sars - cov -2触发的中性粒细胞细胞外陷阱介导COVID-19病理gydF4y2Ba

2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行，截至2020年5月，全球有400多万人受到影响，30多万人死亡。COVID-19由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起，与流感相似，临床表现为大多数病例轻微的上呼吸道症状，少数患者出现严重的下呼吸道症状，出现急性呼吸窘迫综合征，并可能迅速发展为严重急性肺损伤导致的呼吸衰竭，这是其主要死亡原因(gydF4y2BaLai等人，2020年gydF4y2Ba)．我们也知道，这亚组患者有细胞因子风暴综合征，这似乎是多器官衰竭的原因(gydF4y2BaChen等，2020gydF4y2Ba)．此外，COVID-19患者会出现与败血症相似的体征和症状，其中许多症状会导致微血栓形成、器官功能障碍，最终导致休克(gydF4y2BaWu和McGoogan, 2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba马格罗等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba关等，2020年gydF4y2Ba)．SARS-CoV-2感染的第一步是病毒膜糖蛋白突刺(S)与血管紧张素转换酶2 (ACE2)之间的分子相互作用，ACE2在几种宿主细胞中表达，包括肺细胞、上皮细胞和内皮细胞(gydF4y2BaQi等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba洛夫伦等人，2008年gydF4y2Ba)．为了完成融合过程，S蛋白需要被丝氨酸蛋白酶如TMPRSS2 (gydF4y2Ba舒拉等人，2011年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba霍夫曼等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

循环中性粒细胞数量的增加被认为是COVID-19呼吸道症状严重程度和临床结果不佳的一个指标(gydF4y2Ba关等，2020年gydF4y2Ba)．在中性粒细胞在炎症性疾病中的效应机制中，中性粒细胞来源的细胞外陷阱(NETs)是一些最重要的(gydF4y2Ba布林克曼等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2BaPapayannopoulos和Zychlinsky, 2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba卡普兰和拉迪克，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaJorch和Kubes, 2017gydF4y2Ba)．net是细胞外纤维网络，由含有组蛋白的DNA和颗粒衍生酶(如髓过氧化物酶(MPO)和弹性酶(gydF4y2Ba布林克曼等人，2004年gydF4y2Ba)．中性粒细胞形成NET的过程称为NETosis，已被广泛研究。一般来说，这一过程始于模式识别受体或趋化因子激活中性粒细胞，随后产生ROS和钙动员，从而导致蛋白质精氨酸脱亚胺酶4 (pad4)的激活，这是一种细胞内酶，参与组蛋白上精氨酸残基的脱亚胺(gydF4y2BaLi et al.， 2010gydF4y2Ba)．在2004年,gydF4y2Ba布林克曼等人(2004)gydF4y2Ba最初将net描述为中性粒细胞释放的杀微生物机制(gydF4y2Ba布林克曼等人，2004年gydF4y2Ba)．然而，越来越多的证据表明，网络具有双刃剑的活动。net除了具有杀微生物活性外，还与组织损伤有关，因此也与一些疾病的发病机制有关，包括类风湿关节炎(gydF4y2BaKhandpur等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaSur Chowdhury等人，2014gydF4y2Ba)、糖尿病(gydF4y2BaWong等人，2015gydF4y2Ba)，以及败血症。关于败血症，我们的团队和其他人描述了在实验和临床败血症期间，NETs在血液中高浓度存在，并且与重要器官损伤和败血症严重程度的生物标志物呈正相关。此外，分别用重组人DNase (rhDNase)或PAD-4抑制剂进行药物治疗，破坏或抑制NET释放，显著减少了器官损伤，特别是在肺部，并增加了严重脓毒症小鼠的存活率(gydF4y2BaColón等，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaCzaikoski等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaKambas等人，2012年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMartinod等人，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaAltrichter等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba克拉克等人，2007年gydF4y2Ba)．众所周知，败血症与COVID-19病理生理学中涉及的关键事件(如细胞因子过度生产)之间的相似之处(gydF4y2Ba梅塔等人，2020年gydF4y2Ba)、微血栓形成(gydF4y2Ba马格罗等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaDolhnikoff等人，2020年gydF4y2Ba)，以及急性呼吸窘迫综合症(gydF4y2BaLai等人，2020年gydF4y2Ba)，这让我们假设NETs在SARS-CoV-2感染期间被触发，并可能导致COVID-19患者的组织损伤。在这种情况下，最近的证据表明，COVID-19患者血浆和肺部的NETs增加(gydF4y2Ba米德尔顿等，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSkendros等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2020gydF4y2Ba)．然而，NET生成背后的细胞和分子机制及其在COVID-19中的免疫病理作用尚不完全清楚。在这里，我们证明了NETs在COVID-19患者尸检的血浆、气管吸出物和肺组织标本中的浓度增加。此外，我们发现循环中性粒细胞被SARS-CoV-2感染并释放高水平的NETs。重要的是，SARS-CoV-2可以直接诱导健康中性粒细胞释放NETs，这依赖于ace2 -丝氨酸蛋白酶轴、病毒复制和PAD-4信号。最后，sars - cov -2激活的中性粒细胞释放的NETs促进肺上皮细胞凋亡。这些结果描述了由SARS-CoV-2感染产生NETs的新的细胞和分子机制，以及它们在COVID-19病理生理学中可能的有害作用。因此，抑制NET释放或作用可能是COVID-19的潜在治疗靶点。gydF4y2Ba

尽管全球COVID-19患者数量呈指数级增长，但目前还没有有效的治疗方法。了解宿主应对SARS-CoV-2感染的机制，肯定有助于开发新的治疗策略，以治疗COVID-19。在此，我们旨在研究NETs在COVID-19病理生理学中的可能作用。首先，我们采用标准方案对所有患者(32例)的鼻咽样本进行RT-PCR，确认其SARS-CoV-2感染(gydF4y2BaNalla等，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba)和/或在血浆样本中检测出抗SARS-CoV-2特异性抗体IgM和IgG。COVID-19患者的人口学特征和临床特征见gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba．循环中性粒细胞数量的增加是COVID-19预后较差的指标(gydF4y2Ba黄等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaChen等，2020gydF4y2Ba)．我们评估了循环中性粒细胞的数量(CD15gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba流式细胞术检测COVID-19患者。正如最近的报道(gydF4y2Ba马格罗等人，2020年gydF4y2Ba)，本队列的COVID-19患者也表现出明显的中性粒细胞(gydF4y2Ba图S1, A-CgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

脓毒症时血液循环和器官组织中的NETs水平升高(gydF4y2BaColón等，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaCzaikoski等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaKambas等人，2012年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMartinod等人，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaAltrichter等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba克拉克等人，2007年gydF4y2Ba)．考虑到重症COVID-19患者也会出现细胞因子风暴和重要器官损伤等败血症事件(gydF4y2BaChen等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba关等，2020年gydF4y2Ba)，然后通过测量MPO-DNA复合物(gydF4y2BaColón等，2019gydF4y2Ba)．证实先前的研究结果(gydF4y2Ba米德尔顿等，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSkendros等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2020gydF4y2Ba)，与健康对照组相比，在COVID-19患者的血浆中发现了更高水平的NETs (gydF4y2Ba图1 AgydF4y2Ba)．为了验证COVID-19患者血浆中NETs浓度较高是否是循环中性粒细胞数量增加或其释放这些介质能力增强的结果，我们纯化了对照组和COVID-19患者的血液中性粒细胞，以分析NETs的体外释放gydF4y2Ba．gydF4y2Ba使用标准化的细胞数量，我们发现与对照组相比，来自COVID-19患者的血液中性粒细胞释放出更高水平的NETs (gydF4y2Ba图1 BgydF4y2Ba)．NETs在显微镜下可见为DNA的细胞外纤维，与MPO和瓜氨酸组蛋白H3 (h3it;gydF4y2Ba布林克曼等人，2004年gydF4y2Ba)．共聚焦显微镜分析也证实了这些数据，并显示COVID-19患者中性粒细胞释放NETs的能力增强(gydF4y2Ba图1 CgydF4y2Ba)．这些数据通过Pearson DAPI与MPO的共域相关系数分析(gydF4y2Ba图1 DgydF4y2Ba)．COVID-19患者的蚊帐是典型的刚性棒。值得注意的是，超过80%的COVID-19患者的中性粒细胞NETs结构呈阳性(gydF4y2Ba图1 EgydF4y2Ba)．此外，来自COVID-19患者的中性粒细胞释放的net分支长度也大于健康对照组(gydF4y2Ba图1 FgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

介导中性粒细胞释放NETs的最重要的细胞内机制之一是PAD-4的激活。该酶催化组蛋白上精氨酸残基的瓜氨酸化，促进染色质解压缩和NETs的挤压(gydF4y2BaLi et al.， 2010gydF4y2Ba)．值得注意的是，通过将细胞与PAD-4的抑制剂cl -脒(Cl-Amidine)孵煮，COVID-19患者血液中性粒细胞释放的NETs减少。gydF4y2Ba图1,G和HgydF4y2Ba)．这些结果表明，在COVID-19患者中，循环中性粒细胞更容易释放依赖于pad -4的NETs，这可能导致系统性可溶性NETs增加。gydF4y2Ba

在COVID-19危急和严重病例中，肺部炎症是危及生命的呼吸系统疾病的主要原因(gydF4y2Ba关等，2020年gydF4y2Ba)．net已在病毒和非病毒感染患者和实验动物的肺组织中被鉴定出来(gydF4y2BaSivanandham等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaDicker等人，2018gydF4y2Ba)．接下来，我们调查了重症监护室接受机械通气的重症COVID-19患者的气管吸气物或死后COVID-19患者的肺切片中NETs的含量。首先，我们发现，与健康对照组的气道液相比，COVID-19患者的气管吸出液中NETs的浓度更高(gydF4y2Ba图2 AgydF4y2Ba)．气管吸出物中的NETs浓度比COVID-19患者血浆中观察到的NETs浓度高10倍(gydF4y2Ba图1 AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba图2 AgydF4y2Ba)．气管吸入物颗粒细胞的共聚焦显微镜分析也显示了典型的NETs结构，细胞外DNA与MPO和H3Cit (gydF4y2Ba图2 BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们调查了在COVID-19患者中观察到的肺组织损伤是否与NETs的局部存在有关。首先，我们通过CT分析确认了COVID-19患者肺部广泛损伤。我们在CT成像中观察到所有肺野的空气支气管图多发实变，周围和支气管血管周围分布，下叶更明显，伴有磨玻璃影，并与弥漫性肺泡损伤相容(gydF4y2Ba图S1 DgydF4y2Ba)．接下来，我们进行了微创尸检以收集肺组织并分析组织病理学特征。COVID-19尸检肺组织的组织病理学分析显示，渗出性和增生性弥漫性肺泡损伤(gydF4y2Ba图S1, EgydF4y2Ba[我]);肺泡及小气道上皮细胞病变及鳞状化生的强烈改变(gydF4y2Ba图S1 EgydF4y2Ba(二));轻度淋巴细胞浸润;肺小动脉改变(内皮性肿胀和小纤维性血栓)。10例患者中有6例观察到中性粒细胞性肺炎，程度不同(gydF4y2Ba图S1 EgydF4y2Ba)．对存在中性粒细胞的COVID-19死后个体肺组织的共聚焦显微镜分析也显示了特征性NET结构的存在，细胞外DNA染色与MPO和H3Cit共定位(gydF4y2Ba图2 CgydF4y2Ba)．由于心力衰竭而从肺叶切除术中获得的健康组织中未发现net (gydF4y2Ba图2 CgydF4y2Ba)．这些结果表明，NETs在肺组织中释放，并与COVID-19患者的肺损伤有关。gydF4y2Ba

几种刺激触发NETosis，包括病原体相关分子模式、损伤相关分子模式和炎症介质，包括细胞因子和趋化因子(gydF4y2Ba布林克曼等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKeshari et al.， 2012gydF4y2Ba)．亦有证据显示，中性粒细胞感染多种病毒可引发NETs的形成(gydF4y2BaSaitoh等，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaFunchal等人，2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHiroki等人，2020年gydF4y2Ba)，这促使我们研究SARS-CoV-2是否能够直接促进人体中性粒细胞释放NET。为此，从健康对照组血液中分离出的中性粒细胞在活SARS-CoV-2和灭活SARS-CoV-2感染的不同多样性(MOIs)中培养。我们发现，存活而非灭活的SARS-CoV-2以moi依赖的方式增加了NETs的释放(gydF4y2Ba图3,A和BgydF4y2Ba)．重要的是，sars - cov -2诱导的NETs释放被一种PAD-4抑制剂cl -脒取消(gydF4y2Ba图3,A和BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

与我们在COVID-19患者中性粒细胞中观察到的情况类似，在存在SARS-CoV-2的情况下，体外培养的健康中性粒细胞释放的NETs具有更长的分支长度(gydF4y2Ba图3 CgydF4y2Ba)．值得注意的是，我们检测到带有SARS-CoV-2抗原的中性粒细胞(gydF4y2Ba图3dgydF4y2Ba)．SARS-CoV-2抗原阳性的中性粒细胞比抗原阴性的中性粒细胞更容易出现NETosis (gydF4y2Ba图3、D、EgydF4y2Ba)．在11例新冠肺炎患者中，5例分离的血液中性粒细胞中也检测到SARS-CoV-2抗原gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中性粒细胞产生net的效率也更高(gydF4y2Ba图S2, A和BgydF4y2Ba)．这些结果表明，SARS-CoV-2可能直接激活中性粒细胞释放NETs。在含有灭活SARS-CoV-2的培养物中缺乏NET释放表明，激活的病毒感染和/或复制可能是触发NET释放所必需的。gydF4y2Ba

为了研究这一假设，我们用富马酸替诺福韦二吡酯(TDF)治疗SARS-CoV-2暴露的中性粒细胞，TDF是一种RNA聚合酶抑制剂，已被证明可以减少Vero细胞中SARS-CoV-2的复制(gydF4y2BaElfiky 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaClososki等人，2020年gydF4y2Ba)．TDF是与瑞德西韦同属一类的药物，可在体外有效抑制病毒复制，加速COVID-19患者的康复(gydF4y2Ba尹等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaBeigel等人，2020年gydF4y2Ba)．值得注意的是，TDF废除了由SARS-CoV-2诱导的健康捐赠者中性粒细胞释放NETs (gydF4y2Ba图3 FgydF4y2Ba)，这也与细胞内病毒载量的降低有关(gydF4y2Ba图3 GgydF4y2Ba)．值得注意的是，TDF并没有减少pma诱导的NET释放，从而排除了TDF对NET产生的脱靶效应(gydF4y2Ba图3 HgydF4y2Ba)．最后，为了进一步支持SARS-CoV-2在中性粒细胞中的复制过程，我们通过免疫荧光原位评估了双链RNA (dsRNA)的存在。dsRNA是由病毒RNA聚合酶产生的，作为RNA病毒基因组复制的中间体，包括SARS-CoV-2 (gydF4y2Ba韦伯等人，2006年gydF4y2Ba)．重要的是，在sars - cov -2感染的中性粒细胞感染后2和4小时检测到dsRNA (gydF4y2Ba图3 IgydF4y2Ba)．我们未在未感染的细胞或与灭活病毒孵育的细胞中检测到dsRNA染色(gydF4y2Ba图3 IgydF4y2Ba)．综上所述，这些数据表明，病毒复制周期对于sars - cov -2激活的中性粒细胞释放NETs至关重要。值得注意的是，我们的数据并没有证实SARS-CoV-2在NETosis过程开始之前，随着感染性子代的释放，完成了其复制周期。从这些数据中出现的另一个重要问题是关于活性SARS-CoV-2复制促进NET形成的分子机制。一个可能的候选者是TLR7，因为已知这种细胞内传感器参与识别单链RNA病毒(gydF4y2BaLund等人，2004年gydF4y2Ba)．事实上，TLR7与基孔肯雅病毒和HIV感染的中性粒细胞产生NETs有关(gydF4y2BaHiroki等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSaitoh等，2012gydF4y2Ba)．尽管我们的数据表明，SARS-CoV-2能够直接刺激NETs，但考虑到在严重的COVID-19期间细胞因子和趋化因子水平增加(gydF4y2Ba龚等，2020gydF4y2Ba，gydF4y2Ba预印gydF4y2Ba)，我们不能忽视细胞因子和趋化因子也在持续的COVID-19期间激活NETosis。例如，COVID-19患者的血清能够增加健康中性粒细胞对NETs的释放(gydF4y2Ba米德尔顿等，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2020gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

冠状病毒的细胞进入依赖于病毒刺突(S)蛋白与细胞受体的结合以及宿主细胞蛋白酶对S蛋白的启动。证据表明，SARS-CoV-2使用ACE2和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2进入不同类型的细胞(gydF4y2BaLi et al.， 2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba霍夫曼等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaLan等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba严等，2020年gydF4y2Ba)．因此，我们研究了sars - cov -2感染中性粒细胞中NETs的释放是否依赖于ACE2-TMPRSS2轴。首先，我们通过常规PCR和Western blot检测了4名健康供体中性粒细胞中ACE2的表达。作为阳性对照，我们评估了ACE在Caco-2细胞系(gydF4y2BaYamashita等人，2005年gydF4y2Ba)和经表达人ACE2的慢病毒转导的HeLa细胞(HeLa -ACE2)。作为阴性对照，我们使用非转导的HeLa细胞。我们检测了所有供体中性粒细胞中ACE2的mRNA和蛋白表达(gydF4y2Ba图S2 CgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba图4 AgydF4y2Ba)．据此，来自六个公共数据库的大规模转录组数据也显示ACE2在免疫系统细胞中表达，包括中性粒细胞(gydF4y2Ba李等，2020年gydF4y2Ba)．然后研究ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用在SARS-CoV-2释放NETs中的作用。因此，分离的中性粒细胞用中和性抗hace2抗体(αACE2)或camostat处理，camostat是丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的抑制剂，可阻断S蛋白与ACE2受体(gydF4y2Ba霍夫曼等人，2020年gydF4y2Ba)．值得注意的是，这两种药物都能消除中性粒细胞释放的sars - cov -2诱导的NETs (gydF4y2Ba图4、B、CgydF4y2Ba)．暴露于SARS-CoV-2的中性粒细胞的病毒载量也被αACE2或camostat抑制(gydF4y2Ba图4 DgydF4y2Ba)．这些处理没有改变pma激活的中性粒细胞产生NET (gydF4y2Ba图4 EgydF4y2Ba)，表明ACE2/TMPRSS2通路对于中性粒细胞进入SARS-CoV-2并释放NETs至关重要。gydF4y2Ba

NETs的释放与几种免疫介导疾病的组织损伤有关，包括慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎和败血症(gydF4y2BaDicker等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaKhandpur等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaColón等，2019gydF4y2Ba)．NETs通过细胞外暴露DNA、颗粒蛋白(如MPO)和组蛋白引起组织损伤，诱导细胞凋亡和纤维化过程(gydF4y2BaThammavongsa等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba亚达夫等人，2019gydF4y2Ba)．COVID-19的特征是肺泡上皮广泛损伤(gydF4y2BaDolhnikoff等人，2020年gydF4y2Ba)．为了了解释放的NETs在COVID-19病理生理学中的可能作用，我们接下来探讨了NETs可能参与肺上皮细胞损伤的假设。为此，从与SARS-CoV-2 (MOI = 1.0)孵育的健康对照中分离的血液中性粒细胞与人肺泡基底上皮细胞A549细胞共培养，并测定细胞活力(膜联蛋白VgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞)(gydF4y2Ba图5 AgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们发现，与未激活的中性粒细胞相比，sars - cov -2激活的中性粒细胞增加了A549细胞的凋亡。与cl -脒共培养可防止细胞凋亡(gydF4y2Ba图5 B和CgydF4y2Ba)．除了释放更高水平的net外(gydF4y2Ba图1 BgydF4y2Ba)，从COVID-19患者中分离出的中性粒细胞也比从健康对照中分离出的中性粒细胞对A549细胞显示出更高的细胞毒性作用(gydF4y2Ba图S2, D, EgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了证实NETs对肺上皮细胞的有害作用，我们评估了从体外pma激活的中性粒细胞(来自健康对照)纯化的NETs是否也能导致肺上皮细胞死亡。我们发现A549细胞暴露于纯化的NETs显著增加了凋亡膜联蛋白V的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞与未处理细胞的比较(gydF4y2Ba图5,D和EgydF4y2Ba)．重要的是，加入可降解NETs的rhDNase，可防止net诱导的A549细胞凋亡达到未处理细胞中观察到的类似水平(gydF4y2Ba图5,D和EgydF4y2Ba)．细胞角蛋白-17表达下调与上皮细胞活力降低有关(gydF4y2BaMikami等人，2017年gydF4y2Ba)．暴露于纯化NETs后，A549细胞中细胞角蛋白-17的表达显著降低，rhDNase (gydF4y2Ba图5,F和GgydF4y2Ba)．总之，这些结果表明，net可能是中性粒细胞的潜在有害介质，在SARS-CoV-2激活期间导致肺上皮细胞损伤。此外，NETs还可以激活不同的模式识别受体，包括TLR4和7，它们介导炎症介质的释放，从而放大NETs在COVID-19患者中的直接作用(gydF4y2BaSaitoh等，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaFunchal等人，2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHiroki等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在这种情况下，在重症COVID-19期间，观察到肺上皮细胞和内皮细胞凋亡，损害肺功能的事件，加重了疾病的严重程度(gydF4y2BaDolhnikoff等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang et al.， 2020agydF4y2Ba)．在这种情况下，重症COVID-19的特征是肺上皮细胞和内皮细胞凋亡，这些事件损害肺功能。同样，我们发现了中性粒细胞释放NETs的存在，以及COVID-19患者气管吸入物中NETs的高浓度与COVID-19的严重程度有关。最后，对COVID-19患者尸检获得的肺组织切片进行分析，发现位于肺泡间隙的中性粒细胞释放NETs。gydF4y2Ba

血栓形成事件可能导致严重COVID-19患者的肺、心脏和肾脏微循环受损(gydF4y2Ba马格罗等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaDolhnikoff等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSu等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang等，2020bgydF4y2Ba)．在这种情况下，NETs与不同疾病中血栓形成事件的起始和增强直接或通过血小板的激活有关(gydF4y2Ba珀多莫等人，2019年gydF4y2Ba)．虽然我们没有讨论NET在COVID-19期间可能参与血栓形成，但观察到NET产生的系统性增加这一事实使我们有理由推断NETs也触发了这些事件。因此，最近的研究表明，在培养的中性粒细胞和COVID-19患者的肺尸检中存在NETs与血小板源性溶栓因子共定位(gydF4y2Ba米德尔顿等，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSkendros等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，在本研究中，我们证明了在COVID-19患者中，循环和肺浸润的中性粒细胞释放了更高水平的NETs。我们还发现，SARS-CoV-2直接刺激中性粒细胞释放NETs，其机制依赖于ACE2和丝氨酸蛋白酶活性轴以及有效的病毒复制。最后，我们的研究结果证明了NETs对肺上皮细胞的潜在有害作用，这可能解释了严重COVID-19的部分病理生理学。总之，我们的研究支持使用NETs合成抑制剂或NETs破碎促进剂，作为临床过程中改善多器官损伤的一种策略。gydF4y2Ba

根据中国疾病预防控制中心的数据，我们招募了17名COVID-19重症患者和15名重症患者。gydF4y2BaWu和McGoogan, 2020年gydF4y2Ba)，经上文所述的RT-PCR证实(gydF4y2BaNalla等，2020年gydF4y2Ba)，或通过SARS-CoV-2特异性抗体IgM和IgG (Asan Easy Test COVID-19 IgM/IgG试剂盒;峨山制药)。gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba总结临床、实验室和治疗记录。我们对所有患者进行了胸部CT检查。为了比较血液和气管抽吸物中的NET测定，我们收集了21个年龄和性别匹配的健康对照(年龄，40.57±15.29;24%的女性)。gydF4y2Ba

通过静脉穿刺采集患者和健康对照组的外周血样本，并在450℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba用于等离子体分离。然后将血细胞重新悬浮在汉克平衡盐溶液中(康宁;猫。21-022-CV)，中性粒细胞群体由Percoll (GE Healthcare;猫。17-5445-01)密度梯度。分离的中性粒细胞在RPMI 1640中重悬(Corning;猫。15-040-CVR)，添加0.1% BSA。中性粒细胞纯度经Rosenfeld-colored Cytospin (Laborclin; cat. 620529).

气管液是通过无菌技术吸入气管口管获得的。收集的液体与0.1 M二硫苏糖醇1:1混合(赛默飞世尔科学公司;猫。R0862)，在37°C下孵育15分钟。将得到的溶液离心750gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C 10 min。用0.1%的聚l -赖氨酸溶液将细胞置于盖玻片中进行免疫染色，上清液用于NETs的测定。为了刺激健康对照组的气道液体生成和收集，吸入5ml高渗盐水(3%)。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2巴西/SPBR-02/2020毒株用于体外实验，最初从巴西首批COVID-19病例中分离出来。储存在DMEM中保存的Vero E6细胞系单层中扩增(Corning;猫。15 - 013表格)。滴度以50%组织培养感染剂量(TCID50)表示，由Reed-Muench法确定，并以每体积接种的TCID50表示。对于使用灭活病毒的实验，将原液与最终浓度为0.2%的甲醛在37°C下孵育过夜。gydF4y2Ba

根据美国疾病控制中心的协议(gydF4y2BaNalla等，2020年gydF4y2Ba)．用Trizol (Invitrogen;猫。15596026)从250 μ l的均质细胞颗粒中提取，以便在体外测定基因组病毒载量。所有RT-PCR检测均使用Viia 7 Real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行。简单地说，用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, cat。10400745)，用2µl互补DNA (cDNA)、20µM正向和反向引物、5µM探针和4µl Taqman Universal Master Mix II进行SARS-CoV-2 RT-PCR，最终体积为10µl(应用生物系统公司;猫。4440038)，参数为:50°C, 2 min, 95°C, 10 min，再循环40个周期，95°C, 15 s, 60°C, 1 min。数据以SARS-CoV-2组相对表达量的倍数变化表示。gydF4y2Ba

中性粒细胞(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba从COVID-19患者或健康对照组中提取的细胞)，用补充0.1% BSA的RPMI 1640(200µM;Sigma-Aldrich;猫。506282)，富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF;10µM;如在gydF4y2BaClososki等人，2020年gydF4y2Ba)，中和抗ace2抗体(αACE2;0.5µg / ml;瑞亚生物技术;猫。IM-0060)， camostat mesylate (camostat;10µM;Sigma-Aldrich;猫。SML0057)。所有化合物均在感染SARS-CoV-2 (MOI = 1.0)或用50 nM PMA刺激前1小时使用。 The viral load in cell pellet and concentration of NETs in supernatants was determined 4 h after infection. In another context, neutrophils from healthy controls were incubated with SARS-CoV-2 (MOI = 0.5 and 1.0) for 4 h at 37°C or inactivated SARS-CoV-2. The concentration of NETs in supernatants was determined. A total of 5 × 10^4gydF4y2Ba分离的中性粒细胞附着在0.1%聚l -赖氨酸溶液覆盖的盖玻片上(Sigma-Aldrich;猫。P8920)在37°C孵育4小时进行NET免疫染色。gydF4y2Ba

简单地说，中性粒细胞培养的血浆或上清在预涂有抗mpo抗体的培养皿中孵育一夜(赛默飞世尔科学公司;猫。pa5 - 16672)。使用定量it PicoGreen试剂盒(Invitrogen;猫。P11496)，如所述(gydF4y2BaColón等，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaCzaikoski等人，2016gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

用兔抗组蛋白H3 (H3Cit;Abcam;猫。ab5103;1:500)，小鼠抗mpo (2C7;Abcam;猫。ab25989, 1:500)，兔抗细胞角蛋白17 (Abcam;ab53707;1:400)。 The samples were washed in PBS and incubated with secondary antibodies donkey anti-mouse IgG AlexaFluor 647 (Thermo Fisher Scientific; cat. A32787; 1:800) or AlexaFluor 488 (Abcam; cat. ab150061; 1:800) and donkey anti-rabbit IgG AlexaFluor 488 (Abcam; cat. ab150065; 1:800) or AlexaFluor 594 (Abcam; cat. ab150076; 1:800). The nuclei were stained with DAPI (Life Technologies; cat. D1306; 1:1,000). To detect SARS-CoV-2 for immunostaining, we used a human serum kindly provided by Dr. Edison Durigon (University of São Paulo, São Paulo, Brazil) from a recovered COVID-19 patient (1:400). We used anti-human IgG biotin-conjugated (Sigma-Aldrich; cat. B-1140; 1:1,000) followed by amplification kit TSA Cyanine 3 System (PerkinElmer; cat. NEL704A001KT), according to the manufacturer’s protocol. For the detection of virus replication, we used mouse anti-dsRNA J2 (J2-1909; SCICONS English & Scientific Consulting Kft.; cat. 10010200; 1:1,000), as described (韦伯等人，2006年gydF4y2Ba)．二抗和免疫前荧光对照(gydF4y2Ba图S3, A, BgydF4y2Ba)．图像由Axio Observer结合630倍放大倍率的LSM 780共焦装置(Carl Zeiss)采集。NETs被确定为两种抗体(DAPI、MPO和H3Cit)的共定位区域，并使用Fiji/ImageJ软件进行量化。为了确定共域化，我们使用了每个样本中DAPI:MPO的比值，并执行皮尔逊相关系数。gydF4y2Ba

分析免疫染色图像以检查NETs的长度。选择DAPI、MPO和H3Cit染色来识别net中存在的像素。我们使用了来自斐济的适配插件Simple Neurite Tracer (ImageJ)。gydF4y2Ba

分离的中性粒细胞(1.5 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞)用50 nM的PMA (Sigma-Aldrich;猫。P8139)在37°C下放置4小时。含有NETs的培养基在450度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba以去除细胞碎片，收集含有net的上清液，并在18000下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba．去除上清液，将球团在PBS中重悬。net随后通过GeneQuant (Amersham生物科学公司)进行量化。gydF4y2Ba

从健康对照、HeLa细胞、hAce2-HA转导的HeLa细胞和Caco-2细胞中分离的中性粒细胞用于gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba基因表达评价。对于每个细胞样本(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞)，150ng总RNA使用Trizol (Invitrogen;猫。15596026)经高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems;猫。10400745)，根据制造商的说明。常规PCR采用Phusion高保真聚合酶(Thermo Fisher Scientific;猫。F531S)使用底漆进行gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba(向前，5 ' -TCCTAACCAGCCCCCTGTT-3 '，反向，5 ' - tgacaatgccaaccactatctt -3 ')，以及gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba(正向，5 ' -GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3 '，反向，5 ' -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3 ')，作为内部控制。cDNA合成后，用以下方法扩增样品:95°C 2 min;95°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s，循环扩增40次;最后使用Viriti 96孔热循环器(应用生物系统)在72°C下延长7分钟。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳观察。gydF4y2Ba

在DMEM (Life Technologies;猫。1200017)补充0.1 mg链霉素/ml, 100单位青霉素/ml, 10% (vol/vol)胎牛血清(赛默飞世尔科学;猫。12657029)。按照上述方法培养Caco-2细胞，但DMEM中添加20% FBS和MEM非必需氨基酸溶液(GIBCO;猫。11140 - 050)。用裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl [pH 7.5]， 150 mM NaCl, 10% [vol/vol]甘油，5 mM EDTA, 1% [vol/vol] Triton X-100)裂解HeLa细胞，Caco-2细胞和Ace2-HA转导的HeLa细胞，并补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich;猫。 P8340) on ice for 20 min and centrifuged for 20 min, 14,000ggydF4y2Ba在4°C。收集上清液，使用Bio-Rad蛋白测定法(cat。5000006)来平衡总蛋白质水平。等量样品缓冲液(4% SDS;将160 mM Tris-HCl [pH 6.8]， 20% [vol/vol]甘油，100 mM二硫苏糖醇和0.1%溴酚蓝)加入样品中，煮沸3分钟。来自健康对照组的原代人中性粒细胞用Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad;猫。1610737EDU)补充2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich;猫。M6250)在95°C。样品在还原条件下用SDS-PAGE 10%凝胶分解，转移到硝化纤维膜上(GE Healthcare Biosciences; cat. 10600002). The membranes were washed three times with PBS-T (PBS, 0.5% Tween 20) and blocked with 5% nonfat dry milk and 1% BSA (Invitrogen; cat. 15561020) in PBS-T for 1 h and then incubated overnight at 4°C with rabbit anti-ACE2 (Rhea Biotech; cat. IM-0060; 1:1,000) or mouse anti–β-actin (Santa Cruz Biotechnology; cat. sc-47778; 1:1,000) in PBS with 1% BSA. Then, the membranes were washed five times with PBS-T (5 min for each wash) and incubated with HRP conjugated with anti-mouse IgG (GE Healthcare Biosciences; cat. NA931, 1:10,000) or HRP conjugated with anti-rabbit IgG (Sigma-Aldrich; cat. GENA934; dilution 1:10,000) in PBS-T with 5% nonfat dry milk and 1% BSA for 1 h. Afterward, the membranes were washed again five times with PBS-T (5 min for each wash), and the proteins were detected with enhanced chemiluminescence solutions (solution 1: 1 M Tris-HCl [pH 8.5], 250 mM luminol, 90 mM p-coumaric acid; and solution 2: 30% H_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 M Tris-HCl [pH 8.5])，并使用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)进行可视化。gydF4y2Ba

人肺泡基底上皮A549细胞系(5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba)，维持在DMEM中，与cl -脒(200µM)预孵育(30分钟)的健康对照组中性粒细胞共同培养(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba)和SARS-CoV-2 (MOI = 1.0)共培养2 h。A549细胞还与来自COVID-19患者的中性粒细胞或纯化NETs (10 ng/ml)共培养，或未与rhDNase (0.5 mg/ml;罗氏公司;2小时，在37°C)。A549细胞与中性粒细胞或NETs共培养，37℃孵育24 h，通过流式细胞仪Annexin V染色或细胞角蛋白-17免疫染色检测A549细胞活力。gydF4y2Ba

简单地说，全血白细胞用固定活力染料eFluor 780 (eBioscience;猫。65-0865-14;1:3 000)和CD14特异性单克隆抗体(M5E2;双相障碍;猫。557153;1:50)， cd19 (hib19;BioLegend;猫。 302212; 1:200), CD15 (W6D3; BD; cat. 563141; 1:200) and CD16 (ebioCB16(CB16); eBioscience; cat. 12–0168-42; 1:200) for 30 min at 4°C. A549 cells (5 × 10^4gydF4y2Ba)用FITC ApoScreen Annexin V凋亡试剂盒(SouthernBiotech;猫。10010-02)，根据制造商的说明。所有数据在FACSVerse流式细胞仪(BD Biosciences)上收集，使用FlowJo (TreeStar)软件进行进一步分析。gydF4y2Ba

采用超声引导下的微创方法对10例COVID-19患者进行尸检。covid -HC-FMUSP尸检研究由HC-FMUSP伦理委员会批准(议定书#3951.904)，并在尸检室的图像平台(gydF4y2Bahttps://pisa.hc.fm.usp.br/gydF4y2Ba)．采样协议已在前面描述(gydF4y2BaDuarte-Neto等人，2019gydF4y2Ba)．肺组织标本用H&E和免疫染色。gydF4y2Ba

统计学意义由双尾配对或非配对学生决定gydF4y2BatgydF4y2Ba单因素方差分析和Bonferroni事后检验;P < 0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 8.4.2软件进行统计分析并绘制曲线图。gydF4y2Ba

该研究遵循的程序得到了巴西国家伦理委员会(CONEP, CAAE: 30248420.9.0000.5440)的批准。从招募的患者中获得书面知情同意。gydF4y2Ba

无花果S1。gydF4y2Ba显示了本队列中COVID-19患者的免疫病理特征。gydF4y2Ba无花果S2。gydF4y2Ba显示感染COVID-19患者的中性粒细胞对肺上皮细胞凋亡的影响。gydF4y2BaS3无花果。gydF4y2Ba显示免疫染色在sars - cov -2感染中性粒细胞实验中的特异性。gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba显示COVID-19患者的临床特征。gydF4y2Ba

我们感谢Marcella Daruge Grando, Livia Maria C.S. Ambrósio, Muriel C.R.O. Berti, Basílica Botelho Muniz和Juliana Trench Abumansur的技术援助。gydF4y2Ba

本研究得到Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo赠款(2013/08216-2和2020/05601-6)，Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico和Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior赠款的支持。gydF4y2Ba

作者贡献:F.P. Veras, M.C. Pontelli, F.Q. Cunha, R.D. Oliveira, J.C. alvs - filho, T.M. Cunha, P. Louzada-Junior, E. Arruda, L.O. Leiria和L.D. Cunha对研究设计有贡献。J.E. Toller-Kawahisa, M. de Lima, D.C. Nascimento和D. Colón进行中性粒细胞分离。F.P. Veras, D. Caetité， Roberta Rosales和G.M. Almeida进行免疫染色和共聚焦分析。J.E. Toller-Kawahisa, A.H. Schneider和D. Caetité进行了NET量化。C.M. Silva做了气管液体实验。L. Siyuan, S. Batah, A. Fabro, T. Mauad, M. Dolhnikoff, A. Duarte-Neto和P. Saldiva对肺解剖分析也有贡献。F.P. Veras和M.C. Pontelli进行A549上皮细胞损伤试验。A.H.施耐德对net进行了净化。F.P.维拉斯、M.C.庞特利、R.马丁斯和I.A.卡斯特罗进行了SARS-CoV-2实验。R. Martins和I.M. Paiva对SARS-CoV-2进行了RT-PCR和IgM/IgG检测。 F.P. Veras, M.C. Pontelli, and A.H. Schneider performed experiments with αACE2, camostat, and tenofovir disoproxil fumarate in infected neutrophils. I.M. Paiva performed PCR forACE2gydF4y2Ba基因的表达。L.A. Tavares和L.L.P. da Silva参与了HeLa细胞中ACE2的转导，并进行了ACE2蛋白表达的实验。F.P. Veras, M. de Lima和D.C. Nascimento进行了FACS分析。M.I.F. Lopez、M.N. Benatti、L.P. Bonjorno、M.C. Giannini、R. Luppino-Assad、S.L. Almeida、F. Vilar、R. Santana、V.R. Bollela、M. Auxiliadora-Martins、M. Borges、C.H. Miranda、A. Pazin-Filho和F. Dal-Pizzol为收集COVID-19患者的临床标本以及人口学和临床特征分析做出了贡献。F.Q. Cunha, R.D. Oliveira, T.M. Cunha, F.P. Veras, J.C. alvs - filho, M.C. Pontelli, P. Louzada-Junior, E. Arruda, D.S. Zamboni和L.O. Leiria撰写了手稿。所有作者都同意了这份手稿。gydF4y2Ba