通过时间型I/III型干扰素模式和流感比较发现COVID-19的抗病毒免疫未调整gydF4y2Ba

免疫的一个中心范式是干扰素(IFN)介导的抗病毒反应先于促炎反应，优化宿主保护和最小化附带损害gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}．在此，我们报告，对于2019冠状病毒病(COVID-19)，这一范式不适用。通过研究32例因肺炎住院的中重度COVID-19患者的时间IFN和炎症细胞因子模式，并对呼吸衰竭和死亡的发展进行纵向随访，我们发现，IFN-λ和I型IFN的产生都减少和延迟，只有一小部分患者在病情危重时才诱导产生。相反，在所有患者中，促炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6和IL-8在ifn之前产生，并持续较长时间。这种情况反映在血液转录组中，其中突出的IFN签名仅在炎症增强的危重患者中可见。相比之下，在16名因肺炎而住院且临床病理特征与COVID-19相似的流感(流感)患者和24名症状较轻的非住院流感患者中，IFN-λ和I型IFN在较早、较高水平且独立于疾病严重程度的情况下被强烈诱导，而促炎细胞因子仅急性产生。值得注意的是，COVID-19患者中较高的IFN-λ浓度与支气管吸出物中较低的病毒载量和更快的病毒清除相关，且较高的IFN-λ与I型IFN比值与危重患者的预后改善相关。此外，与流感相比，COVID-19患者中细胞因子模式的改变与更长住院时间、更高的危重疾病发生率和死亡率相关。这些数据表明，COVID-19的抗病毒反应未调整，导致病毒持续存在、高炎症和呼吸衰竭。gydF4y2Ba

由β冠状病毒SARS-CoV-2引发的COVID-19已成为我们这个时代最严重的流行病之一，造成肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和死亡的高发gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．SARS-CoV-2感染最显著的特征之一是，它在很长一段时间内不被注意到，持续数周的轻微或不复杂的疾病，直到一亚组患者出现突然和严重的症状，需要住院、氧气支持和/或入住重症监护室(ICU)。gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．这种情况与病毒潜伏期异常长(从2天到14天)和病毒在呼吸道存在时间异常长(通常在初次感染后一个多月由传统分子诊断测试检测到)相一致gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．相比之下，迄今为止导致肺炎住院的主要呼吸道病毒流感病毒感染的潜伏期为1 - 4 d，病毒呈阳性的窗口期很短，只有几天，在1 - 3 d内突然出现症状，导致肺炎gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．其他常见呼吸道病毒，如呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒、异肺炎病毒和普通感冒冠状病毒的潜伏期也较短(从1-5天不等)，症状表现更为迅速和急性gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba这使得SARS-CoV-2在这方面非常独特。这种差异的基础尚不清楚，但很可能是COVID-19独特的病程和临床表现背后的病理生理学的关键驱动因素。gydF4y2Ba

COVID-19的特征是出现高炎症反应，也称为“细胞因子风暴”，损害气体交换功能，导致ARDS、多器官衰竭和死亡gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．我们和其他人之前已经证明，由IFN-λ (III型IFN)和I型IFN精心调节的抗病毒反应对于平衡免疫以获得最佳保护和最小损害至关重要gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}．偏离这种平衡会引发有害的“细胞因子风暴”，对人体健康造成毁灭性后果。最近的一项研究表明，在COVID-19患者中，I型IFN和IFN-λ没有产生，因为它们无法在一小部分临床特征不明的COVID-19队列的血清中检测到gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．相比之下，另一项研究报告称，I型IFN在COVID-19患者中被诱导，并表明其浓度在危重患者中可能降低gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．这种差异可能是由于每一项研究都专注于一个明显的异质疾病过程的单一和可能的明显快照。因此，研究动力学分析与描述免疫反应的过程有关，特别是考虑到细胞因子是瞬时产生的。这一标准尤其适用于ifn，它们在感染早期表达，随后迅速下调。gydF4y2Ba

在这里，我们对32例COVID-19患者和16例因社区获得性肺炎住院的流感患者的I型和III型ifn和主要炎症细胞因子模式进行了全面的时间分析，并根据当前世界卫生组织指南进行了纵向随访gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．两组患者入院时表现出相似的临床病理特征和相似的疾病严重程度(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们还分析了24例病情较轻的流感患者，他们在放射学上没有发现肺炎，也不需要住院(称为轻度流感;补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，以及10个健康的个体。使用高灵敏度的Luminex和ELISA检测，我们量化了住院后在规定时间间隔内收集的患者血清中与抗病毒免疫和高炎症相关的18种细胞因子和趋化因子(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．该分析基于相同的疾病症状和严重程度的临床标准，主要是是否患有肺炎和是否需要氧气支持，对患者进行校准。gydF4y2Ba

我们发现，COVID-19患者对IFN-λ和I型IFN的诱导严重受损。在大多数COVID-19患者中未检测到IFN-λ和I型IFN(在测定定量极限的中位数水平)，尽管一些患者产生IFN-λ，少数患者也产生IFN-α(图1)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．这一观察结果与流感患者进行了对比，后者在入院的第一个(1-3天)时间间隔内几乎一致表达两种ifn，且浓度显著高于流感患者。在所有病例中，IFN的表达都是短暂的，I型IFN的水平在住院后3 d后迅速下降，而IFN-λ则持续较长时间。值得注意的是，尽管其制造IFN的能力有限，COVID-19患者仍强烈表达促炎细胞因子，如TNF、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IFN-γ和CCL3，并在较长时间内保持高浓度(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．与健康个体相比，其他细胞因子如IL-1β， IL-12, IL-23和CCL4也在特定时间间隔显著上调，反映了疾病病程的异质性(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

当根据疾病症状发作进行比较时，出现了类似的模式(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．COVID-19患者的IFN-λ和I型IFN水平明显延迟和降低，仅在一小部分患者中检测到，且在症状出现的7-10天之后(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．相比之下，所有流感患者在前6天内都表现出高水平的这些细胞因子(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．尽管COVID-19患者在症状出现的前6天几乎不产生IFN，但他们会产生与流感病毒浓度类似的促炎细胞因子和趋化因子，如TNF、IL-6、IL-8、IL-10和CCL3。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．此外，他们表现出促炎介质的延长表达，TNF、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10和CCL4的高浓度在发病后的3周内仍可检测到，而在流感患者中，其中一些介质的表达在此时下调。gydF4y2Ba

值得注意的是，COVID-19患者入院时的全身炎症标志物，如c反应蛋白(CRP)浓度、白细胞(WBC)、中性粒细胞计数和中性粒细胞/淋巴细胞(N/L)比与流感患者相似(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．他们甚至有较低的发烧和较低的CURB-65得分，这是一种常用的肺炎严重程度的衡量标准gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba)．然而，在随访过程中，COVID-19患者发生需要ICU支持的急性呼吸窘迫综合征的发生率要高得多。在我们的队列中，32名患者中有16人(50%)发展为危重疾病，其中3人死亡，相比之下，16名流感患者中只有3人(18.7%)死亡，没有人死亡(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．COVID-19患者在更大的时间窗口内变得危重(第一名患者在入院后第1天发病，最后一名患者在入院后第9天发病;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)比入院后第一天就出现危重症状的流感患者要少。这一发现与COVID-19所描述的严重呼吸衰竭的高发和长时间病程一致(参考文献)。gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba})．有趣的是，在COVID-19患者中，危重患者入院时CRP浓度、WBC和中性粒细胞计数以及N/L比更高(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)，但没有抑制-65或发烧(扩展数据图。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．流感危重患者也有较高的白细胞计数、中性粒细胞计数、N/L比和抑制因子-65的趋势，而非住院的流感患者没有表现出任何这些增加(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 a -gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，我们检查了不同患者组之间的时间细胞因子模式是否不同。值得注意的是，我们观察到，尽管没有成为危重患者的COVID-19患者产生的I型或III型IFN很少，但与健康和非危重患者相比，危重患者的IFN-λ水平在1-3天的时间间隔内显著升高(图1-3)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．部分危重患者也产生IFN-α(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，尽管与非住院的轻度流感患者相比，其剂量明显较低(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或流感住院患者总数(包括危重和非危重患者;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。相反，所有COVID-19患者均产生促炎细胞因子如TNF、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-γ，危重患者在特定时间间隔内也表现出明显高于非危重患者的IL-6和IL-7浓度，IFN-γ有升高的趋势，与他们所处的高炎症状态一致(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．个体患者数据进一步证实了这些趋势(扩展数据图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在非危重患者中，CCL3显著高于健康对照组，而在危重患者中则不显著(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．相比之下，危重症和非危重症流感患者在制造I型和III型ifn的能力以及促炎细胞因子如TNF、IL-6或IL-7的能力上没有差异(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．同样，患有轻微流感的非住院患者表现出强烈的I型和III型干扰素的产生，这表明在流感疾病严重程度的范围内，抗病毒反应仍然强劲。他们也表现出类似的促炎细胞因子，如TNF、IL-6、IL-7、IL-8和IFN-γ，但与非危重或危重流感住院患者相比，CCL3水平更高。在雷达图上可视化这些模式可以发现，COVID-19患者在诱导抗病毒和促炎症反应方面存在重大失衡，而在流感中没有出现这种失衡(图1)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们试图确定COVID-19患者的细胞因子模式失衡是否与系统免疫效应和与疾病严重程度相关的参数有关。为此，我们从5名健康个体和9名COVID-19患者(5名非危重患者和4名危重患者)中获取了临时性WBC转录组，从进入病房或ICU的第一天开始，并在之后的不同时间点开始。总共分析了24个RNA-seq基因表达综合数据集。聚类分析显示，样本根据临床表型的严重程度进行分组，表明这是变异的主要来源，并提供了一种预测哪些患者将进展为危重或非危重疾病的方法(图5)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．将第1天作为最相关的时间点，我们发现与健康个体相比，COVID-19患者中有4,225个基因表达差异(补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．当危重症和非危重症患者分别与健康对照组比较时，分别观察到4214和4902个差异表达基因(DEGs)，其中1979个是常见的，其余的是在一个或另一个患者组中唯一发现的(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba及补充表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在这些DEGs中，2674个基因在危重患者和非危重患者之间也存在显著差异(补充表)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．火山图显示，两组之间最受调控的基因存在显著差异，危重患者表现出更强的免疫和抗病毒反应基因模式(图1)。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)．DEGs的通路分析确实揭示了危重患者中最显著的过度表达通路与免疫系统的正向调节、先天免疫反应的激活、对病毒的防御反应和对IFN的细胞反应相关(图1)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．IL-1β产生途径的诱导和对IL-1的反应也很明显。相比之下，在非危重症患者中，除了IL-1β产生通路外，这些通路没有明显上调(图1)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．其他过度表达的途径包括调节细胞成分的大小和自然杀伤(NK)细胞毒性(图1)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，带有时间信息的热图揭示了一长组抗病毒基因在危重患者中的强烈诱导，而在非危重患者组中只有一小部分抗病毒基因上调(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．该集合包括经典的抗病毒反应基因，可由I型和III型IFN诱导，如gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf2gydF4y2Ba，gydF4y2BaSocs3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIsg20gydF4y2Ba，gydF4y2BaOaslgydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi5gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfit1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaIfit5gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfitm10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba1英镑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2英镑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4英镑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5英镑gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6英镑gydF4y2Ba与非危重症患者或健康个体相比，均显著上调gydF4y2BaIrf3gydF4y2Ba，gydF4y2BaSocs3gydF4y2Ba，gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba，gydF4y2BaOas1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi27gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi44gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfitm5gydF4y2Ba非危重症患者也上调，但上调幅度低于危重症患者(补充表)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．第1天表达的抗病毒基因集比较如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba证实危重症患者与非危重症患者之间有统计学显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.25 × 10gydF4y2Ba^{−20gydF4y2Ba})，这与这些患者中IFN λ和I型IFN产生的不同模式一致。危重患者中I/III型IFN反应较强不太可能是由于IFN受体组分的高表达，因为两者之间未观察到显著差异gydF4y2BaIfnlr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl10rbgydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfnar1gydF4y2Ba除危重症患者Ifnar2水平增加两倍外，其他患者组和健康人mRNA水平均升高(补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

进一步的热图分析表明，危重患者有更强的全身固有免疫反应，其标志是关键促炎介质的表达增加，包括补体成分(gydF4y2BaC2gydF4y2Ba，gydF4y2BaC4bpagydF4y2Ba)、细胞因子(gydF4y2BaCsf1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCxcl10gydF4y2Ba)和基质金属蛋白酶(gydF4y2BaMmp8gydF4y2Ba，gydF4y2BaMmp9gydF4y2Ba)优于健康个体(图5)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．相反，非危重症患者表达增强gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba这是一种主要的抗炎蛋白抑制细胞因子风暴gydF4y2BaIl7gydF4y2Ba这与维持周围T细胞的内稳态有关。值得注意的是，炎性小体基因如gydF4y2BaNlrp6gydF4y2Ba，gydF4y2BaNrlc4gydF4y2Ba，gydF4y2BaNod2gydF4y2Ba，gydF4y2BaAim2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCasp9gydF4y2Ba，gydF4y2BaCasp10gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1rngydF4y2Ba而且gydF4y2BaIl1r1gydF4y2Ba这些都与IL-1β的产生或反应有关gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba，在COVID-19危重患者中也上调，而gydF4y2BaPycardgydF4y2Ba（gydF4y2BaAscgydF4y2Ba)，炎症小体组装的一个关键成分，在非危重症患者中比健康个体中下调，表明IL-1β通路在更严重的疾病中发挥突出作用(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．模式识别受体(PRRs)参与微生物的识别，如gydF4y2BaDdx58gydF4y2Ba（gydF4y2Ba瑞吉gydF4y2Ba)，gydF4y2BaAim2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfih1gydF4y2Ba（gydF4y2BaMda5gydF4y2Ba)，gydF4y2BaIfi16gydF4y2Ba，gydF4y2BaTlr2和Tlr4gydF4y2Ba，也上调了。总的来说，当作为一个集合比较时，炎症小体和PRR基因如图所示。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba两组间差异显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 9.72 × 10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba})．在细胞类型水平，基因表达分析显示显性激活的中性粒细胞/髓样细胞特征(gydF4y2BaMpogydF4y2Ba，gydF4y2BaElanegydF4y2Ba，gydF4y2BaCd177gydF4y2Ba，gydF4y2BaItgamgydF4y2Ba，gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCeacam8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaFcgr1agydF4y2Ba)，在危重患者中较轻，在非危重患者中不显著(图5。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．相反，T、B、NK淋巴细胞谱系及相关基因(gydF4y2BaCd3dgydF4y2Ba，gydF4y2BaCd3egydF4y2Ba，gydF4y2BaCd4gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd8agydF4y2Ba，gydF4y2BaCd19gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd22gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNcam1gydF4y2Ba)在危重患者中明显下调。这些数据与淋巴减少、高中性粒细胞计数和高N/L比在这些患者中也存在一致(扩展数据图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，此前也有报道称与COVID-19患者更严重的疾病和更糟糕的预后有关(参考文献。gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba})．TNF、IL-6和IL-8等细胞因子可能直接导致这些影响，因为众所周知，它们可触发中性粒细胞的动员和激活、淋巴细胞减少的发展以及先天免疫反应和全身炎症的诱导gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}．因此，COVID-19患者在住院早期的WBC转录组可以提供有关疾病严重程度的重要信息，并指导以更个性化的方式给药IL-1抑制剂等治疗。gydF4y2Ba

有趣的是，与流感相比，COVID-19合并肺炎患者的细胞因子模式失衡与更糟糕的疾病结局相关。首先，COVID-19组表现出较高的危重疾病发生率和死亡率(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．第二，COVID-19患者，以及被分为危重和非危重患者的患者，比流感患者需要更长时间的住院时间(图1)。gydF4y2Ba5 a - cgydF4y2Ba)．对于非危重型和危重型COVID-19患者，中位时间分别为14和23 d，而流感患者为7和19 d(图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)．延长住院时间可能归因于未调整的抗病毒反应，导致COVID-19的临床病程较流感更长，即使是非危重患者也需要更长的恢复时间。gydF4y2Ba

识别能够预测住院时间的细胞因子和细胞因子组合，从而独立于已知的实验室和临床严重程度参数(如OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba饱和度、呼吸频率或N/L比)，我们生成了入院时(1-3天间隔)细胞因子水平与住院时间的相关性矩阵(图1-3)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．我们发现，较高的IL-6和IL-10，较低的CCL3浓度，与住院时间成正比(图。gydF4y2Ba5 d-fgydF4y2Ba)．IL-6和IL-10作为监测COVID-19严重程度的生物标志物的价值已被报道gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}但对CCL3来说，这是新的。值得注意的是，IFN λ浓度也与较高的IL-6和IL-10以及较长的住院时间相关，这与它们在危重患者中几乎完全诱导而非非危重患者一致(图1)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

一个问题是危重患者体内诱导的IFN水平是否有益，因为在动物模型中已经显示I型或III型IFN产生延迟会引起免疫病理gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}或干扰上皮修复gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba},分别。我们发现，进入ICU期间较高的IFN-λ浓度与呼吸道内较低的SARS-CoV-2病毒载量和更快的病毒清除有关(图。gydF4y2Ba5克,gydF4y2Ba)．此外，当时较高的IFN-λ与I型IFN的比值与在ICU住院时间较短有关(图。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)，两名IFN-α水平最高的患者住院时间也最长(均为23 d，中位数为17 d)。这些数据表明，在COVID-19危重患者中，延迟的IFN-λ诱导可能仍然具有保护作用，而IFN-α可能弊大于利，至少在一部分患者中是这样。gydF4y2Ba

综上所述，我们的研究结果表明，SARS-CoV-2感染不遵循传统的抗病毒免疫范式。它不是首先激活抗病毒反应然后是促炎过程作为第二道保护线，它的作用相反;它会在ifn介导的抗病毒防御被诱导之前很久触发促炎反应。这种情况是一个主要的悖论，有助于解释COVID-19的许多独特或不寻常的特征。病毒在呼吸道的长潜伏期和持续时间，使SARS-CoV-2检测呈阳性数周，可归因于I型和III型ifn的产生延迟和/或减少。患者在异常长时间内无症状或症状非常轻微，可归因于I型干扰素的缺乏或受损和延迟表达，I型干扰素是人类流感样疾病和流鼻涕、咳嗽、疲劳、呼吸困难和发热等症状的主要介质gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．最后，促炎细胞因子的早期和持续表达最终发展为长时间的高炎症，可促进呼吸衰竭的突然发展，需要住院和频繁的ICU住院。值得注意的是，在流感中，I型和III型IFN反应的迅速诱导，在疾病严重程度的范围内，与快速恢复和显著降低危重疾病发生率或死亡率相关gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．最近一项446例COVID-19患者的回顾性队列研究表明，早期给予IFN-α (IFN-a2b)与降低住院死亡率有关，而晚期IFN-α治疗导致死亡率增加和恢复延迟，这无疑表明，IFN产生的时机对COVID-19患者也至关重要(参考文献)。gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba)．可以想象的是，I型或III型IFN的后期产生可能不会产生病毒耐药性，但反而会促进免疫病理。gydF4y2Ba

COVID-19这种独特的临床过程是否与之前提出的针对SARS-CoV的SARS-CoV-2衍生IFN抑制剂的存在有关gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}和MERS-CoVgydF4y2Ba^32gydF4y2Ba尚不清楚，但有可能。与其他病毒一样，一旦达到较高的病毒载量，例如在病毒孵化并最终在易感人群中传播之后，抑制作用可能会被克服。在我们的研究中，我们没有发现检测ifn时非危重患者和危重患者之间的病毒水平有显著差异(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．然而，在一项研究中，严重疾病的病毒载量高于轻度疾病，但未在另一项研究中得到证实gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．此外，较高的病毒载量可以克服SARS-CoV-2对培养的呼吸上皮细胞中IFN产生的剂量依赖性抑制gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们的研究并非没有需要注意的地方。首先，它描述了循环中的细胞因子模式，尽管这些通常被用于分析感染反应中的“细胞因子风暴”，但它们与呼吸道中的免疫反应之间的关联程度很难知道。其次，我们的研究规模相对较小，我们的发现还有待其他队列的验证。尽管如此，我们的研究具有独特的信息量，因为它以从住院到进入ICU的时间方式解决了IFN的产生和“细胞因子风暴”在COVID-19中的激活，因此应该对IFN疗法的临床试验设计特别有用。它还描述了IL-6和CCL3等生物标志物和基因表达签名，这些标志物对评估新入院的COVID-19患者的危重疾病发展风险和住院时间特别有用。最后，它提供了COVID-19与流感的并排比较，研究了具有相似遗传、人口统计学和临床病理特征的患者群体，从而揭示了这两种疾病之间抗病毒免疫反应的重要差异，这些差异以前没有被怀疑过。gydF4y2Ba

研究参与者gydF4y2Ba

在这项非介入性研究中，纳入了32例根据世界卫生组织指南诊断为COVID-19肺炎、呼吸道样本(鼻咽拭子或支气管吸入)SARS-CoV-2 PCR反转录(RT-PCR)检测阳性的患者gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．患者于2020年3月至4月从1gydF4y2Ba^圣gydF4y2Ba希腊雅典“Sotiria”胸部疾病综合医院的呼吸和危重护理临床病房和ICU。纳入时SARS-CoV-2 RT-PCR阳性的健康无症状个体作为对照组。gydF4y2Ba

根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗指南(试行修订版)》的改编，对病例的严重程度进行分级gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．所有患者均为中度至重度疾病，表现为呼吸道症状和肺炎的影像学表现。他们符合以下任何一个标准:gydF4y2Ba

1. 1.gydF4y2Ba

   呼吸窘迫(≥30次/分钟)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}）;gydF4y2Ba

2. 2.gydF4y2Ba

   静息时氧饱和度≤93%;gydF4y2Ba

3. 3.gydF4y2Ba

   动脉氧分压(PaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)/吸入氧的分数(FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)≤300mmhg，无其他器官衰竭。gydF4y2Ba

16例患者发生呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸衰竭(PaO)引起的危重症gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba≤200mm Hg)，需要机械通气，伴有休克和/或其他器官衰竭，需要ICU护理。住院期间和出院时在不同时间间隔抽血;白细胞和血清收集并储存，待将来使用。gydF4y2Ba

为了更好地了解COVID-19感染的免疫反应，我们还研究了一组确诊甲型H1N1/H3N2流感病毒感染的患者。2018年12月至2019年5月期间，共招募了40名患者gydF4y2Ba^ndgydF4y2Ba希腊雅典“Sotiria”胸部疾病综合医院呼吸科和希腊雅典雅典大学医学院“Attikon”大学医院。使用BioFire FilmArray呼吸板试验(bioMerieux)从鼻咽拭子中获得确认。与COVID-19患者类似，根据疾病的严重程度，流感患者被分为无肺炎放射学发现、不需要氧气支持和住院的轻症患者和有肺炎放射学发现(x光或计算机断层扫描)、需要氧气和需要住院的症状的中重度患者gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．住院的流感患者被细分为未发展成(PaO)的患者gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba> 200 mmhg)或发生危重症(PaO)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba≤200 mm Hg)。流感患者入院时与COVID-19患者有相似的临床病理特征(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．所有纳入研究的患者在整个住院期间(从入院到出院)进行了临床评估和纵向随访。所有血液标本立即处理以收集血清，等份保存在−80°C。此外，我们还收集了10名中位年龄为54.5岁(41-70岁)的健康个体的血清，其中3名男性和7名女性。gydF4y2Ba

该研究符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则，并获得了希腊雅典“Sotiria”胸部疾病综合医院(批准号为16707/10-7-18和8385/31-3-20)和希腊雅典大学医学院“Attikon”大学医院(批准号为1821A/22-9-16)伦理委员会的批准。所有参与者都提供了书面知情同意。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2检测gydF4y2Ba

根据制造商说明，使用Nuclisens easyMAG仪器(bioMerieux)从鼻咽拭子和支气管吸入物中提取RNA。使用鼻咽拭子进行初步诊断，而在ICU使用支气管抽吸器评估病毒载量。对提取的SARS-CoV-2 E基因核酸进行实时RT-PCRgydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细胞因子分析gydF4y2Ba

在−20℃冷冻和储存的血清样本中，不进行其他解冻，分析IFN-γ、TNF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17A、IL-23、CCL3、CCL4和CX3CL1的存在，使用MILLIPLEX MAP人类高灵敏度T细胞检测试剂盒(Merck Millipore)。解冻的血清等份在下午13000转离心。测试前立即在4℃下放置10分钟。每次检测都根据制造商的血清样品方案进行，使用推荐的样品稀释度和标准曲线浓度(默克Millipore)。根据制造商的说明(默克Millipore)，在Luminex 200系统上使用Luminex xPonent v.3.1软件对样品进行分析。对于每一种细胞因子，每一种检测方法的最低检出限为pg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IFN-γ为0.50,TNF为0.42,IL-1β为0.2,IL-2为0.24,IL-4为0.60,IL-6为0.16,IL-7为0.33,IL-8为0.30,IL-10为0.50,IL-12为0.24 (p70)， IL-13为0.20,IL-17A为0.50,IL-23为8.00,CCL3为2.00,CCL4为0.80,CX3CL1为10.00采用高灵敏度夹心ELISA试剂盒检测人IFN-α (Abcam)和IFN-λ1 (BioLegend)。其敏感性在pg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IFN-α为1.00,IFN-λ1为2.00。使用Biotek Gen5 v.1.05软件获取数据并进行分析。gydF4y2Ba

RNA-seq分析gydF4y2Ba

RNA-seq分析使用RNeasy Micro kit (QIAGEN)从全血白细胞中纯化总RNA。RNA样本用DNase I (QIAGEN)处理，并在NanoDrop上定量(Thermo Fisher Scientific)。用TruSeq RNA文库准备试剂盒v.2制备下一代测序文库(Illumina)按照制造商的说明。在安捷伦2100生物分析仪上使用安捷伦DNA 1000试剂盒对文库的质量进行验证。此分析返回日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与健康个体相比，治疗在每个时间点发生了成倍的变化。所有COVID-19危重症和非危重症患者的DEG转录本是根据调整后的gydF4y2BaPgydF4y2Ba临界值为0.05(错误发现率(FDR)为5%)。对危重症和非危重症的COVID-19 DEGs进行了进一步的统计比较。使用Cytoscape的ClueGO和CluePedia插件对健康个体的deg进行通路富集分析。采用TM4 MeV v.4.8进行热图绘制，采用欧氏距离进行分层聚类。在R中分别使用hclust函数和ggdendro包进行聚类和树状图。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

用NextSeq 500 (Illumina)测序的样品使用标准协议进行分析。简单地说，原始读取使用FastQC v.0.11.2和cutadapt v.1.6进行预处理，然后使用TopHat 2.0.13版本、Bowtie v.1.1.1版本和Samtools v.1.1版本将其映射到人类基因组(GRCh38)。使用HTSeq v.0.6生成读计数表。在至少一个数据集中以阈值10过滤原始读取计数，结果共得到21880个基因。DESeq2分析gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba在危重症和非危重症患者及健康人、危重症和非危重症患者中进行。此分析返回日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与健康个体相比，治疗在每个时间点发生了成倍的变化。DEG转录本的选择基于一个调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba临界值为0.05 (FDR为5%)。通路富集分析使用Cytoscape的ClueGO和CluePedia插件进行。采用TM4 MeV v.4.8进行热图绘制，采用欧氏距离进行分层聚类。在R中分别使用hclust函数和ggdendro包进行聚类和树状图。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据分析采用GraphPad Prism软件。用Mann-Whitney量表评估细胞因子水平差异的统计学意义gydF4y2BaUgydF4y2Ba-test非参数数据。细胞因子水平与住院时间(以天为单位)之间的相关性采用Spearman秩序相关系数进行检验，并用corrplot R软件包进行可视化分析。使用双尾Student 's评估基因组间差异的统计学意义gydF4y2BatgydF4y2Ba-test参数数据。使用ggplot2 R包中的极坐标图来可视化细胞因子反应模式的差异。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

关于研究设计的进一步信息可在gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。RNA-seq原始数据已存入基因表达综合(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)在生物计划登入编号下gydF4y2BaPRJNA638753gydF4y2Ba并且是公开的。gydF4y2Ba

作者感谢A. Gavriil和G. Vatsellas提供的技术援助，感谢P. Katsikis(荷兰Erasmus医学中心)和V. Soumelis(法国巴黎圣路易研究所，Université)对手稿的批判性阅读。E.A.得到了欧洲委员会(IMMUNAID, no。779295和CURE，不。希腊研究和创新基金会(INTERFLU, no. 767015);1574)和詹森制药公司。i.e.m.由希腊研究与创新基金会(relief, no。506)。这项工作得到了希腊胸科学会的资助和Jorge Andres Sanchez Papaspiliou家人和朋友的捐赠。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 这些作者对这项工作做出了同样的贡献:Ioanna-Evdokia Galani, Nikoletta Rovina。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 希腊雅典科学院生物医学研究基金会临床、实验外科学和转化研究中心免疫生物学实验室gydF4y2Ba

   Ioanna-Evdokia Galani, Vicky Lampropoulou, Vasiliki Triantafyllia, Maria Manioudaki, Eleftherios Pavlos & Evangelos AndreakosgydF4y2Ba

2. 希腊雅典国立和卡波迪兰雅典大学医学院“索蒂里亚”胸部疾病总医院呼吸内科第一ICUgydF4y2Ba

   尼克莱塔·罗维娜和安东尼娅·库索库gydF4y2Ba

3. 希腊雅典国立和卡波distrian雅典大学医学院“Sotiria”胸部疾病总医院呼吸内科第一科gydF4y2Ba

   Evangelia Koukaki, Vasiliki Panou & Nikolaos KoulourisgydF4y2Ba

4. 希腊雅典雅典大学医学院阿提孔大学医院内科第四科gydF4y2Ba

   Paraskevi C. Fragkou, Vasiliki Rapti & Sotirios TsiodrasgydF4y2Ba

5. 希腊雅典“Sotiria”胸部疾病总医院第二呼吸科gydF4y2Ba

   Ourania KoltsidagydF4y2Ba

6. 希腊巴斯德研究所微生物学系，希腊雅典gydF4y2Ba

   Andreas健全的gydF4y2Ba

7. 英国伦敦帝国理工学院国立心肺研究所气道疾病感染科gydF4y2Ba

   Evangelos AndreakosgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

N.R, S.T, A.K.和E.A.设计了这项研究;i.e.g.， N.R, V.L, V.T, E.K, P.C.F, V.P, V.R, O.K.和e.a进行患者数据和样本收集;V.L.和E.A.对样品进行加工和制备，用于下游分析;e.k.、P.C.F、v.p.、v.r.、O.K.和N.K.进行了医疗评估;对i.e.g.、N.R、V.L、v.t和e.a进行细胞因子测定;i.e.g.， M.M.和E.A.进行RNA-seq分析;A.M.测量病毒载量;i.e.g.， N.R, V.L, V.T, M.M, E.P, E.K, A.K.和e.a对数据进行分析和解释;e。a起草了手稿并监督了研究。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaEvangelos AndreakosgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有竞争利益。gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba同行评审报告可用。gydF4y2Ba自然免疫学gydF4y2Ba感谢匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。L. A. Dempsey是这篇文章的主要编辑，并与编辑团队的其他成员合作管理其编辑过程和同行评审。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba