耐多药结核病不是由于不依从性，而是由于患者间药代动力学的变异性

摘要

(见Dartois的社论评论1827 - 9．）

背景。据信，不依从是耐多药结核病(mdr -结核病)出现的直接原因。与耐多药结核病发生相关的不依从程度尚不清楚。在一项随机对照试验中，一些患者被随机分为不坚持组，这是不道德的;因此，应采用其他研究设计。

方法。我们对中空纤维的杀菌和杀菌效果进行了研究，在一些实验中，接种物中添加了0.5%耐利福平和异烟肼等基因菌株。标准治疗每天进行28-56天，不坚持程度在0%到100%之间变化。采用方差分析比较耐药人群的大小。我们还利用计算机辅助临床试验模拟了10,000名南非开普敦结核病患者，探讨了药代动力学变异性对耐多药结核病发生的影响。

结果。只有在不依从程度≥60%时才会出现治疗失败。令人惊讶的是，异烟肼和利福平耐药人群在任何实验中都没有达到≥1%的比例，不坚持的比例也没有达到更高的比例。然而，临床试验模拟表明，由于药代动力学的变化，大约1%的完全坚持的结核病患者仍然会发展为耐多药结核病。

结论。这些基于临床前模型的数据表明，单是不依从并不是耐多药结核病出现的充分条件。

药物敏感结核病目前使用异烟肼、利福平和吡嗪酰胺治疗，作为直接观察短期治疗策略(DOTS)的一部分。然而，治疗的成功受到耐多药结核病(mdr - tb)出现的威胁，mdr - tb定义为同时对异烟肼和利福平耐药。据信，大多数耐多药结核病是由于坚持不良引起的，因此需要直接督导下的短程化疗。世界卫生组织(世卫组织)已将直接督导下的短程化疗纳入结核病控制的全球方法。然而，与耐多药结核病出现相关的不坚持程度尚不清楚;因此程序需要这样做所有肺结核病人由卫生部门监督医护人员在吞咽抗生素时．世卫组织总干事称DOTS是过去几十年最重要的卫生突破[1］．

大多数确定直接监督治疗效用的研究是回顾性的，并依赖于DOTS规划实施前后耐多药结核病的检查率[2，3.］．然而，DOTS有5个组成部分，包括提供充足和标准化的药物供应，这可能导致在不依赖坚持的情况下降低耐多药结核病发病率。最近，一项元分析对医护人员直接监督的有效性提出了质疑[4］．此外，尽管有>98%的依从性，耐多药结核病的广泛出现仍在发生[5］．我们感兴趣的是确定坚持不良是否会导致治疗失败和耐多药结核病的出现。由于DOTS现已在世界范围内被接受，因此进行随机临床研究来回答这些问题既不符合伦理，也不可取。因此，我们检查了结核病的中空纤维系统(HFS)模型中的问题。

方法

菌株

结核分枝杆菌实验中使用H37Rv (ATCC 27294)，其对异烟肼、利福平和吡嗪酰胺的最低抑制浓度(MICs)分别为0.06、0.125和12.5 mg/L。一株耐利福平的等基因菌株(ATCC 35838)，其MIC为>32 mg/L，原因是dna依赖RNA聚合酶β亚基基因的密码子531 Ser→Leu突变(rpoB)也被使用。我们制造出了抗异烟肼结核分枝杆菌H37Rv株(MIC = 2 mg/L)，其过氧化氢酶过氧化物酶基因315密码子AGC→GGC突变(katG)．培养物的储存和传播如前所述[6-9]。培养物在添加10%油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶(OADC)的Middlebrook 7H9肉汤中生长，温度为37℃，温度为5% CO₂还有震动条件。第4天log相培养进行实验。

定义

杀菌活性的标准定义是抗生素对快速繁殖的细菌的杀灭，杀菌活性的标准定义是对酸性环境中半休眠或缓慢复制的细菌的杀灭[10，11］．在HFS中，治疗失败的定义是实验结束时阳性培养的存在。根据美国疾病控制和预防中心(CDC)的方案1，不依从程度定义为错过剂量的百分比，在该方案中，药物每天给药56天[11］．然而，在世界许多地区，在治疗的初始阶段(5/7方案)，每周7天中的5天进行治疗(共40次)。世卫组织的建议2.1B是在低艾滋病毒环境下每周服用3次(每周服用3次)[12］．

中空纤维系统

我们的HFS模型的技术细节已经在前面描述过[6-9]。每个HFS及其内容物在37°C、5% CO下孵育₂．结核分枝杆菌接种到每个HFS的外周室。每天通过电脑控制的注射泵进行药物治疗。我们模拟了异烟肼每日300毫克、利福平每日600毫克和吡嗪酰胺每日2克在患者体内的药代动力学。HFS通过新鲜培养基稀释中心室来实现抗生素浓度的下降。我们为半衰期最小的药物设定稀释率，并通过计算机驱动的注射泵来补充较长的半衰期药物，从而获得较长的半衰期。在前24小时内的5个时间点测量每个HFS的药物浓度。然后使用ADAPT 5程序对这些浓度进行建模[13]，假设为一阶消元的1室模型[6-9]。从外周室取样细菌，然后用生理盐水清洗两次以去除任何残留药物，并在添加10% OADC的Middlebrook 7H10琼脂上培养(此处称为“琼脂”)。在添加0.2 mg/L异烟肼、2.0 mg/L利福平或300 mg/L吡嗪酰胺的琼脂上培养，以计数耐药亚群。此外，基于我们提出的新的易感断点，我们还检测了对0.125 mg/L异烟肼或0.0625 mg/L利福平的耐药性[14］．对于吡嗪酰胺，将琼脂酸化至pH 5.8，并添加10%胎牛血清[9］．37°C, 5% CO下培养₂，孵化后3周开始计数菌落。

不依从实验

我们验证了不坚持的程度与耐药的大小成正比的假设结核分枝杆菌人群。在杀菌效果实验中，结核分枝杆菌在对数相生长的第4天接种到每个HFS的外周室，其中肉汤循环。这样做是为了结核分枝杆菌会继续对数相增长。为了达到第4天的杀菌效果，对数期生长培养物在酸化至pH值5.8的肉汤中培养4天(半休眠杆菌)，然后用循环酸化肉汤接种到每个HFS的外周室。

首先，每18个HFSs接种20 mL 6.5 log₁₀菌落形成单位(CFU)每毫升药物敏感结核分枝杆菌对数相生长。这模拟了每个系统半径约2.2 cm的球形结核脓肿的体积。每天进行治疗，直到在28天的治疗期内，3个HFSs分别达到总剂量的0%、20%、40%、60%、80%和100%(补充表1)。总剂量和耐药培养结核分枝杆菌分别于第3、7、10、14、21、28天采集。在杀菌效果研究中，根据杀菌效果研究结果，接种半休眠杆菌，检查0%、30%、60%、70%、80%和100%的不粘附情况(补充表1)。

接下来，我们检查了非依从性模式对耐药出现的影响。耐药突变体的出现是一个随机过程，这意味着耐药亚群可能只是没有偶然出现。为了排除这种可能性，接种物与0.5%的等基因利福平耐药菌株进行了预混，以进行非粘附性杀菌效果研究。之所以选择0.5%的比例，是因为它略低于1%的临床意义比例。然后对三组HFSs进行80%或60%的非依从性治疗，分别以start-stop、start-stop-start或描述结核患者常见行为的随机模式进行。对于随机遗忘模式，生成了一个计算机生成的随机数序列，每个整数代表一天的治疗。为了确定非依从性期间疗效的降低是否仅仅反映了累积药物剂量减少的影响，我们纳入了另外3种HFSs，在前20%的天内给予整个28天累积剂量，然后停止。最后，专家意见建议，如果有人在治疗的初始阶段错过了2周的累积剂量，应重新开始标准治疗，就像患者没有接受任何治疗一样[11］．为了验证这一点，我们在第28天至第42天期间对每个暴露于不同不依从模式的HFS进行了100%依从性的标准每日治疗，并比较了不同程度的不依从后标准每日治疗的死亡率。

为了确定在杀菌效果研究中与最差结果相关的不依从模式，对杀菌效果研究进行了4项更改。首先，将非依从性研究期延长至56天(补充表1)。其次，在前28天的前40%时段，以及后28天的前40%时段，给药28天的全部累积剂量。为了确定不粘附对先前存在的耐药亚群扩增的影响，接种物与0.5%的耐利福平分离物和0.5%的异烟肼耐药菌株预混合。为了加强耐药性检测，我们在第56天清空每个HFS药筒中的全部细菌种群，并使用测试条(AB Biodisk)进行利福平和异烟肼mic。

统计分析

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。采用Bonferroni后验校正的双向方差分析(ANOVA)比较各时间点的细菌负担。进行线性回归分析以比较死亡率，在暴露于不同的不依从模式的HFS中，100%的依从性。

蒙特卡罗模拟

我们认为药代动力学变异是耐多药结核病出现的另一种解释。首先，当一组患者服用相同剂量的抗结核药物时，由于进化驱动的药代动力学变异性，药物浓度分布很广[15-18]。这导致在整个治疗的初始阶段，一小部分患者的药物浓度较低。鉴于抗结核药物作为单药治疗时耐药性几乎是肯定的[19-21]，我们假设由于药代动力学变异性导致的低药物浓度导致有效的单药治疗，从而在一定比例的患者中产生耐药性。因为利用蒙特卡罗方法的计算机辅助临床试验模拟可以很好地预测结核病患者的治疗事件[7，9，22]，我们应用这种数学方法来确定在南非开普敦Khayelitsha使用标准疗法治疗期间发生耐多药结核病的患者比例。之所以选择这个位置，是因为耐多药结核病很常见，而且抗结核药物在这些患者体内的药代动力学变异性已得到很好的表征[17，18］．

首先，通过检查浓度-时间曲线(AUC)下的0- 24小时区域，在开普敦的临床研究和肯尼亚内罗毕的一项研究中，利福平在该点以下无效[23-26]，确定了在该点以下有有效异烟肼单药治疗的利福平暴露[23-26]。回归分析发现，与早期杀菌效果相关的最小AUC为13.1 mg*h/L，与灭菌效果相关的最小AUC为7.8 mg*h/L。的比率结核分枝杆菌然后测定不同auc下CFU/mL的下降。异烟肼被定义为仅在前3天介导微生物杀灭，但从第4天到第56天继续预防利福平耐药。利福平和异烟肼被认为是相互独立的，既不协同也不拮抗。吡嗪酰胺在中性pH值下无活性[27］．仅对中性pH下的杆菌进行耐药检测;因此，吡嗪酰胺的存在被忽略。我们假设在酸性条件下，半休眠杆菌不会出现耐药性，因为3种药物对该亚群有效，因此单药治疗的情况不太常见。

我们对1万名治疗药物敏感结核病的患者进行了蒙特卡罗模拟。开普敦结核病患者的利福平和异烟肼人群药代动力学参数[17，18]被嵌入到ADAPT 5程序的PRIOR子程序中。在前56天内，每天使用标准剂量异烟肼和利福平治疗的患者产生了AUC和峰值浓度的分布。然后计算每1万名患者的微生物杀灭率。的检测下限结核分枝杆菌痰液浓度为0.699 log₁₀CFU /毫升(28］．保守起见，我们假设并非所有单药治疗的患者都会产生耐药性。因此，我们将“单药治疗”受试者的耐药发生率限制为与治疗前2个月单药治疗患者临床研究中观察到的比率成正比[19，21，29］．

在第二组蒙特卡罗模拟中，我们确定了有效单药治疗患者出现耐药的时间。我们假设耐药突变体的患病率为3.5 × 10⁻⁶3.1 × 10⁻⁸分别适用于异烟肼和利福平[30.]，药物暴露后耐药细胞的数量服从泊松分布。假设耐药杆菌加倍时间为1-6天[31］．我们假设公共katGS315T和rpoBS531L突变的适应度成本可以忽略不计[32］．

结果

不粘附对杀菌活性的影响

在每个HFS中观察到的药物浓度的药代动力学分析证实，每种药物在每个HFS中达到不同的药代动力学特征(图1一个)．关于疗效，方差分析表明，70.5%的总方差结核分枝杆菌人口可归因于非依从性(P<。)。0%-40%不依从的HFS也有类似情况结核分枝杆菌整个28天期间的死亡率(图1 b)．60%不坚持的HFS在第14天之前的死亡率较低(P=措施)。然而，80%的患者不坚持治疗，治疗失败。因此，不坚持的断点是每日方案剂量的60%-80%。在耐药方面，吡嗪酰胺耐药亚群占接种量的3.55%，但在所有系统中，这一比例随着时间的推移而下降，并在第14天降至临床意义的1%以下。因此，非依从性并没有放大吡嗪酰胺耐药亚群。没有出现任何异烟肼或利福平耐药结核分枝杆菌亚人群，甚至在治疗失败的HFS中。因此，与不坚持相关的治疗失败是由于异烟肼和利福平敏感结核分枝杆菌．

在杀菌活动中不粘附模式的影响

不同的不粘附模式与对数期生长细菌的不同治疗反应相关，如图所示图2．启动-停止模式的情况更糟，因为当方案停止时，微生物的杀灭停止了，细菌开始重新生长。当患者忘记接受治疗，但每次在与医护人员接触之前都重新开始治疗时，这种启停-启停-启停模式会导致中间结果。当患者随机忘记服用抗生素时发生的随机不依从模式表现最好(图2A及B)．在HFS中，在前20%的天内给予整个28天累积剂量的微生物杀灭模式显示在图2 c．这证明了快速的微生物杀灭，直到治疗停止，这样到第28天，该方案的杀灭量少于28天每日治疗的相同累积剂量(P< . 01)。这意味着，当100%坚持治疗时，累积药物剂量和治疗持续时间都独立地导致了不坚持治疗期间的治疗失败。

的pyrazinamide-resistant结核分枝杆菌反应模式类似于上述第一个杀菌效果研究中遇到的情况。在所有系统中都遇到了利福平耐药菌株，总菌群高于检测限。第28天耐药细菌负担的比较见图2 d这表明利福平耐药亚群从未增加到原始接种物中引入的0.5%以上。一些HFS在第28天出现异烟肼耐药亚群(图2 e)．然而，异烟肼耐药亚人群低于1%的阈值，即使不坚持。最后，当所有HFSs均从第28天开始采用标准疗法时，斜率为结核分枝杆菌死亡率显示在表1这表明，无论之前的不坚持程度如何，所有HFSs都有良好的微生物杀灭效果。死亡率与- 0.16相似(95%置信区间，-。21到-.10)log₁₀CFU /毫升/天(r²= 0.93)，在治疗的前14天内遇到了100%的依从性。这意味着没有MDR结核分枝杆菌或者遇到足够的耐受水平，限制标准治疗的有效性，尽管以前的依从性很差。

在消毒过程中粘附性差的影响

在消毒效果期间，与治疗失败相关的不依从程度显示在图3．70%不坚持的HFS死亡更慢;80%的不坚持失败了。因此，在消毒效果期间与治疗失败相关的断点不坚持在日常治疗方案的70%至80%之间。在所有系统中均未出现异烟肼或利福平耐药亚群。此外，接受治疗的HFS在第28天没有任何吡嗪酰胺耐药杆菌。

消毒过程中不依从模式的影响

在整个56天的治疗初始阶段，给予0.5%异烟肼耐药亚群和0.5%利福平耐药亚群接种，不同模式的不依从性的影响显示在图4．在开始-停止模式和随机非粘附模式之间，细菌总负担几乎没有差异。对于60%不坚持启停策略的人来说，尽管第14天的死亡速度比随机模式更快(结核分枝杆菌负担3.39±0.09 vs 4.56±0.08 log₁₀CFU /毫升;P< 0.01)，到第56天无显著差异。然而，在56天的治疗中，>1%比例的异烟肼耐药亚群和利福平耐药亚群均未检测到。即使在第56天清空每个HFS的全部20ml内容物，利福平和异烟肼mic也与开始接种的相似，进一步证明没有耐药人群的扩增。

药代动力学变异与耐多药结核病的出现

我们进行了蒙特卡罗模拟，以确定药代动力学变异性对疗效和耐药出现的影响。对所得到的药代动力学参数的检查表明，它们与原始药代动力学数据非常相似[17，18]，在内部验证模拟。1万名模拟开普敦患者痰中微生物的杀灭率显示在图5一个．痰中细菌计数呈双阶段模式(图5一个)，这是实际结核病患者在接受治疗时所遇到的反应[26，33]，从而从外部验证了我们的假设。模拟受试者2个月痰液转化率为58.32%。这与在南非西开普接受短程化疗的结核病患者的临床研究中观察到的51%-60%相似[34，35]，这进一步验证了我们的模拟预测了真实的临床效果。

利福平浓度低于致死浓度结核分枝杆菌969例患者(前3天AUC <13.1 mg*h/L，随后<7.8 mg*h/L)。因此,结核分枝杆菌在这些暴露于异烟肼单药治疗的患者中，已知会导致耐药性[29］．这些患者的痰清除率较慢结核分枝杆菌，如图5 b．在该组中，另外296名患者将产生异烟肼耐药。此外，即使低浓度的利福平也不会致死结核分枝杆菌在68例因单药治疗(即耐多药结核病)并发异烟肼耐药的患者中，这些浓度处于已知可扩增耐药亚群的范围。因此，在治疗开始时患有药物敏感结核病的1万名西开普患者中，有0.68%的患者在8周内发生了耐多药结核病，尽管他们吞下了100%的药物。>1%比例耐药出现的时间为图5 c．

讨论

影响数百万患者的全球卫生政策应在实验室接受假设检验。我们在HFS中测试了非依从性假设。HFS无免疫系统，可获得大量的细菌负荷，这是出现耐药的2个重要危险因素[36］．在HFS中，当每种药物作为单一疗法使用时，1-3周内会出现耐药性[7-9]。因此，令人惊讶的是，在多个实验中，没有出现或扩大利福平或异烟肼耐药亚群与非依从性。在治疗早期遇到的“吡嗪酰胺耐药”亚群仅仅反映了这样一个事实:在液体培养中，临界浓度的吡嗪酰胺不能杀死>90%的杆菌[37-40]。无论如何，这个亚种群是短暂的。因此，在治疗的初始阶段，不依从不是耐多药结核病出现的充分条件，甚至不是单药耐药。

我们提出药代动力学变异性作为耐多药结核病出现的工作假设。我们使用了蒙特卡罗模拟，该模拟已被证明可以正确预测抗结核药物的疗效[7，39]，获得了与临床相似的微生物杀灭指数和模式[33-35]。模拟结果表明，患者之间的药代动力学变异性将导致相当一部分患者在整个治疗初始阶段都采用单药治疗，从而导致耐药性。然而，这一假设需要在临床中进一步验证。然而，如果被证明是正确的，这个问题就会有一个科学的解决方案，即通过考虑药代动力学的可变性来优化当地人群的剂量，或者更好的是，如果资源可用，可以对每个患者的剂量进行个性化。

我们的发现也有直接的临床和公共卫生意义。尽管坚持不良没有导致耐多药结核病，但它仍然导致HFS治疗失败。在> ~ 60%不坚持每日治疗方案时出现失败。另一方面，5/7疗法相当于我们的启停启停疗法，29%的人不坚持。因此，如果患者在该方案中服用了所有40剂，就不会出现治疗失败。我们的研究是第一个证明两种治疗方案具有同等疗效的证据。然而，如果出现不坚持的情况，5/7疗法就不那么宽容了。对于每周三次的治疗方案，几乎任何不坚持都会导致治疗失败。因此，应该质疑推荐这种疗法是否明智。

我们的实验还回答了另一个实际问题。根据专家意见，如果患者在治疗的初始阶段错过了2周的累积剂量，则应重新开始标准治疗，就像患者没有接受任何治疗一样[11］．在这里，我们提供了第一个实验证据，即标准疗法即使在非依从性后也会起作用(表1)．然而，只有在达到与失败相关的不坚持程度时，才应该重新开始治疗。

总之，治疗失败只发生在高比率的不坚持。在HFS的重复实验中，没有出现耐多药结核病不粘附的情况。相反，我们认为药代动力学变异性更可能是耐多药结核病出现的原因。

补充数据

补充资料可在传染病杂志在线(http://www.oxfordjournals.org/our_journals/jid/)．

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笔记

财政支持。

这项工作得到了美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所(R01AI079497)的资助。

潜在的利益冲突。

T. G.抗真菌药物的相关研究工作由辉瑞、默克和安斯泰来制药公司赞助。他也是Merrimack Pharmaceuticals的顾问。所有其他作者:无冲突报告。

所有作者都提交了ICMJE潜在利益冲突披露表。编辑认为与稿件内容相关的冲突已被披露。

参考文献

作者指出