吸入的皮质类固醇（ICSS）在慢性阻塞性肺病（COPD）中广泛规定。然而，关于ICSS治疗响应的预测因子很少。探讨糖皮质激素诱导的转录物1的变异吗（glcci1.）RS37973与ICS功效有关。招募了204例临床稳定的COPD患者，并施用并施用吸入氟替卡松丙酸盐/萨尔米尔组合（每日两次）24周。我们基因型函数RS37973，主要评估其对肺功能变化的影响。在体外，从部分患者中分离的中性粒细胞与各种浓度的地塞米松孵育（0,10⁻⁶米和10⁻⁴ M) in the presence or absence of cigarette smoke extract, apoptosis was then assessed by flow cytometry. Patients with the homozygous GG genotype (increases of 15.3 ± 33.2 mL) had significantly poorer improvement in FEV₁(92.7±29.6 mL;p < 0.001) or AG (59.4 ± 26.9 mL;p < 0.001) genotypes after 24-week treatment.在体外，地塞米松对中性粒细胞凋亡对GG基因型的抑制作用较少，这进一步验证了突变等位基因的存在可能对糖皮质激素的存在，无论吸烟状态如何。RS37973的GG基因型可能与中国COPD患者的ICS疗效降低相关。

慢性阻塞性肺病（COPD）是全世界死亡率的主要和增加原因¹，导致持续气流限制，气道重塑和肺功能逐渐恶化。吸烟是航空公司正在进行的炎症的主要危险因素之一²和吸入的皮质类固醇（ICS）是抗炎治疗的主要效果。目前的指导方针建议使用ICS与长效相结合的β₂高度加剧风险的患者的重要人物^3.．然而，疗效表现出个体间的高度变异，许多患者的反应不充分。而且长期的吸入性糖皮质激素治疗有局部和全身副作用的风险，如口咽念珠菌病，声音嘶哑，肺炎^4，5、骨质疏松症等⁶．因此，识别容易无反应的患者变得越来越重要。

糖皮质激素诱导转录本1基因(glcci1.）已经在哮喘中进行了密集地研究^{7，8，9，10.，11.}Tantisira和他的同事在2011年发现功能性rs37973多态性与rs37972处于完全连锁不平衡状态，可能会导致非西班牙裔白人哮喘患者对ICSs治疗的应答降低^12.．随后，van den berge等．进一步调查了效果glcci1.63例COPD患者糖皮质激素反应的变异rs37972。然后扩展了坦提塞拉的发现等．从哮喘到慢性阻塞性肺病glcci1.是否也与ICS治疗后COPD肺功能的改变有关^13.．然而，由于参与者数量少且缺乏功能验证，对其作用的精确glcci1.慢性阻塞性肺病的发病率远不能确定。

中性粒细胞性炎症是慢性阻塞性肺病呼吸道和循环系统的一个显著特征。这种持续和异常的炎症与疾病进展高度相关，而细胞凋亡是非炎性清除中性粒细胞的关键解决方案^14.．然而，糖皮质激素延缓了中性粒细胞的凋亡在体外细胞培养。这可能在一定程度上解释了吸入性糖皮质激素对COPD的疗效不如哮喘^15.．位于glcci1.结果表明，rs37973的突变等位基因“G”在启动子区下调了rs37973的表达glcci1在体外功能分析^12.．glcci1.诱导是糖皮质激素治疗的胸腺瘤细胞凋亡的早期制造者^16.．因此，我们假设，从rs37973基因型不同的COPD患者中分离出来的中性粒细胞可能对糖皮质激素刺激也有不同的反应在体外．

与哮喘不同的是，尽管处方广泛，但很少有COPD药物遗传学研究关注遗传变异在ICS治疗反应中的作用^17.，18.．根据他们的发现，我们旨在进一步调查功能性RS37973变体是否与中国COPD患者的长期ICS治疗反应相关。此外，我们的目标是验证RS37973变体的潜在预测值在体外地塞米松介导的中性粒细胞凋亡的细胞研究。

参与者

招募了209例临床稳定的COPD患者，其中，204名符合条件的患者最终包括在我们的研究中（4次失去后续行动和1次迁移）。基线的人口特征和肺功能在由RS37973基因型分层分层的组之间均匀（表格1)．平均年龄为67.0岁。共有79.4％的患者是男性，53.4％是目前吸烟者，吸烟历史20多人。平均支气管扩张剂强制呼气量一秒钟（FEV₁）是1.22升，为预测值的46.31％。根据慢性阻塞性肺病（金）标准的全球倡议，我们所有的患者都在C或D类别中^3.这意味着慢性阻塞性肺病加重的高风险。

基因型和等位基因频率

关于RS37973基因型，59名（28.9％）个体纯合的主要'A'等位基因，50例（24.5％）个体纯合的突变体的“G”等位基因，95（46.6％）是Ag杂合子。次要的等位基因G'频率为0.478，所有基因型频率都在Hardy-Weinberg均衡（p= 0.340)。

RS37973基因型与肺功能之间的关联变化

ICS治疗24周后，GG纯合子基因型患者(增加15.3±33.2 mL) FEV改善明显较差₁(92.7±29.6 mL;p < 0.001) or AG (59.4 ± 26.9 mL;p< 0.001)基因型(图。1A)．至于FEV₁百分比预测，与AA纯合子（3.67±1.38％）相比，GG纯合子的GG纯合子也增加（0.68±1.36％）（3.67±1.38％;p < 0.001) or AG heterozygotes (2.40 ± 1.35%;p< 0.001)，而总体平均改善为2.33±1.73% (图。1B)．此外，对rs37973的每个突变等位基因G的影响进行了回归分析(图2)，表明“G”等位基因每增加一个副本，ICS功效就会降低(R²= 0.476 f = 179.23P < 0.001).

吸烟状况对ICS疗效的影响

与以前的研究一致^19.，20.，我们发现吸烟状态是FEV变化的重要预测因子₁（图3.)．与非吸烟患者相比，吸烟者的改善显着差（46.8±39.0 mL与71.0±38.3ml;p< 0.001)，在校正了年龄、性别和预测FEV的基线百分比后₁．至于FEV的变化₁在吸烟和非吸烟患者中观察到预测，类似结果的百分比（未被调节的协变量，1.86±1.61％，而不是2.89±1.72％;p < 0.001).

RS37973基因型对地塞米松介导的中性粒细胞凋亡的影响

共计43例自愿患者额外提供静脉血8ml进行中性粒细胞培养在体外，其中rs37973的AA、AG和GG基因型分别为11、14和18个。地塞米松显著抑制中性粒细胞自发凋亡，与基因型无关，且呈浓度依赖性(0,10⁻⁶米和10⁻⁴ M) manner under standard culture conditions for 18 h (图4A)．有趣的是，我们发现从GG基因型患者分离的中性粒细胞没有显示出10次凋亡的相应减少⁻⁶ M, compared with solvent control (the percentage of apoptotic cells: 72.03 ± 2.06% versus 72.27 ± 1.33%;p = 0.903).

以前的研究报道说，地塞米松导致浓度依赖性抑制中性粒细胞凋亡，通常在10时显而易见⁻⁸M，最大值为10⁻⁶M为临床相关药物浓度^{21.，22.，23.}．在我们的研究中，rs37973的AA和AG基因型也证实了类似的抗凋亡作用。然而，自从地塞米松在10⁻⁶ M had little effect on GG genotype, we extended our experimental concentration to 10⁻⁴ M, higher than clinically relevant drug concentrations. Only then did we observed an expected suppression of neutrophil apoptosis by dexamethasone in GG genotype (67.03 ± 1.74% versus 72.27 ± 1.33%;p= 0.004)。此外，我们观察到，与GG基因型患者相比，AA基因型患者分离的中性粒细胞凋亡百分率显著降低⁻⁶ M (59.68 ± 5.80% versus 72.03 ± 2.06%;p = 0.025) and 10⁻⁴M(53.64±5.88% vs 67.03±1.74%;p= 0.013)地塞米松，表明地塞米松对GG基因型的抑制作用较小(图4B.)．

地塞米松减弱cse诱导的中性粒细胞凋亡

香烟烟雾提取物(CSE)作为独立的中性粒细胞系统的基础炎症环境，与所有基因型的假处理细胞相比，能显著促进中性粒细胞凋亡。对于AA和AG基因型，地塞米松以浓度依赖的方式降低CSE的促凋亡作用(10⁻⁶米和10⁻⁴ M), compared with merely CSE-treated cells (图5 a, b, d)．但是，我们并没有观察到地塞米松对GG基因型以10的浓度相同的效果⁻⁶ M (图5C.)，与无CSE环境培养相似。cse诱导的中性粒细胞凋亡只有在较高浓度时才能轻微减弱(10⁻⁴(73.63±3.58% vs 81.94±2.45%;p= 0.032)。

在我们的研究中，我们证实了这点glcci1.rs37973是COPD患者ICSs治疗反应降低的重要决定因素。纯合子突变型“G”基因型患者在ICS治疗24周后肺功能改善明显较差。此外，我们验证了rs37973变异对皮质类固醇反应的潜在预测价值体外结果表明，地塞米松对GG基因型患者分离的中性粒细胞具有较低的抗凋亡作用。

跟进坦提塞拉的发现等．在哮喘^12.， Van den Berge和他的同事首先研究了glcci1.63例荷兰COPD患者IC治疗反应中的RS37972多态性。在3至30个月的烟道式治疗氟酮或不含唾液表的情况下，主要的等位基因纯合子在FEV中具有更大的改善₁与纯合子突变型相比，表明glcci1.也与慢性阻塞性肺病的ICS反应相关^13.．在范登·贝尔热的基础上等402名非西班牙裔白人COPD患者从两项gsk赞助的临床研究中提取，接受糠酸氟替卡松单药治疗12周。然而，结果恰恰相反，表明glcci1.rs37973多态性与rs37972高度相关，但对FEV无影响₁回复^24.．考虑到van den Berge的小样本大小等。的研究，初始关联可能是一个假阳性。但是，另一方面，不推荐由指南建议的IC单疗法^3.，因为它比与长效的组合效果较小β₂- 一个角度。GSK研究中的受试者具有较低的基线FEV1％，预测并仅接受了仅12周的IC单药治疗，这可能导致相对假阴性。此外，有争议的结论也可能部分来自不同的民族。更好地阐明可能的作用glcci1.在COPD中，我们的研究然后选择了204例中临床稳定COPD患者的良好表现，所有患者接受了吸入的氟酮丙酸盐24周的丙酸盐治疗。结合体外我们的研究结果进一步证实了功能性rs37973多态性有可能成为中国COPD患者ICS治疗应答的一种新的遗传预测因子。

与之前对哮喘的研究一致，功能性rs37973变异glcci1.在935名非西班牙裔白人成人和儿童中首次发现了导致ICS治疗反应显著下降的Tantisira等．^12.，随后在402名欧洲哮喘儿童中得到证实⁹224名日本成年患者⁷．然而，rs37973的作用最近受到了一个大型设计良好的复制研究的挑战，该研究在7个gsk赞助的临床试验中，包括1924名非西班牙裔白人哮喘患者，表明rs37973没有显著影响FEV的变化₁在ICSS治疗的8或12周后⁸．这种差异证据的可能解释可能是不同的终点，不同的治疗持续时间和种族变异。COPD和哮喘都是慢性气道炎症，其特征在于气流限制，并且可能与荷兰假说共享共同的遗传背景^25.．尽管存在相似之处，COPD患者通常对皮质类固醇的患者通常不如哮喘学，这可能部分导致COPD（中性粒细胞，巨噬细胞，CD8 +淋巴细胞）的关键炎症细胞的明显差异^26.哮喘(嗜酸性粒细胞，CD4 +淋巴细胞)^27.．既往研究表明，在临床相关药物浓度(通常在10 ~ 10之间)下，糖皮质激素抑制中性粒细胞凋亡同时促进嗜酸性粒细胞凋亡^-10米和10⁻⁶米在体外细胞培养^{23.，28.，29.}．尽管药物遗传学可能在各种疾病中显示出类别效应，考虑到COPD和哮喘之间的差异，rs37973变异对皮质类固醇反应的影响应谨慎解释，在COPD和哮喘都需要进一步的前瞻性验证。

据我们所知，只有另一种基因变体，促肾上腺皮质激素释放激素受体1中的rs242941 (CRHR1)已被报道为COPD患者皮质类固醇反应的可能决定因素^18.．然而，金的研究等．小小只有12周的后续观察，共有87名患者，由于缺乏进一步的验证，作用CRHR1在慢性阻塞性肺病中仍然无法定义。尽管ICSs被广泛使用，甚至被过度使用^30.，只有很少的研究证明了与COPD中的皮质类固醇反应性有关的标志物。其中大多数仅限于短期反应或不确定的临床特征，如支气管扩张剂响应性^31.频繁加剧^32.、痰嗜酸性等^33.．没有建立长期响应的预测因素。因此，我们的研究突出了有希望的药物原药方法的新方法，以预测COPD中长期ICS治疗疗效。

吸烟不仅是COPD最重要的原因，还与加速肺功能下降和皮质类固醇反应性有关^2，34.．我们的研究通过表明吸烟者在FEV的改进显着差，确认了先前研究的₁经过24周的ICS治疗。因此，戒烟是慢性阻塞性肺病必不可少的治疗策略。

在体外功能验证，与之前的研究一致^{21.，22.，23.}，我们观察到地塞米松在标准培养条件下以浓度依赖性方式抑制自发性嗜嗜中性嗜液体凋亡。有趣的是，在10点存在⁻⁶ M dexamethasone, which was thought to be the maximal inhibitory concentration^22.rs37973 GG基因型患者分离的中性粒细胞在CSE环境下或不存在相应的凋亡减少。只有当我们把实验专注度提高到10时⁻⁴M，我们是否观察到预期的抑制努力。与我们的临床相关研究结果一致，这些结果进一步证实了突变等位基因“G”对皮质类固醇反应的负面影响，与吸烟状态无关。

由于细胞凋亡有助于消除粒细胞而不释放组毒毒剂并限制组织损伤，在某种程度上，细胞凋亡的不适当延迟可能是有害的对中性粒细胞炎症。因此，抑制中性粒细胞凋亡的抑制不会导致伴随更好的临床反应，我们的实验只能验证GG基因型的中性粒细胞对糖皮质激素的反应较少在体外，中性粒细胞凋亡不能作为ICS治疗后肺功能变化的指标。然而,Marwick等．据报道，在严重的缺氧条件下，糖皮质激素失去了促进中性粒细胞存活的能力，甚至可以降低GM-CSF等炎症介质的促进效果，这表明糖皮质激素可能无法解释在发炎组织的位点上的增强中性粒细胞生存率^21.．糖皮质激素作为一种有效的非特异性抗炎药物，在COPD中更可能通过抑制淋巴细胞炎症来发挥其抗炎作用^35.，增加上皮屏障功能，降低氧化应激等^36.．慢性阻塞性肺病的免疫发病机制非常复杂，各种炎症细胞、细胞因子及其在不同周围环境中的相互作用^37.，从而进一步研究模仿已研究糖皮质激素在COPD中的确切抗炎机制显然需要炎症环境。

然而，我们的研究也有一定的局限性。我们在汉族人群中招募了一组选择性的同质COPD患者。由于遗传分布在不同的种族，我们的结果可能不适用于其他种族。此外，我们只研究了一个潜在的遗传预测因子，它远不能准确地预测ICSs在COPD中的疗效。作为McGeachie等．报告称，即使是两种基因变异的组合，glcci1.和CRHR1，可以实现更好的准确性，以预测哮喘学的ICS治疗响应^10.．虽然我们对COPD中糖皮质激素反应的预测因子知之甚少，但我们的研究为COPD的个体化治疗提供了新的思路，表明药物遗传学可能成为预测长期吸入性糖皮质激素疗效的一种有前途的新方法。

另一个限制是ICS和长效联合治疗β₂在我们的研究中使用了agagists（氟替卡松丙酸盐/萨米特洛尔），IC治疗反应可能受到影响β₂在某种程度上取笑。长效的确切效果β₂IC的角度是不确定的，但他们被认为具有协同互动^38.．实际上，COPD患者从组合治疗比IC单一疗法更好地受益，并且在练习中被广泛使用，如准则的建议^3.．但随后，我们进一步验证了rs37973变异对皮质类固醇反应的影响在体外细胞研究。尽管有这些局限性，我们相信我们的主要发现是可靠的，因为临床试验和细胞实验一直表明突变等位基因的存在可能会对皮质类固醇反应性产生负面影响，而不管吸烟状态如何。

总之，我们的研究表明，RS37973的GG基因型与汉族人群临床稳定COPD患者的ICSS疗效降低有关。

参与者

从2012年4月到2013年12月，来自中国武汉同济医院的临床稳定COPD共有209家门诊病人。根据金标准，所有患者均为C类别C或D.^3.，定义为支气管扩张器后的FEV₁/强制生命能力比小于70％，FEV₁在筛选前，在前一年中少于预测值的50％和/或至少一个记录的COPD恶化。此外，符合条件的患者至少40岁。主要排除标准是哮喘或呼吸道感染，在4周内收到系统性或吸入的皮质类固醇，以及可能影响血液学疾病，恶性肿瘤，全身狼疮红斑等中性粒细胞计数解释的其他疾病的存在。

研究设计

在注册时，根据美国胸部社会/欧洲呼吸协会的标准，向参与者进行肺功能测试188bet官网地址^39.．一份详细的问卷收集有关症状、COPD加重史、吸烟状况和基本人口统计信息。符合条件的患者接受吸入式丙酸氟替卡松/沙美特罗联合治疗(500/50 ug，每日2次)，持续治疗24周。一名训练有素的护士指导每个病人使用吸入器技术，并从他们身上取2ml静脉血进行基因分型。在本研究中，我们主要评估不同基因型患者的ICS治疗反应，定义为FEV的变化₁（即FEV._1治疗- FEV._1baseline.)。所有的临床数据都是由同一位医生收集的，他对患者的基因型一无所知。另外，另外采集8毫升血液进行中性粒细胞培养在体外来自部分自愿患者，并不是纳入我们研究的先决条件。

从所有参与者获得单独的书面知情同意书。本研究经同济医学院同济医院伦理委员会批准，华中科技大学同济医学院（IRB ID：20120441），并根据赫尔辛基宣言的原则进行。样品收集和所有实验方法按照相关指南和法规进行。

DNA提取和基因分型

所有参与者都是针对RS37973多态性的基因分型。根据制造商的协议（血液基因组DNA净化试剂盒;天根生物技术，北京，中国）从2mL外周EDTA-抗凝血液中提取基因组DNA。聚合酶链反应扩增的总体积为12.5μl，含有6.25μlAkman通用PCR主混合物（Applied Biosystems Inc.，Foster City，Ca，USA），50 ng提取的DNA和300nm的特异性探针和引物（测定ID：RS37973，AHUACTL;应用生物系统）。反应条件如下：95℃，10分钟，在95℃下为15℃，60℃下降1分钟。然后通过使用ABI 7900 HT Taqman序列检测系统（应用生物系统）的等位基因辨别程序确定基因型。和10％的样品在技术复制品中随机基因分型。

中性粒细胞的分离和培养

亚甲甲淀粉沉淀，Ficoll-hypaque密度梯度离心（TBD，天津，中国）和污染红细胞的低渗裂解（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，美国，美国）的嗜中性粒细胞。将分离的细胞洗涤两次并重新悬浮在RPMI 1640培养基（Life Technologies / Gibco，CA，USA，USA），含有10％胎牛血清，1×10⁵ cells/ml. Neutrophil viability consistently exceeded 90%, as determined by trypan blue exclusion test. The cell suspension was then transferred equally to 6-well non-adherent culture plates (Corning, NY, USA), and divided into two groups: with or without 10 μg/ml cigarette smoke extract (Murty Pharmaceuticals, Inc., Lexington, KY, USA). Cells of both groups were stimulated with different concentrations of dexamethasone (Sigma) 0, 10⁻⁶米和10⁻⁴ M in a solvent of dimethyl sulphoxide and were incubated in a humidified incubator (95% air, 5% CO₂(37℃)，放置18小时。所有实验重复3次。

流式细胞术检测细胞凋亡

孵育后，根据制造商的议定书，通过附睾V-FITC凋亡检测试剂盒（Keygen，南京）定量测定中性粒细胞凋亡百分比。简而言之，收获细胞，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，然后重悬于400μL膜蛋白V结合缓冲液中。在黑暗的室温下用4μl插膜蛋白V-fitc（AnnV）孵育10分钟后，加入4μl碘化丙锭（PI）并再孵育5分钟。所有实验程序都在冰上严格运行。然后立即在Becton Dickinson LSR流式细胞仪上运行样品，通过CellQuest软件分析数据。正常的活细胞定义为ANN V.^-/ pi.^-，早期的凋亡细胞ANN V.⁺/ pi.^-晚期凋亡或坏死细胞为Ann V⁺/ pi.⁺由于膜损伤。

统计分析

基线特征的分类变量采用皮尔逊卡方检验和连续变量采用单因素方差分析、Bonferroni事后检验进行比较。对Hardy-Weinberg平衡进行分析，采用卡方检验比较观察到的基因型频率与期望基因型频率。在ICS治疗24周后，rs37973变异对肺功能改变的影响采用一般线性模型评估，不作调整，因为均质基线分层的基因型。采用线性回归估计rs37973每个次要等位基因G(编码为0、1或2)对FEV变化的影响₁．

除rs37973基因型外，我们还对影响ICS治疗反应的因素进行了逐步多元线性回归分析，因为之前的研究显示年龄、性别、预测FEV的基线百分比₁吸烟状态影响FEV的变化₁^19.，20.．吸烟状态是FEV变化的重要预测因子₁在我们的研究中，我们用协方差的阶乘分析重复了我们的分析。固定效应是吸烟状况和rs37973基因型，有三个协变量:年龄、性别和预测FEV的基线百分比_1。

地塞米松介导的中性粒细胞凋亡通过双尾配对t检验或独立样本t检验进行分析，比较rs37973基因型内部或之间的差异。在Windows (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)上使用IBM SPSS Statistics 22.0进行统计分析p值小于0.05被认为是统计学意义的。

数据可用性

本研究已在中国临床试验注册中心(http://www.chictr.org.cn/)注册;注册号,chictr -罗伯- 15005824。注册日期:2015-01-05。

如何引用这篇文章: Lei, Y。等．glcci1.RS37973：中国慢性阻塞性肺病患者吸入皮质类固醇的潜在遗传预测因子。科学。代表。7, 42552;doi: 10.1038 / srep42552(2017)。

出版商的注意:《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

基金资助:国家自然科学基金项目(81570033,81570047,81470227,81370145,81370156)，国家重点基础研究发展计划(973计划，20l5CB553403)，中华医学会科研计划项目(2013BAI09B00)，国家科技支撑计划(2016YFC1303900、2016YFC1304700);教育部长江学者和创新团队资助项目(2016YFC1304700);IRT_14R20)。

隶属关系

1. 华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，解放大道1095号，武汉430030
   • 元Lei
   • ，ying高
   • ，苗李
   • ，小美吴
   • ，建平赵
   • ，盐熊
   • 许,Yongjian
   • & Jungang谢
2. Acadia初中，温尼伯，Manitoba，R3T 3B3，加拿大
   • 摘要陈
3. 华中科技大学同济医学院同济医学院通知医院传染病研究所传染病，1095，武汉武汉，430030
   • 秦宁

贡献

J.X.是稿件的担保人。J.X.，Y.X.和W.X.，设计和进行了临床研究。Y.L.和Y.G.完全访问所有数据，并负责数据的完整性以及数据分析的准确性。J.X.，Y.X.，Y.L.和Y.G.贡献撰写稿件。Y.L.，Y.G.，J.C.，M.L.，X.W.，Q.N. J.Z. and W.X. performed sample collection and cell experiments. All authors reviewed and approved the manuscript.

通讯作者

对应于金堂谢．

相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

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