摘要gydF4y2Ba
肺动脉高压(PAH)以肺动脉内皮细胞(PAEC)增殖、凋亡和通透性异常为特征。骨形态发生蛋白受体ii型(BMPR-II)的功能缺失突变是遗传性PAH最常见的原因，通常导致单倍体功能不全。我们之前的研究表明BMPR-II的表达是通过溶酶体降解途径调控的。在这里，我们发现抗疟疾药物氯喹显著增加了PAECs中BMPR-II蛋白的细胞表面表达，而不依赖于转录。抑制蛋白质合成实验显示细胞表面BMPR-II的快速周转，这是由氯喹处理抑制。在siRNA敲低BMPR-II转录本后，氯喹可增强PAEC的BMPR-II表达。通过使用血外生长内皮细胞(BOECs)，我们证实，在携带BMPR-II突变的患者的BOECs和BMPR-II突变的PAECs中，响应内皮BMPR-II配体BMP9的信号传导受损。氯喹显著增加突变BMPR-II PAECs和boec中BMP9-BMPR-II信号靶点Id1、miR21和miR27a的基因表达。这些发现为用氯喹等药物恢复细胞表面BMPR-II作为遗传性PAH的潜在治疗方法提供了支持。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
肺动脉高压(PAH)是一种进行性疾病，其特征是在肺循环中内皮细胞增殖、凋亡和血管通透性失调以及平滑肌细胞增殖(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．转化生长因子β (TGFβ)超家族，尤其是骨形态发生蛋白，在PAH的病理生物学中起着关键作用(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．骨形态发生蛋白受体II型(BMPR-II)基因的突变，编码骨形态发生蛋白受体II型(BMPR-II)，是至少70%的遗传性和10-40%的明显散发PAH病例的基础(gydF4y2Ba4 - 6gydF4y2Ba)．在肺动脉平滑肌细胞中，截断或错义突变导致bmp诱导的Smad1/5信号通路减少，DNA结合转录因子抑制剂(Id)的转录诱导减少(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．在BMPR-II中报告的大多数突变导致单倍功能不全状态(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
来自突变患者的内皮细胞增殖增加，无法形成血管网络(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．即使没有BMPR-II突变，该受体的缺乏也会导致非遗传形式的多环芳烃的病理(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．此外，常用的多环芳烃动物模型，包括小鼠的慢性缺氧或大鼠的单野百合碱暴露，显示肺中BMPR-II水平显著降低(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．此外，在这些模型中，BMPR-II靶向基因传递到肺血管系统可以预防肺动脉高压(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
我们实验室最近的研究表明，溶酶体抑制剂可能会增加细胞表面BMPR-II水平。我们之前发现卡波济肉瘤疱疹病毒E3连接酶K5将BMPR-II靶向于溶酶体。k5介导的降解可被选择性v型atp酶抑制剂卡卡霉素A抑制，暴露肺动脉内皮细胞(PAECs)和平滑肌细胞与卡卡霉素A导致BMPR-II表达显著增加(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
氯喹或与其密切相关的化合物羟氯喹最初被合成用于治疗疟疾，现在广泛用于治疗类风湿关节炎、红斑狼疮和结节病以及一些皮肤疾病(gydF4y2Ba16 - 20gydF4y2Ba)．此外，我们最近发现氯喹在以肺中BMPR-II表达缺失为特征的肺动脉高压大鼠模型中预防和逆转肺动脉高压(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．氯喹是一种溶酶促生成剂，因为它通常被制备为二质子弱碱(pKa 8.5)。氯喹的非富集形式优先积累在溶酶体，因为它迅速扩散穿过细胞/细胞器膜。一旦进入较低的pH值(4.6)，溶酶体氯喹的环境就会质子化，不再能自由扩散出去(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
在内皮细胞中，BMP/TGFβ信号通路是通过I型和II型受体的异二聚体受体复合物介导的(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)．BMP9和BMP10最近被确定为BMPR-II/Alk-1受体复合物的特异性配体，刺激受体Smad1/5/8通路的激活，以及Id基因的下游转录(gydF4y2Ba第23 - 25gydF4y2Ba)．我们实验室最近报道BMPR-II有助于BMP9刺激诱导PAECs中Smad1/5/8磷酸化和Id转录(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)．由于Alk-1突变也被证明可导致多环芳烃，内皮型BMPR-II/Alk-1受体复合物及其同源配体可能在该疾病的病理生物学中发挥核心作用(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
典型的BMP信号通路需要受体Smads (R-Smads)被激活的受体复合物磷酸化，随后与Smad4结合以转位到细胞核中。最近的研究表明，非规范的BMP信号可以直接影响microRNAs (miRs)的处理(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)．bmp已被证明可调节miR21、miR-100、miR-199a-5p和miR-27a等mir的表达(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba)．德雷克gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)的研究表明，miR21、miR27a和miR100的表达在PAECs中受到BMP9的调控，而BMP9依赖于完整的BMPR-II。gydF4y2Ba
在本研究中，我们确定了氯喹对内皮细胞中BMPR-II水平和BMP信号的影响。我们发现，在药理学相关浓度下，氯喹可迅速增加BMPR-II蛋白的细胞表面定位，但不改变Alk-1蛋白水平。我们第一次确定内源性BMPR-II在蛋白质合成阻断后迅速翻转，这一效应可被氯喹抑制。氯喹部分恢复内皮细胞中BMPR-II的表达，其中BMPR-II mRNA被敲除。对BMP9/BMPR-II靶基因Id1、miR21和miR27a的评估显示，氯喹恢复了BMPR-II中功能丧失突变的内皮细胞的信号传递。综上所述，这些发现支持氯喹增加BMPR-II表达的作用，作为遗传性PAH的潜在治疗干预。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
氯喹可增加内皮细胞中的BMPR-II蛋白水平gydF4y2Ba
我们试图研究用氯喹阻断溶酶体是否能显著增加内皮细胞中的BMPR-II水平。用卡卡纳霉素A (50 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或氯喹(100 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)显著增加BMPR-II蛋白水平，分别增加5.6倍和3.5倍(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。BMPR-II mRNA的转录没有显著升高，这表明BMPR-II的升高可能是由于溶酶体途径抑制(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).我们还试图确定通过K5介导的泛素化靶向BMPR-II的溶酶体降解是否可以被氯喹抑制(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．虽然不像卡卡纳霉素A那样明显，但氯喹治疗稳定表达K5的HeLa细胞部分恢复了BMPR-II蛋白水平(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)。此外，在微血管内皮细胞系中，氯喹显著增加了BMPR-II的表达水平(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)。同样，氯喹对任何细胞系中的BMPR-II基因表达均无影响(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba
用卡卡霉素A和氯喹抑制溶酶体显著增加内皮细胞内源性bpr - ii的表达。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba人PAECs用DMSO(载体)、马卡霉素A (50 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或氯喹(100 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．通过免疫印迹法评估BMPR-II的总表达，并重新检测α-微管蛋白以确保负载相等。定量BMPR-II的免疫印迹表达，表达量以BMPR-II与负荷对照之比表示。柱状图显示溶酶体抑制后bpr - ii相对于适当载体对照的倍增变化。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与对照组比较< 0.05 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BaBgydF4y2Ba)从处理后的PAECs中提取总RNA，制备cDNA。qPCR检测BMPR-II基因表达。表达式归一化为B2M，并表示为相对于对照的折叠变化。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba) HeLa细胞、HeLa- k5和HMEC-1细胞系用载液(DMSO)、卡卡纳霉素A (50 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba)和氯喹(100 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．通过免疫印迹法评估BMPR-II的表达，并重新检测α-微管蛋白以确保负载相等。（gydF4y2BaDgydF4y2Ba)从处理后的细胞株中提取总RNA，制备cDNA。qPCR检测BMPR-II基因表达。表达式归一化为B2M，并表示为相对于对照(HeLa +载体)的折叠变化。gydF4y2Ba
类风湿关节炎患者血浆氯喹水平变化范围为36.6 - 3895 ng/ml (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)．我们在这个范围内进行了浓度反应试验。分别用0、0.5、1、5、10和50 μ浓度处理PAECs 16 hgydF4y2Ba米gydF4y2Ba．0.5-50 μ处理gydF4y2Ba米gydF4y2Ba与无治疗对照组相比，氯喹以剂量反应方式增加了BMPR-II蛋白表达(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba补充材料，图S1gydF4y2Ba)．即使在较高浓度的氯喹，内皮特异性I型受体Alk-1的表达也没有受到显著影响(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA，灰色条)。gydF4y2Ba
氯喹在生理相关浓度下增加BMPR-II的表达和肺成纤维细胞的表面表达。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba用氯喹浓度0.5、1、5、10和50 μ处理人PAECs 16 hgydF4y2Ba米gydF4y2Ba．通过免疫印迹法评估BMPR-II的总表达，并重新检测α-微管蛋白以确保负载相等。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba)从处理后的PAECs中提取总RNA，制备cDNA。qPCR检测BMPR-II和Alk-1基因的表达。表达式归一化为B2M，并表示为相对于对照的折叠变化。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaNgydF4y2Bamrc5 - bpr - ii - gfp细胞分别用DMSO(载体)、卡卡纳霉素A (50 n . gfp)处理16 hgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或氯喹(100 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)并通过共聚焦显微镜进行评估。对细胞进行溶酶体标记物LAMP-1免疫染色，并用DAPI反染色。gydF4y2Ba
氯喹增加BMPR-II的细胞表面定位gydF4y2Ba
接下来，我们试图研究溶酶体抑制是否影响BMPR-II细胞表面定位。稳定表达gfp标记的BMPR-II的MCR5肺成纤维细胞系在玻璃载玻片中培养，并用相关载体，豆加霉素A (50 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或氯喹(100 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba共聚焦显微镜下，gfp标记的BMPR-II定位于载药对照组的细胞表面(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba氟)。用卡卡纳霉素A治疗后，gfp标记的受体与溶酶体标记物LAMP-1共定位(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaG-J)。在这些条件下，在细胞表面观察到很少的受体，这表明受体的快速周转和在溶酶体中的积累。用氯喹处理也会导致溶酶体积累，但也似乎增加了细胞表面gfp标记的BMPR-II(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bak - n;箭头)。gydF4y2Ba
为了确定BMPR-II细胞表面定位，利用细胞表面受体的生物素化。用载体、卡卡纳霉素A (50 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba)和氯喹(100 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．非生物素化对照组的BMPR-II在总裂解液中基本表达，而单独用亲和素-琼脂糖珠在表面无表达。与对照对照相比，卡卡纳霉素A和氯喹都增加了细胞裂解液BMPR-II的总表达，但只有氯喹似乎增加了BMPR-II的表面表达(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).生物素化也被用于测定氯喹浓度反应后内源性BMPR-II在PAECs中的表面表达。生物素化分析显示氯喹的所有浓度(0.5 ~ 50 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)增加BMPR-II的表面表达(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB;箭头)。因此，浓度为10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba氯喹在病人体内反映了较高的稳态血药浓度，被选择用于进一步的实验。gydF4y2Ba
氯喹在生理相关浓度下增加BMPR-II的细胞表面表达。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)处理后的mrc5 - bpr - ii - gfp细胞表面蛋白生物素化，并通过免疫印迹法评估生物素化下拉和细胞总裂解液中bpr - ii的表达。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba用氯喹在0.5、1、5、10和50 μ的浓度下处理人PAECs 16 hgydF4y2Ba米gydF4y2Ba．生物素化表面蛋白，通过免疫印迹法评估生物素化部分和总细胞裂解液中BMPR-II的表达。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)进行0、0.5、1、2、4和16 h。通过免疫印迹法评估总BMPR-II的表达，并重新检测α-微管蛋白，以确保负载相等。（gydF4y2BaDgydF4y2Ba用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)处理0、0.5、1、2、4和16 h。从处理的细胞株中提取总RNA，制备cDNA。qPCR检测BMPR-II基因表达。表达归一化为B2M/β-actin，并以相对于对照组(0 h)的倍数变化表示。gydF4y2Ba
我们接下来试图确定氯喹作用于BMPR-II表达的时间过程。用10 μ氯喹处理PAECsgydF4y2Ba米gydF4y2Ba0.5、1、2、4和16 h。氯喹处理2 - 4 h后BMPR-II蛋白水平升高(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC).在这些时间点未观察到BMPR-II mRNA水平明显升高(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba
氯喹抑制细胞表面BMPR-II的降解gydF4y2Ba
为了确定氯喹对BMPR-II表达的影响，了解内源性受体的周转是至关重要的。通过在一段时间内用环己亚胺阻断蛋白质合成来研究BMPR-II调控的动态。用20 μg/ml环己亚胺处理PAECs 0、0.5、1、2和4 h，检测BMPR-II蛋白和基因表达。早在1小时就观察到总受体表达的丧失(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA). BMPR-II基因表达在整个时间过程中未受影响(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB;白色的酒吧)。阻断蛋白质合成对Alk-1蛋白和基因表达没有影响(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA和B;灰色酒吧)。gydF4y2Ba
氯喹治疗可抑制BMPR-II的快速周转。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba环己亚胺(20 μg/ml)抑制人PAECs蛋白合成。在蛋白合成阻断0、0.5、1、2、4小时后评估蛋白表达。通过免疫印迹法评估总BMPR-II和Alk-1表达，并重新检测α-微管蛋白以确保负载相等。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba)从处理后的PAECs中提取总RNA，制备cDNA。qPCR法检测BMPR-II和Alk-1基因的表达。表达式归一化为B2M，并表示为相对于对照的折叠变化。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba人PAECs用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)在抑制蛋白质合成之前。通过免疫印迹法评估BMPR-II的表达，并重新检测α-微管蛋白以确保负载相等。（gydF4y2BaDgydF4y2Ba)从处理后的PAECS中提取总RNA，制备cDNA。qPCR检测BMPR-II基因表达归一化至B2M，并以相对于对照的倍数变化表示。gydF4y2Ba
为了确定氯喹是否改变蛋白合成抑制后BMPR-II的损失，用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)在环己亚胺治疗前16小时。如前所述，BMPR-II的表达在1小时后迅速消失，但用氯喹处理后2小时后仍保持表达(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)。同样没有观察到BMPR-II基因表达的显著影响(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaD)。1-2小时后，pasmc中BMPR-II也迅速丢失(gydF4y2Ba补充材料，图S2gydF4y2Ba)．此外，16小时氯喹处理PASMCs维持BMPR-II表达超过2-4小时的蛋白质合成阻断。gydF4y2Ba
由于氯喹预处理16小时不可避免地增加了BMPR-II的表达，我们也进行了实验，用氯喹预处理PAECs仅1小时，BMPR-II蛋白水平与时间0相似gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA)。在抑制蛋白合成之前，氯喹处理的BMPR-II表达的正常化显示，氯喹显著增加并维持BMPR-II表达直到2小时(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba
氯喹在抑制蛋白合成后显著维持BMPR-II的表达。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)在抑制蛋白质合成前1小时。通过免疫印迹法评估BMPR-II的表达，并重新检测α-微管蛋白以确保负载相等。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba)定量BMPR-II表达免疫印迹，表达量以BMPR-II:负荷对照之比表示。BMPR-II表达归一化至车辆时间0 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3). *gydF4y2BaPgydF4y2Ba与对照组相比< 0.05。gydF4y2Ba
氯喹在siRNA敲除后恢复BMPR-II蛋白水平gydF4y2Ba
遗传和非遗传形式的多环芳烃通常以BMPR-II蛋白表达减少为特征(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．因此，我们试图用RNA干扰重现疾病中受体表达减少的现象。在我们之前的研究中，用10 n沉默BMPR-IIgydF4y2Ba米gydF4y2BasiRNA的敲除效率超过90% (gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)．因此，siRNA的连续稀释被用来重建“单倍不足”水平的BMPR-II蛋白表达。分别用10、1、0.1和0.01 n转染PAECsgydF4y2Ba米gydF4y2BaBMPR-II。48小时后，评估蛋白质和转录本水平的敲除效率。浓度为0.1 ngydF4y2Ba米gydF4y2BasiRNA降低BMPR-II蛋白(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaA)和mRNA(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)与转染对照组相比，表达水平降低了~ 50%。考虑到PAEC供体之间的可变性，浓度为0.1和1 ngydF4y2Ba米gydF4y2BasiRNA用于后续实验，以确定氯喹是否可以挽救BMPR-II蛋白的表达。除了在32小时后用氯喹处理细胞16小时外，BMPR-II的敲除与之前相同。在浓度为1 n的siBMPR-II敲除中，BMPR-II的表达降低到~ 50%的水平gydF4y2Ba米gydF4y2Ba．三个独立实验的密度测定显示，氯喹处理使BMPR-II水平在0.1和1 n敲除后分别提高了2.2倍和6.5倍gydF4y2Ba米gydF4y2Ba分别为siRNA(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba
氯喹增加了内皮细胞中BMPR-II蛋白的表达，但BMPR-II基因表达减少了~ 50%。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)分别在0.01、0.1、1或10 n转染siBMPR-II或siCPgydF4y2Ba米gydF4y2Ba使用Dharmafect1 (DH)。免疫印迹法检测总BMPR-II蛋白表达。重新检测α-微管蛋白印迹以确保负载相等。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba)制备总RNA和cDNA。qPCR检测BMPR-II的表达，其表达归一化至B2M，表达为相对于dh转染细胞的倍数变化。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba以0.1 n或1 n转染siBMPR-II或siCPgydF4y2Ba米gydF4y2Ba使用Dharmafect1 (DH)。32 h后，用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．免疫印迹法检测BMPR-II蛋白表达。重新检测α-微管蛋白印迹以确保负载相等。数据来自三个实验。gydF4y2Ba
氯喹不抑制bmp介导的Smad信号通路和靶基因转录gydF4y2Ba
由于氯喹抑制BMPR-II的内化，这种干预可能会对受体下游的信号传导产生不利影响。此外，氯喹的脱靶效应可能会对BMP信号传导产生负面影响。为了评估这一点，在氯喹(10 μ)存在下，用BMP9 (1 ng/ml)刺激PAECsgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)．下游信号通过检测典型Smad1/5/8蛋白磷酸化和Id1转录进行评估。细胞先用氯喹预处理16小时，再用BMP9刺激1小时和4小时。如前所述，BMP9刺激增加了BMPR-II蛋白和基因表达(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba如本研究之前所述，氯喹显著增加了BMPR-II蛋白的表达，但没有增加mRNA的表达(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaBMP9处理1和4小时后Smad1/5/8的磷酸化都增加了，而氯喹对其没有影响(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA). BMP9有效地增加了Id1基因的表达，特别是在刺激1 h后(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC).再次，氯喹治疗未影响这表明阻断溶酶体对内皮细胞中的BMP信号传递没有有害影响。事实上，在BMP9暴露8小时后，Smad1/5/8磷酸化和Id1表达不受氯喹影响(gydF4y2Ba补充资料，图S3A-CgydF4y2Ba)．此外，在氯喹存在的BMP9处理后检测p38MAPK磷酸化时，未观察到smad独立信号的明显增加(gydF4y2Ba补充材料，图S4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
BMP9治疗后的典型Smad信号不受氯喹治疗的影响。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba人PAECs用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或生长因子受限条件下的车辆。用BMP9 (1 ng/ml)处理细胞1或4小时。用抗BMPR-II、phospho-Smad1/5/8或total Smad1抗体进行免疫印迹。用α-微管蛋白重新检测印迹以确保负载相等。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCgydF4y2Ba人PAECs用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或生长因子受限条件下的车辆。用BMP9 (1 ng/ml)处理细胞1或4 h，提取总RNA，制备cDNA。qPCR检测BMPR-II (B)和Id1 (C)的表达。表达归一化为B2M，表达为相对于对照的折叠变化(EBM-2/2% FBS)。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与对照组相比< 0.001。数据为平均值±SEM (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2Ba
氯喹增加BMPR-II蛋白表达，并改善含有BMPR-II突变的内皮细胞的下游信号gydF4y2Ba
最初，我们证实了来自BMPR-II突变患者的内皮细胞缺乏bmp9介导的信号传导。静息后，对照组和BMPR-II单倍不足血生长内皮细胞(BOECs)用BMP9 (1 ng/ml)处理4和12小时。12小时后，与对照组相比，突变BOECs的Id1表达显著降低(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba此外，在BMP9刺激20小时后，单倍不足的BMPR-II PAECs中Id1的表达也显著降低(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba
通过氯喹处理，bpr - ii突变细胞中减少的Id1, miR21和miR27a的表达得以恢复。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba将人血生长内皮细胞(BOECs)在0.1%的血清中静置过夜，然后用BMP9 (1 ng/ml)处理4和12小时。用qPCR检测Id1的表达，归一化至β-actin。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与BMP9处理12 h的对照组PAECs相比< 0.05。数据为平均值±SEM (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3/4)。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba人PAECs用BMP9处理(3 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba)在总RNA提取前20小时。采用qPCR法检测Id1、miR21和miR27a的表达。miR21和miR27a表达归一化为RNU48, Id1表达归一化为GAPDH。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba在BMP9刺激20小时之前，提取总RNA，并按上述方法测定miR21、miR27a和Id1的表达。对三种独立的RNA制剂分别进行三次定量PCR检测。折叠变化计算为BMP9与载体处理细胞在每种条件下转录本的商数。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与相关对照组比较< 0.001。数据为平均值±SEM (gydF4y2BangydF4y2Ba= 9)。gydF4y2BaDgydF4y2Ba用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或载体4或16小时。用BMPR-II抗体进行免疫印迹，并用α-微管蛋白重新标记印迹，以确保负载相等。由于突变PAECs中BMPR-II水平较低，需要不同的暴露时间。gydF4y2Ba
德雷克gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)最近观察到miR21和miR27a的表达受BMP9的调控。在该研究中，bmp9刺激的miR21和miR27a水平被BMPR-II的RNA干扰完全取消。因此，我们评估了氯喹对这些microRNAs加工和Id1基因表达的影响。对照和BMPR-II单倍不足的PAECs先用氯喹预处理4/16小时，然后用BMP9刺激20小时。BMP9刺激对照PAECs诱导miR21和miR27a表达(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2BaB).正如预期的那样，在BMP9存在的情况下，单倍不足的PAECs对这些目标的诱导很少。氯喹预处理16 h后，对对照细胞miR21和miR27a的加工无影响。BMPR-II突变(外显子1-8缺失)的PAH患者的paec显示BMP9刺激的miR21、mir27a和Id1水平显著降低(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2BaC)。在BMP9存在的情况下，氯喹处理单倍不足的PAECs显著增加了Id1、miR21和miR27a的表达(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaC)。在氯喹预处理4小时后和随后暴露于BMP9后观察到类似的显著结果(gydF4y2Ba补充材料，图S5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
对照组和突变体PAECs分别用氯喹预处理4和16小时，检测BMPR-II蛋白表达。对照组细胞在氯喹处理4和16小时后观察到BMPR-II水平升高(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2BaD)。显著的是，在用氯喹处理4和16小时的细胞中，观察到单倍不足的PAECs中BMPR-II蛋白表达增加(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaD)。我们进一步评估了氯喹对两名BMPR-II突变患者(R320X和R548X) boec的影响。氯喹处理显著增加突变boec中4和16小时后BMPR-II的总表达(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba补充材料，图S6gydF4y2Ba)．突变PAEC系和单倍不足BOEC系的密度测定证实，在氯喹存在时bpr - ii的表达显著增加(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2BaB). BMPR-II突变体R320X BOECs在BMP9刺激20 h后，与对照组相比，Id1表达显著降低(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC)。此外，16小时氯喹预处理显著增加了BMP9存在时Id1的表达(图。gydF4y2Ba9gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba
氯喹处理显著增加突变boec中BMPR-II蛋白的表达并挽救Id1基因的表达。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)或载体4或16小时。用BMPR-II抗体进行免疫印迹，并用α-微管蛋白重新标记印迹，以确保负载相等。（gydF4y2BaBgydF4y2Ba)定量BMPR-II表达免疫印迹，表达量以BMPR-II:负荷对照之比表示。柱状图显示氯喹治疗后BMPR-II相对于对照组的倍增变化(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3). *gydF4y2BaPgydF4y2Ba与对照组相比< 0.05。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba人boec用氯喹(10 μgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)在BMP9前16小时(3 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba提取总RNA, qPCR检测Id1的表达。表达归一化为β-肌动蛋白，表达为相对于对照的倍数变化。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05和**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与对照组相比< 0.01。数据为平均值±SEM (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
II型骨形态发生蛋白受体在多环芳烃中起关键作用。在发现突变的情况下，在肺中观察到BMPR-II表达减少。此外，没有BMPR-II突变的特发性病例和疾病的动物模型都与肺BMPR-II蛋白水平的显著降低有关(gydF4y2Ba10 - 13gydF4y2Ba)．因此，维持BMPR-II细胞表面表达的能力在PAH的治疗中具有特别的意义。gydF4y2Ba
我们最近的研究强调了通过抑制溶酶体靶向调控BMPR-II的潜力(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．我们最近也报道了用氯喹治疗暴露于野百合碱的大鼠不仅能抑制该模型中PAH的发展，而且还能增加肺BMPR-II蛋白水平，这与我们观察到的溶酶体阻断剂增加受体的内源性表达一致(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．调控BMPR-II表达水平的潜在机制尚不清楚。gydF4y2Ba
在这里，我们报告氯喹能够部分恢复K5介导的泛素化和下调HeLa细胞中的BMPR-II，这与我们之前使用卡卡纳霉素A的发现相似(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．虽然这两种抑制剂都通过影响溶酶体酸化来阻断溶酶体降解途径，但它们对BMPR-II定位的影响不同。仙人掌霉素A是一种选择性的液泡atp酶抑制剂。液泡atp酶是定位于许多细胞内细胞器膜的质子泵，主要调节细胞内pH值(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba)．加卡那霉素A的抑制作用立即增加腔内pH值(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)．值得注意的是，巴菲霉素AgydF4y2Ba1gydF4y2Ba另一种大环内酯类抗生素已被证明可完全消除EGF溶酶体降解，但对配体内化和内吞作用无影响(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)．仙人掌霉素A和其他大环内酯类药物的高毒性妨碍了它们在临床治疗中的应用。氯喹的作用模式是作为弱亲脂性碱，其中游离碱很容易通过膜(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)．它在酸性溶酶体中积累，因为它被质子化，增加了溶酶体的pH值(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)．接触卡卡霉素A后，bpr - ii在溶酶体中积累，但使用氯喹治疗后，除了一定程度的溶酶体积累外，质膜上的bpr - ii似乎增加了。由于已知BMPR-II可通过溶酶体降解(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)，我们推测抑制BMPR-II的溶酶体降解导致蛋白在该细胞器内的积累，正如我们在共聚焦成像研究中观察到的那样。Massagué及Kelly (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)报道，在TGFβ结合配体:受体复合物迅速内化溶酶体降解，并被氯喹治疗阻断。此外，他们假设TGFβ受体是通过细胞内池的循环来补充的。因此，氯喹可能的治疗益处之一可能是维持细胞表面的BMPR-II。鉴于目前缺乏针对细胞外区域的抗体来评估BMPR-II的细胞表面表达，我们采用了另一种方法。为了测量在氯喹存在下BMPR-II细胞表面表达的增加，利用生物素标记细胞表面分子。gydF4y2Ba
在本研究中，我们试图描述氯喹对内皮中BMPR-II水平的影响。最近的研究使用胎羊持续肺动脉高压模型的PAECs描述了受损的血管生成，可以通过氯喹抑制自噬来挽救(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)．然而，目前还没有文献描述氯喹对内皮细胞BMPR-II的调节作用。这项研究中最引人注目的观察是氯喹维持BMPR-II表面表达的明显能力，特别是在药理学相关浓度下。BMPR-II蛋白表达的增加不依赖于BMPR-II转录的增加。我们还发现BMPR-II蛋白水平在蛋白合成抑制后迅速降低。相反，内皮特异性I型受体Alk-1的蛋白表达不受影响。哈gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)之前报道过I型和II型BMP受体经历了构成型内吞作用。这些研究是在成纤维细胞样COS7和小鼠成肌细胞C2C12细胞系中进行的。然而，这些观察结果支持了我们的发现，即BMPR-II的表达在蛋白质合成被阻断后迅速丢失。氯喹可部分抑制BMPR-II的快速损失。gydF4y2Ba
拯救减少受体表达的能力可能是治疗多环芳烃的关键因素。大多数遗传性或特发性PAH病例，其中BMPR-II突变被确定，是由于无义，移移和剪接位点缺陷。这导致BMPR-II转录本过早终止，因此通过无意义介导的衰变而丧失表达(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)．在这些个体中预测BMPR-II单倍性不足，BMPR-II表达减少50%。我们试图通过滴定先前使用的BMPR-II siRNA来重建这种表达水平(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)．使用10 - 100倍的siRNA稀释，我们能够模拟与BMPR-II突变相关的表达水平的降低(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．氯喹治疗部分恢复受体表达水平，其中BMPR-II水平为50%或更低。更重要的是，氯喹治疗来自BMPR-II突变患者的内皮细胞部分挽救了BMPR-II蛋白的表达。gydF4y2Ba
阻止BMP - ii的细胞表面转换可能会损害BMP信号。我们测定了氯喹对BMP9诱导的Smad信号及其下游转录因子Id1的影响。在对照PAECs中，氯喹对BMP9介导的典型信号传导过程没有损害。德雷克之前报道过gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)，我们证实了BMPR-II突变的PAECs和BOECs在BMP9诱导Id1表达和加工microRNAs、miR21和miR27a方面存在缺陷。这与我们之前的报告形成对比，我们在之前的报告中使用siRNA敲低BMPR-II和ActR-IIa，表明BMP9在PAECs中诱导Id基因表达是共同依赖于这些受体的(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)．这突出了受体的实验敲低和内源性突变受体研究之间的重要区别。然而，在本研究中，在携带BMPR-II突变的细胞中，我们证明氯喹治疗BMPR-II突变内皮细胞可以挽救这些下游BMP9/BMPR-II靶标的表达。我们的研究结果表明，在正常内皮细胞表面增强BMPR-II的表达并不会进一步增加对配体的响应信号，相反，我们的研究结果表明，BMPR-II限制了BMP信号在较低水平的受体表达。在这种情况下，在BMPR-II单倍不足的情况下，氯喹能够增强BMP信号。BMPR-II的这种基因剂量效应此前已有报道gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba（gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)．目前，尚不确定干预突变BMPR-II通路的最佳点是受体本身水平，还是下游信号。因此，在受体下游BMP信号缺乏的情况下，增强的BMPR-II表达水平可能无效。然而,在gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在肺动脉高压大鼠模型中，有几种机制可能介导BMP信号的丢失，我们已经证明氯喹可以预防疾病的发生和发展(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
本研究首次报道了BMPR-II的动态调控，以及利用一种广泛应用的治疗药物调节细胞表面表达的可能性。然而，除了氯喹潜在的非特异性作用外，关于BMPR-II在内皮细胞中的降解和周转机制还存在几个问题。众所周知，4-氨基喹诺酮类药物具有广泛的作用。除了修饰溶酶体酸化外，它们还被证明可以靶向参与内吞降解的其他分子。氯喹在溶酶体中的积累抑制磷脂酶A2 (gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)．最近研究表明，细胞质磷脂酶A2的拮抗剂可抑制多种内吞途径(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)．在这种情况下，氯喹可能通过溶酶体抑制以外的另一种机制在细胞表面维持BMPR-II。gydF4y2Ba
有几篇报道详细介绍了TGFβ超家族受体降解的内吞途径。特别是哈同gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)建立了网格蛋白和小泡介导的内吞作用在BMPR-II的处理过程中的作用。此外，他们发现BMPR-II与网格蛋白包被凹(ccp)的关键成分Eps15R和小穴穴的主要成分小穴穴蛋白-1相互作用。BMPR-II也显示，利用荧光共振能量转移，结合CCPs的另一个关键成分，适配器蛋白复合体2 (AP2)。CCPs的破坏增加了C2C12s的Smad信号和成骨，这表明CCPs作为抑制膜结构域(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
最近的研究强调了小穴蛋白-1在血管信号传导和肺动脉高压中的重要性。据报道，BMPR-II定位于PAECs的富脂膜结构域，并与小穴蛋白-1共同定位(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)．穴蛋白-1在血管平滑肌细胞信号传递中也很重要。使用RNA干扰靶向减少小穴蛋白-1导致BMP信号减少(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)．此外，小穴蛋白1敲除小鼠出现右心室肥厚和肺动脉压升高(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)．在PAH患者中发现了BMP/Smad信号级联的几个成员的突变，包括Alk-1、endoglin和Smad8。最近,奥斯丁gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)首次在一个遗传性多环芳烃家族和一个特发性多环芳烃个体中发现了小穴蛋白-1的移码突变。因此，在肺动脉高压中BMP信号的调节和胞吞作用之间提供了联系。尽管有这些考虑，氯喹和羟氯喹在临床实践中被广泛应用，根据我们目前和最近的发现，在临床研究中，作为BMP信号通路受损的PAH中的增强剂，氯喹和羟氯喹是值得研究的(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
综上所述，我们的研究结果为针对PAH中BMPR-II受体的降解(与BMPR-II缺陷或突变相关)以恢复下游信号和功能提供了概念证明。进一步阐明BMPR-II通过溶酶体从细胞表面降解的机制可能为干预提供额外的特异性靶点。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
人paec购自英国Workingham的Lonza公司。细胞维持在完全内皮细胞生长培养基-2 (EGM-2)中，并在传代4-8时使用。如前所述，从BMPR-II种系突变(外显子1-8缺失)的PAH患者中分离出PAECs (gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)．如前所述分离boec (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．细胞维持在完整的EGM-2中，并在传代5-7时使用。转化的人微血管内皮细胞系(HMEC-1)来自美国疾病控制中心(CDC，亚特兰大，佐治亚州，美国)，并在MDCB131培养基(Life Technologies，佩斯利，英国)中保持，该培养基含有15%胎牛血清(FBS) (Life Technologies)、10 ng/ml EGF、1 ng/ml氢化可可松(Sigma-Aldrich，普尔，多塞特，英国)和抗生素。人类肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)在我们的实验室中通过外植体分离和培养，如前所述(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)．恒生化MRC5 (SV40T)肺成纤维细胞稳定表达人野生型BMPR-II-GFP (MRC5-BMPR-II-GFP)按照前面描述的方法进行培养(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)．HeLa细胞系在添加10%胎牛血清和抗生素的DMEM中培养。HeLa K5稳定细胞系的创建和培养如前所述(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．马卡霉素A溶解在DMSO中，最终浓度为50 ngydF4y2Ba米gydF4y2Ba注射16小时。氯喹(gydF4y2BaNgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(7-Chloro-4-quinolinyl)gydF4y2BaNgydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-二甲基-1,4-戊二胺二磷酸盐)溶解在无菌无核酸酶水中，并以不同的浓度和时间使用(均为Sigma-Aldrich)。环己亚胺溶于无菌无核酸酶水中，用量为20 μg/ml (Sigma-Aldrich)。关于BMP9处理，请参见相关图例。gydF4y2Ba
mRNA定量逆转录pcrgydF4y2Ba
根据制造商的方案，使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen, Crawley, UK)提取总RNA，并进行柱上dna酶消化。按照制造商说明书所述，使用高容量逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Warrington, UK)对总RNA (1000 ng)进行逆转录。使用SYBR®-Green JumpStart™Taq ReadyMix™(Sigma-Aldrich)和相关的正反意义引物以及ROX参考染料(Life Technologies)对合成的互补DNA进行扩增。以下引物序列用于BMPR-II(义5 ' -caaatctgtgagcccaacagtcaa-3 '，反义5 ' -gaggaagaataatctggataaggaccaat-3 ');β-肌动蛋白(义5 ' - gcaccacaccttctacaatga-3 '，反义5 ' -gtcatcttctcgcggttggc-3 ')。定量引物测定Alk-1、ID1、GAPDH和β2-微球蛋白(B2M) (Qiagen)。反应在StepOnePlus™实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行扩增。使用ΔΔCT方法将目标mRNA的相对表达归一化为GAPDH、β-actin或B2M (gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)，并表示为相对于相关对照的折量变化。gydF4y2Ba
microRNA定量逆转录pcrgydF4y2Ba
使用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)提取总RNA。miR21和miR27a使用TaqMan microRNA试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行量化，并如前所述归一化至RNU48 (gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
RNA干扰gydF4y2Ba
PAECs在60mm培养皿中(4.38 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/孔)用于蛋白质或六孔板(2 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/孔)，在EGM-2中培养48小时。转染前，将PAECs在Opti-MEM I (Life Technologies)中孵育3-4小时。分别用0.01、0.1、1或10 n转染PAECsgydF4y2Ba米gydF4y2BasiRNA (BMPR-II (Dharmacon siGENOME SMARTpool)或siccontrol非靶向(均为Dharmacon On-TARGETplus) (Perbio Science, Erembodegem-Aalst, Belgium)与DharmaFECT1 (8.75 μl/孔/ 60mm培养皿或4 μl/孔/ 6孔培养皿)在Opti-MEM i中稀释后，在37℃下与siRNA:DharmaFECT1复合物孵育4小时，然后用EGM-2替换。在可能的情况下，通过qPCR和western blotting验证敲除效率。gydF4y2Ba
西方墨点法gydF4y2Ba
细胞在60mm培养皿中培养至融合，然后进行相关处理(详见结果部分)。细胞在150 μl的冰溶液(50 mgydF4y2Ba米gydF4y2BaTris-HCl, pH 8;150米gydF4y2Ba米gydF4y2Ba生理盐水;1% igepal ca-630;0.5%脱氧胆酸盐;0.1% SDS和1x无edta蛋白酶抑制剂鸡尾酒)(罗氏，西苏塞克斯，英国)，在10000离心10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba．蛋白质浓度采用Bio-Rad Lowry法(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK)测定，以牛血清白蛋白(BSA)为标准。各样品取等量蛋白，用5×上样缓冲液稀释，煮沸5分钟。SDS-PAGE凝胶分离细胞裂解液(总蛋白40 ~ 80 μg)，半干印迹法将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上。印迹被阻断，并用相关抗体进行检测。BMPR-II小鼠单克隆(BD transduclaboratories, NJ, USA);小鼠GFP单克隆(Roche);phospho-Smad1/5/8兔多克隆，total Smad1兔多克隆，phospho-p38MAPK和total p38MAPK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)。Alk-1兔多克隆是D Marchuk教授(Duke University, NC, USA)的善意礼物。用适当的辣根过氧化物酶偶联抗体和增强化学发光试剂(GE生物科学公司，英国Little Chalfont)培养印迹。为确认负载相等，用抗-α-微管蛋白抗体(Sigma-Aldrich)培养印迹。gydF4y2Ba
细胞表面生物素化gydF4y2Ba
方法改编自RennoldsgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．（gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)．PAECs或MRC5-BMPR-II-GFP细胞接种于60mm培养皿(4.38 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba或7 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/孔)，治疗前培养48小时。细胞按照相关结果部分的描述进行处理。治疗后，将细胞放在冰上，用冰冷的PBS冲洗两次。用ph8含1 m的PBS冲洗细胞一次gydF4y2Ba米gydF4y2BaMgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和0.1 mgydF4y2Ba米gydF4y2BaCaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(PBS-pH8)，然后用新鲜制备的EZ-Link™nhs - ss -生物素以3mg /ml (Perbio Science)在PBS-pH8中孵育10分钟。生物素化通过用含有1% BSA的PBS洗两次碗(猝灭任何未结合的nhs - ss -生物素)，然后孵育10分钟来终止。孵育后，用PBS清洗细胞，然后用1ml PBS (1% Triton X100和1x无edta蛋白酶抑制剂鸡尾酒)裂解细胞。将avidin -琼脂糖珠(Pierce Protein Research Products, Rockford, IL, USA)加入900 μl裂解液中，在4℃旋转过夜。剩余100 μl用于总蛋白测定。然后通过离心收集生物素-亲和素琼脂糖复合物，并用裂解缓冲液洗涤三次。然后在5×样品加载缓冲液中重悬，在SDS-PAGE前煮沸5分钟。gydF4y2Ba
免疫荧光gydF4y2Ba
将MRC5-BMPR-II-GFP细胞接种到BD Falcon™玻璃载玻片上(BD Biosciences)，并在治疗前培养48小时。处理后，用PBS清洗腔室载玻片，用1:1的丙酮:甲醇固定渗透。染色前用10%胎牛血清在PBS中阻断细胞。用1:200的小鼠抗人LAMP-1一抗(Dako, Ely, UK)和1:500的兔抗小鼠TRITC二抗(Dako)检测LAMP-1。用PBS清洗腔室载玻片三次，并装入甘油/PBS溶液DAPI (vectasshield, Peterborough, UK)。使用共聚焦显微镜(徕卡TCS SPE)观察和拍摄细胞，并使用徕卡LAS AF软件捕获图像。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
使用Student 's进行统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01和***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项工作得到了英国心脏基金会计划拨款RG/03/005 (N.W.M.)的支持。剑桥国家卫生研究院生物医学研究中心提供了基础设施支持。额外的支持由Leducq基金会(N.W.M.)提供，部分由NHLBI/NIH支持，奖励号R01HL098199 (M.A.A.)。英国心脏基金会为支付本文的开放获取出版188滚球软件费用提供了资金。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢Suzy Comhair和Serpil Erzurum(克利夫兰诊所病理生物学和呼吸研究所，俄亥俄州克利夫兰)为细胞提供BMPR-II突变。作者也要感谢d.a Marchuk教授(分子遗传学和微生物学系，杜克大学医学中心，达勒姆，北卡罗来纳州)慷慨地提供Alk-1抗体。gydF4y2Ba
利益冲突声明gydF4y2Ba．没有宣布。gydF4y2Ba
