sars - cov -2触发的中性粒细胞胞外陷阱介导COVID-19病理gydF4y2Ba

2019年冠状病毒病(COVID-19)成为大流行，影响了全球400多万人，到2020年5月，已有30多万人死亡。COVID-19由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引起，与流感相似，临床表现从大多数病例的轻度上呼吸道症状到一小部分患者的严重下呼吸道症状，其中急性呼吸窘迫综合征可发展为急性呼吸窘迫综合征，并可能迅速发展为呼吸衰竭，这是其主要死亡原因(gydF4y2BaLai et al.， 2020gydF4y2Ba)。我们还知道，这类患者有细胞因子风暴综合征，这似乎是导致多器官衰竭的原因(gydF4y2BaChen et al.， 2020gydF4y2Ba)。此外，COVID-19患者出现与败血症相似的体征和症状，其中许多会导致微血栓形成、器官功能障碍，最终导致休克(gydF4y2BaWu和McGoogan, 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaMagro et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaGuan等人，2020gydF4y2Ba)。SARS-CoV-2感染的第一步是病毒膜糖蛋白突刺(S)与血管紧张素转换酶2 (ACE2)之间的分子相互作用，ACE2在几种宿主细胞中表达，包括肺肺细胞、上皮细胞和内皮细胞(gydF4y2Ba齐等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaLovren et al.， 2008gydF4y2Ba)。为了完成融合过程，S蛋白需要被丝氨酸蛋白酶如TMPRSS2 (gydF4y2BaShulla et al.， 2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaHoffmann等人，2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

循环中性粒细胞数量的增加被认为是COVID-19呼吸道症状严重程度和临床结果不佳的一个指标(gydF4y2BaGuan等人，2020gydF4y2Ba)。在炎症性疾病中中性粒细胞的效应机制中，中性粒细胞衍生的细胞外陷阱(net)是最重要的(gydF4y2BaBrinkmann et al.， 2004gydF4y2Ba；gydF4y2BaPapayannopoulos和Zychlinsky, 2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba卡普兰和拉迪奇，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaJorch and Kubes, 2017gydF4y2Ba)。神经网络是细胞外纤维网络，由含有组蛋白和颗粒衍生酶的DNA组成，如髓过氧化物酶(MPO)和弹性酶(MPO)。gydF4y2BaBrinkmann et al.， 2004gydF4y2Ba)。中性粒细胞形成NET的过程被称为NETosis，已被广泛研究。一般来说，这个过程从中性粒细胞被模式识别受体或趋化因子激活开始，然后是ROS的产生和钙的动员，这导致蛋白精氨酸脱亚胺酶4 (PAD-4)的激活，这是一种参与组蛋白上精氨酸残基脱亚胺的细胞内酶(gydF4y2BaLi et al.， 2010gydF4y2Ba)。在2004年,gydF4y2BaBrinkmann et al. (2004)gydF4y2Ba最初将net描述为中性粒细胞释放的杀菌机制(gydF4y2BaBrinkmann et al.， 2004gydF4y2Ba)。然而，越来越多的证据表明，网络具有双刃剑活动。除了它们的杀微生物活性外，NETs还与组织损伤有关，因此与若干疾病的发病机制有关，包括类风湿性关节炎(gydF4y2BaKhandpur et al.， 2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaSur Chowdhury等人，2014gydF4y2Ba)、糖尿病(gydF4y2BaWong et al.， 2015gydF4y2Ba)和败血症。关于脓毒症，我们的团队和其他人已经描述了在实验和临床脓毒症中，NETs在血液中浓度很高，并且与重要器官损伤和脓毒症严重程度的生物标志物正相关。此外，分别用重组人dna酶(rhDNase)或PAD-4抑制剂进行药物治疗，破坏或抑制NET释放，可显著减轻器官损伤，尤其是肺损伤，并提高严重脓毒症小鼠的存活率(gydF4y2BaColón等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaCzaikoski et al.， 2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaKambas et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaMartinod et al.， 2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaAltrichter et al.， 2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaClark et al.， 2007gydF4y2Ba)。众所周知，败血症与COVID-19病理生理学中的关键事件(如细胞因子过量产生)之间存在相似之处(gydF4y2BaMehta et al.， 2020gydF4y2Ba)、微血栓形成(gydF4y2BaMagro et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaDolhnikoff et al.， 2020gydF4y2Ba)，以及急性呼吸窘迫综合症(gydF4y2BaLai et al.， 2020gydF4y2Ba)，这使我们假设NETs在SARS-CoV-2感染期间被触发，并可能导致COVID-19患者的组织损伤。在此背景下，最近的证据表明，COVID-19患者血浆和肺部的NETs增加(gydF4y2BaMiddleton et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaSkendros等人，2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2020gydF4y2Ba)。然而，NET产生的细胞和分子机制及其在COVID-19中的免疫病理作用尚不完全清楚。在这里，我们证明了COVID-19患者尸检的血浆、气管吸入物和肺组织标本中NETs的浓度增加。此外，我们发现循环中性粒细胞被SARS-CoV-2感染并释放高水平的NETs。重要的是，SARS-CoV-2可以直接诱导健康中性粒细胞释放NETs，这依赖于ace2 -丝氨酸蛋白酶轴、病毒复制和PAD-4信号。最后，sars - cov -2激活的中性粒细胞释放的NETs促进肺上皮细胞凋亡。这些结果描述了SARS-CoV-2感染产生NETs的新细胞和分子机制及其在COVID-19病理生理中的可能有害作用。因此，抑制NET的释放或作用可能是COVID-19的潜在治疗靶点。gydF4y2Ba

尽管全球COVID-19患者人数呈指数级增长，但目前尚无有效的治疗方法。了解宿主处理SARS-CoV-2感染的机制，肯定会有助于开发旨在治疗COVID-19的新治疗策略。在这里，我们旨在探讨NETs在COVID-19病理生理中的可能作用。首先，我们采用标准方案对所有患者(32例)的鼻咽样本进行RT-PCR检测，确认了SARS-CoV-2感染。gydF4y2BaNalla et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba)和/或检测血浆样本中针对SARS-CoV-2的特异性抗体IgM和IgG。COVID-19患者的人口学和临床特征见gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba。循环中性粒细胞数量增加是COVID-19预后恶化的一个指标(gydF4y2Ba黄等人，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaChen et al.， 2020gydF4y2Ba)。我们评估了循环中性粒细胞(CD15)的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba流式细胞术检测COVID-19患者的细胞。正如最近报道的(gydF4y2BaMagro et al.， 2020gydF4y2Ba)，本队列的COVID-19患者也表现出明显的中性粒细胞增多(gydF4y2Ba图S1, A-CgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

血液循环和器官组织中的NETs水平在败血症期间升高(gydF4y2BaColón等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaCzaikoski et al.， 2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaKambas et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaMartinod et al.， 2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaAltrichter et al.， 2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaClark et al.， 2007gydF4y2Ba)。考虑到重症COVID-19患者还可观察到细胞因子风暴、重要器官病变等脓毒症事件(gydF4y2BaChen et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaGuan等人，2020gydF4y2Ba)，然后通过测量MPO-DNA复合物(gydF4y2BaColón等人，2019gydF4y2Ba)。证实先前的发现(gydF4y2BaMiddleton et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaSkendros等人，2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2020gydF4y2Ba)，与健康对照组相比，COVID-19患者血浆中的NETs水平更高(gydF4y2Ba图1 AgydF4y2Ba)。为了验证COVID-19患者血浆中较高的NETs浓度是由于循环中性粒细胞数量增加还是它们释放这些介质的能力增强的结果，我们纯化了对照组和COVID-19患者的血液中性粒细胞，以分析NETs的体外释放gydF4y2Ba。gydF4y2Ba使用标准化的细胞数量，我们发现与对照组相比，COVID-19患者的血液中性粒细胞释放的NETs水平更高(gydF4y2Ba图1 BgydF4y2Ba)。在显微镜下，NETs可以看作是与MPO和瓜氨酸化组蛋白H3 (H3Cit;gydF4y2BaBrinkmann et al.， 2004gydF4y2Ba)。共聚焦显微镜分析证实了这些数据，还显示来自COVID-19患者的中性粒细胞释放NETs的能力增强(gydF4y2Ba图1 CgydF4y2Ba)。通过对DAPI与MPO共定位的Pearson相关系数分析(gydF4y2Ba图1 DgydF4y2Ba)。COVID-19患者的NETs是典型的硬棒。值得注意的是，超过80%的COVID-19患者中性粒细胞对NETs结构呈阳性(gydF4y2Ba图1 EgydF4y2Ba)。此外，COVID-19患者中性粒细胞释放的NETs分支长度也大于健康对照组(gydF4y2Ba图1 FgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

介导中性粒细胞释放NETs的最重要的细胞内机制之一是PAD-4的激活。该酶催化组蛋白上精氨酸残基的瓜氨酸化，促进染色质去浓缩和net的挤压(gydF4y2BaLi et al.， 2010gydF4y2Ba)。值得注意的是，用cl -脒(一种PAD-4抑制剂)孵育细胞后，COVID-19患者血液中性粒细胞释放的NETs减少。gydF4y2Ba图1,G和HgydF4y2Ba)。这些结果表明，在COVID-19患者中，循环中性粒细胞更容易释放pad -4依赖性NETs，这可能导致全身可溶性NETs增加。gydF4y2Ba

肺部炎症是COVID-19危重型和重症型中危及生命的呼吸系统疾病的主要原因。gydF4y2BaGuan等人，2020gydF4y2Ba)。已在病毒和非病毒感染患者及实验动物的肺组织中发现NETs (gydF4y2BaSivanandham et al.， 2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaDicker et al.， 2018gydF4y2Ba)。接下来，我们调查了重症监护病房机械通气下的重症COVID-19患者气管吸入物或死后COVID-19肺切片中NETs的含量。首先，我们发现，与健康对照组的呼吸道液体相比，COVID-19患者的气管吸入液中NETs的浓度更高(gydF4y2Ba图2agydF4y2Ba)。气管吸入物中NETs浓度比COVID-19患者血浆中NETs浓度高10倍(gydF4y2Ba图1 AgydF4y2Ba和gydF4y2Ba图2agydF4y2Ba)。气管吸入颗粒细胞的共聚焦显微镜分析也显示出典型的网状结构，细胞外DNA被MPO和H3Cit染色(gydF4y2Ba图2bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

接下来，我们研究了在COVID-19患者中观察到的肺组织损伤是否与NETs的局部存在有关。首先，我们通过计算机断层扫描(CT)分析证实了COVID-19患者肺部的广泛损伤。我们在CT成像中观察到所有肺野多发实变伴支气管充气征，伴外周及支气管血管周围分布，下肺叶更明显，伴磨玻璃影，与弥漫性肺泡损伤相符(gydF4y2Ba图S1 DgydF4y2Ba)。接下来，我们进行了微创解剖以获取肺组织并分析组织病理学特征。COVID-19尸检肺组织的组织病理学分析显示渗出性和增生性弥漫性肺泡损伤(gydF4y2Ba图S1, EgydF4y2Ba[我]);强烈的肺泡和小气道上皮改变伴细胞病变和鳞状化生(gydF4y2Ba图S1 EgydF4y2Ba(二));轻度淋巴细胞浸润;肺小动脉的变化(内皮肿胀和小纤维性血栓)。10例患者中有6例的样本中出现不同程度的中性粒细胞性肺炎(gydF4y2Ba图S1 EgydF4y2Ba)。对存在中性粒细胞的COVID-19死后个体的肺组织进行共聚焦显微镜分析也发现存在特征性NET结构，细胞外DNA染色与MPO和H3Cit共定位(gydF4y2Ba图2 CgydF4y2Ba)。在心力衰竭肺叶切除术后获得的健康组织中未发现NETs (gydF4y2Ba图2 CgydF4y2Ba)。这些结果表明，NETs在肺组织中释放，并与COVID-19患者的肺损伤有关。gydF4y2Ba

几种刺激触发NETosis，包括病原体相关的分子模式、损伤相关的分子模式和炎症介质，包括细胞因子和趋化因子(gydF4y2BaBrinkmann et al.， 2004gydF4y2Ba；gydF4y2BaKeshari et al.， 2012gydF4y2Ba)。也有证据表明，中性粒细胞被几种病毒感染后，可触发NETs的形成(gydF4y2Basaito et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaFunchal等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaHiroki et al.， 2020gydF4y2Ba)，这促使我们研究SARS-CoV-2是否能够直接促进人类中性粒细胞释放NET。为此，从健康对照血液中分离的中性粒细胞在活的和灭活的SARS-CoV-2的不同感染多重度(MOIs)存在下进行培养。我们发现，活的但未灭活的SARS-CoV-2以依赖于moi的方式增加了NETs的释放(gydF4y2Ba图3、A、BgydF4y2Ba)。重要的是，sars - cov -2诱导的NETs释放被一种PAD-4抑制剂Cl-Amidine (gydF4y2Ba图3、A、BgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

与我们在COVID-19患者中性粒细胞中观察到的相似，体外培养的健康中性粒细胞在SARS-CoV-2存在下释放的NETs具有更长的分支长度(gydF4y2Ba图3 CgydF4y2Ba)。值得注意的是，我们检测到带有SARS-CoV-2抗原的中性粒细胞(gydF4y2Ba图3 DgydF4y2Ba)。对SARS-CoV-2抗原呈阳性的中性粒细胞比抗原阴性的中性粒细胞发生更高的NETosis (gydF4y2Ba图3、D、EgydF4y2Ba)。在11名COVID-19患者中，5名患者的血液中性粒细胞中也检测到SARS-CoV-2抗原，而这些SARS-CoV-2抗原gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中性粒细胞也更有效地产生NETs (gydF4y2Ba图S2、A、BgydF4y2Ba)。这些结果表明，SARS-CoV-2可能直接激活中性粒细胞释放NETs。灭活的SARS-CoV-2培养物中缺乏NET释放表明，激活的病毒感染和/或复制可能是触发NET释放的必要条件。gydF4y2Ba

为了研究这一假设，我们用富马酸替诺福韦二氧吡酯(TDF)处理暴露于SARS-CoV-2的中性粒细胞，TDF是一种RNA聚合酶抑制剂，已被证明可以减少Vero细胞中SARS-CoV-2的复制(gydF4y2BaElfiky 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaClososki et al.， 2020gydF4y2Ba)。TDF是与瑞德西韦同属一类的药物，在体外有效抑制病毒复制，加速COVID-19患者的康复(gydF4y2BaYin等人，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaBeigel et al.， 2020gydF4y2Ba)。值得注意的是，TDF消除了由SARS-CoV-2诱导的健康供体中性粒细胞释放NETs (gydF4y2Ba图3fgydF4y2Ba)，这也与细胞内病毒载量的减少有关(gydF4y2Ba图3ggydF4y2Ba)。值得注意的是，TDF并没有减少pma诱导的NET释放，从而排除了TDF对NET产生的脱靶效应(gydF4y2Ba图3 HgydF4y2Ba)。最后，为了进一步支持SARS-CoV-2在中性粒细胞中的复制过程，我们利用免疫荧光法原位评估了双链RNA (dsRNA)的存在。dsRNA由病毒RNA聚合酶产生，作为RNA病毒基因组复制的中间物，包括SARS-CoV-2 (gydF4y2BaWeber et al.， 2006gydF4y2Ba)。重要的是，在感染sars - cov -2后2和4小时，在感染的中性粒细胞中检测到dsRNA (gydF4y2Ba图3、1gydF4y2Ba)。我们未在未感染细胞或用灭活病毒孵育的细胞中检测到dsRNA染色(gydF4y2Ba图3、1gydF4y2Ba)。综上所述，这些数据表明，病毒复制周期对于sars - cov -2激活的中性粒细胞释放NETs至关重要。值得注意的是，我们的数据并没有证实SARS-CoV-2在NETosis过程开始之前通过释放传染性后代完成其复制周期。从这些数据中出现的另一个重要问题是关于活跃的SARS-CoV-2复制促进NET形成的分子机制。一个可能的候选者是TLR7，因为已知这种细胞内传感器参与识别单链RNA病毒(gydF4y2BaLund et al.， 2004gydF4y2Ba)。事实上，TLR7与感染基孔肯雅病毒和艾滋病毒的中性粒细胞产生NETs有关(gydF4y2BaHiroki et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2Basaito et al.， 2012gydF4y2Ba)。尽管我们的数据表明SARS-CoV-2能够直接刺激NETs，但考虑到在严重的COVID-19期间细胞因子和趋化因子的水平升高(gydF4y2BaGong et al.， 2020gydF4y2Ba，gydF4y2Ba预印gydF4y2Ba)，我们不能忽视的是，在正在进行的COVID-19期间，细胞因子和趋化因子也在激活NETosis。例如，COVID-19患者的血清能够增加健康中性粒细胞释放NETs (gydF4y2BaMiddleton et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

冠状病毒进入细胞取决于病毒刺突蛋白与细胞受体的结合以及宿主细胞蛋白酶引发的S蛋白。有证据表明，SARS-CoV-2利用ACE2和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2进入不同的细胞类型(gydF4y2BaLi et al.， 2003gydF4y2Ba；gydF4y2BaHoffmann等人，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaLan et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaYan等，2020gydF4y2Ba)。因此，我们研究了感染sars - cov -2的中性粒细胞中NETs的释放是否依赖于ACE2-TMPRSS2轴。首先，我们通过常规PCR和Western blot检测了4名健康供体中性粒细胞中ACE2的表达。作为阳性对照，我们评估了Caco-2细胞株(gydF4y2BaYamashita等人，2005gydF4y2Ba)和HeLa细胞用慢病毒转导表达人ACE2 (HeLa -ACE2)。作为阴性对照，我们使用未转导的HeLa细胞。我们检测了所有供体中性粒细胞中ACE2 mRNA和蛋白的表达(gydF4y2Ba图S2 CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba图4 AgydF4y2Ba)。与此相一致，来自6个公共数据库的大规模转录组数据也显示ACE2在免疫系统细胞中表达，包括中性粒细胞(gydF4y2Ba李等人，2020gydF4y2Ba)。然后，我们研究了ACE2和SARS-CoV-2 S蛋白相互作用在SARS-CoV-2释放NETs中的作用。因此，用中和性抗hace2抗体(αACE2)或卡莫司他处理分离的中性粒细胞，卡莫司他是丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的抑制剂，可阻断S蛋白与ACE2受体的早期相互作用(gydF4y2BaHoffmann等人，2020gydF4y2Ba)。值得注意的是，这两种药物都消除了中性粒细胞释放的sars - cov -2诱导的NETs (gydF4y2Ba图4、B、CgydF4y2Ba)。暴露于SARS-CoV-2的中性粒细胞的病毒载量也被αACE2或卡莫司他(gydF4y2Ba图4 DgydF4y2Ba)。这些处理没有改变pma活化的中性粒细胞产生NET (gydF4y2Ba图4 EgydF4y2Ba)，这表明ACE2/TMPRSS2通路对于SARS-CoV-2进入和中性粒细胞释放NETs至关重要。gydF4y2Ba

NETs的释放与几种免疫介导疾病的组织损伤有关，包括慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎和败血症(gydF4y2BaDicker et al.， 2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaKhandpur et al.， 2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaColón等人，2019gydF4y2Ba)。NETs通过细胞外暴露DNA、颗粒蛋白(如MPO)和组蛋白引起组织损伤，诱导细胞凋亡和纤维化过程(gydF4y2BaThammavongsa et al.， 2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaYadav et al.， 2019gydF4y2Ba)。COVID-19的特征是肺泡上皮的广泛损伤(gydF4y2BaDolhnikoff et al.， 2020gydF4y2Ba)。为了了解释放的NETs在COVID-19病理生理中的可能作用，我们接下来探讨了NETs可能参与肺上皮细胞损伤的假设。为此，将经SARS-CoV-2 (MOI = 1.0)培养的健康对照血分离中性粒细胞与人肺泡基底上皮细胞A549细胞共培养，测定细胞活力(膜联蛋白V)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba流式细胞术(gydF4y2Ba图5 AgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们发现，与未激活的中性粒细胞相比，sars - cov -2激活的中性粒细胞增加了A549细胞的凋亡。与cl -脒共培养可抑制细胞凋亡。gydF4y2Ba图5 B、CgydF4y2Ba)。除了释放更高水平的net (gydF4y2Ba图1 BgydF4y2Ba)，从COVID-19患者中分离的中性粒细胞对A549细胞的细胞毒性作用也高于从健康对照中分离的中性粒细胞(gydF4y2Ba图S2、D、EgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

为了证实NETs对肺上皮细胞的有害作用，我们评估了从体外pma活化的中性粒细胞(来自健康对照)中纯化的NETs是否也能导致肺上皮细胞死亡。我们发现A549细胞暴露于纯化的NETs显著增加凋亡的膜联蛋白V的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与未处理细胞相比(gydF4y2Ba图5、D、EgydF4y2Ba)。重要的是，添加可降解NETs的rhDNase可将net诱导的A549细胞凋亡阻止至与未处理细胞相似的水平(gydF4y2Ba图5、D、EgydF4y2Ba)。下调细胞角蛋白17的表达与上皮细胞活力降低有关(gydF4y2BaMikami et al.， 2017gydF4y2Ba)。暴露于纯化的NETs后，A549细胞中细胞角蛋白17的表达显著降低，rhDNase (gydF4y2Ba图5、F、GgydF4y2Ba)。总之，这些结果表明，NETs可能是中性粒细胞的潜在有害介质，在SARS-CoV-2激活期间引起肺上皮细胞损伤。此外，NETs还可以激活不同的模式识别受体，包括介导炎症介质释放的TLR4和7，这反过来可以放大NETs在COVID-19患者中的直接作用(gydF4y2Basaito et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaFunchal等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaHiroki et al.， 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在这种情况下，在严重的COVID-19期间，观察到肺上皮细胞和内皮细胞的凋亡，损害肺功能的事件，加重了疾病的严重程度(gydF4y2BaDolhnikoff et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba张等，2020agydF4y2Ba)。在这种情况下，重症COVID-19的特征是肺上皮细胞和内皮细胞的凋亡，这是损害肺功能的事件。同样，我们发现中性粒细胞释放的NETs的存在以及COVID-19患者气管吸入物中高浓度的NETs与COVID-19严重程度有关。最后，对COVID-19患者尸检获得的肺组织切片进行分析，发现释放NETs的中性粒细胞位于肺泡间隙。gydF4y2Ba

在COVID-19重症患者中，血栓形成事件可能导致肺、心脏和肾脏微循环受损(gydF4y2BaMagro et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaDolhnikoff et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaSu et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2Ba张等，2020bgydF4y2Ba)。在这种情况下，NETs直接或通过激活血小板，与不同疾病中血栓形成事件的启动和增强有关(gydF4y2BaPerdomo et al.， 2019gydF4y2Ba)。虽然我们没有解决在COVID-19期间NET可能参与血栓形成的问题，但观察到的NET生成的系统性增加这一事实使我们有理由推断NET也触发了这些事件。因此，最近的研究表明，在培养的中性粒细胞和COVID-19患者的肺解剖中，NETs与血小板源性溶栓因子存在共定位(gydF4y2BaMiddleton et al.， 2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaSkendros等人，2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总之，在本研究中，我们证明了在COVID-19患者中，循环和肺浸润中性粒细胞释放更高水平的NETs。我们还发现SARS-CoV-2直接刺激中性粒细胞释放NETs，其机制依赖于ACE2和丝氨酸蛋白酶活性轴以及有效的病毒复制。最后，我们的研究结果证明了NETs对肺上皮细胞的潜在有害作用，这可能解释了严重COVID-19的部分病理生理学。总之，我们的研究支持在临床过程中使用神经网络合成抑制剂或神经网络碎片化促进剂作为改善多器官损伤的策略。gydF4y2Ba

根据中国疾病预防控制中心(cdc)的数据，我们登记了17例危重患者和15例重症患者。gydF4y2BaWu和McGoogan, 2020gydF4y2Ba)，经RT-PCR证实，如前所述(gydF4y2BaNalla et al.， 2020gydF4y2Ba)，或通过针对SARS-CoV-2的特异性抗体IgM和IgG (Asan Easy Test COVID-19 IgM/IgG试剂盒;峨山制药(株)gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba总结临床、实验室和治疗记录。我们对所有患者进行了胸部CT检查。为了比较血液和气管吸入物的NET测定，我们收集了21名年龄和性别匹配的健康对照(年龄，40.57±15.29;24%的女性)。gydF4y2Ba

采用静脉穿刺法采集患者和健康对照者外周血，450℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba用于血浆分离。然后将血细胞重悬在汉克平衡盐溶液中(康宁;猫。21-022-CV)，中性粒细胞群体由Percoll (GE Healthcare;猫。17-5445-01)密度梯度。分离的中性粒细胞重悬于RPMI 1640(康宁;猫。15-040-CVR)，添加0.1% BSA。经Rosenfeld-colored Cytospin (Laborclin; cat. 620529).

气管液体是通过无菌技术从气管管中抽吸获得的。将收集的液体与0.1 M二硫苏糖醇(Thermo Fisher Scientific;猫。R0862)，在37°C下孵育15分钟。将得到的溶液离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C孵育10 min。用0.1%聚l -赖氨酸溶液将细胞制成球粒，进行免疫染色，上清液用于测定NETs。为了刺激健康对照者气道液体的产生和收集，吸入5ml高渗生理盐水(3%)。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2巴西/SPBR-02/2020株用于体外实验，最初是从巴西首批COVID-19病例中分离出来的。在Vero E6细胞系的DMEM (Corning;猫。15 - 013表格)。滴度以Reed-Muench法测定的50%组织培养感染剂量(TCID50)表示，并以每接种体积的TCID50绘制。对于使用灭活病毒的实验，将储存液与终浓度为0.2%的甲醛在37°C下孵育过夜。gydF4y2Ba

根据美国疾病控制中心(cdc)的协议(gydF4y2BaNalla et al.， 2020gydF4y2Ba)。利用Trizol (Invitrogen)提取的总核酸，RT-PCR检测N1和N2基因以及RNase P管家基因;猫。15596026)从250µl均质细胞颗粒中提取，以便在体外测定基因组病毒载量。所有RT-PCR检测均采用Viia 7 Real-time PCR系统(Applied Biosystems)。简单地说，用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems, cat.)用随机引物引物提取200 ng RNA进行反转录反应后。10400745)，最终体积为10µl，使用2µl互补DNA (cDNA)， 20µM正向和反向引物，5µM探针和4µl Taqman Universal Master Mix II，不含尿嘧啶- n -糖基化酶(Applied Biosystems;猫。4440038)，参数为:50°C 2 min, 95°C 10 min，然后40个循环，95°C 15 s, 60°C 1 min。数据用SARS-CoV-2组的倍变相对表达量表示。gydF4y2Ba

中性粒细胞(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba取COVID-19患者或健康对照的细胞)，用RPMI 1640培养液孵育，RPMI 1640中添加或未添加cl -脒(200µM)处理的0.1% BSA;Sigma-Aldrich;猫。506282)，富马酸替诺福韦二吡酯(TDF;10µM;如gydF4y2BaClososki et al.， 2020gydF4y2Ba)，中和抗ace2抗体(αACE2;0.5µg / ml;瑞亚生物技术;猫。IM-0060)，甲磺酸卡莫司他(camostat;10µM;Sigma-Aldrich;猫。SML0057)。所有化合物均在感染SARS-CoV-2 (MOI = 1.0)或50 nM PMA刺激前1 h使用。 The viral load in cell pellet and concentration of NETs in supernatants was determined 4 h after infection. In another context, neutrophils from healthy controls were incubated with SARS-CoV-2 (MOI = 0.5 and 1.0) for 4 h at 37°C or inactivated SARS-CoV-2. The concentration of NETs in supernatants was determined. A total of 5 × 10^4gydF4y2Ba分离的中性粒细胞附着在涂有聚赖氨酸溶液0.1% (Sigma-Aldrich;猫。P8920)在37°C孵育4小时进行NET免疫染色。gydF4y2Ba

简单地说，中性粒细胞培养的血浆或上清液在预涂有抗mpo抗体(Thermo Fisher Scientific;猫。pa5 - 16672)。结合MPO的DNA使用Quant-iT PicoGreen试剂盒(Invitrogen;猫。P11496)，如所述(gydF4y2BaColón等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaCzaikoski et al.， 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

固定样品，用以下抗体染色:兔抗组蛋白H3 (H3Cit);Abcam;猫。ab5103;1:500)，小鼠抗mpo (2C7;Abcam;猫。ab25989, 1:500)，兔抗细胞角蛋白17 (Abcam;ab53707;1:400)。 The samples were washed in PBS and incubated with secondary antibodies donkey anti-mouse IgG AlexaFluor 647 (Thermo Fisher Scientific; cat. A32787; 1:800) or AlexaFluor 488 (Abcam; cat. ab150061; 1:800) and donkey anti-rabbit IgG AlexaFluor 488 (Abcam; cat. ab150065; 1:800) or AlexaFluor 594 (Abcam; cat. ab150076; 1:800). The nuclei were stained with DAPI (Life Technologies; cat. D1306; 1:1,000). To detect SARS-CoV-2 for immunostaining, we used a human serum kindly provided by Dr. Edison Durigon (University of São Paulo, São Paulo, Brazil) from a recovered COVID-19 patient (1:400). We used anti-human IgG biotin-conjugated (Sigma-Aldrich; cat. B-1140; 1:1,000) followed by amplification kit TSA Cyanine 3 System (PerkinElmer; cat. NEL704A001KT), according to the manufacturer’s protocol. For the detection of virus replication, we used mouse anti-dsRNA J2 (J2-1909; SCICONS English & Scientific Consulting Kft.; cat. 10010200; 1:1,000), as described (Weber et al.， 2006gydF4y2Ba)。二抗和免疫前荧光对照(gydF4y2Ba图3、A、BgydF4y2Ba)。图像由Axio Observer联合LSM 780共聚焦装置获得，放大倍率为630倍(卡尔蔡司)。NETs被确定为两种抗体(DAPI、MPO和H3Cit)的共定位区域，并使用Fiji/ImageJ软件进行量化。为了确定共定位，我们通过执行Pearson相关系数在每个样本中使用DAPI:MPO的比率。gydF4y2Ba

对免疫染色图像进行分析，以检查网的长度。选择DAPI, MPO和H3Cit染色来识别NETs中存在的像素。我们使用来自斐济的插件Simple Neurite Tracer (ImageJ)。gydF4y2Ba

分离的中性粒细胞(1.5 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba用50 nM的PMA (Sigma-Aldrich;猫。P8139)在37℃下加热4小时。将含有NETs的培养基在450℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba去除细胞碎片，收集含net的上清液，在18000℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba。去除上清，将微球重悬于PBS中。然后通过GeneQuant (Amersham Biosciences Corporation)对NETs进行量化。gydF4y2Ba

从健康对照、HeLa细胞、hAce2-HA转导的HeLa细胞和Caco-2细胞中分离的中性粒细胞gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba基因表达评价。对于每个细胞样本(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞)，用Trizol (Invitrogen;猫。15596026)通过高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems;猫。10400745)，根据制造商的说明。传统PCR采用Phusion High Fidelity polymerase (Thermo Fisher Scientific;猫。F531S)使用引物gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba(正向，5 ' -TCCTAACCAGCCCCCTGTT-3 '，反向，5 ' - tgacaatgccaaccactatctt -3 ')，以及gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba(正向，5 ' -GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3 '和反向，5 ' -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3 ')，作为内部控制。cDNA合成完成后，使用以下方法扩增样品:95°C 2 min;然后在95°C、60°C和72°C条件下分别扩增30 s、30 s和30 s，进行40个循环;最后使用Viriti 96孔热循环器(Applied Biosystem)在72°C下延长7分钟。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳观察。gydF4y2Ba

在DMEM (Life Technologies)培养基中培养HeLa细胞和转染Ace2-HA的HeLa细胞;猫。12800017)添加0.1 mg链霉素/ml, 100单位青霉素/ml和10% (vol/vol)胎牛血清(Thermo Fisher Scientific;猫。12657029)。Caco-2细胞按上述方法培养，但DMEM中添加20%胎牛血清和MEM非必需氨基酸溶液(GIBCO;猫。11140 - 050)。用裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl [pH 7.5]， 150 mM NaCl, 10% [vol/vol]甘油，5 mM EDTA, 1% [vol/vol] Triton X-100)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich;猫。 P8340) on ice for 20 min and centrifuged for 20 min, 14,000ggydF4y2Ba在4°C。收集上清液，使用Bio-Rad蛋白测定法(cat)测定每个样品的蛋白质水平。5000006)平衡总蛋白水平。等量的样品缓冲液(4% SDS;将160 mM Tris-HCl [pH 6.8]， 20% [vol/vol]甘油，100 mM二硫苏糖醇和0.1%溴酚蓝)加入样品中，煮沸3分钟。健康对照的原代人中性粒细胞用Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad;猫。1610737EDU)添加2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich;猫。M6250)在95°C。样品在还原条件下用SDS-PAGE 10%凝胶溶解，转移到硝化纤维素膜上(GE Healthcare Biosciences; cat. 10600002). The membranes were washed three times with PBS-T (PBS, 0.5% Tween 20) and blocked with 5% nonfat dry milk and 1% BSA (Invitrogen; cat. 15561020) in PBS-T for 1 h and then incubated overnight at 4°C with rabbit anti-ACE2 (Rhea Biotech; cat. IM-0060; 1:1,000) or mouse anti–β-actin (Santa Cruz Biotechnology; cat. sc-47778; 1:1,000) in PBS with 1% BSA. Then, the membranes were washed five times with PBS-T (5 min for each wash) and incubated with HRP conjugated with anti-mouse IgG (GE Healthcare Biosciences; cat. NA931, 1:10,000) or HRP conjugated with anti-rabbit IgG (Sigma-Aldrich; cat. GENA934; dilution 1:10,000) in PBS-T with 5% nonfat dry milk and 1% BSA for 1 h. Afterward, the membranes were washed again five times with PBS-T (5 min for each wash), and the proteins were detected with enhanced chemiluminescence solutions (solution 1: 1 M Tris-HCl [pH 8.5], 250 mM luminol, 90 mM p-coumaric acid; and solution 2: 30% H_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 M Tris-HCl [pH 8.5])，并使用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)进行可视化。gydF4y2Ba

人肺泡基底上皮A549细胞系(5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba)，在DMEM中维持，与来自健康对照(10)的Cl-Amidine(200µM)预孵育(30分钟)的中性粒细胞(10µM)共培养gydF4y2Ba^6gydF4y2BaA549细胞与来自COVID-19患者的中性粒细胞或纯化NETs (10 ng/ml)共培养2 h，或不与rhDNase (0.5 mg/ml;罗氏公司;37℃下2 h)。A549细胞与中性粒细胞或NETs共培养，37℃孵育24 h，采用Annexin V染色流式细胞术或细胞角蛋白17免疫染色法测定A549细胞活力。gydF4y2Ba

简单地说，全血白细胞用固定活力染料eFluor 780 (eBioscience;猫。65-0865-14;1:3 000)和CD14特异性单克隆抗体(M5E2;双相障碍;猫。557153;1:50)， cd19 (hib19;BioLegend;猫。 302212; 1:200), CD15 (W6D3; BD; cat. 563141; 1:200) and CD16 (ebioCB16(CB16); eBioscience; cat. 12–0168-42; 1:200) for 30 min at 4°C. A549 cells (5 × 10^4gydF4y2Ba)用FITC ApoScreen Annexin V凋亡试剂盒(SouthernBiotech;猫。10010-02)，根据制造商的说明。所有数据均在FACSVerse流式细胞仪(BD Biosciences)上收集，使用FlowJo (TreeStar)软件进行进一步分析。gydF4y2Ba

采用超声引导下微创入路对10例新冠肺炎患者进行尸检。covid - 19-HC-FMUSP尸检研究经HC-FMUSP伦理委员会批准(协议#3951.904)，并在尸检室的图像平台上进行(gydF4y2Bahttps://pisa.hc.fm.usp.br/gydF4y2Ba)。之前描述了采样方案(gydF4y2BaDuarte-Neto等人，2019gydF4y2Ba)。肺组织标本进行H&E染色和免疫染色。gydF4y2Ba

统计显著性由双尾配对或未配对的学生确定gydF4y2BatgydF4y2Ba单因素方差分析后采用Bonferroni事后检验;P < 0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 8.4.2软件进行统计分析和作图。gydF4y2Ba

本研究遵循的程序已获得巴西国家伦理委员会(CONEP, CAAE: 30248420.9.0000.5440)的批准。从招募的患者中获得书面知情同意。gydF4y2Ba

无花果S1。gydF4y2Ba显示了该队列中COVID-19患者的免疫病理特征。gydF4y2Ba无花果S2。gydF4y2Ba新冠肺炎患者感染的中性粒细胞对肺上皮细胞凋亡的影响。gydF4y2BaS3无花果。gydF4y2Ba在sars - cov -2感染中性粒细胞实验中显示免疫染色的特异性。gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba符合新冠肺炎患者的临床特征。gydF4y2Ba

我们感谢Marcella Daruge Grando、Livia Maria C.S. Ambrósio、Muriel C.R.O. Berti、Basílica Botelho Muniz和Juliana Trench Abumansur提供的技术援助。gydF4y2Ba

本研究得到了圣保罗州 健康基金会(2013/08216-2和2020/05601-6)、国家健康发展咨询委员会Científico e Tecnológico和圣保罗州健康发展基金会Nível高级基金的支持。gydF4y2Ba

作者贡献:F.P. Veras, M.C. Pontelli, F.Q. Cunha, R.D. Oliveira, J.C. Alves-Filho, T.M. Cunha, P. Louzada-Junior, E. Arruda, L.O. Leiria和L.D. Cunha对研究设计做出了贡献。J.E. Toller-Kawahisa, M. de Lima, D.C. Nascimento和D. Colón进行中性粒细胞分离。F.P. Veras, D. caetit， Roberta Rosales和G.M. Almeida进行免疫染色和共聚焦分析。J.E. Toller-Kawahisa, A.H. Schneider和D. caetit进行了NET量化。C.M. Silva做了气管液体实验。L. Siyuan, S. Batah, A. Fabro, T. Mauad, M. Dolhnikoff, A. Duarte-Neto和P. Saldiva对肺解剖分析做出了贡献。F.P. Veras和M.C. Pontelli进行A549上皮细胞损伤试验。A.H. Schneider进行了net的纯化。F.P. Veras、M.C. Pontelli、R. Martins和I.A. Castro进行了SARS-CoV-2实验。R. Martins和I.M. Paiva对SARS-CoV-2进行了RT-PCR和IgM/IgG检测。 F.P. Veras, M.C. Pontelli, and A.H. Schneider performed experiments with αACE2, camostat, and tenofovir disoproxil fumarate in infected neutrophils. I.M. Paiva performed PCR forACE2gydF4y2Ba基因的表达。la Tavares和L.L.P. da Silva参与了HeLa细胞中ACE2的转导，并进行了ACE2蛋白表达的实验。F.P. Veras、M. de Lima和dc Nascimento进行FACS分析。M.I.F. Lopez、M.N. Benatti、L.P. Bonjorno、M.C. Giannini、R. Luppino-Assad、S.L. Almeida、F. Vilar、R. Santana、V.R. Bollela、M. Auxiliadora-Martins、M. Borges、C.H. Miranda、A. Pazin-Filho和F. Dal-Pizzol参与了COVID-19患者的临床标本收集和人口统计学和临床特征分析。F.Q. Cunha, R.D. Oliveira, T.M. Cunha, F.P. Veras, J.C. Alves-Filho, M.C. Pontelli, P. Louzada-Junior, E. Arruda, D.S. Zamboni和L.O. Leiria撰写了手稿。所有作者都认可了这份手稿。gydF4y2Ba