开发新的抗病毒药物治疗流感:未来会怎样?

摘要

有三个主要因素促使医学上需要开发用于治疗流感的新型抗病毒药物:抗病毒耐药性;在严重流感病例中，包括在甲型流感(H5N1)疾病中，抗病毒疗效有限;而且缺乏肠外药物。自2003年以来，病毒对M2离子通道抑制剂(即M2抑制剂，或金刚烷)即金刚烷胺(例如，Symmetrel;Endo实验室)和金刚乙胺(如氟马定;森林实验室)-在季节性甲型流感(H3N2)病毒中迅速增加，现在如此广泛，这类药物已基本无效，尽管它们对大多数甲型流感(H1N1)病毒仍有活性[1，2］．2007-2008年流感季节在许多国家还出现了耐奥司他韦的甲型(H1N1)流感病毒的社区传播[3.］．对M2抑制剂和神经氨酸酶抑制剂(NAIs)的耐药性的出现在一些免疫功能高度低下的宿主中也一直是一个临床问题。口服NAI奥司他韦似乎有利于住院患者治疗季节性流感[4 - 6]和一些高致病性甲型禽流感(H5N1)在人类中的病例，但它并没有将甲型禽流感(H5N1)的总病死率降低到50%以下[7］．多种因素可能导致这种高死亡率，包括延迟就诊、出现对奥司他韦的耐药性，以及一些患者的生物利用度可能降低。在这方面，特别是在重症住院病人的临床管理方面，目前没有治疗流感的肠外药物。这些因素中的每一个都导致需要替代抗病毒治疗，特别是在大流行防备方面，并需要考虑联合治疗。本文将重点介绍几种正在进行临床试验的药物。

M2-Inhibitor阻力

在治疗使用M2抑制剂期间出现耐药是众所周知的;在治疗使用期间发生的m2抑制剂耐药流行率的估计见表1［9，10，12，15，17］．此外，近年来，社区A(H3N2)分离株对M2抑制剂的耐药流行率急剧增加，并在全球范围内蔓延，如图所示图1［1，2］．2006年，这导致美国免疫实践咨询委员会改变了关于使用这一整类抗病毒药物的建议[18］．早期监测研究发现，季节性分离株的原发性耐药发生率较低，历史上的耐药频率为1%-3%。m2抑制剂耐药频率的增加首先出现在2003年流感季节来自中国和香港的甲型流感病毒(H3N2)分离株中，然后蔓延到全球，2005-2006年流感季节不仅在亚洲，而且在美国的发病率为>90%，在欧洲接近50%。2006-2007年流感季节的数据显示，亚洲和美国对>的m2抑制剂耐药率为80%，欧洲部分地区对>的耐药率为50%。2007-2008年北半球流感季节期间继续检测到非常高频率的耐药A(H3N2)病毒。虽然A(H1N1)病毒耐药的总体比例不如A(H3N2)病毒高，但也观察到A(H1N1)病毒在地理上不同，耐药频率增加。

表1

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治疗期间检测抗抗病毒流感。

图1

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2000-2006年甲型流感(H3N2)病毒社区分离株对M2抑制剂的抗病毒耐药性。改编自[1]，并获得Elsevier Ltd.的许可，以及[2］．

最近A(H3N2)和A(H1N1)病毒分离株的耐药性是由于M2蛋白31位的丝氨酸-天冬酰胺取代。不幸的是，对目前的M2抑制剂(金刚烷胺或金刚乙胺)中的任何一种产生耐药性，导致对整个M2抑制剂类产生耐药性，尽管耐M2抑制剂的病毒仍然对nai敏感。从公共卫生的角度来看，这些变异保留了其毒性和人际传播能力。在实验室或流行病学研究中没有确定生物适应性的丧失。

许多A(H5N1)病毒也发现对m2抑制剂类抗病毒药物的耐药性[19］．在越南、泰国和柬埔寨首次出现的第1支病毒也具有耐药性，因为第31位的丝氨酸-天冬酰胺取代，与耐药性a (H3N2)病毒中发现的突变相同。在印度尼西亚流行的分支2.1病毒中也发现了高频率的m2抑制剂耐药，这是因为这种突变或第27位的一种突变。另一方面，大多数(>90%)从欧亚大陆传播到欧洲和非洲的分支2.2病毒和分支2.3病毒对M2抑制剂保持敏感性。有限的数据显示，金刚烷胺对1997年香港部分感染M2抑制剂敏感的A(H5N1)病毒的个别病人有效，当时这些病毒首次被发现可引起人类疾病[20.］．

奈的阻力

在治疗使用期间发生对NAIs的耐药(表1) [8，11，13，14，16，21]在社区分离株中出现的频率较低[22 - 24］．随着使用更详细的监测，与降低易感性相关的新突变继续被发现。然而，NAIs对禽病毒中发现的所有9种神经氨酸酶亚型的抑制活性预示着NAIs可能对大流行毒株具有活性，无论该毒株是a (H5N1)病毒还是从动物病毒中获得血凝素和神经氨酸酶的其他一些新病毒。在NAI类抗病毒药物中，有一个有趣的现象，即可变的交叉耐药，这取决于神经氨酸酶类型和亚型、药物和特定的神经氨酸酶突变，因为药物在活性酶位点内的相互作用不同。实际后果是扎那米韦(Relenza;葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline)对几种神经氨酸酶亚型保持完全抑制活性，当突变赋予对奥司他韦(达菲;罗氏实验室(Roche Laboratories)。

门诊成人、门诊儿童和住院儿童也有对奥司他韦耐药的记录(表1) [8，11，14，16，21］．对奥司他韦的耐药频率远低于对M2抑制剂的耐药频率，但并非微不足道，特别是在儿童中;在日本进行的一项研究中，近五分之一的儿科患者中检测到耐药变异[1］．毫不奇怪，在儿童中检测到耐药病毒的频率远远高于成人，因为一般来说，儿童具有更高的病毒复制负荷，相应地出现耐药变异的机会也更大。在流感动物模型中，耐耐nai变异通常具有较低的传染性和毒性，但并非总是如此。在动物模型中，一些奥司他韦耐药性突变与完全复制能力和传播性相关。早期对社区分离物的研究发现，在甲型流感(arginine to赖氨酸292，谷氨酸to缬氨酸N2号119，组氨酸to酪氨酸N1号神经氨酸酶274)和B型神经氨酸酶(天冬氨酸to天冬酰胺198，异亮氨酸to苏氨酸222，丝氨酸to甘氨酸250)中具有耐药性突变(基于N2编号)的病毒可能已经在人与人之间传播[23，24］．由于第274位组氨酸-酪氨酸突变而对奥司他韦具有耐药性的甲型H1N1流感病毒在2007-2008年流感季节首次出现在许多国家[3.］．这一现象是在明显缺乏选择性药物压力的情况下发生的，并表明这些耐药变体可在人与人之间有效传播，并能够引起典型的流感[25］．

在使用奥司他韦治疗的甲型(H5N1)流感病毒感染患者中已记录出现耐药性。在来自越南的8例患者的病例系列研究中，de Jong等人。26) (图2)观察到，在发病后中位6天开始的奥司他韦标准疗程与一半患者咽部病毒载量的降低在时间上相关，并且疗程结束时咽部病毒RNA的清除与生存率相关。相比之下，那些随着时间的推移病毒载量增加或无法清除病毒的患者死于疾病。其中2例患者有治疗产生的奥司他韦耐药病毒变异，在第274位有组氨酸到酪氨酸突变，这是在N1型含神经氨酸酶病毒中观察到的最常见的突变。具有这种突变的N1神经氨酸酶显示对奥司他韦的易感性显著降低(>400倍)，但仍被扎那米韦抑制[27，28］．

图2

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8例患者咽拭子标本中甲型H5N1流感病毒载量。改编自[26，并得到了马萨诸塞州医学会的许可。

奥司他韦治疗和预防已用于免疫功能受损的流感病毒感染宿主，疗效明显[29-33］．然而，在一些免疫功能受损的宿主中出现了对奥司他韦耐药的变异，似乎与病毒复制时间延长和临床结果不佳有关[16］．在一些免疫功能高度低下的宿主中，使用了两种抗病毒药物的序贯治疗，部分原因是这些患者的病毒清除失败。不幸的是，在这一人群中，发现了对M2抑制剂和NAIs的双重耐药性[16］．对于免疫功能低下的宿主，应避免在流感管理中采用顺序用药的方法。

目前流感抗病毒治疗的局限性

目前抗病毒治疗的疗效在某些人群和情况下是有限的或不确定的。例如，奥司他韦的活性代谢物羧酸奥司他韦对乙型流感的活性远远低于对甲型流感神经氨酸酶的活性(表2)．这一发现在日本的几项研究中得到了证实，这些研究表明，在儿童，特别是幼儿中，与甲型流感治疗相比，用奥司他韦治疗乙型流感与延迟抗病毒效果和临床缓解有关[35-37］．此外，尚未完成高危或住院人群的对照研究，尽管新出现的证据表明，即使延迟治疗对患有严重季节性流感住院的成年人也是有益的[4 - 6］．

表2

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帕拉米韦、羧酸奥司他韦和扎那米韦对神经氨酸酶的体外抑制。

口服奥司他韦对A(H5N1)疾病的疗效有限，该疾病的总死亡率为~ 60% [38］．接受奥司他韦治疗的患者病死率徘徊在50%左右，而未接受抗病毒治疗的患者病死率接近90% [7］．可能有多种影响因素，特别是从发病到抗病毒治疗的时间延迟，早期给药(发病后3-4天内)与降低死亡率有关。世界卫生组织(世卫组织)于2006年及2007年更新了人类感染甲型H5N1禽流感病毒的临床管理建议[39，40］．更新后的指南部分基于2007年3月在土耳其举行的一次会议上分享的临床报告[41]，他们讨论了抗病毒治疗和支持性护理，并讨论了免疫调节剂的理论应用。这些指南提供了关于什么似乎有帮助(即奥司他韦、氧气疗法和肺保护通气支持策略)和什么没有帮助(包括抗生素预防、高剂量皮质类固醇和M2抑制剂单一疗法，特别是当病毒株对M2抑制剂有耐药性时)的指导。事实上，使用皮质类固醇似乎与死亡风险增加有关[7］．

治疗流感的新型抗病毒药物

目前正在积极探索多种潜在靶点，以寻找新的流感抗病毒治疗方法。一些潜在的干预部位显示在图3［42］．最近的几篇综述文章全面讨论了关于新抗病毒药物开发的靶点和一些抗病毒药物的现状，特别是那些处于临床前和早期临床开发的药物[42-44］．在目前处于不同开发阶段的许多抗病毒药物中，一些药物和配方已显示出临床前活性，目前正在进行人体试验表3．

图3

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流感病毒复制和抗病毒抑制位点。GTP，鸟苷5’-三磷酸;IMP，肌苷5' -单磷酸;信使RNA;siRNA，小干扰RNA。转载自[42]，并获得自然出版集团的许可。

表3

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临床开发中用于治疗流感的选择性研究性抗病毒药物

不经肠道的仙女虫属．目前的抗病毒治疗是口服或吸入。这些途径可能无法为重症患者提供快速、可靠的药物输送。例如，有报道称，扎那米韦治疗骨髓移植患者肺炎失败，即使患者感染的甲型(H1N1)流感病毒对扎那米韦敏感[45］．此外，口服奥司他韦的生物利用度，特别是通过非标准方法(例如，通过鼻胃管)给予时，是不确定的，尽管最近一份关于3名患者的报告发现在这种情况下有足够的吸收[46］．肠外政府将通过保证快速输送和血液中的高水平增加药物输送到感染部位的可能性，从而规避了这些限制，特别是在肺炎患者或甲型H5N1流感病毒感染患者的肺外感染中。

扎那米韦较低的口服生物利用度(~ 2%)已得到充分证明[47]并为该药物的替代给药途径的开发提供了动力。虽然吸入剂型已获批准，但静脉注射扎那米韦已在2a期试验中进行评估[48］．在病毒感染前5天，健康志愿者每天两次静脉注射600毫克扎那米韦或安慰剂，发现扎那米韦对实验感染具有高度保护作用(分别为14%对100%，感染)，减少病毒脱落(分别为0%对100%，有病毒脱落)，并预防疾病[48］．静脉注射扎那米韦在甲型H5N1病毒感染的灵长类动物模型中具有活性[49]，以及东南亚流感临床研究网络[50]正在制定一项方案，在甲型H5N1禽流感患者中进行研究。

最近，NAI peramivir (BioCryst Pharmaceuticals)目前正在进行静脉注射和肌肉注射给药的二期试验。体外IC₅₀奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦的数据显示，这3种药物在低纳摩尔范围内都是流感病毒神经氨酸酶的有效抑制剂(表2) [34］．在甲型H5N1流感病毒感染的动物模型中，从病毒接种后1小时开始，连续5天多次口服奥司他韦或连续5天多次口服帕拉米韦(以单次肌肉注射或连续5天肌肉注射的方式给药)的小鼠比注射生理盐水的对照组小鼠更有可能存活(表4) [51］．多剂量帕拉米韦方案是唯一在第15天预防瘫痪的方案(表4)．然而，在第二个动物模型中，肌注帕拉米韦对神经侵袭性A(H5N1)疾病提供了不完全的保护。在感染了3种不同剂量甲型流感(H5N1)病毒中的1种的雪貂中，肌肉注射多剂量帕拉米韦(70%-86%)的总生存率提高，而肌肉注射生理盐水的生存率(11%-43%);与生理盐水组(50%[13/26])相比，帕拉米韦组脑炎发生率较低(32% [8/25]);在接受肌注多剂量帕拉米韦治疗的动物中，有8%(2/25)出现了瘫痪，而在接受肌注盐水治疗的动物中，这一比例为42% (11/26)[51］．

表4

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帕拉米韦或奥司他韦可提高感染甲型/越南/1203/04(H5N1)流感病毒的小鼠存活率。

帕拉米韦在人体内具有较长的血浆消除半衰期，似乎也能与酶结合较长时间[52-2允许不频繁给药方案的因素。在健康志愿者进行的剂量范围研究中，肌注和静脉注射帕拉米韦(10,000-20,000 ng/mL)的峰值血浆浓度比口服奥司他韦标准剂量(~ 350 ng/mL;图4) [53］．在临床试验中，这些较高水平的血液可能在多大程度上提供更强的抗病毒疗效，并可能降低耐药出现的频率，仍有待确定。未来的研究将需要确定如此高的血浆NAI水平是否会为高危或住院流感患者带来更大的临床益处。最近的一份报告指出，单次300或600毫克静脉注射帕拉米韦对治疗成人门诊无并发症流感有效[54］

图4

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在一期临床试验中肌注和静脉给药后帕拉米韦的血浆浓度。改编自[53]，经允许。

长效仙女虫属．澳大利亚Biota控股公司和日本Sankyo制药公司正在共同开发长效吸入式NAIs。CS-8958(也称为R-118958)在每周给药一次的流感治疗小鼠模型中显示出良好的活性[55，56］．Rennecke等人。[56]报道，在健康男性受试者中，吸入1、2、5或10 mg剂量的R-118958未导致在血浆中检测到活性代谢物，尽管在给药5 mg和10 mg剂量后的144小时内在尿液中检测到活性代谢物。实验室检测未发现严重不良事件或临床显著变化。现有数据表明CS-8958可能允许更方便的局部给药方案，日本一项二期研究的发起者最近宣布，在治疗无并发症的流感时，发现单次吸入剂量与标准5天疗程的奥司他韦同样有效[57］．

聚合酶抑制．T-705(富山化学)不仅对所有3种流感病毒类型(A、B和C)有活性，而且对其他RNA病毒也有一定活性，包括一些出血热病毒[58，59］．T-705经历核糖基化，然后磷酸化，因此功能类似核苷。其主要作用机制是抑制病毒RNA聚合酶。在包括人体细胞在内的临床前毒性试验中，它似乎比利巴韦林表现出更有利的治疗指标(表5) [59]，并在甲型H5N1流感病毒感染的小鼠模型中显示出活性(图5) [60］．这些数据表明，在给予300mg /kg/天剂量的队列中，病毒接种后48小时，在给予600mg /kg/天剂量的队列中，病毒接种后60小时，患者的生存受益。在口服吸收和耐受性方面，最初未发表的人类药理学数据令人鼓舞，2007-2008年流感季节期间，日本正在进行2期疗效研究。

表5

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T-705与利巴韦林的体外抗流感活性和细胞毒性

图5

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单次口服T-705对暴露于致死性流感a /Duck/N/1525/81(H5N1)病毒的小鼠存活的影响改编自[60]，并获得了美国微生物学会的许可。

附件抑制．DAS181 (Fludase;NexBio)是一种融合结构，它结合了来自放线菌viscosus，一种常见的口腔细菌，与人类上皮锚定结构域相连;它可以在大肠杆菌［61］．唾液酸酶以病毒附着过程为目标，这是流感病毒复制的早期事件。当这种分子接触到细胞时，它会切断呼吸道上皮细胞表面的受体，这些受体被流感血凝素所识别，包括人类病毒所附着的α2,6-唾液酸连接受体和鸟类病毒所附着的α2,3-唾液酸连接受体。DAS181对一系列a型和B型流感病毒具有抑制作用，体外EC₉₀值范围为<1至56 nmol/L [61］．该分子上的上皮标记将其活性提高了一个数量级(约5 - 30倍)[61］．DAS181在体外去除受体可导致延长抗病毒效果，尽管尚不清楚这种效果是否会转化为临床中较低频率的给药方案。该分子对人体细胞生长无抑制作用。

经鼻给药已在小鼠中显示出预防和治疗活性，并在雪貂中显示出减少炎症反应的抗病毒作用[61］．图6说明了DAS181在流感啮齿动物模型中鼻内给药的效果[61］．在使用甲型/越南/1203/2004(H5N1)流感病毒的高致病性禽流感小鼠模型中，das181在预防和治疗方面都具有活性[62］．预防性管理，DAS181剂量为1毫克/公斤/天保护100%的小鼠免于致命疾病，并防止病毒传播到大脑。在治疗上，当感染后72小时开始治疗时，暴露于A(H5N1)病毒挑战的小鼠的抗病毒作用和存活率增加被注意到[62］．

图6

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DAS181对小鼠肺病毒滴度的影响改编自[61]，并获得了美国微生物学会的许可。

联合治疗

联合治疗在流感治疗中并不是一个新概念。事实上，在它成为艾滋病毒感染管理的护理标准之前，它最初是在临床前试验中用于治疗流感的。虽然这是一种很有前途的策略，但很少有来自联合疗法治疗流感的对照临床试验的数据被发表。几年前，当流行的A型流感病毒可预测地对M2抑制剂敏感时，国家过敏和传染病研究所抗病毒合作研究组比较了接受扎那米韦雾化加口服金刚乙胺或盐水安慰剂雾化加口服金刚乙胺的住院成人的结果[63］．本研究纳入的患者数量较少，限制了其统计能力，但与单独接受金刚乙胺治疗的患者相比，接受联合治疗的患者注意到一些令人鼓舞的趋势。扎那米韦联合金刚乙胺治疗的患者在减少病毒脱落天数和降低m2抑制剂耐药频率方面表现出不显著的趋势。接受联合治疗的患者在治疗第三天也更有可能没有咳嗽或只有轻微咳嗽(15/16 [94%]vs. 11/20 [55%];P =。01) [63］．在接受联合治疗的患者中没有发现耐药变异，而在单独接受金刚乙胺的患者中有3例。

M2抑制剂- nai联合疗法也被研究用于治疗A(H5N1)疾病。图7显示了单一药物和联合治疗对甲型H5N1流感病毒金刚烷胺敏感株接种小鼠存活率的影响[64］．虽然单药治疗显示出剂量相关效应，但在该动物模型中，金刚烷胺和奥司他韦在较高剂量下的联合使用可获得最高水平的生存和抗病毒效应。相比之下，当感染的A(H5N1)病毒对M2抑制剂具有耐药性时，除了单独使用奥司他韦之外，没有发现更大的益处。这表明，如果引起感染的流感病毒对M2抑制剂敏感，M2抑制剂- nai联合治疗是一种潜在的治疗选择。如前所述，一些A(H5N1)毒株保留对M2抑制剂的敏感性;因此，在最近的世卫组织管理指南中提出了联合治疗的可能性[40］．

图7

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金刚烷胺(AM)-奥司他韦(OS)联合治疗对甲型H5N1流感病毒接种小鼠存活的影响小鼠在病毒接种前24小时开始接受相同的治疗计划，以指示剂量(mg/kg/天)使用AM或OS, AM和OS的组合，或盐水安慰剂。改编自[64］．

各种其他抗病毒组合已经被研究或提出，如图所示表6［65 - 73］．进一步的临床前研究和最终的临床试验对于确定这些新药物或建议的组合是否能提供比现有药物更有临床意义的益处将是非常宝贵的。然而，在获得这些临床试验数据之前，医生必须根据患者特征和可能的或实际的抗病毒药物易感性模式的知识，做出艰难的治疗决定。下面两个例子就是这样的选择。

表6

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潜在的联合抗病毒治疗流感。

一名肾移植病人，40岁，2007年2月因呼吸道症状及甲型流感病毒感染入院。理论上，该患者可以单独或联合使用奥司他韦、扎那米韦或金刚乙胺治疗。鉴于流感病毒感染最有可能是由于对M2抑制剂具有耐药性的A(H3N2)病毒，使用金刚乙胺几乎没有意义，因为它会增加毒性风险，几乎没有机会改善临床结果。奥司他韦和扎那米韦联合治疗可以提供两种具有不同作用谱和给药部位的NAIs。遗憾的是，口服吸入扎那米韦对住院患者或该联合方法在相关动物模型中的疗效和耐受性尚未得到充分研究。大剂量口服利巴韦林[74]和静脉注射利巴韦林[75]是其他的可能性，但对于流感的治疗还处于研究阶段。因此，当时口服奥司他韦是最实用的治疗方案。

相比之下，假设在对罗马尼亚禽流感疫情的调查过程中，一名确诊与家禽接触的患者因5天的发烧、咳嗽和现在越来越严重的呼吸短促史入院。检测显示甲型流感(H5N1)病毒感染，可能是由2.2支病毒引起的，并且有肺炎的放射学证据。目前，没有来自随机对照临床试验的证据表明在这种情况下选择了特定的抗病毒干预措施。更新后的世卫组织指南将推荐奥司他韦治疗，但也将建议考虑替代药物方案，包括M2抑制剂和奥司他韦联合治疗，以及将奥司他韦剂量和治疗时间增加一倍。由于来自分支2.2的几乎所有A(H5N1)病毒都对M2抑制剂敏感，奥司他韦和金刚乙胺联合治疗将是一种合理的方法。鉴于甲型H5N1肺炎患者的生存可能性很低，尽快控制复制的干预措施是有意义的。希望在未来，肠外制剂，包括特异性单克隆抗体[76]或可能是恢复期血浆[77]，将可用于此类患者的研究。

用于治疗流感的抗病毒药物的当前趋势

目前正在进行大量努力，以开发新的抗病毒药物用于治疗流感，与现有治疗方法相比，这些药物具有更好的活性谱或更好的药理特征。未来用于流感治疗的抗病毒药物的一些最理想的特征包括:更强的效力，可迅速抑制病毒复制;更长的血浆或肺部半衰期，允许更少的剂量(甚至是单一的治疗剂量);降低耐药流感病毒株发展的风险;以及用于联合治疗的全新抗病毒作用模式。

致谢

金融支持．BioCryst制药公司为编写本文提供了教育资助，并为本文所依据的“流感抗病毒治疗:挑战现状”(圣地亚哥，2007年10月4日)研讨会提供了支持。

补充赞助．本文作为增刊的一部分发表，题为“流感抗病毒治疗:挑战现状”，由医学和护理教育研究所和国际医学出版社联合赞助，并得到BioCryst制药公司的教育拨款支持。

手稿准备．F.H.在专题讨论会期间和撰写本手稿期间是世界卫生组织的工作人员;本文仅代表作者观点，并不代表世界卫生组织的决定或政策。国际医学出版社(亚特兰大)的玛芝丽·塔玛斯协助准备和编辑手稿。

潜在的利益冲突．f.h.:没有冲突。

参考文献