外泌体诱导和逆转单野百合碱诱导的小鼠肺动脉高压gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

目标gydF4y2Ba

单核野鼠碱(MCT)诱导肺动脉高压(PH)小鼠的细胞外泡(EVs)诱导健康小鼠的PH，间充质干细胞(MSCs)的EVs的外泌体(EXO)部分可以抑制缺氧PH的发展。我们试图确定EVs的外泌体部分是否负责调节肺血管反应，以及EXO- mir含量的差异是否解释了MSCs和MCT-PH小鼠的EXOs的不同作用。gydF4y2Ba

方法和结果gydF4y2Ba

将来自MCT-PH和对照组小鼠的血浆、肺ev分为EXO(外泌体)、微泡(MV)组分并注射到健康小鼠体内。骨髓间充质干细胞中的ev被分成EXO、MV组分并注射到mct处理的小鼠体内。通过右心室-左心室+中隔(RV/LV + S)比值和肺动脉壁厚/直径(WT/D)比值来评估PH值。miR微阵列也对所有EXO人群进行了分析。mct损伤小鼠的EXOs增加了健康小鼠的RV/LV + S和WT/D的比值，而MVs不增加。MSC-EXOs在MCT注射时可防止RV/LV + S、WT/D比值的增加，并逆转MCT注射后这些比值的增加。来自mct损伤小鼠和特发性肺动脉高压(IPAH)患者的EXOs中miRs-19b、-20a、-20b和-145的水平增加，而从MSC-EXOs中分离出的miRs中抗炎、抗增殖的miRs的水平增加，包括miRs-34a、-122、-124和-127。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些发现表明，循环或MSC-EXOs可能根据其miR货物调节肺动脉高压效应。MSC-EXOs逆转MCT-PH的能力为新的多环芳烃治疗提供了一个有前途的潜在靶点。gydF4y2Ba

1.简介gydF4y2Ba

肺动脉高压(PAH)是一种罕见的疾病，其特征是远端肺动脉循环的血管重塑。PAH中的重构包括肺血管内皮细胞的凋亡和增殖、远端肺小动脉的肌化、细胞外基质蛋白的沉积和血管周围炎症。gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}这些无数的变化导致周围小动脉的丧失，并在保留的部分血管床上形成闭塞性血管病。随着病情进展，肺血管阻力增加，导致右心室(RV)衰竭和死亡。目前可用的医学疗法包括对肺循环有一定选择性的血管松弛药物。这些药物改善了患者的功能能力，延缓了病情恶化的时间，但要治愈这种疾病，可能需要一种能够阻止或逆转发生的大范围肺血管重构的方法。gydF4y2Ba

多环芳烃患者肺血管重构的原因尚不清楚。内源性肺血管扩张剂、生长因子和炎症通路的合成和代谢改变已被确认，但尚不清楚这些异常是否导致了疾病的发生和传播，还是仅仅代表了疾病发生后细胞信号的改变。在多环芳烃中观察到的大量血管异常表明，该疾病不太可能是由单一事件或甚至是适度数量的缺陷引起的。相反，涉及凋亡、血管生成和炎症的一系列信号通路的失调可能是诱导和维持所见的肺血管变化所必需的。gydF4y2Ba

MicroRNAs (miRs)是一种小型的非编码rna，通过与启动子区域的一个共同部分结合并抑制mRNA的翻译，可以同时调节多达数百个基因的转录。众所周知，许多miR物种调节与血管细胞生长、凋亡和炎症相关的整合基因程序的转录，使它们非常适合调节肺动脉高压(PH)的发病机制。最近的研究提出了多种miRs作为肺血管重构的关键调节剂，可能为治疗多环芳烃提供重要的治疗靶点。gydF4y2Ba^{3 - 5gydF4y2Ba}然而，目前还不清楚这些miR物种来自哪里，以及它们是如何被运送到目标细胞的。gydF4y2Ba

已经描述了两种主要的循环mir池。其中一种是miRs，它与argonaute2蛋白家族结合，使其保持完整而不被rna酶降解。gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba另一个主要的细胞池包括在细胞外囊泡(ev)中运输的mir。ev是细胞衍生的结构，包含代表它们脱落的细胞的细胞质和细胞膜成分。它们是自发产生的，但也响应外部应激源，包括缺氧、剪应力、照射、化疗药物和细胞因子。gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba文献中已经描述了ev的几个不同的亚群体，包括外泌体(EXOs)、微粒、外泌体、微泡(mv)、膜颗粒和凋亡小泡。gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba它们的货物中包括许多蛋白质和核酸物种，包括小rna和miRs。最初认为ev是细胞碎片，大量研究表明ev是RNA和蛋白质在细胞内传输的载体，直接影响受体细胞的基因表达和细胞表型。gydF4y2Ba^{卖地gydF4y2Ba}

在此之前，我们证实，当注射到健康小鼠体内时，从单核野鼠碱诱导的肺动脉高压(MCT-PH)小鼠的循环或肺部分离的ev可诱导右心室肥厚(RVH)和肺血管重构。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba然而，其他研究表明，从间充质干细胞(MSCs)分离的EVs能够减缓小鼠缺氧PH值的发展。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba骨髓间充质干细胞越来越被认为是治疗多种疾病的潜在治疗方法，包括急性肺损伤、支气管肺发育不良和ph。然而，在这些模型中给予骨髓间充质干细胞并没有与肺中骨髓间充质干细胞数量的任何明显增加相关，这表明骨髓间充质干细胞除了直接组织移植外，还有其他一些方式起作用。gydF4y2Ba

在目前的研究中，我们试图确定哪些EV亚群在小鼠中MCT-PH的发展和逆转中发挥调节作用，以及如何区分诱发疾病的EV和抑制疾病的EV。我们发现，从MCT-PH小鼠中分离的ev的EXO部分(MCT-PH EXOs)可诱导健康小鼠的肺动脉高压变化，而从MSC中分离的ev的EXO部分(MSC-EXOs)可预防和逆转相同动物模型的PH。此外，我们发现MCT-PH EXOs含有与PAH发病机制有关的miRs水平升高，而MSC-EXOs含有抑制血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、诱导血管SMCs和内皮祖细胞(EPCs)衰老的miRs水平升高。我们还发现，与健康志愿者相比，从特发性PAH (IPAH)患者中分离出的EXO中，许多在MCT-PH EXOs中增加的miRs也增加了，并且从人类MSCs中分离出的EXO在逆转小鼠MCT-PH方面与从小鼠MSC中分离出的EXO一样有效。总之，这些发现表明，EXOs在调节PH值下的肺血管重构中发挥了重要作用，并为PAH的治疗指明了一种新的潜在治疗方法。gydF4y2Ba

2.方法gydF4y2Ba

2.1实验动物gydF4y2Ba

所有的小鼠研究都得到了机构动物护理和使用委员会(罗德岛医院，CMTT#s 0090-10, 0211-08)的批准，并按照NIH的指南(实验室动物护理和使用指南)进行。所有研究均使用6 ~ 8周大的雄性C57BL/6小鼠，并通过CO安乐死gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba吸入/颈椎错位。gydF4y2Ba

2.2间充质干细胞的分离和培养gydF4y2Ba

小鼠间充质干细胞(MSCs)按照Zhu的描述分离和培养gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba简单地，从10只小鼠中取出腿骨，用补充了2mm的α-MEM (Hyclone)冲洗gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺/10%胎牛血清(FBS)去除造血干细胞。在使用前，FBS在10,000超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将制粒物料丢弃，上清10万超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h。上清液中含有耗尽EXOs的FBS，然后用于所有组织分离或细胞培养实验。骨被胶原酶消化，放置在含有α-MEM/10% exo耗尽的FBS的塑料培养瓶中，37°C培养。更换培养基(第3天)去除非粘附细胞、碎片。第5天，将骨屑和贴壁细胞重新播种到新的烧瓶中，37°C培养。每48小时更换一次培养基。细胞的免疫分型在第4代发生，证实存在CD29+/CD44+/Sca-1+/CD31−/CD45−/CD86−粘附细胞。在第5通道进行成脂、成软骨和成骨分化试验，确认细胞分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。gydF4y2Ba

这些研究中使用的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)购自龙沙。这些细胞是从正常的非糖尿病成人骨髓中分离出来的，这些骨髓是从多个供体后髂骨双侧穿刺中提取的。按照制造商的说明培养hMSCs。gydF4y2Ba

2.3 msc衍生电动车群体的分离与表征gydF4y2Ba

从第8篇(第5篇为hMSCs)获得的无细胞培养基中分离出msc - ev。由于使用该协议培养的间充质干细胞可以维持多达10个传代，因此此时分离出的ev来自真正的间充质干细胞。gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba细胞通过离心(300gydF4y2BaggydF4y2Ba， 10 min)，将上清液分成如下3个不同的部分:(i) MV部分:无细胞培养基在10000超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h后将颗粒状材料在PBS中重新悬浮;(ii) EXO馏分:MV颗粒上清液在10万超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h后将球团材料重新悬浮在PBS中;和(iii) EV分数:无细胞培养基在10万超离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1小时没有前面的10000gydF4y2BaggydF4y2Ba将含有mv和EXOs的颗粒材料重悬在PBS中。所有组分的蛋白质含量用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)测定。此外，通过EM、western blot和NanoSight分析对囊泡群体进行了特征分析。gydF4y2Ba

2.4 mct损伤小鼠不同EV群体的PH诱导研究gydF4y2Ba

小鼠接受ev, EXOs或mv的注射，这些都是从mct损伤或车辆注射小鼠的肺部或血浆中分离出来的。EVs、EXOs或mv以100µL PBS中25µg的剂量经尾静脉注射，每天1次，连续3天。在~ 2 ~ 4 × 10的范围内分离出25微克ev、EXOs和mvgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养的肺细胞和150-300 μ L的全血。对照组小鼠接受等量的PBS。4周后对小鼠进行分析。gydF4y2Ba

2.5使用mmsc - ev预防MCT损伤的研究gydF4y2Ba

小鼠每周皮下注射MCT (600 mg/kg)或PBS(对照剂)4周。每次注射3小时后，小鼠通过尾静脉注射分别获得25µg mmsc - ev和100µL PBS或等量PBS。在~ 2 ~ 4 × 10的范围内分离出25微克evgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养mMSCs。1周后对小鼠进行分析gydF4y2Ba在线补充资料，图S1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2.6使用msc - ev进行MCT损伤逆转研究gydF4y2Ba

小鼠每周皮下注射MCT或PBS，持续4周。最后一系列注射后一周，部分小鼠被处死进行分析，其余小鼠每日尾静脉注射mMSC-EVs或hMSC-EVs, 25µg/天或等量PBS，持续3天。在~ 2 ~ 4 × 10的范围内分离出25微克evgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养的骨髓间充质干细胞4周后对小鼠进行分析gydF4y2Ba在线补充资料，图S2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在单独的实验中，小鼠每天尾静脉注射骨髓间充质干细胞- ev、小鼠肺细胞来源的ev (LEVs)或非骨髓间充质干细胞来源的ev(谱系耗尽的骨髓细胞ev或lin - ev)， 25µg/天或等量PBS，从最后一系列MCT或载药注射后1周开始，持续3天。在~ 2 ~ 4 × 10的范围内分离出25微克evgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养的肺细胞或林细胞。4周后对小鼠进行分析。gydF4y2Ba

同样在单独的实验中，小鼠每周接受皮下注射MCT或PBS，持续4周。最后一系列注射后一周，部分小鼠处死进行分析，其余小鼠每日尾静脉注射mscs - evs、-EXOs或- mv, 25µg/天或等量PBS，持续3天。在~ 2 ~ 4 × 10的范围内分离出25微克ev、EXOs和mvgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养mMSCs。4周后对小鼠进行分析。gydF4y2Ba

2.7肺组织学gydF4y2Ba

用1.5 cc的4%多聚甲醛PBS充气，用10 cc PBS冲洗肺循环。两种方法均在恒定压力(20 cm H)下进行gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO)。左右肺分别用石蜡包埋，每个石蜡块5µm切片进行苏木精和伊红染色。从每只小鼠的左右肺分别取10根血管(直径20 ~ 50 μm)进行分析。肺血管壁厚/血管壁径(WT/D)比值由测量血管壁厚度(内板-外膜)除以腔内直径(内板-内板)确定。gydF4y2Ba

2.8右心室肥厚测量gydF4y2Ba

室间隔游离壁从室间隔上剥离并称重。测量数据用左室游离壁到左室+室间隔比值(RV/LV + S)表示。gydF4y2Ba

2.9 miR微阵列分析gydF4y2Ba

从以下EV种群中分离出的miRs:(i) msc - exo;(ii) Lin−exo;(iii)来自mct损伤小鼠的血浆exo;(iv)来自载药注射小鼠的血浆exo;(v)来自多环芳烃患者的血浆exo， (vi)来自对照组的血浆exo。每组分析处理三个独立样本。使用安捷伦2100生物分析仪测定总RNA的数量和质量。大约0.25-0.5%的总RNA提取部分是miR物种。每个样品10纳米克的总RNA，从5 - 10 μ g的EXOs中分离出来，使用高容量cDNA转录试剂盒(Applied Biosystems，所有设备/试剂)来扩增cDNA。cDNA预扩增反应使用所有引物测定的混合混合进行，包括一个10分钟的循环，95°C; 14 cycles, 95°C, 15 s; one 4 min cycle, 60°C. RT–PCR reactions were performed in with the 7900HT Fast RT PCR System using 384-well TaqMan^®gydF4y2Ba啮齿动物和人类MicroRNA阵列卡。2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}方法计算各靶蛋白miR的相对表达量，gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba以snoRNA 202(啮齿动物阵列)和RNU6B(人阵列)作为内源性对照。gydF4y2Ba

2.10统计分析gydF4y2Ba

所有分析均使用SAS Software 9.4 (SAS Inc.)和GLIMMIX程序运行。分析了gydF4y2Ba数据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6gydF4y2Ba用假设正态分布的广义估计方程和夹心估计来实现。所有其他分析均采用一般线性模型(双向方差分析)，采用最小二乘估计进行检验。使用Tukey校正进行多次比较。在0.05水平上建立显著性，计算所有区间估计为95%置信。数据gydF4y2Ba数据gydF4y2Ba1 - 6gydF4y2Ba以95% ci的平均值表示。gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

3.1 MCT-PH小鼠EXOs诱导肺动脉高压改变gydF4y2Ba

在之前的研究中，gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba我们发现，从MCT-PH诱导的健康小鼠心室肥大和肺血管重构小鼠的血浆或肺匀浆中分离出的ev，而对照小鼠的ev没有影响。在这些研究中使用的ev包含许多囊泡亚群，包括mv和exo。为了确定这些实验中从血浆和肺匀浆中获得的ev中有多少比例对致病作用负责，我们在本研究中进行了额外的实验，将来自MCT-PH小鼠和正常对照小鼠的ev分离为exo和mv。健康小鼠组接受尾静脉注射从mct损伤小鼠或对照小鼠的血浆或肺中分离的ev、mv或EXOs，或等量PBS。4周后，注射了MCT-PH小鼠的血浆或肺ev或EXOs的小鼠RV/LV + S和WT/D比明显高于注射了PBS或从对照小鼠(无PH的载药注射小鼠)中分离出来的ev或EXOs的小鼠(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．注射从MCT-PH小鼠血浆或肺中分离的mv并不增加健康小鼠的RV/LV + S或WT/D比(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.2 mmsc - ev可防止mct诱导的RV肥大和肺血管重构gydF4y2Ba

为了确定msc - ev是否能减弱MCT- ph的发展，小鼠每周皮下注射MCT或对照，持续4周。每次注射后，两组小鼠尾静脉注射25µg mscs - ev或等体积PBS。最后一系列注射4周后，PBS治疗的mct损伤小鼠RV/LV + S和WT/D比明显高于PBS治疗的对照组小鼠。然而，与对照组小鼠或PBS治疗的mct损伤小鼠相比，mscs - ev治疗的mct损伤小鼠的RV/LV + S或WT/D比值没有增加(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.3 mmsc - ev和hmsc - ev逆转mct诱导的RV肥大和肺血管重构gydF4y2Ba

我们下一步试图确定一旦MCT-PH已经确定，mscs - ev是否能够逆转肺动脉高压变化。在这些实验中，从最后一次注射MCT后1周开始，每天尾静脉注射25µg mscs - ev或hmsc - ev或等量PBS(载药)，持续3天。最后一次注射EV 4周后，mMSC-EV治疗的MCT损伤小鼠RV/LV + S和WT/D比显著低于PBS治疗的MCT损伤小鼠，且与未接受MCT治疗的小鼠RV/LV + S和WT/D比无差异(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．在用hmsc - ev治疗的mct损伤小鼠中也发现了类似的结果。最后一次注射后4周，hMSC-EV治疗的MCT损伤小鼠的RV/LV + S和WT/D比显著低于单独给予PBS的MCT损伤小鼠，且与未接受MCT治疗的小鼠的RV/LV + S和WT/D比无差异(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在其他实验中，用从健康小鼠中分离的lev和lin - ev治疗mct损伤小鼠。EV注射4周后，用这些EV治疗的mct损伤小鼠的RV/LV + S和WT/D比与单独用PBS治疗的mct损伤小鼠相同(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.4 mMSC-EXO人群逆转了mct诱导的RV肥大gydF4y2Ba

为了确定哪一部分的MSC-EVs负责逆转MCT- ph, MCT损伤组和车辆注射组的小鼠每天尾静脉注射mscs - evs, mscs - exos, mscs - mvs，或等体积的PBS单独在最后剂量的MCT后3天。最后一系列EV注射4周后，mscs - exos或mscs -EV治疗的mct损伤小鼠RV/LV + S和WT/D比明显低于单独注射mscs - mv或PBS的小鼠。用MSC-EXOs或- ev治疗的MCT损伤小鼠的RV/LV + S和WT/D比与未用MCT治疗的小鼠无差异(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.5基于exis的mir的差异表达gydF4y2Ba

miR微阵列分析以EXO为基础的miR，并将其表达水平与对照EXO人群进行比较。记录了特定EXO种群特有的或显著上调的miRs(大于两倍)，并进行了以下比较:(i)诱导PH的已知EXOs (mct损伤小鼠血浆EXOs)与对照种群(载药注射小鼠血浆EXOs)， (ii)逆转PH的已知EXOs (mMSCs-EXOs)与对照种群(林骨髓细胞EXOs)，以及(iii)逆转PH的已知EXOs与诱导PH的已知EXOs。gydF4y2Ba

与从载体注射小鼠分离的血浆EXOs相比，mct损伤小鼠血浆EXOs包含19个唯一表达或上调的miRs, 140个减少或不表达的miRs, 221个表达水平相似(见gydF4y2Ba在线补充资料，图S3gydF4y2Ba)．与从Lin−骨髓细胞分离的EXO相比，msc - exos包含65个唯一表达或上调的miRs, 147个减少或不表达的miRs, 168个表达水平相似(见gydF4y2Ba在线补充资料，图S3gydF4y2Ba)．与从MCT-PH小鼠血液中分离出的EXOs相比，mMSC-EXOs包含44个唯一表达或上调的miRs, 115个减少或不表达的miRs, 221个表达水平相似(见gydF4y2Ba在线补充资料，图S3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对从多环芳烃患者和对照组患者血浆中分离出的EXOs进行了类似的分析。我们发现21种miRs在IPAH患者的血浆EXOs中唯一表达或上调，其中11种在mct损伤的小鼠血浆EXOs中唯一表达或上调，而对照组的小鼠血浆EXOs则不同(gydF4y2Ba表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

在目前的研究中，我们发现从MCT-PH小鼠的血浆或肺中分离的ev的EXO部分可以诱导健康小鼠的RV/LV + S和WT/D比的增加，从MSCs中分离的EXOs可以阻止MCT-PH的发展，逆转已建立的MCT-PH小鼠的肺动脉高压变化。这些发现表明，EXOs能够调节右心室肥大和肺血管重构的发生和逆转，这取决于它们的来源，并强烈表明循环的EXOs在调节PH值小鼠模型的肺动脉高压反应中起着关键作用。gydF4y2Ba

其他研究人员认为，在临床前和人类PH形态中，循环ev均增加。gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba我们之前已经证明，从患有MCT-PH的小鼠的血浆或肺中提取的ev的未分离制剂转移到健康小鼠，会引起与MCT-PH中发生的相同类型的RV肥大和肺血管重构，而注射从健康小鼠的血浆或肺中分离的ev则没有效果。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba从血浆或组织培养中分离出的ev包含多种亚细胞种类，包括较大尺寸的囊泡(包括mv)、较小尺寸的囊泡(包括EXOs)和细胞碎片。因此，从我们之前的工作中不清楚是哪一部分的EV组分负责将肺高压效应从患病小鼠转移到健康小鼠。gydF4y2Ba

在目前的研究中，我们发现从MCT-PH小鼠分离的ev的致病作用可以通过去除EXO部分完全消除。从MCT-PH小鼠的血浆或肺中给予EXOs的健康小鼠出现RV肥大和肺血管重构，而从MCT-PH小鼠的EVs中EXOs耗尽后没有肺动脉高压效应。这些发现表明，EXOs是调节这些实验中看到的肺血管反应的EV物种，并强烈表明，在这种PH模型中，一旦PH确定，EXOs可能在疾病进展中发挥重要作用。gydF4y2Ba

PH的MCT模型以内皮细胞凋亡和血管周围炎症为特征。EVs的释放已在多种细胞类型中得到很好的描述，包括发生凋亡的血管内皮细胞。虽然从MCT-PH小鼠中获得的引起PH值的EXO的细胞来源还不确定，但我们发现，从无细胞肺条件培养基中获得的EXO与从血浆中分离的EXO产生相同的肺动脉高压效应，而从其他器官中获得的EXO则没有。在之前的研究中，我们对来自MCT-PH和载体注射小鼠的血浆和肺源性ev进行了蛋白质组学分析，发现来自这两种来源的ev似乎富含内皮细胞、血小板、红细胞、骨髓细胞和淋巴细胞特异性的蛋白质。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba我们还发现，与对照小鼠的血浆和肺ev相比，从MCT-PH小鼠分离的血浆和肺ev具有更高的内皮细胞标志物表达。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba这些结果强烈提示，能够诱导肺动脉高压改变的血浆exo来源于肺血管内皮。本研究的结果支持以下假设:肺血管内皮细胞释放一种独特的EXOs群体，在健康肺中诱导肺动脉高压变化。这可能是一个促进血管重构的正反馈循环，并有助于解释MCT-PH一旦建立就很难完全逆转。gydF4y2Ba

有趣的是,李gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba发现MSC输注对低氧PH的保护作用也由MSC- exos介导。在该研究中，在缺氧开始前和开始后4天静脉给药MSC-EXOs延缓了巨噬细胞的肺内涌入，并减缓了RV肥大和血管重构的发展。在目前的研究中，我们发现在损伤时使用MSC-EVs的类似策略可以防止MCT-PH的发展。每次MCT注射后立即输注MSC-EV完全防止了MCT引起的右心室肥厚和肺血管壁厚度的增加。更重要的是，小鼠在最后一剂MCT后1周开始注射msc - ev, RV肥大和肺血管壁厚度完全逆转。相比之下，输注从其他组织或非间充质骨髓细胞分离的EVs对逆转肺动脉高压变化没有影响。mscs - ev的有益作用并不局限于间充质干细胞，因为mscs - ev在逆转MCT-PH方面与mscs - ev一样有效。此外，我们发现EVs的EXO分数而不是MV分数是逆转肺动脉高压变化的原因。这些发现支持了李的观点gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba此外，本研究表明MSC-EXOs能够逆转和钝化ph的实验模型。这些发现进一步证实了EXOs在临床肺血管疾病治疗中的治疗潜力。gydF4y2Ba

EXOs调节肺血管和右心室肥厚反应的机制仍有待阐明;然而，许多研究表明，exo是mir细胞内传递的有效载体。miRs在PH发病机制中的作用因其能够同时调节多个基因的表达而引起了广泛的关注。据报道，在PH的动物模型和多环芳烃患者中，有超过12种miRs上调，另有一些miRs被发现下调。gydF4y2Ba^{3 - 5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}在本研究中，我们推测MCT-PH小鼠EXOs和MSC-EXOs对肺血管重构的不同影响可能是由它们所含的miRs种类的差异所解释的。我们发现，与健康小鼠的EXOs相比，MCT-PH小鼠的EXOs中唯一表达或上调的miRs超过两倍。其中一些miRs与ph的发病机制有关。有趣的是，许多在MCT-PH小鼠的EXOs中上调的miRs也在IPAH患者的EXOs中升高。事实上，在MCT-PH小鼠EXOs中唯一表达或上调两倍以上的19个miRs中，发现有11个在IPAH患者中与健康对照组相比上调两倍以上。MCT-PH小鼠和IPAH患者EXOs中常见的mir增加包括miR-17-92簇、miR-21和miR-145。miR-17-92簇(包括mir -17、-18a、-19a、-20a、-19b-1和-92-1)是一个特征良好的mir家族，已知在调节细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。gydF4y2Ba^20.gydF4y2BamiR-17-92簇在调节肺血管重构中的作用引起了相当大的兴趣，因为BMPR2是家族PH的主要中介，已被证明是该家族的几个成员的直接靶标，包括mir -17和-20a。gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba在超过70%的家族性PH病例和约四分之一的IPAH病例中已发现BMPR2基因点突变。gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}有趣的是，在IPAH患者和PH动物模型中，即使BMPR2基因表达正常，BMPR2蛋白水平也会降低，这表明miR对BMPR2转录的抑制可能在PAH的发病机制中起着重要作用。gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}更重要的是，使用靶向拮抗剂消耗miR-20a可以恢复BMPR2信号，并减弱缺氧PH的发展，这强烈表明miR-20a能够诱导肺血管疾病。gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba因此，通过循环EXOs向肺血管内皮细胞传递miR-20a可能在诱导或促进PH中发挥重要作用。gydF4y2Ba

miRs-21和-145也与多环芳烃的发病机制密切相关。gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}一些研究表明，miR-21增强了血管SMC的增殖和迁移。gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}miR-21的表达在缺氧、BMPR2信号和IL-6的作用下增加，在多环芳烃中高度失调。gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}miR-21是否能够诱导PH尚不清楚。miR-21的反义抑制剂已被证明可减少缺氧条件下的肺血管重构。gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba然而，其他研究表明miR-21可能对PH有保护作用，因为miR-21缺失的小鼠有夸大的肺动脉高压反应。gydF4y2Ba^28gydF4y2BamiR-145在血管smc中高度表达，并已被证明能促进收缩表型。gydF4y2Ba^29gydF4y2BamiR-145的表达可被TGF-β、BMP4和缺氧激活，并在PAH患者中被发现升高。gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba靶向破坏miR-145基因或反义抑制可防止缺氧诱导PH的发展。gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba

除了被认为参与PAH发病机制的mir外，几乎所有在MCT-PH小鼠EXOs和IPAH患者中被发现上调或唯一表达的mir都属于Hale所描述的一类gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba^19gydF4y2Bahypoxamirs。低血凝素是mir的一个子集，在低氧张力的响应下增加。尽管长期以来，缺氧被认为是肺血管重构的重要环境刺激因素，但导致缺氧诱导PH值的分子和细胞信号机制尚不清楚。最近的研究有力地表明，在氧张力降低时，miR物种的上调可能在缺氧时肺血管重构的调节中发挥重要作用。gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba在大约1400种不同的miRNA中，有~ 165种被鉴定为与TGF/BMP信号、炎症刺激和缺氧相关的低氧miRNA。gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba几乎所有在MCT-PH小鼠的EXOs中被发现上调的miRs，以及IPAH患者都属于这一类，包括miR-17-92簇、miR-21和miR-145。因此，小鼠和IPAH患者EXOs中增加的miRs包括许多与PAH发病机制相关的物种。这些miRs是否有助于PH的发展，还是由于PH而增加，还需要进一步的研究。然而，我们的研究发现，当注射到健康小鼠体内时，含有这些miRs水平增加的EXOs会诱导PH值，而没有这些miRs水平增加的EXOs(从对照小鼠中分离的EXOs)则不会，这强烈表明这些miR中的一个或多个可以诱导肺血管重构。gydF4y2Ba

确定在PH发展过程中上调的miRs可以进一步加深我们对疾病发病机制的了解。此外，确定哪些miRs及其下游靶点对于介导MCT-PH EXOs的病理作用是必要的，这有助于确定治疗PAH的潜在治疗靶点。此外，在循环EXOs中miR表达的程序或模式是肺血管重构所特有的，可以作为一种生物标志物，帮助诊断和监测多环肺动脉高压。gydF4y2Ba

与此同时，在MCT-PH小鼠中逆转PH值的MSC-EXOs中，与无作用的非msc骨髓干细胞/祖细胞相比，许多miRs增加。许多miRs(如miRs-101a， -122， -193， -224和-302b)已被发现可诱导凋亡或抑制多种癌细胞的生长或迁移(gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba7gydF4y2Ba参,gydF4y2Ba31-40gydF4y2Ba)．虽然这些miRs对肺血管重构的影响尚未被直接研究，但它们对快速生长细胞系的抗增殖特性可能在一定程度上解释MSC-EXOs逆转MCT-PH小鼠肺动脉高压变化的能力。MSC-EXOs中miR-124表达的增加尤其令人感兴趣，因为最近的研究表明，miR-124的下调有助于缺氧PH下的肺血管重构。gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba王gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba发现miR-124表达在从低氧PH的犊牛和严重IPAH的人类分离的成纤维细胞中显著降低。此外，miR-124的过表达减弱了高血压成纤维细胞的增殖、迁移和单核细胞趋化蛋白-1的表达。研究人员得出结论，靶向于恢复miR-124功能的疗法在PAH的治疗中具有很高的潜力。因此，在本研究中，用MSC-EXOs治疗的MCT-PH小鼠肺血管重构的逆转可能部分是由于肺成纤维细胞中miR-124表达的恢复。gydF4y2Ba

最后，最近的研究表明miR-34a在介导内皮祖细胞、成纤维细胞和血管SMCs的衰老和抑制血管生成方面发挥作用。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba考虑到EPCs以及成纤维细胞和血管SMCs的增殖在肺血管重构中的突出作用，注射MSC-EXOs后MCT-PH的逆转可能是由于以exos为基础的miR-34a转移到骨髓和肺循环。gydF4y2Ba

在我们所知的唯一一项其他研究中，MSC-EXOs被用来钝化小鼠的PH值，gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba研究人员还分析了降低PH值的EXOs和没有降低PH值的EXOs之间miR含量的差异，发现miR -16、- 21、-199 a和pre-let 7b的表达增加。尽管我们发现MSC-EXO中miR-199a家族的水平增加，但我们没有看到miR-16、21或pre-let-7b的差异。然而，我们使用非间充质骨髓细胞EXOs (Lin−骨髓细胞EXOs)作为对照人群，而在之前的研究中，MSC-EXO含量与成纤维细胞EXOs比较。gydF4y2Ba

这项研究的发现有几个局限性。首先，用差速离心分离我们研究中使用的EXO和MV亚群。这种分离技术不会产生单纯的小泡亚种群。gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}尽管这些研究中使用的所有EXO的平均尺寸都在EXO文献中描述的30-100 nm的尺寸范围内，gydF4y2Ba^8gydF4y2BaEM和NanoSight分析表明，在这些制剂中检测到MV大小范围(100-1000 nm)的囊泡。同样，在这些研究中，小于100纳米的囊泡污染了中压种群。尽管差速离心存在局限性，但对于分离ev的“金标准”方法尚无共识。国际细胞外囊泡学会(ISEV)最近发表了一份立场声明，概述了定义细胞外囊泡的最低实验要求，其中包括跨膜蛋白的存在，如tetraspanins (CD9, CD63, CD81)。gydF4y2Ba^45gydF4y2BaTetraspanins通常存在于exo中，但在mv中不存在。gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba通过western blot分析，我们发现这些研究中使用的所有ev(包括EXOs和mv)和EXOs对CD63和CD81均呈阳性，部分对CD9呈弱阳性。相反，这些研究中使用的mv没有一个对CD63呈阳性，但有些对CD9或CD81呈弱阳性(见gydF4y2Ba在线补充资料，图S4-S8gydF4y2Ba)．这些数据表明，尽管在这些研究中使用的EXO和MV种群不是纯的，但它们肯定富含EXO和/或MV。最重要的是，我们证明了尽管存在这种杂质，但当注入小鼠体内时，EXO和MV亚群的影响是截然不同的。gydF4y2Ba

也有可能是非ev miRNA可能与大蛋白成球，并可能促成了这篇手稿中报道的观察结果。我们认为这是不可能的，因为电动汽车弹丸在使用前被彻底清洗。此外，与大蛋白结合的miRNAs预计不会在肺细胞培养过程中保持完整，因此在这些研究中不太可能促进PH的诱导或逆转。此外，我们之前已经证明，从患有MCT-PH的小鼠中分离出的肺经超离心耗尽ev的血浆和细胞培养基注入健康小鼠时，不会诱导PH值。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba

在组织分离和细胞培养过程中使用的胎bs提供了可能影响我们研究结果的额外ev来源。然而，绝大多数电动汽车在使用前都被FBS的超离心耗尽。尽管如此，也有可能少量基于fbs的电动汽车污染了这些研究中使用的电动汽车群体。由于这些研究中使用的所有EV都是用相同的EV耗尽胎牛血清制备的，而且一些EV种群具有生物效应(诱导或逆转或PH值)，而另一些则没有，因此来自牛血清的EV不太可能混淆结果。此外，使用小鼠和人类阵列卡在ev耗尽的牛血清上进行的miR微阵列分析没有发现任何miR物种的存在。因此，这些研究中报道的miR物种没有被牛源miR污染。gydF4y2Ba

总之，我们表明注射EXOs可以诱导或逆转mct诱导的小鼠PH值，这取决于它们的来源。一旦PH值确定，诱导PH值的EXOs似乎来自肺血管内皮细胞，并增加了与PH发病机制有关的miRs水平，而逆转PH值的EXOs似乎是MSCs所特有的，并增加了miRs的表达，可诱导多种高增殖细胞(包括EPCs、成纤维细胞和血管SMCs)的抗增殖、凋亡或衰老作用。综上所述，我们认为肺血管内皮细胞和间充质干细胞释放的循环EXOs在调节肺血管重构中发挥重要作用。因此，EXOs代表了有前途的靶点，可用于开发治疗多环芳烃的新治疗策略。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充材料可在心血管研究在线。gydF4y2Ba

利益冲突:gydF4y2Ba没有宣布。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

该项目得到美国国立卫生研究院(GM103468 P.J.Q.， HL088328 J.R.K.， GM103652 J.M.A.)的支持。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba