specific被动免疫后抗体滴度和生存的老鼠,肺炎链球菌感染

Cassard等最近的报告表明,老鼠和人类嗜碱粒细胞表现出抑制FcγRIIB表达在细胞表面的 18),导致减毒的参与免疫球蛋白,IgE-induced嗜碱粒细胞激活反应。同样,FcγRIIB-KO老鼠表现出更高的免疫接种后免疫球蛋白水平显示( 19]。因此,我们研究了什么影响FcγRIIB不足或封锁对PspA免疫功效。FcγRIIB-KO老鼠对二级PspA免疫与高架PspA-specific IgG1 IgG2a抗体滴度,与WT小鼠相比 图7 一个和 7 B)。这些研究结果的基础上,我们下一个检查是否封锁FcγRIIB嗜碱粒细胞在输血前到老鼠收件人将另外增强basophil-mediated继发性免疫反应。事实上,anti-FcγRIIB-F (ab)₂经过不同嗜碱粒细胞孵化与anti-PspA抗血清反应显著增加il - 4和il - 6发布体外,与正常相比PspA-reactive嗜碱粒细胞( 图7 C和 7 D)。沿着这条线,过继转移anti-FcγRIIB-F (ab)_{2 -}嗜碱粒细胞预处理到老鼠PspA-immunized显著增加PspA-specific IgG1 IgG2a抗体滴度在受体小鼠,而老鼠接受输血和PspA-reactive只嗜碱粒细胞(即没有以前anti-FcγRIIB-F (ab)₂孵化; 图7 E和 7 F)。重要的是,被动免疫天真的小鼠的抗血清PspA-immunized老鼠收到一个FcγRIIB-blocked输血,PspA-reactive嗜碱粒细胞表现出显著降低菌血症,从而改善生存与侵入性肺炎双球菌的挑战后,相对于小鼠接受单输血PspA-reactive嗜碱粒细胞没有以前FcγRIIB封锁( 图7 E和 7 F)。总的来说,这些数据表明,细胞表面的封锁FcγRIIB嗜碱粒细胞进一步强调其作为增强剂对PspA体液免疫反应,从而此外改善抗菌阻力对IPD的老鼠。

图7。

打开新标签 下载幻灯片

FcγRIIB不足或封锁对细胞因子释放的影响和肺炎链球菌表面蛋白(PspA)特殊抗体滴度及其对被动免疫的小鼠的影响与挑战链球菌引起的肺炎。小鼠免疫与PspA根据所示的疫苗接种计划图5答:一个和B,PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1;一个)和IgG2a (B)抗体滴度测定在野生型小鼠(WT)(白色的酒吧)和FcγRIIB-knockout (KO)小鼠(黑条)(32天)7天,10天(每天35),二次免疫后14天(39)。C和D,PspA-reactive嗜碱粒细胞使用α-FcγRIIB-F (ab)₂或不及时治疗。随后,PspA补充说,24小时后白介素4 (il - 4;C)和白介素6 (il - 6;D)在文化上层的细胞因子水平测定。E和F、FcγRIIB-blocked PspA-reactive嗜碱粒细胞被过继转移到PspA-immunized老鼠(黑条)。控制3×10的老鼠收到过继转移⁵PspA-reactive嗜碱粒细胞(白色的酒吧)。PspA-specific IgG1 (E)和IgG2a (F32)抗体滴度测定在天,35岁和39。G和H小鼠被动免疫,汇集PspA-specific抗血清收集32天从PspA-immunized老鼠收到过继转移PspA-reactive嗜碱粒细胞(黑线)或从老鼠身上收集FcγRIIB-blocked, PspA-reactive嗜碱粒细胞(虚线)。随后,老鼠感染肺炎链球菌和生存(G)和菌血症(H)监测在12天的观察期。抗体滴度提出了均值±10到16 SD (一个和B)或14日至15日(E和F每治疗组)小鼠。细胞因子水平均数±6决定。所示的实验板一个和B重复了两次,而实验面板所示C和D重复3次。生存和菌血症监控在10每治疗组小鼠。这个实验重复了2次得到了类似的结果P< . 05,* *P< . 01和* * *P<措施治疗组之间的差异。

图7。

打开新标签 下载幻灯片

FcγRIIB不足或封锁对细胞因子释放的影响和肺炎链球菌表面蛋白(PspA)特殊抗体滴度及其对被动免疫的小鼠的影响与挑战链球菌引起的肺炎。小鼠免疫与PspA根据所示的疫苗接种计划图5答:一个和B,PspA-specific免疫球蛋白G1 (IgG1;一个)和IgG2a (B)抗体滴度测定在野生型小鼠(WT)(白色的酒吧)和FcγRIIB-knockout (KO)小鼠(黑条)(32天)7天,10天(每天35),二次免疫后14天(39)。C和D,PspA-reactive嗜碱粒细胞使用α-FcγRIIB-F (ab)₂或不及时治疗。随后,PspA补充说,24小时后白介素4 (il - 4;C)和白介素6 (il - 6;D)在文化上层的细胞因子水平测定。E和F、FcγRIIB-blocked PspA-reactive嗜碱粒细胞被过继转移到PspA-immunized老鼠(黑条)。控制3×10的老鼠收到过继转移⁵PspA-reactive嗜碱粒细胞(白色的酒吧)。PspA-specific IgG1 (E)和IgG2a (F32)抗体滴度测定在天,35岁和39。G和H小鼠被动免疫,汇集PspA-specific抗血清收集32天从PspA-immunized老鼠收到过继转移PspA-reactive嗜碱粒细胞(黑线)或从老鼠身上收集FcγRIIB-blocked, PspA-reactive嗜碱粒细胞(虚线)。随后,老鼠感染肺炎链球菌和生存(G)和菌血症(H)监测在12天的观察期。抗体滴度提出了均值±10到16 SD (一个和B)或14日至15日(E和F每治疗组)小鼠。细胞因子水平均数±6决定。所示的实验板一个和B重复了两次,而实验面板所示C和D重复3次。生存和菌血症监控在10每治疗组小鼠。这个实验重复了2次得到了类似的结果P< . 05,* *P< . 01和* * *P<措施治疗组之间的差异。

讨论

先前的报道从我们组和其他人瓦解嗜碱粒细胞作为细胞免疫佐剂的作用在辅助体液免疫反应对完整蛋白质抗原(14]。使用两种不同的实验方法,我们表明,扩大池大小的抗原嗜碱粒细胞显著增强二次体液记忆反应virulence-associated肺炎球菌蛋白。特别是,嗜碱细胞过继转移但不是生长因子依赖扩张嗜碱细胞计数被发现老鼠从致命的IPD中解救出来后与高度致命的挑战肺炎链球菌。这些保护作用是另外增加的抑制FcγRIIB封锁嗜碱粒细胞在输血前到接受者的老鼠。目前建立了一个新的视角研究从而提高未来蛋白质疫苗接种预防人类IPD的功效。

之前我们之前显示消耗的嗜碱粒细胞PspA引发刺激导致显著降低抗原抗体滴度,过继转移antigen-reactive嗜碱粒细胞为天真的老鼠被发现增强记忆反应infection-unrelated allophycocyanin蛋白用于研究[14]。然而,报告没有地址的功能,实验结果扩大嗜碱细胞池大小对结果的致命细菌的小鼠肺部感染模型。目前的研究表明,IL-3——或者IL-3C-elicited嗜碱细胞计数升高引发明显高于PspA-specific抗体滴度在小鼠接种肺炎球菌virulence-associated PspA。这些数据是第一个表明增加数量的嗜碱粒细胞通过生长因子治疗小鼠大幅增加内存对肺炎链球菌蛋白质的反应。从PspA-immunized此外,小鼠被动免疫与抗血清,IL-3C-treated小鼠相应证明大大提高生存,与老鼠收到PspA-immunized抗血清相比,vehicle-treated老鼠。IL-3C-treated, PspA-immunized老鼠不免受致命的肺炎球菌的挑战,我们认为最有可能的是由于长期IL-3治疗方案,这在某种程度上也增加了数量的其他粒细胞子集(数据未显示)已知反应激活和增强脱粒IL-3治疗(20.,21]。

作为第二种方法增加小鼠嗜碱细胞计数,我们过继转移PspA-reactive嗜碱粒细胞前二级PspA免疫。重要的是,PspA-reactive嗜碱粒细胞不仅释放了大量的il - 4和il - 6在体外,最有可能在一个Fc-receptor-dependent方式(14),但他们的转移也引发了il - 6水平明显高于在受体小鼠脾脏,连同显著增加PspA-specific IgG1滴度。这些数据表明,PspA能够触发增加Th2细胞因子(il - 4和il - 6)释放antigen-reactive嗜碱粒细胞,增加细胞因子反应的抗原嗜碱粒细胞数量进一步增加,这是必不可少的B-cell-dependent抗体反应(14),我们认为的主要作用是增加il - 4和il - 6在当前的模型系统。

的角色Th1和Th2反应保护性免疫力肺炎链球菌是有争议的。IgG2a,这主要是与Th1反应,被认为有最高的诱导能力补充肺炎球菌表面沉积,表明Th1-biased对肺炎双球菌(免疫反应更有效22- - - - - -25]。相反,IgG1抗体由Th2细胞和细胞因子il - 4反应被证明各PspA IgG2a一样保护性抗体免疫模型(26,27]。我们的报告表明,Th2-biased反应介导通过IgG1足以保护小鼠免受IPD,根据显著降低后肺炎球菌菌血症和死亡率的挑战。

这些数据支持这样的观点:嗜碱粒细胞回复完整蛋白质抗原通过提供一个早期的Th2细胞因子促进来源强调Th2细胞反应和随后浆细胞数量增加和增强小鼠产生抗体。然而,我们没有地址嗜碱粒细胞是否可以作为主要的抗原呈递细胞启动Th2反应(17,28- - - - - -31日]。最近的一项研究使用屋尘螨(HDM)过敏模型支持机制树突细胞是主要抗原呈递细胞HDM抗原,而嗜碱粒细胞放大Th2免疫HDM (28]。此外,最近的一份报告表明,嗜碱粒细胞能够占用半抗原诱导的蛋白质或多肽但不能Th2反应,树突细胞的存在是需要的32]。解决这方面的basophil-dependent免疫力IPD等待未来的调查。

小说方面的报告目前是一个转移FcγRIIB-blocked PspA-reactive嗜碱粒细胞另外增加PspA-specific抗体滴度,进一步提高他们对IPD的保护。这些数据说明,不仅嗜碱粒细胞的数量,而且其特定Fc-receptor-dependent催化剂和抑制剂的平衡形状完整的总体响应,接种肺炎球菌疫苗的蛋白质,因此应被视为额外的手段加强未来basophil-dependent肺炎球菌疫苗接种战略。

未来的一个重要方面basophil-dependent肺炎球菌疫苗接种的方法在人类的足够的可用性未激活的自体嗜碱粒细胞输血的目的。总之,自体嗜碱粒细胞生成可以从病人的骨髓活检在体外,再次利用IL-3作为生长因子从骨髓祖细胞体外扩大嗜碱粒细胞。然而,这方面的嗜碱细胞生物学等待未来的调查。

在一起,当前研究的数据表明,过继转移PspA-reactive嗜碱粒细胞是一种强大的工具来增加Th2-dominated PspA-specific IgG1小鼠的抗体反应,从而显著提高小鼠的宿主防御能力承受bacteremia-inducing病毒的一个致命的挑战肺炎链球菌。

笔记

财政支持。这项工作得到了德国联邦教育和研究的框架内执行德国肺癌研究中心。

潜在的利益冲突。所有作者:没有报道冲突。

作者所提交的国际形式披露潜在的利益冲突。编辑认为冲突相关手稿的内容已经披露。

引用

作者指出