摘要gydF4y2Ba
特发性肺动脉高压发展的一个重要的发病机制被假设为癌样细胞增殖独立于血流动力学。然而，由于血管病变与血流动力学应力是不可分离的，当血流动力学应力被消除时，病变的命运是未知的。gydF4y2Ba
我们应用左肺动脉带束治疗晚期肺动脉高压大鼠模型，研究血流动力学压力降低对闭塞性血管病变的影响。大鼠注射VEGF阻断剂Sugen5416，缺氧3周，正常缺氧7周(共10周)(SU/Hx/Nx大鼠)。在注射SU5416前1周或注射逆转后5周进行减少左肺血流动力学压力的绑带手术。SU/Hx/ nx暴露的大鼠均出现严重的肺动脉高压和右心室肥厚。组织学分析显示右肺无条带状病变，包括血管丛状病变，血管周围细胞明显聚集。相反，将左肺动脉束扎不仅可以阻止左肺闭塞病变的发展，而且还可以逆转左肺血管周围的炎症。gydF4y2Ba
我们的结果表明，血流动力学应激是严重肺动脉高压模型大鼠闭塞性内膜病变发展和进展的先决条件。我们认为血管周围炎症和闭塞性新内膜动脉病变是由血流动力学应激驱动的。gydF4y2Ba
1.介绍gydF4y2Ba
肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension, PAH)是一组以小肺动脉进行性狭窄/闭塞(Pulmonary artery, PAs)为特征的疾病，其结果是肺血管阻力增加和严重的肺动脉高压。导致血管狭窄的主要因素是持续的血管收缩和结构重塑。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba尽管最近在治疗方面取得了进展，但目前可用的治疗方法并不令人满意。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba因此，更好地了解PAH的发病机制和更有效的治疗方案势在必行。gydF4y2Ba
目前关于PAH发病机制，特别是特发性PAH (IPAH)的主要假设是，在多次受损伤后，小PAs中的细胞发生不依赖血液动力学的表型变化，成为抗凋亡和高度增殖的，从而导致严重的管腔狭窄/闭塞(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba3–5gydF4y2Ba这一概念得到了临床发现的间接支持，例如血管扩张剂在急性和慢性两种情况下均无效，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba以及在重塑的PAs中出现高度增殖的凋亡抵抗细胞。gydF4y2Ba6–8gydF4y2Ba然而，关于这一概念仍然存在不确定性，因为我们从未能够通过实验测试，如果消除血流动力学应力，将会对已建立的闭塞性内膜病变发生什么。事实上，单肺移植gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba或者肺动脉束带gydF4y2Ba11gydF4y2Ba据报道，肺动脉高压闭塞病变出现消退，尽管消退程度可能取决于高血压动脉血流减少的程度和持续时间。gydF4y2Ba
在本研究中检验了一个显示当前主导假说(左侧)和复活假说(右侧)的图式。LPAB:左肺动脉束带;PAP:肺动脉压;PVR，肺血管阻力。gydF4y2Ba
在本研究中检验了一个显示当前主导假说(左侧)和复活假说(右侧)的图式。LPAB:左肺动脉束带;PAP:肺动脉压;PVR，肺血管阻力。gydF4y2Ba
最近的研究强调慢性炎症是PAH发病机制中的一个关键因素。此外，据报道，异常的血流动力学应激可在肺和体循环中诱导炎症反应。gydF4y2Ba12 - 14gydF4y2Ba因此，我们假设，在PAH中，严重的持续血流动力学应激对于通过诱导血管周围炎症发生闭塞性肺动脉重塑的发展和进展至关重要(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
为了验证这一假设，我们使用了两个已建立的模型，左肺动脉束带(LPAB)减少左肺血流和血流动力学应力(血流动力学卸载)。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2BaSugen5416/缺氧/常氧(SU/Hx/Nx)暴露大鼠，其组织学和血流动力学与人类IPAH相似。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba
2.方法gydF4y2Ba
所有实验方案均由日本九州大学动物护理和使用委员会批准，所有动物操作均遵循NIH《实验室动物护理和使用指南》(NIH出版物，第八版，2011)的原则进行。gydF4y2Ba
2.1 SU5416/缺氧/常氧(SU/Hx/Nx)暴露大鼠gydF4y2Ba
成年雄性Sprague-Dawley大鼠体重200-250 g，皮下注射SU5416 (20 mg/kg, Cayman Chemical, MI, USA)，缺氧(10% OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba) 3周后恢复正常(21% OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，另加2至7周。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba
2.2左肺动脉带束gydF4y2Ba
对大鼠进行LPAB手术，如前所述，只做了轻微的修改。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba简单地，在戊巴比妥钠(30 mg/kg, IP)麻醉下，整个过程中大鼠插管和通气(潮气量，1.0 mL;呼吸速率。100 /分钟)。异氟醚吸入麻醉用于维持外科麻醉水平。在无菌条件下，在第三肋间隙行左开胸手术，然后切开肋间肌肉。打开胸膜，动左肺。定位左肺门，4-0丝线位于左肺动脉下。将25号针(外径0.51 mm)紧扎在左肺动脉旁。然后，迅速取出针头，在腔内形成一个与针头直径相等的固定狭窄开口。随后，在肋间隙用2-0聚二氧杂酮环封闭胸部。 Muscle and skin layers were closed with 4-0 polypropylene. Rats were disconnected from ventilator. Upon confirmation of spontaneous respiration, the animal was extubated.
2.3实验方案和组gydF4y2Ba
我们有五个实验大鼠组；正常和SU/Hx/Nx暴露的大鼠在不同时间点有或没有LPAB，观察血流动力学卸载对肺组织学和炎症信号的影响。在预防方案中，在注射SU5416前1周进行LPAB，以检测血流动力学应激是否有助于闭塞性病变的发展。在逆转方案中，我们在PAH开始后5周进行LPAB，因为我们对该模型的详细时间分析表明，RVSP峰值时心输出量下降，在该时间点形成许多小的PA闭塞性病变。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba两种方案在注射SU5416后10周进行血液动力学和组织学分析，因为该时间段是SU/Hx/Nx暴露大鼠的晚期阶段，此时无LPAB的PAH大鼠出现持续非常高的RVSP和广泛的闭塞性新生内膜病变，包括同心闭塞性和丛状病变。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba在一个单独的系列实验中，我们检测了短期LPAB对已建立的PA闭塞病变和炎症反应的影响。我们在肺动脉高压开始后5周进行LPAB，然后在LPAB手术(3天逆转)后3天进行血流动力学测量，而不是在逆转方案中5周进行。我们有五组大鼠:(i)年龄匹配的正常对照组;(ii) 5周SU/Hx/ nx暴露大鼠;(iii) 10周SU/Hx/ nx暴露大鼠LPAB手术(预防性方案)和(iv) 10周SU/Hx/ nx暴露大鼠5周LPAB手术(逆转方案);和(v) 3天逆转(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
实验方案和组：LPAB，左肺动脉结扎；P，预防方案中的LPAB大鼠；R，逆转方案中的LPAB大鼠；3R，3天逆转方案中的LPAB大鼠。gydF4y2Ba
实验方案和组：LPAB，左肺动脉结扎；P，预防方案中的LPAB大鼠；R，逆转方案中的LPAB大鼠；3R，3天逆转方案中的LPAB大鼠。gydF4y2Ba
在每次血流动力学研究结束时，除3天逆转组(未进行血流动力学测量)外，所有大鼠均采用过量戊巴比妥钠安乐死，并切除心脏。取每只动物右心室/左心室+室间隔(RV/LV + S)的重量比作为右心室肥大的指标。肺用10%福尔马林加0.5%琼脂糖以20cm H充气gydF4y2Ba2gydF4y2BaO压力，并在10%福尔马林中固定过夜。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba左、右肺叶阻塞，石蜡包埋。切片5µm，苏木精伊红染色或verhoff - van Gieson染色。gydF4y2Ba
2.4肺血流测量gydF4y2Ba
使用微球(Dye-Trak VII, Triton Technology Inc.)估计左、右肺的肺血流比例。gydF4y2Ba19gydF4y2BaLPAB及假手术后1天，从麻醉大鼠中分离肺。肺用室内空气通气，并以恒定流量灌注生理盐溶液，如前所述。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba将微球(每100 mL 10 000个颗粒)加入灌注池并在肺内循环。肺被消化，左右肺中的微球被分光计计数，如前所述。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba
2.5导管大鼠血流动力学测量gydF4y2Ba
大鼠经戊巴比妥钠(30 mg/kg, IP)麻醉后置于对照热垫上。血流动力学测量在常氧条件下进行。简单来说，经右颈静脉置入聚乙烯导管(PV-1，内径0.28 mm)至右心室(RV)，测量右心室收缩压(RVSP)。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba通常测量RVSP来估计收缩期肺动脉压，因为在这些极端高血压(RVSP > 80 mmHg)大鼠中，肺动脉导管插管通常是困难的。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba将微尖P-V导管(FTH-1912B-8018, Transonic Inc.)插入右侧颈动脉，测量平均全身动脉压。这些信号由ML880/9 PowerLab 16/30 (AD Instruments)和Science ASVantage 5.0控制单元(FY097B, Transonic Inc.)和一台个人电脑连续记录。监测心率保持一致(>300 bpm)。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba
2.6组织病理学及免疫组化分析gydF4y2Ba
2.6.1管腔闭塞性病变gydF4y2Ba
至少3名不知道切片来源的研究人员评估了所有小血管(包括肺门在内的左右叶每个横截面超过100条血管，外径<100 μm)。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba在verhoff - van Gieson染色片上评估血管是否有闭塞性内膜病变，评分为:无内膜形成证据(0级)，部分管腔闭塞(<50%，1级)，严重管腔闭塞(≥50%，2级)。PA闭塞率以每级的百分比表示。如前所述，我们评估了外径<50 μm和50 - 100 μm之间的血管gydF4y2Ba．gydF4y2Ba21gydF4y2Ba
2.6.2血管周细胞计数gydF4y2Ba
血管周细胞浸润定义为5组肺组织切片中血管周围100 μm直径假想圆内的细胞核数。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba所有细胞均以不知情的方式在15个随机场中计数。gydF4y2Ba
2.6.3 NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB活动gydF4y2Ba
一种氧化还原敏感的转录因子，核因子gydF4y2BaκgydF4y2BaB (NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB)，被认为是PAH发展的关键炎症标志物之一。gydF4y2Ba23gydF4y2BaNF免疫组化染色gydF4y2BaκgydF4y2BaB组使用vecastain Universal Quick试剂盒(Vector Laboratories)进行。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba的gydF4y2BaαgydF4y2BaNF的p65单抗gydF4y2BaκgydF4y2BaB（细胞信号），识别p65亚单位上的一个表位，该表位被结合的蛋白抑制剂掩盖gydF4y2BaκgydF4y2BaB（I）-gydF4y2BaκgydF4y2BaB)，检测激活的NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB.一个不知情的观察者计数NF的数量gydF4y2BaκgydF4y2Ba在×400放大后的10个随机场中发现b阳性细胞。gydF4y2Ba
2.6.4巨噬细胞聚集gydF4y2Ba
用抗CD68抗体(Abcam)免疫染色检测巨噬细胞。一个不知情的观察者在×400的放大倍数下统计了10个随机区域中cd68阳性细胞的数量。gydF4y2Ba
2.6.5扩散gydF4y2Ba
采用抗Ki67抗体(Thermo Scientific)检测细胞增殖程度。一个不知情的观察者以×400的放大倍数计算了10个随机场中ki67阳性细胞的数量。gydF4y2Ba
2.7逆转录- pcr分析肺细胞因子表达gydF4y2Ba
为了评估LPAB对促炎细胞因子的影响，我们检测了IL-1的基因表达gydF4y2BaβgydF4y2Ba、IL-6和TNFgydF4y2BaαgydF4y2Ba(i)年龄匹配的正常对照组(左肺)，(ii) SU/Hx/ nx暴露5周的大鼠(左肺)，和(iii) SU/Hx/ nx暴露10周、LPAB手术5周的大鼠(逆转方案)(分别为左肺和右肺)。用RNeasy纤维组织迷你试剂盒(Qiagen)提取总RNA。引物用于大鼠IL-1的逆转录- pcr分析gydF4y2BaβgydF4y2Ba、il - 6、TNFgydF4y2BaαgydF4y2Ba从Genenet Co.Ind.购买了18个(gydF4y2Ba表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.1微克总RNA采用10µL逆转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit, Toyobo)。RT产物用水稀释10倍，2µL用SYBR Premix Ex进行实时PCR分析gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba™II (TAKARA)和一款LightCycler (Roche, Basel, Switzerland)。用于放大的热循环曲线包括94°C初始变性10 min，随后的40个循环放大步骤:94°C变性10 s, 60°C退火10 s, 72°C延伸30 s。在实时荧光定量PCR分析结束时，对PCR产物的熔化曲线进行分析。熔化曲线分析证实了熔化曲线的单峰特征。电泳证实每个PCR产物均为单条带。采用ΔΔCt法对荧光数据进行分析，18 s作为内部控制。gydF4y2Ba
为rt - pcr引物gydF4y2Ba
| 上游引物gydF4y2Ba | 下底漆gydF4y2Ba | |
|---|---|---|
| IL-6gydF4y2Ba | 5 ' - att gta tga aca GCG atg atg cac -3 'gydF4y2Ba | 5 ' - cca GGT aga aac gga act cca ga -3 'gydF4y2Ba |
| IL-1gydF4y2BaβgydF4y2Ba | 5 ' - CCC tga act caa CTG tga aat agc a -3 'gydF4y2Ba | 5 ' - CCC aag tca agg GCT TGG aa -3 'gydF4y2Ba |
| 肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba | 5′-TCA GTT CCA TGG CCC AGA C-3′gydF4y2Ba | 5 ' - GTT GTC TTT gag atc cat GCC att -3 'gydF4y2Ba |
| 18岁gydF4y2Ba | 5 ' - aag TTT cag cac atc CGA gta -3 'gydF4y2Ba | 5 ' - TTG GTG agg tca atg TCT GCT TTC -3 'gydF4y2Ba |
| 上游引物gydF4y2Ba | 下底漆gydF4y2Ba | |
|---|---|---|
| IL-6gydF4y2Ba | 5 ' - att gta tga aca GCG atg atg cac -3 'gydF4y2Ba | 5 ' - cca GGT aga aac gga act cca ga -3 'gydF4y2Ba |
| IL-1gydF4y2BaβgydF4y2Ba | 5 ' - CCC tga act caa CTG tga aat agc a -3 'gydF4y2Ba | 5 ' - CCC aag tca agg GCT TGG aa -3 'gydF4y2Ba |
| 肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba | 5′-TCA GTT CCA TGG CCC AGA C-3′gydF4y2Ba | 5 ' - GTT GTC TTT gag atc cat GCC att -3 'gydF4y2Ba |
| 18岁gydF4y2Ba | 5 ' - aag TTT cag cac atc CGA gta -3 'gydF4y2Ba | 5 ' - TTG GTG agg tca atg TCT GCT TTC -3 'gydF4y2Ba |
为rt - pcr引物gydF4y2Ba
| 上游引物gydF4y2Ba | 下底漆gydF4y2Ba | |
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2.8统计分析gydF4y2Ba
值为平均值±SEM。组间比较与学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试或方差分析与Scheffe’sgydF4y2Ba事后gydF4y2Ba多重比较检验。差异被认为在gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
3.结果gydF4y2Ba
3.1 LPAB对肺血流的影响gydF4y2Ba
与之前的发现一致，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2BaLPAB手术使左肺相对血流量由38±4降低至15±5% (gydF4y2BangydF4y2Ba=4个，gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05），同时增加了右肺的流量（从61±3%增加到86±6%）。gydF4y2Ba
3.2肺动脉高压的证据gydF4y2Ba
与对照组大鼠相比，所有暴露于SU/Hx/Nx的大鼠均出现严重的肺动脉高压，表现为RVSP和RV/LV+S重量比增加(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).许多SU/Hx/Nx暴露于LPAB的大鼠，与我们之前研究中没有LPAB的大鼠不同，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba有右心衰的征象(周围水肿，肝肿大，胸腔积液)。在预防和逆转方案中，10周时间点的LPAB生存率分别为71%(12 / 17)和63%(5 / 8)。根据我们的经验，没有LPAB的SU/Hx/ nx暴露的大鼠很少在这个时间点死亡。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba所有死亡的老鼠都有右心衰的迹象。gydF4y2Ba
肺动脉高压的证据(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)右心室收缩压（RVSP）。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)平均体动脉压（MSAP）。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba右心室/左心室+间隔(RV/LV + S)重量比。Nor:正常对照组，5W: 5周时间点SU5416/缺氧/常氧暴露大鼠。3R: 3天逆转方案中出现左肺动脉条带(LPAB)的大鼠。P，大鼠用LPAB预防方案;R, LPAB逆转方案大鼠。值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba第4 - 9 =。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs. Nor。gydF4y2Ba
肺动脉高压的证据(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)右心室收缩压（RVSP）。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)平均体动脉压（MSAP）。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba右心室/左心室+间隔(RV/LV + S)重量比。Nor:正常对照组，5W: 5周时间点SU5416/缺氧/常氧暴露大鼠。3R: 3天逆转方案中出现左肺动脉条带(LPAB)的大鼠。P，大鼠用LPAB预防方案;R, LPAB逆转方案大鼠。值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba第4 - 9 =。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs. Nor。gydF4y2Ba
3.3 LPAB对肺闭塞病变的影响gydF4y2Ba
无LPAB注射SU5416后5周，细胞性新内膜病变严重阻塞小pa (gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba4gydF4y2BaEgydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba)，这与我们之前的研究结果一致。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba在预防方案中，非带状右肺出现更严重的闭塞病变，包括成熟的丛状病变(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba，及gydF4y2BaGgydF4y2Ba)，而带条纹的左肺表现出明显的对比，即组织学上接近正常，包括血管和气道结构(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba4gydF4y2BaBgydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba，及gydF4y2BaGgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
左肺动脉环扎可预防和逆转闭塞性血管重塑。H&E染色右（非环扎）和左（环扎）肺的代表性低倍显微照片在预防中的作用(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和逆转(gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaDgydF4y2Ba)协议。箭头表示闭塞性病变(图中为典型的复杂丛状病变)。（gydF4y2BaEgydF4y2Ba) verhoff - van gieson染色肺动脉截面的代表性显微照片。肺动脉闭塞分为0级(无管腔闭塞;白色)，1(<50%咬合;灰色)和2(≥50%闭塞;黑色)。（gydF4y2BaFgydF4y2Ba) 0级(左)、1级(中)、2级(右)在外径(OD)≤50µm肺动脉中的百分比。（gydF4y2BaGgydF4y2Ba)50
左肺动脉环扎可预防和逆转闭塞性血管重塑。H&E染色右（非环扎）和左（环扎）肺的代表性低倍显微照片在预防中的作用(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和逆转(gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaDgydF4y2Ba)协议。箭头表示闭塞性病变(图中为典型的复杂丛状病变)。（gydF4y2BaEgydF4y2Ba) verhoff - van gieson染色肺动脉截面的代表性显微照片。肺动脉闭塞分为0级(无管腔闭塞;白色)，1(<50%咬合;灰色)和2(≥50%闭塞;黑色)。（gydF4y2BaFgydF4y2Ba) 0级(左)、1级(中)、2级(右)在外径(OD)≤50µm肺动脉中的百分比。（gydF4y2BaGgydF4y2Ba)50
在逆转方案中，无带状右肺发生了与预防方案中类似的严重闭塞病变(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba4gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba，及gydF4y2BaGgydF4y2Ba)，而带状左肺的病变几乎完全消失(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba4gydF4y2BaDgydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba，及gydF4y2BaGgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
3.4 LPAB对血管周围炎症细胞聚集和增殖的影响gydF4y2Ba
在未注射LPAB的SU5416后5周，我们在大鼠肺中发现许多单核细胞聚集在闭塞的PAs周围(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）.血管周围细胞以巨噬细胞为主(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaHgydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba24gydF4y2Ba在预防和逆转方案中，非带状右肺中包括巨噬细胞在内的血管周围细胞的累积数量均增加(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，及gydF4y2BaBgydF4y2Ba）.在带状左肺中，这些血管周围细胞的聚集减少到正常水平(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaDgydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，及gydF4y2BaBgydF4y2Ba）.核因子免疫染色gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65 (NFgydF4y2BaκgydF4y2Ba结果显示，在未注射LPAB的SU5416后5周，大部分血管周细胞和部分内膜细胞呈高阳性(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaNgydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2Ba)和非带状右肺在预防和逆转方案中的作用(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaOgydF4y2Ba，gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，及gydF4y2BaCgydF4y2Ba)，而在带状左肺中，这些细胞的染色降低至正常水平(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaPgydF4y2Ba，gydF4y2BaRgydF4y2Ba，及gydF4y2BaCgydF4y2Ba）.Ki67阳性细胞的染色模式与NF相似，但频率较低gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65，即在未注射LPAB的SU5416后5周，许多血管周围细胞和一些有限的内膜细胞被Ki67染色阳性(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaTgydF4y2Ba和gydF4y2BaDgydF4y2Ba)和非带状右肺在预防和逆转方案中的作用(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaUgydF4y2Ba，gydF4y2BaWgydF4y2Ba，及gydF4y2BaDgydF4y2Ba）.在两种实验方案中，左肺中Ki67阳性细胞数量均接近正常水平(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba5gydF4y2BaVgydF4y2Ba，gydF4y2BaXgydF4y2Ba，及gydF4y2BaDgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
左肺动脉环扎可预防和逆转血管周围炎症和细胞增殖。小肺动脉的典型显微照片显示H&E有不同程度的血管周围细胞聚集(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)、CD68 (gydF4y2BaggydF4y2Ba和gydF4y2BahgydF4y2Ba), NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65 (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BargydF4y2Ba)及Ki67 (gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaxgydF4y2Ba)染色的肺动脉。正常:gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，及gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba）.5周时间点SU/Hx/ nx暴露大鼠无左肺动脉带(LPAB):(gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba，及gydF4y2BatgydF4y2Ba）.Non-banded正确(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BaogydF4y2Ba，及gydF4y2BaugydF4y2Ba)左肺束带(gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2BapgydF4y2Ba，及gydF4y2BavgydF4y2Ba)在预防方案中。非捆绑权利(gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，及gydF4y2BawgydF4y2Ba)左肺束带(gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2BargydF4y2Ba，及gydF4y2BaxgydF4y2Ba)在逆转方案中，刻度条表示25µm。血管周围细胞计数结果的统计分析(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba), CD68-positive (gydF4y2BaBgydF4y2Ba), NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65-positive (gydF4y2BaCgydF4y2Ba)，Ki67阳性(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)细胞。也不是,正常;5W, 5周时间点SU/Hx/ nx暴露大鼠无LPAB;P，大鼠在预防方案;R，逆转方案中的大鼠;HPF，高功率场(×400的放大)。比例尺为50µm。值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba= 4 - 6。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs. Nor。gydF4y2Ba__gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 vs. 5W。gydF4y2Ba＃gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001:右肺vs.左肺在预防或逆转方案中。gydF4y2Ba
左肺动脉环扎可预防和逆转血管周围炎症和细胞增殖。小肺动脉的典型显微照片显示H&E有不同程度的血管周围细胞聚集(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)、CD68 (gydF4y2BaggydF4y2Ba和gydF4y2BahgydF4y2Ba), NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65 (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BargydF4y2Ba)及Ki67 (gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaxgydF4y2Ba)染色的肺动脉。正常:gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，及gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba）.5周时间点SU/Hx/ nx暴露大鼠无左肺动脉带(LPAB):(gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba，及gydF4y2BatgydF4y2Ba）.Non-banded正确(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BaogydF4y2Ba，及gydF4y2BaugydF4y2Ba)左肺束带(gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2BapgydF4y2Ba，及gydF4y2BavgydF4y2Ba)在预防方案中。非捆绑权利(gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，及gydF4y2BawgydF4y2Ba)左肺束带(gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2BargydF4y2Ba，及gydF4y2BaxgydF4y2Ba)在逆转方案中，刻度条表示25µm。血管周围细胞计数结果的统计分析(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba), CD68-positive (gydF4y2BaBgydF4y2Ba), NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65-positive (gydF4y2BaCgydF4y2Ba)，Ki67阳性(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)细胞。也不是,正常;5W, 5周时间点SU/Hx/ nx暴露大鼠无LPAB;P，大鼠在预防方案;R，逆转方案中的大鼠;HPF，高功率场(×400的放大)。比例尺为50µm。值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba= 4 - 6。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs. Nor。gydF4y2Ba__gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 vs. 5W。gydF4y2Ba＃gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001:右肺vs.左肺在预防或逆转方案中。gydF4y2Ba
3.5 LPAB对细胞因子mRNA表达的影响gydF4y2Ba
如中所示gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba结果显示，与正常对照组相比，SU5416无LPAB注射5周后肺组织IL-6 mRNA水平显著升高。在逆转方案大鼠中，IL-6在非带状右肺中的表达仍然很高，但LPAB显著降低。相反，尽管IL-1的mRNA水平gydF4y2BaβgydF4y2Ba和肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba显著高于肺SU5416在5周后注射没有LPAB比正常对照组高表达水平似乎是自发减少non-banded对肺协议在10周逆转老鼠,并无显著的影响LPAB观察il - 1的表达水平gydF4y2BaβgydF4y2Ba和肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba（gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba6gydF4y2BaBgydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
左肺动脉束带对促炎细胞因子表达的影响。正常和SU/Hx/ nx暴露大鼠无LPAB 5周时间点肺和逆转方案大鼠左右肺促炎细胞因子基因表达水平。Nor:正常，R:逆转协议中的大鼠。值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba=7-8个*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs. Nor。gydF4y2Ba__gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 vs. 5W。gydF4y2Ba＃gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001:逆转组右肺vs.左肺。gydF4y2Ba
左肺动脉束带对促炎细胞因子表达的影响。正常和SU/Hx/ nx暴露大鼠无LPAB 5周时间点肺和逆转方案大鼠左右肺促炎细胞因子基因表达水平。Nor:正常，R:逆转协议中的大鼠。值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba=7-8个*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs. Nor。gydF4y2Ba__gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 vs. 5W。gydF4y2Ba＃gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001:逆转组右肺vs.左肺。gydF4y2Ba
3.6短期(3天)LPAB的影响gydF4y2Ba
如中所示gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba在LPAB治疗较短时间(3天)后，与右肺未带状治疗相比，带状左肺p65表达明显减少，血管周围细胞数量也明显减少。相比之下，3天带状和非带状肺小pa的闭塞率没有差异。gydF4y2Ba
短时间的左肺动脉束带可以减轻血管周围的炎症，但不能减轻闭塞的血管重构。具有代表性的低放大显微照片显示NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65-stained正确(non-bandedgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和左(带，gydF4y2BaBgydF4y2Ba(注射舒根5461后5周)大鼠左肺动脉封条术后3天(高放大图像见插图)。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba) 0级(白色)、1级(灰色)、2级(黑色)肺动脉闭塞外径(OD)≤50 μm(左)、50 < OD < 100 μm(右)的百分比。全血管周计数结果的统计分析(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)和NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65阳性细胞数(gydF4y2BaEgydF4y2Ba).3R：在3天逆转方案中，大鼠左肺动脉束带。HPF：高功率场（放大400倍）。刻度条表示200µm。数值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba= 4。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05:右vs.左。gydF4y2Ba
短时间的左肺动脉束带可以减轻血管周围的炎症，但不能减轻闭塞的血管重构。具有代表性的低放大显微照片显示NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65-stained正确(non-bandedgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和左(带，gydF4y2BaBgydF4y2Ba(注射舒根5461后5周)大鼠左肺动脉封条术后3天(高放大图像见插图)。（gydF4y2BaCgydF4y2Ba) 0级(白色)、1级(灰色)、2级(黑色)肺动脉闭塞外径(OD)≤50 μm(左)、50 < OD < 100 μm(右)的百分比。全血管周计数结果的统计分析(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)和NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Bap65阳性细胞数(gydF4y2BaEgydF4y2Ba).3R：在3天逆转方案中，大鼠左肺动脉束带。HPF：高功率场（放大400倍）。刻度条表示200µm。数值为平均值±SEgydF4y2BangydF4y2Ba= 4。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05:右vs.左。gydF4y2Ba
4.讨论gydF4y2Ba
血流动力学应激在肺动脉高压(尤其是IPAH)闭塞性内膜病变发病机制中的作用尚存争议，尽管其在先天性心脏病患者血流相关肺动脉高压增加中的意义gydF4y2Ba25gydF4y2Ba在实验模型中，比如左向右分流模型和野百合碱注射的肺切除大鼠，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba都有很好的记录。在这里，我们直接解决了这个重要的问题，即在IPAH的实验模型中，当血流动力学应激降低时，小PAs中闭塞性内膜病变发生了什么。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba本研究最显著的发现是LPAB（血流动力学卸载）几乎完全逆转了晚期肺动脉高压患者已建立的闭塞性PA病变和血管周围炎症。这一结果支持了PAH患者单肺移植后的病例报告，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba并提供了大量的实验证据，表明血流动力学应激对严重闭塞性小PA病变的维持/进展和血管周围炎症细胞聚集至关重要。gydF4y2Ba
我们的预防研究结果支持以下假设:在SU/Hx/ nx暴露的PAH大鼠中，血流动力学卸载可防止严重闭塞性内膜病变和炎症的发展。因为LPAB可以让我们在同一动物中分离血流动力学应激和其他因素的影响，在本例中，VEGF受体阻断(SU)和缺氧(Hx)，在左右肺中观察到的差异可以归因于血流动力学应激的差异。因此，一个主要的机制暗示是SU/Hx诱导的血流动力学应激(血管收缩和高血压)，而不是特定刺激SU/Hx的联合gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba，是闭塞性PA重塑的必要因素，这与慢性缺氧下PA内侧重塑(肌肉化)的结果一致gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba和monocrotaline-exposed老鼠。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba换句话说，任何导致持续严重血流动力学应激的刺激组合(假设在SU/Hx的情况下，缺氧诱导的肺血管收缩和SU诱导的内皮细胞凋亡和功能障碍加剧了血管收缩)都可以诱导PAH新内膜血管表型。这可能至少部分解释了为什么几乎所有先天性心脏病病例在一定条件下，即非限制性和三尖瓣后分流(高流量和大压力梯度)，发展为肺动脉高压和丛状动脉病变。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba
研究发现，短期（3天）限制血流动力学应激可显著降低炎症反应（血管周围细胞积聚和NFgydF4y2BaκgydF4y2BaB）闭塞性重塑中无明显变化的激活）表明炎症是血流动力学应激的下游现象，可能是血管重塑的上游。接下来，我们讨论了哪些炎症介质参与血管重塑的问题。我们观察到肺组织IL-6、IL-1的mRNA水平gydF4y2BaβgydF4y2Ba,肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba在SU/Hx/ nx暴露大鼠5周时升高。IL-6的高水平维持在较晚的时间点，而IL-1的高水平维持在较晚的时间点gydF4y2BaβgydF4y2Ba和肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba随着时间的推移下降。这与先前报道的SU/Hx/Nx大鼠炎症信号的发现一致。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba我们还发现，LPAB显著降低了IL-6的持续高表达以及NFkB的活性，表明在该模型中，NFkB-IL-6通路的血流动力学应激敏感活性可能是严重闭塞性动脉病变炎症维持的核心机制。虽然还需要进一步的研究来确定NF之间的详细调控关系gydF4y2BaκgydF4y2BaB和促炎细胞因子活性，NFkB-IL-6信号通路在介导肺血管炎症中起重要作用的概念与体循环一致。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba一个剩下的，也许是最重要的问题是什么机制的血液动力学应激直接激活，以诱导下游的血管周围炎症过程。gydF4y2Ba
我们观察到许多有LPAB的SU/Hx/ nx暴露的大鼠发生明显的右心衰，不像那些没有LPAB的大鼠。我们推测，LPAB暴露于SU/Hx/ nx的大鼠，由于对原2 - vegf受体阻滞剂的额外因素/冲击(血流动力学应激增加)和缺氧，其右肺无束带的肺动脉高压发展得更快、更严重。观察发现，PAH大鼠暴露于跑步机运动后，无LPAB的SU/Hx/ nx暴露大鼠的死亡率增加(心输出量增加)，支持了这一推测。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba
该研究提出了一个非常有趣的问题，即闭塞性PA病变是否在再次暴露于正常血流动力学应激时恢复。换句话说，组织学上接近正常的左带肺功能正常吗?我们试图通过重新打开绑扎的LPA来回答这个问题，但发现绑扎5周后拆除缝合在技术上是不现实的，因为组织粘连和缝线周围的结缔组织增加。考虑到在大鼠再次暴露于常氧状态后，最初的联合攻击(单次注射SU和接触Hx)不再存在(这可能是大多数IPAH病例的情况，但可能不是遗传性PAH患者携带遗传异常)，有一种可能性是，持续的高血流动力学压力是维持炎症和严重血管重塑的唯一驱动力，从而造成恶性循环(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，这类似于先天性心脏病相关的PAH。虽然这个问题需要进一步的研究，如果病变在再次暴露于正常的血流动力学应激后没有返回，那么这个研究的潜在翻译意义将是巨大的。我们可能能够修复肺动脉高压肺，产生接近正常的肺，并可能通过血流动力学卸载(使受损/重塑的肺循环静止)治愈该疾病(这几乎就像执行单个肺移植)。虽然在晚期IPAH患者中单侧肺动脉带束在临床上是不现实的，因为可能发展为右心衰，但有潜在的方法可以实现肺循环的血流动力学卸载/静息。例如，它可以通过体外膜氧合(ECMO)来实现。最近的报道表明，Novalung®设备(一种无泵肺动脉至左心房ECMO)可以安全地用于等待肺移植的肺动脉高压患者数周(最多174天)。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba
由于以下原因，我们在逆转协议的5周时间点进行LPAB。首先，正如我们之前报道的，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba通过比较SU/Hx/ nx暴露的人PAH大鼠的血流动力学进展情况，模型大鼠RVSP达到峰值、心输出量开始下降的5周左右时间点可能大致对应人的诊断时间。尽管此时在大鼠模型中很少观察到成熟的复杂丛状病变，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba这可能是人类PAH诊断时的情况。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba其次,当我们试图确定是否成熟的丛状的损伤是可逆的血液动力学的卸载,在稍后的时间点执行LPAB(8周),我们发现这些老鼠没有存活下来开胸手术和LPAB(房车后负荷突然增加)因为RV障碍太先进的在这个时间点上。gydF4y2Ba
总之，我们的研究结果支持PAH血管周围炎症和闭塞性动脉病变是由血流动力学应激引起的(gydF4y2Ba图形gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)一旦血流动力学应激诱导闭塞性病变，可能通过激活炎症，这些病变进一步增加血流动力学应激，导致闭塞性病变恶化。因此，血流动力学应激和闭塞性病变形成明显的恶性循环。这可以部分解释为什么多环芳烃会随时间自动恶化。这也表明了一种新的治疗策略的可能性，即如果我们能够像前面讨论的那样干预血流动力学应激，或者可能通过消除炎症过程，恶性循环可以逆转为良性循环。gydF4y2Ba
总之，本研究提供了坚实的实验证据，血流动力学应激是PAH血管周围炎症和闭塞性动脉病变发展和进展的先决条件。这些信息将会影响肺动脉高压的研究和治疗领域，将研究人员的注意力转移到目前被许多人认为不太重要的致病因素，即血液动力学应激。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项工作得到了日本科学促进协会(Japan Society for the Promotion Science, 20588107, 24659393, 24390198, 23220013)的科学研究资助，以及Actelion制药日本公司(Actelion Pharmaceuticals Japan Inc.)的部分资助。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢安藤昭子和Kamada和宏的技术援助，以及大岛香理的有益评论。gydF4y2Ba
利益冲突:gydF4y2Ba没有宣布。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
作者指出gydF4y2Ba
这些资深作者对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba
