严重人类下呼吸道疾病引起的呼吸道合胞体病毒和流感病毒的特点是缺乏肺细胞毒性淋巴细胞反应

文摘

背景。呼吸道合胞病毒(RSV)和流感病毒是小儿下呼吸道感染的常见原因(下呼吸道感染)。人们普遍认为病毒复制和增强免疫反应不当导致疾病的严重程度。在婴儿,RSV下呼吸道感染是更严重的流感病毒下呼吸道感染。

方法。我们比较细胞因子和趋化因子在分泌物的婴儿幸存的各种形式的RSV或流感病毒引起的呼吸系统疾病,以确定哪些介质与严重疾病。我们分析了婴儿的肺组织与RSV的死亡病例和流感病毒下呼吸道感染确定类型的炎症细胞存在。解剖组织研究的淋巴毒素granzyme和凋亡标记半胱天冬酶3。

结果。大量的lymphocyte-derived细胞因子在与RSV感染分泌物从婴儿最小。大多数细胞因子的浓度更大的流感病毒,而不是RSV感染。肺组织免受致命的RSV和流感病毒下呼吸道感染患儿演示了一个广泛存在的病毒抗原,几乎没有cd8 +淋巴细胞和自然杀伤细胞,细胞凋亡明显标记的表达。

结论。严重的小儿下呼吸道感染RSV和流感病毒的特点是适应性免疫反应(而不是过度)不足,健壮的病毒复制,和凋亡危机。

感染呼吸道合胞体病毒(RSV)是最常见的住院原因的婴儿在美国(1,2]。RSV感染相关疾病的发病机理还不是很清楚。尊重当局在该领域最近的文章状态肺病毒复制和强有力的免疫反应(特别是淋巴细胞反应)对RSV是下呼吸道感染的发病机制中的关键元素(下呼吸道感染)3-11]。

相信免疫反应导致RSV下呼吸道感染的发病机制主要来自经验formalin-inactivated RSV疫苗(FIRSV)准备。RSV抗原疫苗接受者开发更大的淋巴组织反应和严重的呼吸道疾病,随后感染RSV比对照组(12,13]。然而,分析肺组织从2疫苗接受者后来死于RSV感染显示嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,不天然RSV下呼吸道感染的特点14,15]。因此,疾病后FI-RSV政府,而可能是由淋巴细胞,似乎是不一样的,自然RSV感染。

免疫功能不全的受试者可能出现长时间的病毒复制,肺炎的临床证据和不太突出喘息,较少的肺泡浸润,当感染RSV [16,17),而主题与完整的免疫反应开发细支气管浸润和喘息(18 - 20]。然而,它并没有表明,T淋巴细胞功能改变(相对于其他细胞)专门占这些差异。

最后,在小鼠模型中,消融的RSV感染后CD4 - CD8 -阳性淋巴细胞减少疾病的严重程度(9]。然而,小鼠模型缺乏许多人类婴儿RSV感染的病理特征,包括中性粒细胞在气道分泌物的优势21,22),广泛的细支气管上皮破坏,堵塞小气道炎症碎片(14,15,18]。病毒复制的模式也有所不同(23,24]。

因此,尽管增加活动组件的RSV感染的炎症反应可能是至关重要的发展严重形式的细支气管炎,过度响应中介的本质仍然是未知的。在人类婴儿,RSV通常会导致严重的下呼吸道感染的几率比流感病毒(25,26]。因此我们评估患儿下呼吸道感染是由这两个病毒引起的炎症反应的性质差异,可能解释与RSV感染更严重疾病的受试者,在婴儿阐明RSV感染的发病机制。

患者和方法

研究人群。本研究的主题是来自2人群。一组由12个月以下婴儿存活年龄与RSV或流感病毒感染的住院病人和门诊病人招募从地区的妇女和儿童医院的水牛。这些受试者评估细胞因子含量的鼻咽分泌物(NPS);表1)(详情,请参阅附录,它只出现在电子出版的杂志)。这些受试者分配诊断为上呼吸道疾病(URTI)单独或毛细支气管炎标准描述的基础上,其他地方(27),在附录中。

第二组的婴儿有致命的下呼吸道感染。尸检肺组织获得了从婴儿致命RSV (n= 9)或流感病毒(n= 11)在医院下呼吸道感染人解剖罗伯托•德尔里奥智利圣地亚哥。这20个婴儿的特点也进行了描述表1和附录。两个病理学家(L.V.和L.M.)独立判断,所有20个婴儿的死因是严重的下呼吸道感染,与典型的细支气管上皮脱落、终端细支气管堵塞,渗透的气道壁和肺泡巨噬细胞和中性粒细胞。没有组织学的肺部细菌感染的证据。垂死的婴儿没有受到长时间机械通气或使用抗炎药或抗病毒药物。

测量NPS的细胞因子。NPS从细胞因子分析受试者招募测试使用人类细胞因子17-Plex Bio-Plex面板(Bio-Rad实验室)。面板包括白介素(IL) 1β- 2、IL - 4, IL-5, IL - 6, IL-7,引发,IL - 10、IL - 12 (p70) IL-13, IL-17,粒细胞集落刺激因子(g - csf) granulocyte-macrophage (GM)脑脊液,干扰素(IFN) - g,单核细胞化学引诱物蛋白(MCP) 1(称为CCL2)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1β(称为亚兰)和肿瘤坏死因子(TNF) -α。介质的检测下限7.5 pg / mL。

常规病理和免疫组织化学(包含IHC)分析。婴儿的肺组织样本和致命的下呼吸道感染和控制组织处理常规染色和包含IHC染色(详情,请参见附录)。

统计分析。统计分析是使用StatView程序(版本正式;SAS)如附录所述。对数变换被用来获得数据的正态分布。数据和表,数据提出了均值±SE的日志₁₀个人趋化因子值。

结果

人口统计学和临床因素

人口和临床特征的分析对象的人细胞因子分析被完成了的上部表1。主题与RSV下呼吸道感染(细支气管炎)住院时间较长和较低的氧饱和度时抽样比主题与流感病毒细支气管炎。其他因素类似的团体之间。

人口的特点提出了婴儿死于下呼吸道感染的上部表1。这些因素是类似于那些幸存下来,除了主题与先天性心脏病和唐氏综合症并不排除在外。先前存在的条件下呼吸道感染的爆发之前下部列出这些婴儿表1。

频率检测的介质

2、IFN-γIL-17。分泌物中检测到只有2 - 2与RSV感染(5.6%)的36个科目,但检测分泌物8(24.2%)的33人流感病毒感染(P= .04点,数据未显示)。IFN-γ中检测出13(36.1%)的36与RSV感染的主题,在32(97%)的33人流感病毒感染(P<。)。IL-17察觉在主题与RSV感染,但在19(57.6%)发现33人流感病毒感染(P<。)。

il - 4、IL-5 IL-13。il - 4中检测出分泌物只有6(16.7%)的36个学科与RSV感染和分泌物中检测21例(61.6%)受试者的33流感病毒感染(P=。)。IL-5和IL-13很少(-24%)范围内,0%的受试者与RSV或流感病毒感染,与组之间没有显著差异(P⩾23),为每个)。

白介素、MCP-1和il - 6的分泌。il - 12 (P= .04点),MCP-1 (P= .047)和il - 6 (P= .015)检测受试者与RSV感染的频率更低比那些流感病毒感染。

IL-1b IL-7, il - 10。IL-1β(P<。),IL-7 (P<。)和il - 10 (P=曾)都与RSV感染次数少,检测对象比流感病毒感染。

g - csf, gm - csf TNF-α、引发和MIP-1β。g - csf、GMCSF TNF-α、引发和MIP-1β检测频率没有显著差异(P⩾.24)主题之间与RSV或流感病毒感染。

因此,大多数细胞因子和趋化因子被发现更频繁地与流感病毒感染婴儿,,令人惊讶的是,没有发现通常在那些RSV感染。

介质在分泌物的浓度和类型的病毒感染

我们下一个评估分泌物的数量测量的介质。首先我们将所有科目之间的细胞因子的反应与RSV感染和那些流感病毒感染(图1 a-1f)。大量的大多数细胞因子是更大的主题与流感病毒感染的受试者与RSV感染。其中包括细胞因子假定被释放从淋巴细胞为主,如IFN-γ和IL-17 (图1一个)。il - 4(也主要由淋巴细胞释放)同样被发现在婴儿与流感病毒感染浓度更高,而其他Th2细胞因子(IL-5和IL-13)要么是只在低浓度在科目中存在缺失或类型的病毒感染(平均值下限检测;图1 b)。大量的il - 12、MCP-1和il - 6(巨噬细胞产生的突出,其他细胞)IL-1β,IL-7,和il - 10级(各种细胞类型)是一个更大的婴儿与流感病毒感染与RSV感染比,尤其是那些与流感毛细支气管炎(图1 c和1 d)。浓度的g - csf, gm - csf, TNF-α引发,MIP-1β(特别是从上皮细胞释放等)出席高浓度和没有显著不同的科目与病毒感染类型(图1 e和1 f)。

介质在分泌物的浓度分析形式和疾病的严重程度

相比我们下介质的浓度与URTI科目与毛细支气管炎患者,两种类型的病毒感染。没有中介出现在更高浓度下呼吸道感染患者罹URTI孤独(受试者相比,P为每个⩾.04点;数据未显示)。这是与RSV感染的主题以及对流感病毒感染。

我们接下来研究中介释放之间的关系和血氧饱和度的测量值。介质的浓度研究孔没有实质性的关系程度的血氧饱和度(P⩾.14点,为每个)。

持久性的介质与持续的疾病

研究对象时已经气喘1 - 5天分泌物的样本。我们想知道是否在这个时间间隔内细胞因子的浓度增加。虽然只有1分泌物样本可用/主题,我们综述了细胞因子浓度气喘发作后的第二天,他们已经获得的。细胞活素T淋巴细胞的数量,- 2 IFN-γ,il - 4,和IL-17拒绝在这个区间,大多数样本中获得5天是大大低于样本中获得1天(表2)。因此,没有任何证据表明在这段区间内淋巴细胞细胞因子反应的发展。

常规肺组织的病理评价对象与致命的下呼吸道感染

所有尸体解剖材料进行常规病理分析。组织的显微照片沾hematoxylin-eosin(他)可在附录中。比较病理结果是由一个病理学家(L.M.),谁不知道感染代理人的身份。在主题与致命的流感病毒感染的情况下,病毒抗原检测主要在上皮细胞更大的航空公司(然而重症毛细支气管炎还是明显),频率较低,在气道腔(图2一个,上面板)。相反,在主题与RSV感染的死亡病例,材料中发现的病毒抗原主要是阻碍的腔小航空公司(图2 b,上面板)。也出现在多核巨细胞病毒抗原衬里或细支气管腔。病毒抗原更广泛地出现在主题与RSV感染比流感病毒感染。细支气管上皮损伤被认为更大的主题与RSV感染的流感病毒感染。周期性acid-Schiff (PAS)阳性材料(粘液)被发现在气道只有1主题与流感病毒感染和其他19个学科没有RSV和流感病毒感染。经管材料也负了阿尔新蓝染色,表明黏蛋白的缺失。其他的发现被认为是类似的20个项目,是否潜在的心脏疾病或唐氏综合症。复合材料包含IHC染色的解剖组织与死亡病例的病毒抗原和其他科目下面列出的所有其他抗原和酶可在附录中。

包含IHC分析

CD4抗原和CD8抗原阳性细胞。令人惊讶的是,CD4抗原阳性细胞出现在很低的频率与致命的肺部的毛细支气管炎(或正常婴儿的肺部组织),不管感染剂的性质(图3,上面板)。CD8抗原阳性细胞也只有很少在这些组织检测,再不管感染病毒的性质(较低的面板)。在扁桃体组织中CD4和CD8细胞容易检测到通过使用相同的包含IHC技术。图3中的结果完全是代表那些在标本20科目与致命的细支气管炎。

CD56抗原阳性细胞。包含IHC染色的结果CD56抗原阳性(NK)淋巴细胞在肺部的主题与致命的下呼吸道感染所示图4。CD56阳性细胞抗原很少是检测在正常婴儿肺部或肺部的主题与流感病毒或RSV感染。CD56抗原在污渍容易检测到人类肺癌活检样本(数据未显示)。

Granzyme-positive细胞。左面板上的证明图5,正常婴儿肺granzyme是负的,淋巴毒素。主题与流感病毒(右上角)和RSV (左下)感染也granzyme负面。预期的积极染色granzyme淋巴细胞存在于活检样本的肺癌病人在右下角的面板。

CD16抗原阳性细胞。肺组织免受致命的RSV和流感病毒下呼吸道感染患儿进行了研究中性粒细胞和巨噬细胞抗原的表达CD16 (图6)。CD16抗原并没有观察到在正常婴儿的肺部组织(左面板)。相比之下,强阳性染色观察与RSV科目或流感病毒感染(中心和右面板)。染色是在肺泡空间和间质炎症细胞,在细胞内渗出物阻塞细支气管腔。

半胱天冬酶3染色。我们下一个彩色的肺组织细胞凋亡标记半胱天冬酶3 (图7)。正常的婴儿肺组织(左面板)没有显示阳性染色细胞凋亡蛋白酶3。致命的下呼吸道感染患儿的肺组织显示强烈的染色。致命的RSV感染,caspsase 3染色是在细支气管上皮细胞表现得最为明显(右面板)。对流感病例,染色是最突出的炎症细胞(巨噬细胞和中性粒细胞,中心面板)。

讨论

婴儿幸存的病毒性下呼吸道感染,大部分17细胞因子测量中与RSV感染的受试者的数量低于在那些与流感病毒感染,也没有出席在那些与RSV感染浓度更高。具体地说,没有证据表明T淋巴细胞激活的呼吸道分泌物从这些婴儿为RSV下呼吸道感染住院的时候;经典的T淋巴细胞细胞因子- 2、il - 4, IFN-γ,IL-17分泌物(几乎都检测不出来。图1一个和1 b)。相比之下,2、il - 4, IFN-γIL-17都检测到更频繁或在更高浓度在主题下呼吸道感染流感病毒。因为婴儿与RSV感染严重疾病(减少氧饱和度和更长期的住院)与流感病毒比婴儿毛细支气管炎,这些发现因此挑战overresponsiveness的细胞毒性淋巴细胞在毛细支气管炎的发展起着至关重要的作用3-11]。所有样品的分泌物为细胞因子分析得到相同的人员在同一冬季使用相同的技术。样本和分析以相同的方式处理。主题与RSV感染相似年龄与流感病毒感染和显然是病了1天,平均而言,比人流感病毒感染(表1)。因此,这些因素不会似乎占减少细胞因子与RSV感染受试者中观察到的反应。

大多数其他细胞因子和趋化因子的数量也减少了RSV感染流感病毒感染相比,或许是因为他们的合成没有被刺激在缺乏T淋巴细胞反应。一些细胞因子含量等于在主题与RSV或流感病毒感染。可能的替代这些介质的来源包括呼吸道上皮细胞和其他炎症细胞。小儿毛细支气管炎的先前的研究细胞因子的反应发现低浓度的IFN-γ主题的严重形式的疾病(-),这通常与我们研究的结果一致。另外本研究证明了有限的淋巴细胞细胞因子- 2和IL-17细支气管炎。

除了少量淋巴细胞细胞因子在分泌物幸存的主题,淋巴细胞expressingCD4或CD8抗原出现在肺组织只有在非常低的数字。Granzyme-positive细胞毒性淋巴细胞也没有检测到致命的下呼吸道感染患儿的肺。在以前的研究支气管肺泡灌洗(BAL)流体从毛细支气管炎患儿中恢复过来,< 2%的细胞存在于BAL液体CD8抗原阳性(21,30.]。在目前的研究中,淋巴细胞CD4, CD8、CD56抗原很少观察到肺解剖组织。相反,在受试者幸存的麻疹病毒肺炎、CD8抗原阳性淋巴细胞主要集中在矿山液体(31日]。在致命的流感病毒感染婴儿期,雄踞在肺组织淋巴细胞(32,33),也存在于感染严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(34]。虽然单核细胞浸润的描述中观察到肺组织从主题与致命的腺病毒感染是有限的,然而,CD4和CD8-bearing在外周血淋巴细胞增殖和释放IFN-γ[35,36]。因此,缺乏RSV CD8淋巴细胞反应和流感病毒感染的婴儿似乎是异常的。我们不知道研究评估granzyme因下呼吸道感染在免疫染色正常婴儿礼物由其他病毒引起的。

这些整体研究结果强烈表明,T淋巴细胞活化和细胞毒性活动时不发生在肺毛细支气管炎患儿正在经历最严重的症状。低数量的细胞表达CD56抗原检测,表明NK细胞活性也降低。适应性反应是否发达后受试者死亡(或幸存)没有实际意义,但是这些反应不在的时候最大的疾病。

研究发展的RSV-specific RSV感染后外周血淋巴细胞细胞毒性活动已经能够证明只有弱反应(37,38]。有趣的是,一些报告所描述的机制RSV感染可以抑制体内细胞毒性反应的发展,包括干扰antigen-dependent T细胞受体信号(39),树突细胞功能的改变40),诱导淋巴细胞凋亡(41,抑制CD4淋巴细胞功能的IFN-α和IFN-λ[42]。

RSV抗原的表达(包含IHC检测分析)被认为超过了流感病毒抗原的主题与各自所造成的细支气管炎病毒的致命病例。虽然没有定量形态测量学,这些观察是由病理学家检查幻灯片没有感染病毒的性质的知识。先前的研究的RSV细支气管炎发现高病毒载量(评估定量聚合酶链式反应)与严重疾病(43]。

最后,为细胞凋亡染色标记半胱天冬酶3与毛细支气管炎的死亡病例的科目。然而,RSV感染,半胱天冬酶3在细支气管上皮细胞和病毒抗原检测。这表明凋亡机制的激活可能是至关重要的清算RSV-infected上皮细胞细胞毒性T细胞反应时缺席。相比之下,半胱天冬酶3染色在巨噬细胞和中性粒细胞主题更加突出与致命的流感病毒感染病例。虽然确切的结论是不可能的,发现一个可能的解释是,病毒抗原的表达已经下降在流感病毒感染的受试者(和细支气管上皮细胞更完整),细胞凋亡被诱导巨噬细胞和中性粒细胞减少炎症反应。需要进一步研究的关键领域。其他肺损伤的模型表明,凋亡信号后立即表达了对受损上皮毒性损伤肺。然而,毒素已经被清理后,在炎症细胞凋亡是突出,大概反映试图终止炎症(44]。

本研究的局限性包括细胞因子的测定在急性疾病的时候只有一次。我们试图纠正这个缺陷,研究中介的动力学反应样本分组1 - 5天的疾病。大量的IFN-γ、il - 4和IL-17拒绝在这个区间。虽然这表明我们没有错过淋巴细胞细胞因子反应的最终发展,后续样品获得了几天可能更为可取。细胞因子的另一个限制是分泌物的样本分析,病毒定量和病理分析并不可以从同一个主题。然而,细支气管炎疾病实体被认为是类似的在全世界演讲(45-47),所以在发病地区差异不太可能。更重要的是,这些发现从2人口在当下研究一致表明T淋巴细胞反应减弱或消失在moresevere形式的小儿病毒性下呼吸道感染,导致缺氧,需要住院治疗,或死亡。

在一项研究25),大量的6细胞因子(il - 12、TNF-αil - 6, IL-1β,引发,和il - 10)被发现是类似于婴儿与RSV感染和流感病毒感染。然而,大量的细胞因子的研究远远低于在目前的研究中,也许是因为样本鼻腔冲洗和吸入等。其他报告发现低数量的TNF-α[48],MCP-1, MIP-1α[49在婴儿比那些与RSV感染流感病毒感染。

总之,我们建议病毒性下呼吸道感染的发病机制主要是未能建立一个自适应相关细胞毒性T淋巴细胞反应。相反,清除病毒显然取决于低效的先天免疫反应介导巨噬细胞和中性粒细胞。半胱天冬酶3在肺部的表达表明,凋亡机制被激活,以清除病毒。这些机制可能最终导致根除感染,但在未感染邻近上皮细胞受损为代价的。这些发现应该鼓励对RSV抗病毒化合物的测试活动,在小儿下呼吸道感染流感病毒。

引用