发展的主要人工培养模型气道粘膜发炎

中性粒细胞违反粘膜表面的感染是一种常见的病理结果。我们提出一个先进的培养模式探讨中性粒细胞transepithelial迁移利用气道粘膜屏障分化主要人类呼吸道基底细胞和先进的成像检查。人类呼吸道基底细胞分化,在气液界面培养(ALI)背面3µm孔隙大小transwells,兼容永恒轮回中性粒细胞的研究。倒爱丽丝展览击败纤毛和粘液生产,符合传统的爱丽丝,可视化的光学相干断层扫描(µOCT)。µOCT是最近开发的实时成像的能力把两和三维分析的细胞事件标志着细节,包括中性粒细胞transmigratory动力学。此外,新设计和成像主要培养模型概括关键分子机制基础bacteria-induced中性粒细胞transepithelial迁移之前使用细胞涂布生产线模型的特点。中性粒细胞应对实施趋药性的渐变和迁移在回应铜绿假单胞菌感染主要通过hepoxilin阿里壁垒A3-directed机制。初级细胞培养系统结合µOCT成像探针提供了重要机会,详细,micro-anatomical和机械特性的bacteria-induced中性粒细胞transepithelial移民和其他重要的免疫和粘膜表面的生理过程。

病原体访问气道粘膜引起炎症,导致支气管炎或肺炎^1,2。多形核中性粒细胞是第一反应者;血液中的中性粒细胞渗出液后精心策划部署和粘附细胞因子相互作用^3,4,5,6穿过内皮⁴。然后遍历间质周的指导下,成纤维细胞⁴和胶原蛋白分解产物⁷,穿过上皮达到感染的网站。在某些疾病,中性招聘是不适应的。例如,囊性纤维化疾病定义为囊性纤维化跨膜电导调节突变(雌性生殖道)基因,特点是慢性呼吸道感染和炎症。炎症导致过多的中性粒细胞涌入,从而延续病理学^8,9,10,最终导致呼吸衰竭。全面评估neutrophil-epithelial信号需要更好的理解疾病。

共培养模型开发研究中性粒细胞迁移在气道上皮屏障¹¹。当前对中性粒细胞transepithelial迁移信号通路的理解几乎完全基于永生的人类肺上皮细胞系。这些细胞分化,形成功能障碍,然而,他们没有许多生理功能相关的特征,如粘液或打纤毛。进一步,这些转化细胞可能显示出异常的信号通路相比主要气道上皮细胞。我们理解中性粒细胞transepithelial迁移将受益通过整合和评估生理相关主要气道上皮细胞显示多个上皮细胞亚型共培养模型的组件系统¹²。

气液界面(ALI)培养促进代pseudostratified从气道黏膜纤毛的气道上皮基底细胞培养在多孔transwell过滤器^13,14。虽然这个平台已经广泛应用于各种各样的研究,一直受到缺乏现成的,大量的人工气道基底细胞。从历史上看,主气道基底细胞无法接受长期的扩张和分化潜能下降通道¹⁵。最近,我们开发了一个定义良好的文化系统,允许长期扩张气道基底细胞使用双重SMAD信号抑制,限制TGF-β转录因子信号通路¹⁶。重要的是,扩张气道基底细胞保持分化潜能,展示功能气道生理和对临床相关的药物能做出适当的回应¹⁶。这个新系统产生无限的生理相关人类支气管上皮细胞在体外评估。在这项研究中,扩展人类呼吸道基底细胞分化倒3µm孔隙大小transwells同时保持他们组织成食用和纤毛细胞的能力。这种发展使炎症研究使用主气道上皮细胞转运。这个生理相关平台支持有效的中性粒细胞迁移transepithelial apically-directed外源性化学引诱物和上皮细胞感染的反应铜绿假单胞菌。进一步,一种高分辨率的光学相干断层扫描(称为micro-OCTμOCT)捕获之前从未见过和详细通过气道上皮细胞动力学控制中性粒细胞transmigratory行为¹⁷。这个模型系统的小说特征包括使用扩展人类基底细胞来源的上皮研究中性粒细胞轮回,生成一个主要培养模型,并没有先前被描述,结合先进的细胞成像,提供生理相关平台探索micro-anatomical过程在粘膜表面。结合,这种先进的系统在传统的人工标志着一个重大的进步在体外模型。

人类呼吸道基底细胞培养在倒置的气液界面能够保持极性和功能性airway-specific micro-anatomy

传统ALI模型,与人类呼吸道基底细胞种子内的0.4µm孔隙大小transwell过滤器,是不兼容的研究炎症transepithelial迁移。为了适当整合阿里与定向培养相关的嗜中性粒细胞transepithelial迁移,我们修改了传统的阿里通过播种人类呼吸道基底细胞transwell的背面。此外,3µm孔隙大小的过滤器被代替0.4µm使中性粒细胞通过(无花果。1 a和B)。减小到最低程度,基底细胞通过3µm毛孔在播种和分化,transwell膜的两面涂上了细胞外基质。底部,人工气道基底细胞,是涂有804 G条件培养基含有laminin-enriched矩阵来提高人类呼吸道基底细胞附着和分化效率最大化¹⁶。对边涂上804 G条件培养基+ 5%人工基底膜,以减少无方向性的人类通过毛孔,防止气道基底细胞迁移分化transwell的意想不到的副作用。这些修改是建立分化良好型的实现,极化阿里气道上皮细胞层与中性粒细胞迁移transepithelial共培养实验系统兼容。

传统ALI模型(直立,0.4µm孔隙)和反向ALI模型(倒置,3µm孔隙)支持人类呼吸道基底细胞的分化与mucocilary生理粘膜屏障功能顶端表面阿里开始后的两周内培养条件(图。1)。Immunofluorescent染色显示气道上皮组件,包括纤毛细胞(乙酰化微管蛋白⁺分泌细胞(CCSP)和俱乐部⁺在两模型(图)。1 c和D)。横断面图像也显示黏膜纤毛的分化与mucin-secreting杯状细胞(MUC5AC⁺)由上皮细胞(CK8毗邻⁺)(图。1 e和F),(AcTub纤毛细胞⁺)与基底干细胞(CK5⁺)(图。1 g和H)。

一个显著区别常规和反向阿里是上皮细胞生长在倒3µm孔隙过滤器更薄(图。1的情况),显然通过横断面)染色(图可视化。1我vs。J)。这种差异并不是由于倒增长,基底细胞种植在倒0.4µm孔隙过滤器是区别那些生长在传统时尚(补充图。1)。相反,当使用较大的孔隙大小,一些基底细胞通过3µm毛孔滤波器的相反面,尽管人工基底膜的应用限制这一段。零星的细胞交叉的现象,证明了DAPI(蓝色,核DNA荧光染色绑定)染色,似乎减少基底细胞层的高度导致薄极化气道播种面对transwell(补充图。2)。然而,基底细胞成功地迁移到相反的表面transwell没有分化成纤毛或杯状细胞,他们也没有妥协的极性发展增长气道上皮的播种脸(图。1补充图。2)。

µOCT成像用于可视化常规(0.4µm)和反向(3µm)爱丽丝。这种技术允许label-free(没有固定、染色、或荧光标记)观察细胞在高分辨率细节。上皮细胞层显然是可视化传统和反向阿里文化(无花果。1 k - n)。比较,面向图像与上皮细胞层的平面上方transwell过滤器。Immunofluorescent染色显示纤毛细胞标记物的表达在阿里文化(无花果。1 c, D、G H)。视频µOCT成像证实功能击败纤毛倒阿里(补充视频1)。测量的标准差µOCT像素强度在每个各自的图像位置随着时间的显示在绿色和进一步量化纤毛运动在两个传统(图。1 k(图)和反向阿里文化。1 l)。尽管上皮生长在反向模型减少了数量的纤毛被immunofluorescent(无花果。1 h)和圆)染色(图1 j),纤毛比较功能,在传统ALI模型,是由µOCT纤毛运动的分析。

阿里的文化传统和倒杯状细胞标记MUC5AC表达(图模型。1 e, F)和展览的能力产生粘液,可以观察到上面一层hypo-dense越不透明的上皮细胞层(无花果。1 m和N)。粘液积极生产,和温和的洗涤与哈佛商学院的顶端表面结果的快速扩张黏液层(补充图。3)。传统爱丽丝不断释放在顶端表面粘液,池是一个紧凑的上面层上皮(无花果。1米)。这种黏液层可以被附加的洗涤与哈佛商学院的上皮细胞层⁺。反向模型不能够池顶端表面粘液可能由于引力作用于黏液层。捕获的图像粘液从顶端的一面倒阿里文化,上皮细胞被洗和基底外侧表面处理100µM乙酰胆碱µOCT成像的前一个小时。黏液层顶端表面似乎密度较低和拉伸,最有可能由于粘液生产的动态平衡,含水量和引力倒transwell模型(无花果。1 n)。图的规模。1 m和N不匹配,以优化为每个阿里黏液层模型的可视化方向。

粘液生产和功能性纤毛功能一般不极化气道上皮细胞系中观察到文化,是否种植传统或倒置。某些极化肺上皮细胞系培养transepithelial电阻(te),作为主要做阿里的文化¹⁸,尽管te可以显示一些变化¹⁹。倒阿里文化进行评估的能力开发可衡量的三通。倒阿里文化能够发展中te(中位数546欧姆*厘米²,范围190 - 1309欧姆*厘米²天,n = 29) transwells评估14-29阿里的分化。虽然反向模型显示略大范围和较低的中值与传统相比,直立0.4µm孔隙大小transwells(平均1508欧姆*厘米²,范围604 - 1888欧姆*厘米²,n = 5),三通的发展反向阿里文化表明功能性极性和屏障完整实现类似阿里在传统培养模式。

总的来说,这些数据表明人类呼吸道基底细胞种子倒3µm transwells和在气液界面培养发展关键,之前为特征的气道的micro-anatomical方面传统的人工气道基底细胞衍生阿里培养模型。方面包括适当的极性,纤毛,粘液分泌,三通的发展。尽管倒阿里文化系统似乎成为一个薄层上皮与传统阿里相比,它独特的具有附加功能必须建立共培养模型研究中性粒细胞transepithelial迁移(生长在倒置的取向与3µm毛孔transwell过滤器)。

中性粒细胞迁移通过人体呼吸道基底细胞衍生阿里壁垒在回应一个实施化学引诱物梯度

评估是否中性粒细胞在气道上皮细胞能够迁移壁垒来源于人类呼吸道基底细胞使用反向阿里文化系统,中性粒细胞被安置在基底外侧倒阿里transwell的隔间。中性粒细胞化学引诱物fMLP(100海里)被放置在顶端室建立定向浓度梯度(无花果。2)。中性粒细胞transepithelial迁移被溶解迁移的定量评估两个小时孵化后中性粒细胞在顶端舱和测量髓过氧化酶(MPO)活动两小时后孵化。fMLP梯度产生强劲的中性粒细胞迁移倒阿里的文化。中性粒细胞transepithelial迁移研究是传统上由使用肺上皮细胞株产生反向极化层服务模型气道粘膜¹¹。因此,我们比较中性粒细胞迁移整个H292肺上皮细胞line-derived单层与迁移在人工气道基底细胞衍生阿里文化,发现没有差别的大小之间的中性粒细胞迁移这两个截然不同的气道上皮细胞层(无花果。2 b)。

成像的中性粒细胞迁移倒阿里文化通过µOCT显示强劲的迁移与定量MPO分析一致。此外,直接视觉µOCT分析了小说整个气道中性粒细胞transmigratory行为的定性分析的依据。中性粒细胞侵入上皮作为骨料以协调的方式在两个小时的潜伏期的存在fMLP梯度(图。2摄氏度)。中性粒细胞迁移在倒阿里文化是视觉捕捉发展随着时间的推移,在二维(无花果。二维),这些图片被堆叠,允许三维可视化(图。2 e)。在二维µOCT成像,中性粒细胞是第一个集群在基底外侧膜之后,进步总运动通过上皮细胞层。破坏上皮细胞后,中性粒细胞集群连接到顶端表面上皮开始摆脱个人的中性粒细胞(补充视频2)。在三维µOCT成像,大量的中性粒细胞集群观察违反顶端上皮表面的上皮屏障的新兴和脱落在两小时的潜伏期(补充视频中性粒细胞3)。

中性粒细胞迁移通过人体呼吸道基底细胞衍生阿里壁垒后顶端感染铜绿假单胞菌

测试是否倒阿里文化的感染会引起中性粒细胞transepithelial顶端表面迁移,我们感染上皮一小时铜绿假单胞菌(PAO1),后跟一个基底洗涤步骤之前,应用中性粒细胞(无花果。3)。GFP-expressing PAO1可以观察到与阿里文化,展示细菌和上皮细胞之间的相互作用(无花果。3 b)。定量评估的大小PAO1-induced中性粒细胞迁移是由MPO顶端的活动。感染PAO1导致显著增加中性粒细胞迁移的数量相比,同等数量的非致病性感染大肠杆菌(MC1000)或模拟感染(缓冲)控制(图。3 c)。中性粒细胞迁移整个人类呼吸道基底细胞衍生阿里文化随着时间的推移被µOCT再次可视化(无花果。3 d)。在二维可视化时,中性粒细胞被聚类在基底外侧表面,然后破坏上皮细胞,产生紧密相关的中性粒细胞聚集在中性粒细胞的顶端表面上皮单独分离(补充视频4)。进一步的,我们可以观察中性粒细胞迁移动力学定性差异比较迁移fMLP梯度和迁移的时候出现铜绿假单胞菌感染。基底外侧表面上,中性粒细胞经历相似的凝结前上皮违反infection-mediated和fMLP-mediated趋化作用。中性粒细胞迁移对fMLP穿过上皮和顶端表面形成小簇的出现然后从集群更容易分离,而中性粒细胞迁移在回应PAO1-induced上皮信号似乎形成更大,更有凝聚力顶端表面质量(补充视频2:fMLP-induced迁移,补充视频4:PAO1-induced迁移)。

干扰hepoxilin A3 (HxA3)降低铜绿假单胞菌全身的嗜中性粒细胞迁移在人工气道基底细胞衍生阿里壁垒

HxA3起着关键作用的侵染诱导transepithelial迁移基于生成的数据从传统的上皮细胞line-derived和共培养模型在活的有机体内实验^20.,21,22,23。上皮细胞产生脂质嗜中性粒细胞趋化剂,HxA3,感染和这个信号负责驾驶中性粒细胞在顶端表面上皮的基底外侧²¹。12-Lipoxygenase (12-LO)将花生四烯酸转化为HxA3和抑制这种酶显著影响侵染诱导中性粒细胞招募^20.。值得注意的是,中性粒细胞化学引诱物,如fMLP,不依赖侵染诱导上皮细胞释放HxA3刺激迁移直接用于细胞的顶面时创建一个趋药性的梯度^20.,21。确定干扰的能力倒阿里文化合成HxA3受到影响P。绿脓杆菌全身的嗜中性粒细胞transepithelial迁移,我们预处理的阿里文化源于人类与疾病预防控制中心气道基底细胞,12-LO的抑制剂。预处理的上皮细胞与车辆控制的能力没有影响PAO1诱导健壮的嗜中性粒细胞transepithelial迁移(图。4补充视频5)。疾控中心预处理的上皮细胞,导致显著的减少中性粒细胞transepithelial迁移相对于车辆控制,所观察到的µOCT(无花果。4 b补充视频6)。设置的CDC预处理和车辆控制感染上皮的预处理,观察中性粒细胞活化基底外侧表面的上皮细胞形成堆积的细胞团(补充视频5和6)。然而,在上皮与12-LO抑制剂(CDC)预处理,很少中性粒细胞进行穿透感染上皮细胞层和细胞的顶面(补充视频6)。使用计算机算法揭示了最小量化µOCT成像transepithelial中性粒细胞迁移与CDC阿里文化预处理的设置,而超过6000中性粒细胞/毫米²(当阿里文化与车辆控制(图预处理的。4摄氏度)。在一个单独的定量分析,MPO活性,CDC预处理明显降低中性粒细胞迁移与车辆控制(p < 0.05)。上皮疾控中心治疗并不影响中性粒细胞transepithelial迁移在回应一个强加的梯度fMLP(无花果。4 d),如fMLP梯度调节趋化作用不依赖于上皮12-LO-mediated HxA3释放中性粒细胞轮回。因此,PAO1-induced中性粒细胞迁移在人工气道basal-derived阿里文化特别是涉及12-LO活动。

然后我们测试HxA3拮抗功能是否会影响中性粒细胞transepithelial移民在人类呼吸道基底细胞衍生倒阿里文化系统。中性粒细胞迁移在PAO1-infected人工气道基底细胞衍生文化评估的存在与否HxA3拮抗剂应用于细胞的顶面。HxA3拮抗剂的使用是一种结构模拟的HxA3之前证明中性粒细胞迁移的干扰PAO1-induced H292气道上皮细胞²²。µOCT图像定量分析显示PAO1-infected人工气道基底细胞文化功能不多中性粒细胞迁移transepithelial HxA3拮抗剂存在时,这明显与观察到的健壮PAO1-induced transepithelial迁移没有拮抗剂(图。4 e)。负迁移的出现在控制工件的分析算法,检测小卷的残骸附近的上皮细胞,提高基线阅读,从而导致负微分算明亮的图像碎片后压在时间点和中性粒细胞前开始迁移。定量读出MPO活性在顶端证实显著减少迁移在PAO1-induced迁移HxA3拮抗剂的设置(p < 0.05),而迁移到一个不相关的化学引诱物的实施梯度(fMLP)(图未受到影响。4 f)。

阿里培养是一个行之有效的方法来生成功能从老鼠和人类呼吸道黏膜纤毛的上皮屏障基底细胞^13,14。这样的在体外多细胞分化模型展览多样性和生理功能,类似于气道表面在活的有机体内^{13,24,25,26,27,28}。能够扩大和人类呼吸道基底细胞分化成成熟气道上皮细胞提供了一个强大的在体外平台研究无数人类呼吸道疾病,包括囊性纤维化^[15,16,27。

小说模型探讨中性粒细胞违反气道粘膜了这里只使用主细胞来自捐赠者没有肺部疾病。基底的进步/干细胞培养技术被用来创建可再生的,生理上有关气液界面气道粘膜屏障。这些气道粘膜屏障功能反向极性和培养在transwell过滤器3µm大小的孔隙,使中性粒细胞transepithelial迁移的调查和潜在的分子机制。此外,我们利用最新进展在活细胞成像和分析利用µOCT提供洞察细胞与中性粒细胞transepithelial迁移机制。这种人工气道基底细胞衍生ALI模型,再加上µOCT成像,可用于测试假设生成使用细胞从研究基于行的培养嗜中性粒细胞的系统来扩大我们的理解过程,这是transepithelial迁移的背景下更紧密地接近设定的气道表面。

机械的理解关于关键炎症过程编排中性粒细胞迁移在粘膜上皮屏障,以应对感染或否则,主要是通过调查在活的有机体内或与在体外共培养系统涉及永生的人类细胞系^{5,6,21,29日,30.,31日,32,33}。动物模型的探索是有价值的嗜中性粒细胞招募空域为他们提供一个合适的在活的有机体内上下文。然而,在活的有机体内模型缺乏必要的精度等关键机制专门询问transepithelial迁移在整个招聘流程。此外,在活的有机体内建模是一个非人类的实验系统,介绍了重要的警告当建模人类疾病。在体外共培养系统代表了一个很好的平台,破译中性粒细胞transepithelial迁移在机械化的水平。极化人类上皮细胞系很容易适应反向共培养模型和可以提供高度可再生的细胞和分子机械的见解系统。然而,肺上皮细胞系普遍采用是永生的,缺乏真正的micro-anatomical气道表面的复杂性,特别是促进粘液分泌和ciliogenesis上皮细胞亚型。因此,一种更健壮的方法,用来理解中性粒细胞违反气道粘膜的吸收主要人类上皮细胞共培养模型更好的近似人类的呼吸道表面。

使用主要的上皮细胞中性粒细胞迁移transepithelial共培养模型中尚未广泛采用,部分原因是由于高成本和技术挑战与隔离,扩张,主要气道细胞的分化在体外。最近发达feeder-free普遍文化系统允许前所未有的多种上皮细胞祖细胞扩张,包括人类呼吸道基底细胞。气道扩张后,基底细胞保持其形态,干细胞标记,和分化潜能¹⁶。此外,人类气管基底细胞培养transwells阿里条件下发展成一个成熟的气道粘膜。方法适应传统ALI模型是必要建立反向取向与大孔允许transwell中性粒细胞通过(3µm比0.4µm)。重要的是要注意,这个实验修改并导致更压缩上皮,我们的发展归功于种植3µm孔隙大小transwell过滤器,而不是反方向。这薄上皮可能影响的分子和细胞机制的某些方面在未来探索这个模型的应用系统时,应考虑解释结果和相关过程发生时在活的有机体内在人类疾病的背景下。然而,尽管这个警告,集成的主要阿里气道粘膜模型转换为中性粒细胞transepithelial实验培养系统提供了更多的生理评估这一重要炎症过程目前可用的替代方法。宿主-病原体相互作用也可以更有针对性的分析,应用病原体是遇到生理相关主要气道粘膜与多个气道上皮细胞亚型,而不是一个单一的上皮细胞。

人类肺基底细胞衍生气道上皮细胞培养与中性粒细胞transepithelial迁移研究概括兼容多个人类呼吸道的特征。粘液生产和殴打纤毛贡献一个额外的生理层复杂性可以利用对中性粒细胞贩卖的研究。具体地说,这个人类原发性上皮模型包含适当的细胞结构,由pseudostratified上皮组成的基底干细胞以及独特的和面向水、纤毛,分泌,mucin-secreting杯状细胞。这些功能现在被认为是通过仔细研究设计,以确定他们的潜在影响bacteria-induced中性粒细胞transepithelial迁移。相反,将中性粒细胞迁移也可以通知机制粘液纤毛功能。长期感染、生物膜、或与中性粒细胞的副产品,如中性粒细胞胞外陷阱(网)与ALI模型也可以集成到模型系统。

建立这种先进之外,生理相关培养系统建模中性粒细胞违反粘膜屏障,我们获得的动态,中性粒细胞transmigratory过程的运动角度1µm使用µOCT成像分辨率^17,34。μOCT是一个高分辨率的光学相干断层扫描(OCT)的实现,它使用光学干扰参考光束来确定散射光的深处生成的示例中,创建一个代表性的光学反射率的地图。成像使用µOCT不需要样本标签或操纵细胞和组织内的折射率差异收益率高的自然对比。这种自然的对比让μOCT揭示真人,详细,三维细胞过程体现。该技术已成功用于视觉上气道功能的组织学特征,包括纤毛拍频和黏液层深度^34,35。µOCT对图像采集与多路复用以前访问micro-physiological过程的量化研究接触相关的刺激。在这项研究中,µOCT允许特征产生的粘液生产阿里和纤毛打活动,除了neutrophil-epithelial交互的可视化和迁移后化学引诱物气道内的信号。活跃的粘液的影响一代和殴打纤毛neutrophil-epithelial相声,以及动态迁移中性粒细胞对上皮的完整性的影响,功能,保证进一步的详细研究。此外,未来的研究面向应用μOCT成像在活的有机体内将使中性粒细胞违反粘膜的可视化和描述真正的呼吸道的生理环境,最终揭示细胞机制支撑所述中性粒细胞transepithelial迁移是否代表什么发生在肺感染和发炎。

在体外共培养模型涉及人类呼吸道基底细胞衍生气道上皮细胞层可再生产地、可靠地促进中性粒细胞迁移趋化梯度上皮感染所产生的反应铜绿假单胞菌(PAO1)^20.。表明细胞基于行的transepithelial迁移模型铜绿假单胞菌感染诱导上皮生产HxA3、花生四烯酸代谢物12-LO,吸引中性粒细胞顶舱^20.,21,22。在这项研究中,我们已经证实人类呼吸道基底细胞衍生气道上皮细胞层依赖于类似的机制。PAO1-induced transepithelial迁移被12-LO抑制剂干扰和阻塞管理HxA3结构性拮抗剂,以前曾有报道称使用细胞涂布生产线共培养模型。这些结果支持这一概念,干扰epithelial-produced HxA3可能有助于抑制侵染诱导炎性损害减少中性粒细胞的数量突破气道上皮屏障。

使用µOCT成像可视化中性粒细胞迁移在人类基底细胞衍生爱丽丝提供了重要的描述性信息,没有充分重视使用标准的端点成像和读出化验。具体来说,我们观察到的常见模式嗜中性粒细胞的激活和聚集在基底外侧方面之前阿里对感染上皮或外生fMLP迁移。信号机制在上皮的基底外侧方面可能重要的中性粒细胞涌入到气道,值得进一步的研究。我们还发现,中性粒细胞迁移整个上皮总在独特的模式,这取决于刺激。特别是PAO1-mediated中性粒细胞迁移在人类基底细胞衍生上皮细胞导致大,内聚团,而中性粒细胞迁移对fMLP导致小团与团更容易分离的中性粒细胞。更好地理解的机制导致这些观察到的迁徙模式将允许进一步洞察infection-mediated上皮细胞信号通路,这可能对治疗有重要临床意义的炎症性肺疾病,传染性或否则,包括中性粒细胞招募。因此,反向(3µm)阿里共培养模型加上µOCT成像进一步询问有用信号通路,编排bacteria-induced中性粒细胞transepithelial迁移。

总之,我们已经描述了一个先进的模型研究嗜中性粒细胞的交易机制,增强了现有的反向共培养模型结合人类呼吸道基底细胞,从而显著提高我们的能力模型人类生理和先天免疫机制在呼吸道的疾病和感染。这个系统,配合先进的成像技术,创造了一个前所未有的机会来集成面向疾病和个性化研究气道内的炎症。研究此依赖基底细胞从一个捐赠者没有肺部疾病,然而,未来的调查可以从各种各样的个人将基底细胞,包括那些基因定义的肺部疾病,评估潜在的遗传差异,可能影响开发或共培养模型系统的性能。总之,这个模型提供了一个机会显著扩大我们的理解neutrophil-epithelial相声的人工气道。

上皮细胞的增长和维护

H292细胞系,从美国获得类型的组织文化,是一种人类肺上皮细胞系来自黏液状的肺癌患者。H292细胞在DMEM / F12培养基(1:1)heat-inactivated 10%胎牛血清+ 100国际单位100 ug /毫升/毫升青霉素和链霉素。H292细胞被播种到胶原蛋白涂层倒transwells与渗透(3µm孔隙大小)聚碳酸酯膜插入,文化面积0.33厘米²(康宁产品# 3415)。Transwells一夜之间被孵化,允许细胞附着表面过滤器底部,然后恢复成24-well细胞培养板与媒体放在Transwells的两侧。H292层保持在文化媒体至少七天之前,确保功能障碍的形成用于迁移化验¹¹。

人工气道基底细胞隔离、文化和黏膜纤毛的分化在气液界面上

人类呼吸道基底细胞,在这项研究中,分离和扩张气道组织收获从单一捐赠者没有肺部疾病通过新英格兰器官银行下一个IRB-approved协议(# 2010 p001354),如前所述¹⁶。知情同意是新英格兰器官获得的银行和向调查人员提供实验依IRB-approved协议。总之,使用以前公布的基底细胞隔离协议¹⁶,EpCAM⁺从气管和主支气管上皮基底细胞分离培养在完成SAGM (Lonza,猫。cc - 3118),持续传播。在这些文化条件下,EpCAM染色⁺上皮基底细胞通道1导致100%的积极性肺转录因子NKX2.1 SOX2, FOXA2和通用干细胞标记p63和KRT5独特识别他们的纯粹的成人呼吸道基底细胞¹⁶。进行实验之间的一致性的目的在这个研究中,基底细胞分离从单一捐赠者之间使用段落4 - 8。基底细胞培养使用双重SMAD抑制剂协议¹⁶、分裂和播种到transwell膜的播种密度> 6000细胞/毫米²。

阿里在传统模式中,细胞被播种到6.5毫米的面对表面transwells与聚酯膜插入0.33厘米²文化区和0.4µm大小的孔(康宁产品# 3470)板与804克的媒介。播种和增长发生在标准的时尚¹⁶。倒ALI模型使用的中性粒细胞transepithelial迁移研究同一transwells H292倒模型:transwells与渗透(3µm孔隙大小)聚碳酸酯膜插入和0.33厘米的文化区²(康宁产品# 3415)。3日播种的基底细胞µm transwells,需要一个两步的过程:首先,transwells翻转和80 - 100年µl 804 G的条件培养基添加的顶端膜和孵化37°C过夜。第二天,涂层中被删除,取而代之的是80年µl气道的基底细胞悬浮在SAGM四到六小时的时间框架允许粘附。额外SAGM介质和任何独立的细胞被小心翼翼地吸气和transwells回到接收井包含500µl成套SAGM气道基底细胞复苏和扩张。一百毫升804 G条件培养基+ 5%人工基底膜(BDBiosciences, 354230)被添加到外套的面对表面transwell在参议院。孵化后一夜之间在37°C, SAGM介质在众议院和涂层介质在参议院被拆除,代之以完成SAGM。传统和反向ALI模型,生长培养基(完成SAGM)仍在上下室1 - 2天,以确保细胞融合。媒体在两院然后替换完成Pneumacult-ALI介质(干细胞技术,猫。05001)或顶点阿里的媒介³⁶第二天再吃。第二天,阿里中只添加了下议院(传统模型)或只在参议院(反向模型)来启动airway-liquid接口(算是天0)。媒体改变了每1 - 2天,直到分化。Ciliogenesis被inverted-phase显微镜监控。

爱丽丝用于实验培养至少9天,以便完整成熟的纤毛和杯状细胞,但不超过34天,避免过度生长或损失的上皮屏障。Transepithelial电阻评估迁移之前化验,确保建立极化上皮屏障使用电压表(EVOM2、上皮Voltohmmeter世界精密仪器,Inc .)。

阿里丰收,切片,染色

为分化标记染色,细胞膜和4%多聚甲醛固定(PFA)在室温下10分钟,洗净,permeabilized PBS + 0.2% Triton x - 100。膜是用于wholemount染色或嵌入在最佳切削温度为6µm冷冻/石蜡复合部分。免疫荧光染色,阿里膜或部分被孵化与主在PBS + 1% BSA抗体稀释了两小时在室温下或在一夜之间在4°C(> 16小时)。孵化后,膜或幻灯片清洗四次PBS + 0.2% Triton x - 100,并与二次孵化抗体在室温下一到两个小时。孵化后,膜或幻灯片清洗四次PBS + 0.2% Triton x - 100,然后用DAPI染色(4’,6-diamidino-2-phenylindole)通过添加足够的0.1µg /毫升DAPI安装前三分钟解决方案和成像。染色是可视化使用奥林巴斯Fluoview FV10i共焦显微镜或尼康A1共焦激光显微镜。阿里上的包埋染色transwell膜与奥林巴斯可视化IX81倒置荧光显微镜。图像捕获多个焦点飞机和结合使用MicroSuite五(奥林巴斯软成像解决方案)和扩展焦成像(EFI)模块创建一个焦距因图像,获取细胞厚阿里文化的复杂性。本研究中使用的初级和二级抗体包括乙酰化微管蛋白(σ,鼠标单克隆,T7451 1:10,000), CCSP(圣克鲁斯生物技术、山羊多克隆,sc - 9772, 1:200)、MUC5AC(热科学、鼠标单克隆,2013 - 05年,1:50 0),CK5 (abcam,兔多克隆、ab53121 1:50 0)和CK8(鼠单克隆,杂种细胞发育研究银行TROMA-I, 1:50)。二级抗体共轭和Alexa萤石(488和594)在1:50 0从生命技术购买和使用。 For each stained image visualized by microscopy, three different areas of the transwell membrane were analyzed in more than three separate experiments. Representative staining images are displayed.

中性粒细胞隔离

中性粒细胞分离,使用一个确定的技术,从全血的健康志愿者在收到书面知情同意在一个机构审查委员会批准的协议(# 1999 p007782)在马萨诸塞州综合医院¹¹。所有的实验都是依照IRB-approved协议执行。短暂,血液是通过静脉穿刺到包含抗凝注射器,酸柠檬酸/葡萄糖,并受离心去除血浆和单核细胞。2%的明胶沉降技术紧随其后裂解与NH红细胞(红血球)₄Cl执行。细胞随后被清洗和resuspended在哈佛商学院没有钙或镁(hbs)浓度的5×10⁷中性粒细胞/毫升。这种中性粒细胞隔离技术允许隔离功能活跃的中性粒细胞(> 98%)纯度90%³⁷。

菌株

大肠杆菌(MC1000)¹¹和铜绿假单胞菌(PAO1)¹¹增加耗氧在一夜之间Luria-Bertani肉汤37°C颤抖的孵化器。实验前,每个细菌悬液resuspended在哈佛商学院和稀释浓度的6×10⁷CFU /毫升哈佛商学院。迁移的实验中,transwells被感染25µl 6×10⁷CFU /毫升细菌1小时,然后洗净。允许µOCT可视化GFP-expressing PAO1³⁸上皮细胞附着,transwells被放置在井包含1毫升的GFP-expressing PAO1 6×10⁷CFU /毫升hbs了五个小时,然后立即洗前成像³⁹。

药物治疗

Cinnamyl-3 4-dihydroxy-α-cyanocinnamate(疾病预防控制中心;恩佐生命科学)12-lipoxygenase抑制剂,被按照制造商的说明和稀释50µM。车辆控制由DMSO溶液的稀释与哈佛商学院匹配的稀释系数。HxA3(100µg /毫升)拮抗剂在先前的研究特点的名字pn - ii - 218 - 36和jr Falck博士在实验室合成UT西南医学中心。

中性粒细胞transepithelial迁移

化验是改编自一个中性粒细胞迁移transepithelial共培养模型系统¹¹。上皮细胞层上生长transwells在哈佛商学院清洗和平衡。实验涉及上皮预处理,上皮细胞培养在化学抑制剂(CDC)或车辆控制(1:1000 DMSO)两个小时。Transwells洗,倒和上皮表面感染25µl 6×10⁷CFU /毫升细菌(MC1000或PAO1)或接受哈佛商学院在洗涤之前一个小时。transwells感染和未感染的控制被放置在井包含哈佛商学院,或者,在某些实验中,HxA3拮抗剂。额外的未感染的控制被安置在外源性化学引诱物,fMLP (100 nM,σ)。中性粒细胞,孤立和resuspended 5×10的浓度⁷中性粒细胞/毫升,在哈佛商学院1:10稀释+和200µl稀释被安置在基底外侧间隔1×10的最终数字⁶中性粒细胞/ 24-well transwell。迁移被允许发展了两个小时在37°C, 5%的二氧化碳。两个小时后,transwells被丢弃和中性粒细胞迁移量化使用过氧化物酶测定中性粒细胞髓过氧化酶(MPO)的评估活动¹¹。个人实验,生成标准曲线来定义每个髓过氧化物酶活性的中性粒细胞迁移数量在405年(OD)(线性回归,R²> 0.99)。结合实验数据运行在不同场合时,迁移是规范化的百分比PAO1-infected控制允许组间比较和实验。

µOCT成像

高分辨率光学相干断层扫描(µOCT)被用来获取的图像通过细胞培养嗜中性粒细胞迁移。仪器是定制提供光学分辨率2µm外侧/水平方向,和1µm轴向/垂直方向。µOCT成像方法曾被报导过^17,34。简要总结,µOCT仪器测量了样品的depth-resolved反射率在宽带光由一个supercontinuum激光源(NKT光子学、比尔卡罗德、丹麦)。机动镜子重定向光束产生10月2 d或3 d横断面图像。µOCT仪器被用于一个倒置的配置;成像激光光束指向下面的样本。一个定制的持有人是由一个透明的OCT-compatible底举行transwell包含上皮细胞和中性粒细胞在远处的大约100µm玻璃底部。

µOCT中性粒细胞成像进行了化验使用3 d视频成像。每10分钟3 dµOCT成交了两个多小时后中性粒细胞为基底外侧间室的位置。附近的样本保持37°C在迁移期间白炽热源。

中性粒细胞迁移计数的获得作为时间的函数,µOCT体积ImageJ序列加载在图像处理软件。感兴趣的区域选择和裁剪。对于每一个时间点,像素点的数量超过一个阈值亮度由ImageJ数,除以相应数量的像素点的数量从一个孤立的嗜中性粒细胞产生中性粒细胞在选定的地区在一个时间点¹⁷。这个分析的结果描绘在时间进程图比较。

Co-registered荧光测量通过向µOCT co-aligning 488 nm激光红外光束路径⁴⁰。荧光发射被分开µOCT梁二向色滤截止波长为605 nm和发射滤波器选择最大限度地拒绝激发(488海里)和10月杂散光线(600 +海里)。一个光电二极管检测过滤荧光发射,一个测量每µOCT图片列出来。虽然荧光和µOCT梁co-registered,荧光发射不是本地depth-resolved。荧光信息结合µOCT体积渲染的数据调制的绿色通道饱和明亮的顶端表面上皮的3 dµOCT体积。(补充图。4)

纤毛的存在进行了分析通过测量标准差µOCT像素强度在每个各自图像的位置。规范化和阈值标准偏差的地图叠加在二维定µOCT横断面图像作为绿色通道叠加。

统计数据

数据报告为±SD和未配对比较,两个尾巴学生的学习任务。一个p值≤0.05被认为是显著的。

我们感谢史蒂文·m·罗,医学博士,M.S.P.H.,伯纳德·b·兰特,Ph.D. and Kevin S. Gipson, M.D. for critical and editorial review of the manuscript. This work was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID, Grant R01 AI095338), NIH/NHLBI (R01 HL116756, R01 HL118185) as well as by the Cystic Fibrosis Foundation (Grants PAZOS13F0, MOU16G0, HURLEY16G0, & TEARNE07XX0).

作者指出

1. 译文是m .少年和红煤备忘录同样这项工作。

从属关系

1. 儿科、哈佛医学院、波士顿,MA,美国

   译文是m .少年红煤谅解备忘录,t·伯纳德•迈克尔•a . Pazos Kinane &布莱恩·p·赫尔利

2. 哈佛医学院病理学系,波士顿,MA,美国

   Kengyeh k .楚家梁,崔Dongyao,蒂姆·n·福特& Guillermo j . Tearney

3. 医学系、哈佛医学院、波士顿,MA,美国

   Jayaraj Rajagopal

4. 黏膜免疫学和生物学研究中心,马萨诸塞州综合医院,波士顿,MA,美国

   译文是m .少年红煤谅解备忘录,Michael a . Pazos Rhianna m . Hibbler亚历山大·d·伊顿和布莱恩·p·赫尔利

5. 再生医学中心,马萨诸塞州综合医院,波士顿,MA,美国

   红煤备忘录& Jayaraj Rajagopal

6. Wellman光医学中心,马萨诸塞州综合医院,波士顿,MA,美国

   Kengyeh k .楚家梁,崔Dongyao Jinhyeob Ryu,蒂姆·n·福特& Guillermo j . Tearney

7. 生物化学和药理学、达拉斯的德克萨斯大学西南医学中心TX,美国

   j . r . Falck

贡献

概念化:L.M.Y.莫莱森,,B。P。H。; Methodology: L.M.Y., H.M., K.K.C., T.N.F., M.A.P., B.P.H.; Investigation: L.M.Y., H.M., K.K.C., H.L., D.C., J.R.y., RH., A.E.; Resources: J.R.F., T.B.K., G.J.T., J.R.a., B.P.H.; Writing original draft: L.M.Y., H.M., K.K.C., B.P.H.; Review & Editing: L.M.Y., H.M., K.K.C., M.A.P., R.H., J.R.F., T.B.K., G.J.T., J.R.a., B.P.H.; Funding Acquisition: M.A.P., J.R.F., G.J.T., J.R.a., B.P.H.

相应的作者

布莱恩·p·赫尔利通信。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

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