甲型流感病毒以人类肺部的II型肺细胞为靶

摘要

背景。高致病性禽流感H5N1病毒优先感染人肺的肺泡II型肺细胞。然而，由于尚未对其他流感病毒的主要靶细胞进行系统研究，因此这种细胞趋向性是否有助于病毒的高毒力尚不清楚。

方法。 我们首次比较了人、高致病性禽流感A病毒H5N1亚型和其他动物流感A病毒在原代人肺器官培养物中的复制、向性和细胞因子诱导。

结果。 亚型H5N1和人类适应的H1N1和H3N2亚型病毒在肺组织中有效复制，而经典猪和低致病性禽流感病毒传播很差。然而，所有检测到的病毒几乎都只在II型肺细胞中检测到，肺泡巨噬细胞很少参与。禽流感病毒感染具有低致病性和高致病性的病毒引起细胞因子和趋化因子的显著诱导，而人类和大流行性H1N1-2009病毒只引起微弱的反应。

结论。这些发现表明，人类肺中甲型流感病毒致病潜力的差异不能归因于不同的细胞趋向性。相反，高或低病毒致病性与在II型肺细胞中有效复制和应对诱导的细胞因子反应的菌株特异性能力有关。

甲型流感病毒是正粘病毒科的典型成员，具有分段的RNA基因组，主要在人类、猪和禽类宿主中传播[1]A型流感病毒对人类的社会经济影响是巨大的，因为仅在美国，它们就导致每年3000-49000人死亡的急性严重呼吸道疾病[2]．禽流感和猪的宿主宿主直接影响人流感的流行病学，因为一些或全部基因来源于动物病毒的新毒株偶尔会出现并在人群中传播。这些大流行中最具破坏性的是1918年的西班牙流感，在全世界造成了多达4000万人死亡[3.]2009年，一种新的甲型H1N1流感亚型病毒在北美出现，带有来自猪宿主库的基因片段，并在全世界迅速传播，导致本世纪第一次流感大流行[4]．

大多数禽流感病毒在人类呼吸道的复制被减弱[5,6]，最初被认为与不同的受体特异性有关。禽病毒的血凝素（HA）分子优先与唾液酸结合，唾液酸与半乳糖（α-2,3SA）具有α-2,3键，半乳糖（α-2,3SA）对应于α-2,3SA在感染禽的肠道中的高表达，后者是禽病毒的主要复制位点[7]相比之下，典型人类菌株的HA主要与α-2,6SA结合，α-2,6SA在人类气管中高度表达[8]然而，最近人们认识到α-2,3SA和α-2,6SA受体决定簇都存在于人肺中，并且禽流感病毒和人流感病毒都可以附着于肺泡上皮细胞[9 - 11]这些发现表明，除特定受体外的因素必须限制禽病毒在人类宿主中的复制。

H5N1亚型高致病性禽流感病毒（HPAIV-H5N1）是一种例外，因为它们会导致人类致命的呼吸道疾病，死亡率接近60%，但其确切原因尚不清楚[12,13]HPAIV-H5N1病毒诱导高水平的细胞因子和趋化因子，这可能有助于增强免疫病理学[在14到18岁]然而，这种高细胞因子血症对疾病严重程度的意义最近在一项有争议的尸检结果的基础上引起了争论[19和动物模型[20 - 22]．

H5N1感染死亡患者的主要病理发现是弥漫性肺泡损伤，这些患者的病毒确实感染了肺泡上皮[12,13]．这导致了一种建议，即明显的细胞趋向性可能至少是这些病毒高致病性的部分原因[11,12,23]．居住在人类肺部的各种细胞类型，包括杯状细胞、I型和II型肺细胞以及肺泡巨噬细胞，被认为对病毒挑战有不同的反应[24]I型肺细胞是扁平的非分裂细胞，占肺泡组织中所有细胞的8%，但覆盖肺泡表面的95%以上，负责气体交换和液体稳态。相比之下，占细胞总数15%的立方型II型肺细胞产生表面活性剂，可以作为干细胞分化为I型肺细胞[24]虽然II型肺细胞的细胞质中有大量线粒体和内质网，但这些细胞器仅在I型肺细胞中很少出现[25,26]，分别表示高代谢活动和低代谢活动。值得注意的是，HPAIV-H5N1主要结合并感染II型肺细胞[10,23,27]相比之下，季节性流感病毒最初感染上呼吸道的细胞，但在少数情况下，它们也会渗入肺部，导致严重的呼吸道并发症[28,29]．在人类肺组织的固定切片中，它们主要附着在I型肺细胞上[11]然而，季节性菌株是否也能有效感染这些细胞尚未确定，因为缺乏尸检报告，组织培养系统和动物模型的信息价值也不确定。

为了提高我们对支持或限制流感病毒在人下呼吸道生长的机制的理解，我们使用了人体外肺模型。这使得在保留人类肺组织的三维结构和细胞多样性的实验模型中，首次系统地比较来自人类、禽类和猪宿主的a型流感病毒的复制、细胞趋向性和细胞因子诱导。最引人注目的是，所有检测的病毒主要感染II型肺细胞，尽管我们观察到菌株之间在复制和细胞因子诱导方面有很大的差异。这些发现表明，流感病毒在人肺中的致病性不是由细胞趋向性决定的，而是与II型肺细胞复制的程度和应对诱导的细胞因子反应的能力有关。

材料和方法

肺外植体、组织培养和病毒

新鲜肺外植体取自柏林胸外科中心接受肺切除术的患者。所有患者均获得书面知情同意书，该研究得到了Charité诊所伦理委员会的批准（项目EA2/050/08和EA2/023/07）。立即将无肿瘤的正常肺组织压印成小圆柱体（高度∼3、 直径8 mm），并在37°C条件下，在罗斯韦尔公园纪念研究所1649培养基（含0.3%牛血清白蛋白、2 mm L-谷氨酰胺和抗生素）中培养5%CO₂.过夜培养后，肺器官培养物接种4×10⁵病毒的菌斑形成单位（PFU）持续1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水清洗3步以去除多余的病毒。为了进行生长曲线分析，通过标准菌斑试验在Madin Darby犬肾（MDCK）细胞上滴定上清液，如别处所述[30]．MDCK细胞在37°C和5% CO条件下生长₂在最低基本培养基中（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素）。本研究使用的病毒包括从致命人类病例中分离的HPAIV A/Thailand/1（Kan-1）/2004（Thai/04[H5N1]）株、大流行性A/Bayen/63/2009（Bay/09[H1N1pdm]）株、季节性A/New Caledonia/20/1999（NC/99[H1N1]）和A/Panama/2007/1999（Pan/99[H3N2]）株、低致病性禽病毒A/duck/Alberta/60/76（Dk/Alb[H12N5]）株和经典猪病毒A/Swing/Wisconsin/1/67（Sw/Wis[H1N1]）株（表1）1）.我们使用了由反向遗传学产生的a/ Panama/2007/1999流感毒株的重组版本，将在其他地方描述。人病毒株在MDCK细胞上生长，而鸭和猪分离株在11日龄的鸡胚中繁殖。将病毒储存在-80°C下，通过空斑试验在MDCK细胞上滴定。所有关于H5N1病毒的实验都是在地方当局批准的用于处理这些病毒的生物安全3级遏制实验室中进行的。

免疫组化和共聚焦显微镜

肺组织用4%多聚甲醛（Sigma）固定。脱蜡后，将组织切片在柠檬酸盐缓冲液（10 mM柠檬酸钠；pH 6.0）中在95°C下加热30分钟以回收抗原，并用1%Triton-X-100渗透15分钟。用5%足够的血清封闭载玻片30分钟，并在4°C下用稀释的Alexa Fluor 488标记的甲型流感病毒特异性抗体（Serotec OBT1551；1:30）孵育过夜。使用DyLight 488微型抗体标记试剂盒（Thermo Scientific）标记甲型流感病毒抗体。如果需要，通过凝集素的载体红染色检测α-2，3-和α-2，6-连接的唾液酸。然后将组织切片在4°C下与前表面活性剂蛋白C（Chemicon AB3786；1:800）、EMP2（Sigma HPA014711；1:50）和/或CD68（Abcam ab955-500；1:50）的主要抗体一起培养过夜。随后，将载玻片与相应的Alexa 546-或Alexa 555-结合二级抗体（Invitrogen）孵育，安装在Mowiol中，并使用LSM 780或LSM5 Pascal共焦显微镜（物镜40×，Plan Neofluar/oil，NA 1.3；63×，Plan Apochrome/oil，NA 1.4；蔡司，Jena，德国）进行分析。

透射电子显微镜

人肺外植体被病毒感染24小时，随后用2.5%戊二醛（50 mM HEPES）浸泡固定，并用1%OsO后固定₄(1小时)，0.1%单宁酸(在50毫米HEPES中30分钟)，2%醋酸铀酰(2小时)。样品在分级乙醇中脱水，并包埋在Epon树脂中。用超微切片机(ultrtracut S, Leica, Wetzlar, Germany)切薄切片，用2%醋酸铀酰(20分钟)和柠檬酸铅(3分钟)进行反染色。切片用TEM 902显微镜(Carl Zeiss SMT AG)检查。图像使用慢扫描电荷耦合器件相机(Pro Scan，德国舒尔林)进行数字化。

细胞因子和趋化因子的测量

病毒灭活后，在4°C下与0.15%TNBP/Triton X-100孵育1小时后，用Procarta细胞因子分析试剂盒（Panomics）测定感染肺外植体上清液中IP-10和MIP-1β的浓度。干扰素β（IFN-β）和白细胞介素1β（IL-1β）使用商用酶联免疫吸附测定试剂盒（Fujirebio，东京和BD Biosciences，海德堡）分析上清液中的水平。

后果

人肺外植体支持甲型流感病毒的复制

系统比较人类和动物甲型流感病毒的复制情况(见表)1)在人肺中，我们建立了一个离体移植模型。肺标本主要由来自下肺叶的复杂肺泡组织组成（图1一个）.用典型的季节性Pan/99(H3N2)病毒感染外植体，导致生产性感染，培养上清中感染性病毒颗粒的数量大幅增加(图)1B).根据持续较低的乳酸脱氢酶释放值（数据未显示）判断，样本的生存能力在96小时内保持稳定。因此，在0小时或1天后，来自同一供体的外植体感染仅导致病毒生长曲线之间的微小差异（图1）1B)添加胰蛋白酶不会增加病毒滴度，表明在肺外植体中保留了病毒HA裂解激活所需的蛋白酶活性（数据未显示）。

对复制效率的系统比较表明，两种毒株之间存在显著且可重复的差异：季节性Pan/99（H3N2）和高致病性泰国/04（H5N1）病毒繁殖效率高，而低致病性禽Dk/Alb（H12N5）病毒复制率低2个数量级（图1C)类似地，季节性和大流行性H1N1病毒NC/99（H1N1）和Bay/09（H1N1pdm）复制到可比的滴度，而典型猪流感病毒Sw/Wis（H1N1）的生长显著减弱（图1）1D)观察到的差异不太可能是特定受体偏好的结果，因为凝集素组织化学分析确定了肺泡腔中的α-2,3SA和α-2,6SA受体决定因素(补充图1)，以确认先前的报告[9]总的来说，这些数据表明人类和动物甲型流感病毒在人类肺组织中的生长能力存在显著差异。有趣的是，不同的甲型流感病毒在外植体中复制的能力与其在h乌曼斯。

高致病性H5N1和季节性和大流行病毒主要感染II型肺细胞

观察到的猪和低致病性禽流感病毒生长受限可能是由多种因素造成的，包括缺乏初始感染、病毒基因表达低、先天免疫反应强烈激活或细胞取向差异。为了确定人类和动物病毒株在细胞水平上可能存在的差异，我们感染了人肺外植体并进行了免疫组织化学分析（图1）2).尽管在人类肺组织中繁殖不良，但在感染低致病性禽流感病毒和经典猪流感病毒的细胞中检测到病毒抗原的比率相似。有趣的是，病毒粒子抗原和II型标记物表面活性剂蛋白C前体的共培养[25]发现感染Sw/Wis(H1N1)、Dk/Alb(H12N5)、Pan/99(H3N2)、NC/99(H1N1)、Thai/04(H5N1)或Bay/09(h11pdm)病毒的绝大多数细胞为II型肺细胞(图1)2一个和2B）.相反，我们在I型肺细胞中没有检测到任何这些病毒，这是通过标记抗原EMP2来判断的(图)3.)和小泡蛋白1(数据未显示)，尽管凝集素染色证实在两种类型的肺细胞上都存在人类和禽类菌株的受体(图)3.C）.病毒抗原和CD68标记物的双重染色也检测到所有病毒的流感病毒抗原阳性肺泡巨噬细胞(补充图2）.最可能的情况是，这表明巨噬细胞正在被感染，因为在与紫外线灭活病毒(数据未显示)孵育后未检测到A型流感病毒阳性细胞，尽管不能排除部分信号是由吞噬的病毒抗原引起的。在组织切片上对感染细胞类型的量化显示，肺泡巨噬细胞仅占抗原阳性细胞的4%-11%，而89%-96%为II型肺细胞，这取决于病毒毒株(图)4）.

为了评估我们在超微结构水平上关于细胞取向的免疫组化数据，肺外植体被感染并进行透射电镜处理。数字5描述了感染Pan/99（H3N2）24小时后肺外植体的肺泡上皮细胞。通过表面活性剂填充的多板层体的典型存在，在被鉴定为II型肺细胞的细胞顶端观察到病毒颗粒出芽（图5一个和5B）.在我们所有的标本中，我们没有观察到病毒从具有I型肺细胞特征的细胞中出芽。这些数据表明，人和动物A型流感病毒在人肺组织中对II型肺细胞具有相同的细胞趋向性，尽管它们在这些细胞中的繁殖能力显著不同。

人和动物甲型流感病毒对人肺组织细胞因子和趋化因子的差异诱导

目前尚不清楚是否在h5n1感染患者和小鼠中观察到细胞因子水平的增强[16,20,22]主要来自最初感染的上皮细胞和肺泡巨噬细胞或招募的免疫细胞。因此，我们确定了HPAIV和panel中的其他病毒对肺组织中细胞因子的诱导作用。季节性的NC/99(H1N1)和Pan/99(H3N2)病毒以及大流行的Bay/09(H1N1pdm)病毒感染人类肺部组织时，只会产生非常微弱的IP-10、MIP-1β、IFN-β和IL-1β分泌(图)6)相比之下，泰国/04（H5N1）病毒引起了这些细胞因子和趋化因子的强烈诱导。令人惊讶的是，低致病性禽病毒Dk/Alb（H12N5）也引起了这些细胞因子和趋化因子的显著诱导，其水平比季节性NC/99（H1N1）高3-13倍当用紫外线灭活病毒或尿囊液探测组织时，这种上调几乎不发生，表明细胞因子诱导是由病毒感染触发的(补充图3).典型猪病毒Sw/Wis（H1N1）导致弱细胞因子反应，只有IP-10达到明显高于季节性病毒的水平。总之，这些发现表明，低致病性禽流感病毒和高致病性禽流感病毒在肺泡组织中诱导的细胞因子反应比人类适应病毒强得多，甚至n缺乏招募的免疫细胞。

讨论

流感是一种主要的人类传染病的主要例子，这种传染病起源于一种动物宿主，这种动物宿主继续为产生具有独特生物学或抗原特性的新型人类病毒株贡献病毒基因[1,31]。流感病毒通过其易出错的RNA聚合酶获得额外的遗传多样性，该聚合酶可在新宿主中快速产生具有选择性优势的突变变体。因此，已知禽流感病毒的病毒聚合酶和HA分子的突变可促进对哺乳动物宿主的适应[6]然而，对促进或限制人类流感病毒生长的宿主因素的全面了解才刚刚开始[6,32]．

我们的目标之一是更好地了解流感病毒适应严重流感患者下呼吸道的相关过程。在这里，我们系统地比较了人、禽和猪宿主在移植的人肺组织中甲型流感病毒的趋向性、复制和细胞因子诱导。肺器官培养对我们研究的适用性得到了HPAIV-H5N1和人类适应的季节性和大流行性病毒有效传播的研究结果的支持。相比之下，低致病性禽流感病毒和经典猪流感病毒的复制效果很差，这可能反映了大多数禽流感病毒在人体内的强衰减，以及很少检测到感染猪流感病毒的人类患者[5,33]．

数学模型表明，一种特定的细胞取向可能强烈影响流感的严重程度[34]．事实上，靶细胞类型的差异与禽流感和人类甲型流感病毒在重建的人类气管支气管上皮细胞中复制的数量相关[35,36]．同样，有人提出H5N1病毒在人肺中优先感染II型肺细胞可能解释了患者和非人灵长类动物的高病毒载量和强病理反应[10,11,23]这一建议是基于这种细胞类型的快速代谢及其在维持肺泡表面张力和启动修复过程中的重要作用[12,27,37]然而，对移植肺组织的免疫组织化学和电子显微镜分析本质上削弱了这一假设，因为HPAIV-H5N1和所有其他检查过的病毒显示出强烈的感染II型肺细胞的倾向，尽管它们的后代滴度变化达数个数量级。这些结果证实并扩展了这一假设以前关于在II型肺细胞中检测大流行性和季节性毒株的病毒抗原的报告，但没有涉及这种细胞中传染性病毒颗粒的产生[38,39]我们发现另一种重要的呼吸道病毒病原体，SARS冠状病毒，已经进化到优先在II型肺细胞中复制，尽管它显然使用了与流感病毒不同的受体进入细胞[40–42]．这表明II型肺细胞对病毒感染高度敏感，这可能是未来抗病毒治疗发展的重要考虑因素。

与流感病毒和II型标记抗原染色的大量重叠相一致，我们没有检测到I型肺细胞中的病毒基因表达，这表明这些细胞中的感染不会超过早期阶段。季节性流感病毒先前显示主要在固定的肺切片上附着在细胞的形态学上sembling I型肺细胞，但这是否启动了病毒复制周期尚未解决[11]有趣的是，据报道，在从肺组织中纯化后，I型细胞可被流感病毒感染[43,44]．显然，需要进一步的工作来解决为什么在II型肺细胞也存在的肺器官培养中没有观察到这一问题。

在受感染的肺标本中，我们也在一些肺泡巨噬细胞中检测到病毒抗原，无论检测哪种菌株。这一发现与最近的报告一致，该报告显示，分离的肺泡巨噬细胞易受人类和禽流感病毒感染[44,45]然而，巨噬细胞在所有感染细胞中只占很小的一部分，它们很可能对病毒的生长没有很大的贡献，但可能对细胞因子的产生有很大的贡献。季节性H3N2和H1N1病毒只诱导了中等程度的细胞因子反应，表明这些病毒避免或抑制了病毒的生长上皮性肺组织的强烈激活[46]．此外，H1N1-2009大流行病毒引发了微弱的细胞因子反应，这证实了先前有关受感染的人巨噬细胞、树突状细胞和初级肺泡细胞的报告[47,48].低水平的细胞因子诱导可能有助于H1N1 pdm病毒在人体内的成功繁殖和快速传播。H5N1病毒至少与季节性H3N2病毒一样复制，但在人体肺外植体的常驻肺泡细胞中诱导了强烈的细胞因子反应。因为在离体培养中没有招募的免疫细胞在感染模型中，HPAIV-H5N1可能在感染患者中显著诱导细胞因子[16]已经在被感染的肺泡细胞水平上启动。

有趣的是，尽管病毒生长缓慢，低致病性禽流感病毒也在肺外植体中引发了强烈的细胞因子反应。这一发现表明，该病毒要么产生大量RNA，增强细胞内受体的激活，控制细胞因子的诱导，要么连接禽类受体决定因素，为细胞因子基因的表达提供信号。后一种可能性与最近的研究结果一致，该研究表明，与HPAIV-H5N1病毒相比，感染低致病性禽流感病毒的小鼠肺部中MIP-1α和IL-1β的浓度相同甚至更高[22]此外，Ramos等人最近表明，鸟类受体结合偏好有助于在各种人类细胞中产生强烈的细胞因子诱导，但其确切原因目前尚不清楚[49]相比之下，典型的猪病毒引发的细胞因子分泌水平较低。因此，动物流感病毒在人类肺部的不良生长不一定是由强烈的细胞因子诱导引起的，但可能涉及其他病毒和/或细胞因子。

将II型肺细胞鉴定为流感病毒的共同靶细胞，选择性支持人类和高致病性禽H5N1病毒株的复制，以及启动细胞因子反应的能力，突出了人类肺器官培养对于深入了解病理生理过程的价值人类肺组织对特定流感病毒的敏感性取决于其在II型肺细胞中固有的复制特性，这是一种抵抗诱导的先天反应的特异性适应[50]，或其组合尚待确定。应记住，任何离体或动物模型都不能完全复制人体呼吸道中的复杂结构和免疫反应。然而，本研究中获得的实验结果与临床和病理观察结果密切相关，因此将ore允许在未来的分析中对物种适应、先天免疫反应和治疗干预等因素进行更详细的调查。

笔记

致谢 我们感谢Andrea Zöhner、Gudrun Heins和Doris Stoll提供了出色的技术支持，并感谢Matthias Budt对手稿的批评性评论。

财政支持。FluResearchNet这项工作是支持的,这是由德国联邦资助的研究和教育(BMBF赠款01 KI - 07131 s . h和赠款01 KI 07132 - 01 KI 1006 C t·w·)的进展(肺炎研究网络进化的遗传抗性和易感性严重脓毒症),由BMBF资助(授予a.c.h. C8);以及德意志联邦共和国跨区域合作研究中心SFB-TR84(授予T. W. B2，授予A. C. H. Z1a，授予A. D. G. Z1b)。J. K.是由国际马克斯·普朗克传染病和免疫学研究学院资助的。

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