比较治疗效果lopinavir remdesivir和组合,例如,对MERS-CoV干扰素β

中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)是严重的呼吸道疾病的病原体与2468多名人类感染和自2012年以来,在27个国家的851人死亡。没有批准治疗MERS-CoV感染虽然lopinavir的组合,例如和干扰素β(LPV / RTV-IFNb)目前正在评估在沙特阿拉伯王国的人类。在这里,我们表明,remdesivir (RDV)和IFNb优越性能LPV和体外抗病毒活性。在老鼠身上,预防和治疗RDV改善肺功能,减少肺病毒载量和严重的肺部病理。相比之下,预防性LPV / RTV-IFNb稍微降低病毒载量而不影响其他疾病参数。治疗LPV / RTV-IFNb改善肺功能,但不降低病毒复制或严重肺部病理变化。因此,我们提供了体内的证据治疗MERS-CoV感染RDV潜力。

冠状病毒(x)的家庭有一个倾向出现到新的主机小说常常导致严重的疾病。2012年,中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)被发现严重呼吸道综合征的病原体在沙特阿拉伯王国(KSA),已经引起全球至少2468例和851例死亡¹。MERS-CoV在骆驼、流行的人畜共患储存宿主,感染至少30年前的证据²。骆驼在中东和也许在东非继续种子人类感染可能需要住院治疗尤其是老年患者先前存在的并发症^1,3,4。类似于x和严重急性呼吸系统综合症(冠),MERS-CoV已经扩散到27个国家通过空中旅行的感染者⁵。在2014年,一个单一的进口情况导致在韩国爆发的186例病例中,而最近的一个案例从中东进口包含结果的快速实施公共卫生措施⁶。MERS-CoV继续引起人类感染在全球范围内,因此被列为优先病原体具有大流行可能由世界卫生组织(世卫组织)和流行病防范创新联盟(CEPI)。目前,没有批准治疗MERS-CoV或任何其他人类x和。

新兴病毒性疾病通常很少如果任何有效的治疗方法。因此,设计和批准用于治疗其他疾病的患者接受新兴病毒综合征经验基于有限的临床或实验室数据。多个美国食品和药物管理局(FDA)批准的疗法已经评估对MERS-CoV体外抗病毒活性包括lopinavir (LPV),例如(RTV)和干扰素β(IFNb)。1 LPV是人类免疫缺陷病毒(hiv - 1)蛋白酶抑制剂通常结合RTV增加通过抑制细胞色素P450 LPV半衰期⁷。虽然对MERS-CoV LPV的抗病毒活性报道州立细胞(浓度导致复制(EC减少了50%₅₀)= 8µM),其他研究报告完全不活动类似性能的^8,9。相比之下,研究评估I型和II型干扰素的抗病毒活性报道IFNb最强有力的干扰素(EC₅₀1.37 -17国际单位/毫升)在减少MERS-CoV复制体外^8,10。唯一的体内研究的治疗效果评估LPV /退货或IFNb MERS-CoV发表了迄今为止在普通狨猴进行适度的改善临床结果指出¹¹。在人类MERS-CoV病人,两个刊登病例报告描述冲突结果的使用结合LPV /退货,聚乙二醇干扰素和利巴韦林两种病人幸存^12,13。为此,一个随机对照试验(奇迹试验),旨在最终确定LPV / RTV-IFNb改善临床结果MERS-CoV患者于2016年启动,到目前为止在KSA招收了76名病人^14,15。

Remdesivir (RDV, gs - 5734)是一种广谱抗病毒核苷药物前体与有效的体外抗病毒活性等不同面板的RNA病毒埃博拉病毒(EBOV)、马尔堡MERS-CoV,冠,呼吸道合胞体病毒(RSV),尼帕病毒(NiV)、亨德拉病毒^16,17,18。RDV anti-MERS-CoV活动的机制可能是通过过早终止病毒RNA转录所示使用重组EBOV生化检测,和合,RSV聚合酶^18,19,20.。在初级人类肺上皮细胞培养,RDV是当代人类浸,强有力地抗病毒对循环冠(EC₅₀= 0.07µM), MERS-CoV (EC₅₀= 0.07µM),以及相关的人畜共患蝙蝠浸^17,21。我们最近报道说,治疗RDV改善疾病预后,减少病毒载量在SARS-CoV-infected老鼠¹⁷。自相似研究与MERS-CoV没有执行,我们生成一个转基因小鼠人性化MERS-CoV受体(dipeptidyl肽酶4hDPP4羧酸酯酶1 c)和删除(Ces1c)提高核苷酸药物动力学的高活性化合物,使其更接近药物暴露在人类²²。在这里,我们表明,RDV提供优越的抗病毒活性对MERS-CoV体外和体内而LPV / RTV-IFNb。此外,RDV是唯一治疗治疗显著降低肺部病理。因此,我们提供了体内的证据治疗MERS-CoV感染RDV潜力。

RDV和IFNb LPV和性能优越的抗病毒活性

我们利用重组MERS-CoV设计来表达一个记者nanoluciferase (MERS-nLUC)为我们的体外抗病毒活性测定。来确保我们的记者WT MERS-CoV病毒表现相似,我们首先证明了MERS-nLUC和野生型(WT) MERS-CoV EMC 2012株复制类似的水平没有药物治疗的抗病毒活性,也同样容易RDV (WT EC₅₀= 0.12µM;MERS-nLUC EC₅₀= 0.09µM)在人类肺上皮细胞系,Calu-3(补充图。1)。这些数据是在协议与WT即乔丹应变(EC₅₀= 0.3µM)报道,沃伦et al。¹⁸。因此,未来的记者病毒数据应该WT MERS-CoV的代表。

然后我们进行平行与MERS-nLUC比较LPV Calu-3细胞抗病毒化验,RTV IFNb, RDV(无花果。1;补充图。2)¹⁷。类似于我们之前的报道,RDV显示有效的抑制MERS-CoV EC的复制₅₀0.09µM,没有可观察到的细胞毒性10μM和选择性指数(SI = EC₅₀/ CC₅₀)> 100¹⁷。(无花果。1)。相比之下,各自的电子商务₅₀值为LPV生成和退货是11.6和24.9µM CC₅₀值> 50µM(无花果。1 b, c)。因此,如果LPV和退货是4.3 >和> 2,分别。结合LPV和室温硫化(LPV: RTV 4.6: 1摩尔比)目前正在评估试验的奇迹¹⁴。LPV /退货(EC的抗病毒活性₅₀= 8.5µM独自(EC) LPV相似₅₀= 11.6µM,P= 0.43,Wilcoxon配对符号秩测试),暗示的效果在很大程度上是由LPV(无花果。1 d)。我们发现强有力的抑制与IFNb MERS-CoV (EC₅₀= 175国际单位(IU) /毫升)(无花果。1 e),抄送₅₀值> 2800国际单位/毫升和SI > 16。在一起,这些数据表明RDV和IFNb优越的体外抗病毒活性和LPV RTV相比,而且退货不显著提高LPV体外抗病毒活性。

IFNb活动不是改善当结合LPV /退货

细胞培养基和人血浆浓度和不同类型的蛋白质,这直接影响到水平的生物免费药物释放蛋白质复杂的比较药物水平相应的系统²³。为了解决这个问题,我们利用比较平衡透析(CED)来确定自由释放药物之间的差异人血浆和细胞培养基揭示最大血浆浓度(C_马克斯)在人类血浆(15µM)相同数量的自由释放LPV 5µM LPV 10%包含细胞培养基的边后卫。因此,我们结合LPV(5µM)和性能(1.09µM)在一个固定的摩尔比4.6:1结合IFNb浓度增加。的抗病毒活性LPV (EC / RTV-IFNb组合₅₀= 160国际单位/毫升)独自IFNb (EC的区别₅₀= 175国际单位/毫升)(P= 0.62,Wilcoxon配对签署等级测试)(图1 f)。这些数据表明,观察体外抗病毒活性的LPV MERS-CoV / RTV-IFNb组合是由IFNb当LPV /退货用于临床相关的浓度。

MERS-CoV鼠标模型测试的核苷酸高活性化合物

老鼠和人类不同,有高水平的血清酯酶(羧酸酯酶1 c,Ces1c),大大减少了老鼠RDV稳定性要求功效研究被执行Ces1c^−−/老鼠为了更好的近似药物动力学和药物暴露在人类¹⁷。MERS-CoV标准实验室小鼠感染预防由于人类和小鼠的差异dipeptidyl肽酶4 (DPP4),入口MERS-CoV受体。使测试RDV的老鼠,我们培育Ces1c^−−/老鼠和老鼠窝藏修改DPP4人性化通过CRISPR / Cas9残留288年和330年(hDPP4)。结果Ces1c^−−/hDPP4老鼠无法区分病毒复制和发病机理hDPP4小鼠在感染MERS-CoV(补充图。3)^22,24。

预防RDV减少MERS-CoV复制和疾病

使用新的Ces1c^−−/hDPP4小鼠模型,我们试图确定预防性RDV可以改善MERS-CoV疾病。如无花果所示。2,预防RDV(25毫克/公斤,出价)管理1天前感染显著减少MERS-CoV-induced减肥5 e + 04(感染的老鼠P< 0.0001、双向方差分析与图基的多重比较检验)或5 e + 05点状单位(pfu) (P< 0.0001、双向方差分析与图基的多重比较检验),相比之下,同样感染vehicle-treated动物。此外,感染RDV管理之前,也阻止了死亡率(P=0.0037,Mantel-Cox测试)在那些管理致死量(即。空斑形成单位,5 e + 05)(无花果。2 b)。vehicle-treated动物相比,肺出血明显减少(P< 0.0001、双向方差分析与图基的多重比较检验)RDV预防(无花果。2摄氏度)^22,25,26。重要的是,RDV预防显著降低肺病毒滴度> 3登录两个4 (5 e + 04P= 0.0240,5 e + 04P= 0.0001、双向方差分析与Sidek的多重比较检验)和感染后的6天(dpi) (5 e + 05P= 0.0001、双向方差分析与Sidek多重比较测试)(图二维),它被证实病毒抗原标记在肺组织的部分(图2 e)。

阿里的RDV预防减少特征

美国胸科学会(ATS)发布了一份共识文件定义参数和工具来更准确地翻译小动物模型的急性肺损伤(ALI)对人类²⁶。使用at肺损伤评分系统旨在量化阿里(图的组织病理学特征。3),我们盲目的苏木精和伊红染色领域得分从小鼠肺组织部分在无花果。2下列特点:中性粒细胞在肺泡和间隙空间,透明膜,蛋白质的碎片填充空气空间,肺泡间隔增厚²⁶。与控制老鼠,ATS RDV-treated小鼠肺损伤分数显著降低(P= 0.0079,Mann-Whitney测试)感染5 e + 04 pfu MERS-CoV和接近统计学意义(P= 0.0536,Mann-Whitney测试)在那些感染病毒剂量越高(5 e + 05 pfu)(图3)。在无花果。3,我们也展示量化病理特性的例子。在正常健康mock-infected控制老鼠(图。3 b)、肺泡气空间是自由的碎片和炎症细胞,墙(即。,septae) of the alveolar sac are thin which facilitates efficient gas exchange and rare neutrophils in circulation are seen in the capillaries within alveolar septae, but not in the air spaces. In contrast, vehicle-treated MERS-CoV-infected animals in both viral dosage groups (Fig.3 c)有多个阿里的组织学特征包括显著的免疫细胞渗透进入肺泡septae合成间隔墙增厚,分散退化和死亡细胞,蛋白质的碎片在空中空间毛细管泄漏导致其中一些被组织成透明膜和中性粒细胞在肺泡septae以及空气中的空间。有趣的是,早期的透明膜(即。,thin pink material lining alveoli) were noted in vehicle-treated animals infected with the lower dose of MERS-CoV (Fig.3 c(左),而更发达的透明膜(即。,thick pink material lining alveoli) were observed in vehicle-treated animals infected with the higher dose of virus (Fig.3 c,对吧)。重要的是,空气空间RDV-treated动物感染的低剂量MERS-CoV(无花果。3 d,左)主要是缺乏细胞碎片,免疫细胞,透明膜虽然肺泡间隔增厚由于增加免疫细胞观察。RDV-treated动物感染的高剂量MERS-CoV(无花果。3 d,右)同样缺乏空气空间碎片和炎症浸润,但表现出增加肺泡间隔增厚。因此,我们盲目的病理评价肺组织部分使用at肺损伤评分系统表明预防性RDV减少阿里MERS-CoV-infected小鼠的病理特征²⁶。

预防性的最小影响LPV / RTV-IFNb MERS-CoV

预防研究提供一个最佳的情况来评估体内抗病毒活性由于时间给出抗病毒药物的代谢和积累细胞内病毒感染前的目标。来确定预防性LPV / RTV-IFNb改善结果MERS-CoV感染后,我们第一次证实,皮下的人类IFNb等效剂量(H.E.D.)对小鼠的生物学效应。管理1×2.5 x,或者25 x H.E.D.鼠标IFNb迅速诱导干扰素刺激基因的表达存在剂量依赖的相关性(研究小组),mx₁在外周血单核细胞(PBMCs)Ces1c^−−/老鼠(补充图。4)。重要的是,动力学mx₁基因表达在MERS-CoV靶器官,肺,在这两方面都是相似的Ces1c^−−/和Ces1c^−−/hDPP4老鼠(补充图。4 b)。同样,一剂IFNb显著诱导持续表达式(P< 0.05、双向方差分析与Sidek多重比较检验)射线诱发干扰素蛋白10 (IP-10 CXCL-10)两株小鼠的血清(补充图。4摄氏度)。因此,我们观察到预期的血液和肺组织研究小组反应Ces1^−−/和Ces1^−−/hDPP4老鼠IFNb后治疗。

然后我们评估如果LPV / RTV-IFNb预防可以改善结果Ces1^−−/hDPP4小鼠感染5 e + 04 MERS-CoV微升。我们比较车辆(口服:丙二醇,乙醇,皮下:PBS)三个不同的治疗方案,包括LPV / RTV-IFNb高(25 x H.E.D. IFNb), LPV / RTV-IFNb低(1 x H.E.D. IFNb),或独自IFNb-high (25 x H.E.D. IFNb)(图4)。预防RDV和车辆作为控制。因为研究小组表达高峰后2 - 4 h IFNb管理局(补充图。4前),我们发起IFNb剂量2 h MERS-CoV感染潜在的抗病毒效应最大化。类似于我们的以前的研究,RDV(25毫克/公斤,出价)或车辆管理皮下每12 h获得曝光在老鼠身上类似于观察人类¹⁷。剂量水平和频率LPV /退货(口服每天一次)和IFNb(每隔一天皮下注射)试验选择镜像的奇迹²⁷。与RDV-treated老鼠(图。4)、车辆、LPV / RTV-IFNb或IFNb本身并没有阻止减肥(图。4 b)。事实上,动物管理IFNb独自失去体重明显多于车辆(P= 0.01),LPV / RTV-IFNb高(P= 0.0001)和低(P= 0.006,双向方差分析与图基的多重比较检验)组(无花果。4 b)。dpi 6日RDV治疗减少肺病毒滴度最(> 3日志减少车辆平均= 1.4 e + 05 pfu /叶,RDV值= 50微升/叶)(图4),而那些在LPV / RTV-IFNb低治疗中度降低(5.5 ~ 4倍,中位数= e + 03 pfu /叶)相比,其车辆(值= 2.3 e + 04 pfu /叶)(P= 0.04、双向方差分析与Sidek多重比较测试)(图4 b)。根据全身体积描记法测量肺功能(WBP),我们发现只有RDV预防改善肺功能(图。4 a、b)(P= 0.002 - 0.0001,双向方差分析与Sidek多重比较的测试)。有趣的是,动物接收IFNb-alone明显肺功能比同伴团体在稍后时间后感染(4 - 5 dpi,P= < 0.05、双向方差分析与图基的多重比较测试)。以确定起始时间和剂量水平会影响结果只IFNb组,我们进行了类似的研究,但管理IFNb较低剂量(即。1 x H.E.D.)感染前24小时(补充图。5)。变更IFNb剂量和时间的管理没有改善的结果从无花果。4,温和改善病毒效价与LPV / RTV-IFNb上面所提到的没有被观察到。综上所述,预防性LPV / RTV-IFNb造成适度减少肺病毒载量在两个研究中,但对其他疾病指标影响最小而IFNb独自不影响病毒的复制和加剧了疾病。

治疗RDV减少MERS-CoV复制和病理

更严格的评估的治疗潜力RDV和LPV / RTV-IFNb和人类更好的模型场景MERS-CoV病人最有可能会启动治疗感染后,我们进行了一系列的治疗效果研究在老鼠身上。我们提出以下治疗方法Ces1^−−/hDPP4小鼠感染5 e + 1日04 pfu MERS-CoV dpi: RDV或车辆,LPV / RTV-IFNb低(1×相当于人类),LPV / RTV-IFNb高(25×相当于人类)或他们的车辆。剂量路线、数量和频率是类似于上面的预防研究。只有治疗RDV大大减少体重损失(P= 0.019 < 0.0001,双向方差分析与图基的多重比较测试)(图5 a、bdpi(图6日)和肺出血。5度)(P< 0.0001、单因子变异数分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验)。同样,只有RDV治疗显著降低肺病毒滴度6日dpi(车辆平均7.8 e + 05 pfu /叶,RDV中位数125微升/叶,P= 0.0001、单因子变异数分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(无花果。5 d),我们证实病毒抗原标记在肺组织的部分(图5 e)。类似的治疗研究(补充图。6)进行但致命剂量的MERS-CoV (5 e + 05 pfu)没有治疗改善生存(补充图。6 a, d)或肺出血(补充图。6 b, e),但治疗RDV显著降低肺病毒载量dpi(补充图6日。S6c)(P= 0.03,Mann-Whitney测试)。因此,治疗LPV / RTV-IFNb未能改善减肥、肺出血、肺和病毒效价5 e + 04 pfu MERS-CoV之后并没有改善生存的致命剂量MERS-CoV(补充图。6 d-f)。相比之下,治疗RDV减少体重,肺出血,在持续MERS-CoV感染和病毒复制,但临床获益的程度取决于病毒治疗的起始剂量和时间。

治疗RDV和LPV / RTV-IFNb改善肺功能

图中描述的在治疗抗病毒疗效的研究。5,我们使用WBP评估肺功能(图。6)。vehicle-treated动物相比,RDV-treated动物减少了体积流量的50%过期(EF50) (P= 0.01、双向方差分析与Sidek多重比较的测试),和金边(P= 0.04、双向方差分析与Sidek多重比较的测试),代理/阻塞气道阻力(图。6)²⁸。同样,Rpef(过期之前的分数达到最大呼气流量),支气管收缩的一个指标,回到基线RDV-treated动物5 dpi (P= 0.002、双向方差分析与Sidek多重比较检验)但仍抑制vehicle-treated动物。与预防研究无花果。4 b治疗LPV + RTV-IFNb低肺功能改善与汽车相比显著降低EF50和金边(P< 0.05、双向方差分析与图基的多重比较检验)和基线水平的Rpef 5 dpi (P< 0.05、双向方差分析与图基的多重比较测试)(图6 b)。虽然治疗LPV / RTV-IFNb未能减少体重,肺出血,和病毒效价,这个方案似乎提供类似于治疗RDV改善肺功能。

治疗RDV但不是LPV / RTV-IFNb减少阿里的迹象

然后我们的肺部病理学量化治疗治疗动物(图。7)。从6 dpi在肺组织的部分,我们盲目地评估,取得了阿里的特点使用三个不同的和互补的方法。在无花果。7一个我们展示了阿里RDV治疗。虽然零星的凋亡细胞和肺泡间隔增厚墙(~ 2-4-fold模拟)由免疫细胞浸润观察小鼠的肺中接受治疗RDV,空气空间仍然主要是自由细胞碎片和炎症细胞类似于mock-infected动物(图。7一个)。相比之下,多个病理特征的典型阿里被指出在汽车组(RDV和LPV / RTV车辆)以及LPV / RTV-IFNb低和高,包括改变肺泡结构由于pneumocyte退化和死亡,大量炎症细胞在septae和肺泡气空间,中性粒细胞在空中空间,和蛋白质的碎片在空中空间组织成透明膜(无花果。7一个)。图中描述的使用at阿里评分工具。3,我们发现只有RDV疗法显著(P= 0.005、单因子变异数分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验)减少肺损伤评分(无花果。7 b)。互补的组织工具,然后量化特征的弥漫性肺泡损伤(爸爸),阿里的病理特点²⁶。我们发现,只有治疗RDV减少爸爸评分(P= 0.04、单因子变异数分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(无花果。7 c)^29日。由于程度的细胞死亡似乎与防护功效,我们量化水平的裂解caspase-3在肺组织的部分抗体标记。Caspase-3,一个被广泛接受的标记的细胞凋亡,调节酶的乳沟和激活驱动程序性细胞死亡^30.。使用定义的软件套件,我们获得公正的量化数据显示,只有RDV治疗显著降低水平的裂解caspase-3抗原(P= 0.0109、单因子变异数分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(无花果。7 d)。因此,使用三个互补和盲方法,我们获得了类似的数据显示,只有治疗RDV降低阿里的组织学特征。

新兴病毒性疾病造成重大的全球大流行(例如,艾滋病毒,1918年流感,天花),流行(例如,冠),和毁灭性的爆发(例如,EBOV MERS-CoV)。浸,宏基因组研究揭示了一个伟大的多样性在野生动物病毒和宿主,甚至确定病毒类似于蝙蝠当前和过去的流行株^31日,32。因此,广谱治疗方法对已知的流行和人畜共患病毒株可能有效种子未来的出现,有可能减少今天和未来减少传染病疫情。目前,fda批准的治疗方法没有任何人类x和感染。非典,MERS-CoV出现后,患者服用药物抗病毒药物(如利巴韦林、LPV RTV)和免疫调制剂(如糖皮质激素、干扰素alpha-2a / 2 b, IFNb)作为单一代理或组合,以改善严重疾病的结果非常有限的成功³³。没有随机对照试验,确定功效困难是由于病人和治疗变异性以及缺乏适当的匹配控制。尽管最近的荟萃分析和建模表明,干扰素治疗并不能提高MERS-CoV患者的临床结果⁴的奇迹审判KSA的目的是最终确定的固定剂量组合LPV / RTV-IFNb MERS-CoV感染的有效治疗¹⁴。在这里,我们表明,RDV提供优越的抗病毒活性对MERS-CoV体外和体内而LPV / RTV-IFNb。此外,RDV是唯一治疗显著降低肺部病理。因此,我们提供了体内的证据治疗MERS-CoV感染RDV潜力。人类抗病毒治疗方案的有效性测试类似于奇迹试验对进步抗病毒发展至关重要和优先治疗最有可能改善MERS-CoV病人的临床结果。

身份和蛋白质浓度的差异使翻译体内体外抗病毒活性的治疗效果。虽然电子商务₅₀对MERS-CoV LPV (EC₅₀= 11µM)属于最大(C_马克斯= 15µM)和最小(C_最小值= 9.5µM)水平在人血浆蛋白的生物可用分数的这些各自的系统相比,应该更准确地翻译体外体内活动潜在功效⁹。例如,槽水平(C_最小值)释放的蛋白质和总(5.8µM)免费LPV(0.057µM)女性艾滋病毒相差100倍,但LPV仍自欧共体高度活跃的和有效的₅₀(0.010 - -0.027µM)低于游离蛋白自由C_最小值^7,34。在一起,这些数据认为,人类自由的生物活性LPV达到的水平远低于那些对MERS-CoV起到强有力的抗病毒作用在细胞培养系统中复制。因此,微摩尔的EC₅₀观察对MERS-CoV LPV加上蛋白质绑定和等离子体的自由LPV水平不足可能是负责与LPV适度的抗病毒效应/ RTV-IFNb预防疾病与治疗政府和最小影响我们的小鼠模型。相比之下,人类等效剂量的RDV明显有效的小鼠感染非典,MERS-CoV和非人灵长类动物感染EBOV因此展示一个更合适的PK / PD关系¹⁷。

干扰素在治疗多种病毒感染是有用的^35,36。IFNb以来被证明是最有效的对MERS-CoV当抗病毒活性的比较多个I型和II型干扰素州立细胞,IFNb选择试验使用的奇迹^8,10。镜像奇迹审判,我们每隔一天交付IFNb皮下注射,未能减少MERS-CoV病毒载量和加剧疾病出现在老鼠。当我们试图理解这个结果,我们发现小实验一致在报告详细的预防或治疗效果的I型干扰素MERS-CoV的动物模型^11,37,38。Falzarano等人证明IFN-alpha-2a加上利巴韦林发起8 h后感染恒河猴的改善结果和肺组织病毒拷贝数减少,但治疗传染性病毒滴度没有影响支气管肺泡灌洗液³⁷。在老鼠hDPP4由adenoviral转导送到肺组织,鼻内IFNb鉴于之前或之后MERS-CoV减少肺部感染滴度虽然肺浓度峰值在这个模型中约两个数量级低于当前转基因模型,因此可能更容易治疗吗^38,39,40。常见的绒猴作为模型的效用MERS-CoV与一项研究详细描述严重呼吸道疾病发病机理是有争议的另一个报道类似轻微疾病在模拟和MERS-CoV-infected动物^41,42。在狨猴,陈等人研究的治疗潜力LPV /退货或IFNb,但每组使用的动物数量太少,缺乏time-matched病毒载量样本,和意想不到的早期死亡率LPV组合成数据难以解释¹¹。然而,上面提到的研究表明,I型干扰素可以发挥抗病毒作用MERS-CoV体内时皮下注射(干扰素α,恒河猕猴)和鼻内(IFNb,腺病毒hDPP4模型)^37,38,39。我们不能减少MERS-CoV效价或改善与干扰素如上所述的结果可能是由于动物模型的固有差异,送货路线,干扰素的不同亚型病毒对抗的先天免疫和/或活跃。因为最近的研究表明类型III干扰素是最有效的改善小鼠流感发病机理,比较研究调查不同干扰素亚型的效力与MERS-CoV应该追求^43,44,45。

人类急性肺损伤(ALI)是由一组定义良好的临床参数(即。,一个cute onset, diffuse bilateral infiltrates on X-ray, ratio of partial pressure of arterial oxygen to inspired oxygen < 300, no evidence of elevated pulmonary arterial pressure, etc.), which can be measured in mice but require specialized procedures, equipment, and training not readily available to most researchers^26,46。此外,阿里通常无法概括所有的动物模型病理特征观察到人类的差异可能潜在的解剖学,生理学,免疫学,遗传学,和复杂的并发症通常与阿里住院患者(如糖尿病、肾脏和肝脏疾病,等等)。²⁶。例如,老鼠有一个截然不同的大叶性成分进行气道比人类少分支,一个休息的呼吸速率远远超过人类(cbt) 250 - 300 bpm在老鼠身上,bpm的人类),和不同数量的中性粒细胞在流通(10 - 25%的老鼠,人类只有50 - 70%)。为了解决这些问题,美国胸科学会(ATS)小鼠模型的创建工具来简化翻译阿里对人类包括量化阿里的特点组织部分²⁶。我们雇了一个互补的弥漫性肺泡损伤定量组织学评估工具(爸爸),阿里的病理特点^26,29日。ATS阿里爸爸和组织学评估工具上面所描述的那样,通过裂解和定量细胞死亡caspase-3抗原标记,我们只显示RDV疗法减少了阿里当发起1 dpi。因此,从几个互补的组织学证据方法证明RDV提供卓越的保护从阿里LPV / RTV-IFNb相比。

Remdesivir (RDV, gs - 5734)是一种广谱抗病毒与有效的体外药效对多个基因RNA病毒无关^16,17,18。RDV表明体内疗效与EBOV非人灵长类动物导致其在临床研究评估包含RDV治疗急性埃博拉病毒病的影响(EVD)以及与长期病毒传染EVD幸存者^47,48。与我们与RDV冠研究一样,这里我们提供类似的证据MERS-CoV与减少体重,改善肺功能,减少病毒的复制与预防和治疗RDV¹⁷。非典的动力学——老鼠或MERS-CoV复制和疾病的价格相比是大大加速了人类。病毒复制的肺山峰在小鼠的肺部感染2 dpi冠MERS-CoV和感染进展死亡率或恢复到7 - 10 dpi,取决于病毒剂量^17,24。因此,治疗小鼠的治疗窗的峰值前病毒复制只有1 - 2天。相比之下,MERS-CoV复制人类呼吸道高峰在7 - 10天之后出现症状和病情课程解决或~ 21天内死亡^49,50。因此,治疗管理窗口后出现症状,但峰值前病毒复制是非常不同的在人类和小鼠实验感染。治疗RDV,我们观察到MERS-CoV发病机制和显著减少病毒滴度下降,然而治疗疾病治疗不完全废除。此外,high-titer病毒培养液,RDV无法阻止死亡和损失的肺功能虽然大大降低病毒载量。这些结果类似于那些获得了冠,在治疗病毒效价和峰值后立刻进行治疗肺损伤还未能改善结果显著降低病毒效价¹⁷。最近报告了类似的观察,单克隆抗体中和未能减少严重肺部疾病病理或临床疾病管理狨猴MERS-CoV感染后1天⁵¹。因为疾病造成SARS和MERS-CoV感染病毒和宿主免疫反应是由两个因素,根据疾病进展的阶段,抗病毒治疗的早期开始,和/或整体联合疗法可能会需要降低病毒复制,免疫病理和/或促进修复和恢复肺内稳态。正在进行的和未来的研究旨在确定MERS-CoV能够产生抗RDV体外和获得的突变谱是否类似MHV EC和冠状转变₅₀值只3-5-fold⁵²。

总之,我们提供体内的证据的潜在效用RDV MERS-CoV治疗病人。总体而言,我们的研究表明RDV CoV-infected患者可能改善疾病预后,为保护医护人员在流行的地区MERS-CoV并证明有价值的在防止未来流行的小说浸在未来出现。

研究设计

本研究的主要目标是比较RDV的预防和治疗效果的组合LPV /退货和IFNb。首先,我们评估抗病毒功效和细胞毒Calu-3人类肺癌细胞系相比,适当的车辆控制。体外实验条件进行了一式六份,除非另有说明,每个药物和抗病毒药物化验重复四次。第二,我们的体内疗效评估预防性RDV相比汽车与两种不同剂量的MERS-CoV MERS-CoV新的转基因小鼠模型的发病机理与提高核苷酸高活性化合物的药物动力学。我们进行了两个额外的预防研究比较RDV和车辆LPV / RTV-IFNb, IFNb-alone,他们的车辆。第三,我们评估上述治疗方案的治疗效果MERS-CoV发病机理的小鼠模型,但不包括一个IFNb,只有胳膊和这些研究进行了两次。所有肺组织学评估蒙蔽的方式进行。此外,我们执行一个致命剂量的MERS-CoV疗效研究。我们体内疗效的研究旨在镜子的奇迹人类临床试验正在评估LPV / RTV-IFNb组合。我们的研究目的是生成所需的数据进一步证明测试在非人灵长类动物和集体通知未来人类的临床试验。 Mice were age- and sex-matched and randomly assigned into groups before infection and treatment. Exclusion criteria for in vivo studies were as follows: If a given mouse unexpectedly did not lose weight after infection and their virus lung titers were more than 2 log₁₀低于组的均值,这表明,感染效率低下,老鼠被审查的所有相关数据。

动物保健和伦理语句

功效进行了研究在动物生物安全三级设施在北卡罗来纳大学教堂山分校。协议下的所有作品进行机构批准的动物保健和使用委员会在北卡罗来纳大学教堂山分校(IACUC协议# 16 - 284)根据指导方针设定的评估和认证协会的实验动物保健和美国农业部。

病毒

体外研究MERS-CoV记者病毒表达nanoluciferase受雇(MERS-nLUC)¹⁷。MERS-nLUC股来自维罗81个细胞的分子克隆通过电穿孔(ccl写明ATCC - 81)和隔离病毒通过文化上层的收获⁵³。简单,编码MERS-nLUC cDNA基因组DNA片段a - f的结扎创建全长cDNA,当时用作体外转录模板。完整的基因组RNA当时electroporated股票收益率为维罗- 81细胞重组病毒。合成证券81年两次通过州立生成工作股票(1.6 e + 07空斑形成单位/毫升)为我们的研究。野生型MERS-CoV抗病毒疗效对比研究是来自我们的EMC 2012感染性克隆如上所述获得股票工作的效价3 e + 07空斑形成单位/毫升⁵³。在体内研究中,我们利用鼠标改编MERS-CoV通道35克隆4即M35C4)²⁴。即M35C4 12氨基酸编码变更以及单核苷酸5ʹUTR和一个大的变化在ORF4b / ORF5删除。这种病毒是通过串行通道分离克隆生成的MERS-CoV老鼠。在老鼠35通道后,病毒空斑纯化和克隆4维罗CCL81细胞获得扩大两倍于我们的工作的股票。工作股票(1.1 e + 08年空斑形成单位/毫升)成立于病毒收集媒介(Optimem (Gibco), 3%胎克隆II血清产品(Hyclone)和抗生素/抗真菌的(Gibco)和非必需氨基酸(Gibco))。

化合物在体外研究和制定

Remdesivir (RDV) lopinavir (LPV),例如(RTV)在100% DMSO和可溶性基提供了科学、公司重组人干扰素β(IFNb)蛋白质从研发系统(8499 if010 / CF,购买2.8×10⁸IU / mg相比标准)和可溶性无菌水推荐。

在Calu-3细胞体外有效性和细胞毒性

来确定病毒复制动力学和RDV易感性之间的相似野生型(WT) 2012和MERS-nLUC MERS-CoV EMC,我们进行比较抗病毒化验人类肺上皮细胞系,Calu-3 2 b4(请提供的简博士曾德克萨斯大学医学分支)。Calu-3 2 b4维护DMEM (Gibco), 20%胎牛血清(的边后卫,Hyclone),和1×Antibiotic-Antimycotic (A / A, Gibco)。感染前短暂,48 h, Calu-3细胞在4.3 e +镀04 /。感染前24小时,培养基是用新鲜的交换媒介。Calu-3 2 b4细胞感染了WT EMC 2012或MERS-nLUC感染复数(MOI) 0.1 1 h在37°C细胞被洗,和RDV稀释剂量反应的两个步骤在媒体(DMEM, 10%的边后卫DMEM 1 x a / a)在重复添加。细胞培养在37°C公司5%₂24 h后100µl媒体从每个收集和化验病毒空斑实验生产的州立CCL81细胞。简单地说,500000维罗CCL81细胞/被播种在six-well盘子。第二天,介质被移除,连续稀释的样本添加每板(10⁻¹-10年⁻⁶稀释在37°C)和孵化1 h,之后井是显示1×DMEM,胎儿克隆2血清,5% 1×A / A, 0.8%琼脂糖。三天后,斑块枚举生成血小板/毫升的价值。的集成电路₅₀GraphPad棱镜中定义的值是7 (GraphPad)。

为了更好地理解RDV的抗病毒活动,LPV, RTV IFNb,或组合LPV /退货或LPV /退货/ IFNb,我们进行了有效性和细胞毒性分析人类肺上皮细胞(Calu-3)。细胞被镀如上所述,感染MERS-CoV表达nanoluciferase (MERS-nLuc)一式六份的莫伊0.08 1 h在存在剂量反应的药物如下所述。1 h(感染后,病毒被删除,文化与媒介冲洗一次,和新鲜的培养基添加包含稀释药物。RDV(即。,GS-5734, stock at 20 mM) was serially diluted in 100% DMSO in twofold increments to obtain a ten-point dilution series. Human IFNb (R + D Systems, 200 µg/mL or 5.6 × 10⁷国际单位/毫升)同样在PBS稀释。LPV(10毫米股票)和性能(10毫米股票)同样在DMSO溶液稀释,尽管各种数量的股票直接复合添加媒体获得的四大稀释十点曲线(µM 50µM 25µM, 12.5, 6.25µM)。模型的固定剂量组合的抗病毒效果LPV /退货用于治疗艾滋病毒,我们进行抗病毒化验的固定组合LPV /退货(体重:体重的比例4:1或摩尔比4.6:1)。LPV / RTV组合连续稀释100% DMSO在双重的增量,但混合股票直接添加到媒体获得以上四大浓度相似。这些研究在4独立重复实验。

LPV模型/退货结合IFNb,我们首先进行比较平衡透析(CED)²³在10%的边后卫和确定5µM LPV包含细胞培养基给相同数量的自由(即。蛋白质的束缚)LPV人血浆中的浓度达到最大(C_马克斯,即,15 µM). We then combined a dose response of human IFNb with a fixed concentration of LPV/RTV (molar ratio of 4.6:1, (5 µM Lopinavir and 1.1 µM Ritonavir) based on the human plasma equivalent maximal concentration of LPV as determined by CED (i.e., 5 µM). Thus, this study was aimed at determining if the maximal amount of LPV attainable in humans provided an additive or synergistic antiviral effect when combined with IFNb. All studies were performed in cell culture medium containing 10% FBS. DMSO (0.5%) was constant in all conditions. At 48 h post infection (hpi), virus replication was quantified on a Spectramax (Molecular Devices) via nanoluciferase assay (NanoGlo Promega). Values from replicate wells per condition were averaged and compared with controls to generate a percent inhibition value for each drug dilution. The IC₅₀GraphPad棱镜中定义的值是7 (GraphPad)有50%的浓度降低病毒复制使用UV-treated MERS-nLUC抑制(100%)和车辆单独抑制(0%)控制。测量细胞毒性,细胞暴露在相同的药物稀释和控制有效性的研究,但在缺乏病毒感染。经过48小时的曝光,细胞生存能力取决于Cell-Titer-Glo Spectramax化验(Promega)和量化。类似的数据获得了至少三个独立的实验。

体内研究配方

RDV可溶性在2.5毫克/毫升车辆中含12% sulfobutylether-β-cyclodextrin钠盐在水中(盐酸/氢氧化钠)pH值5.0。LPV(32毫克/毫升)退货(8毫克/毫升)是随着车辆包含90%的丙二醇,10%乙醇。LPV比RTV举行4:1(体重:体重),所有的研究。鼠标IFNb重组蛋白质从研发系统购买(8234 mb / CF, 1.2×10⁹国际单位/ mg校准对小鼠IFN-beta国际标准)PBS的体内研究和重组。

动物

MERS-CoV结合人类受体dipeptidyl肽酶4 (DPP4)获得进入细胞,和两个残留物(288和330)的绑定接口鼠标直接同源防止感染的老鼠。我们最近开发了一个鼠标鼠标DPP4 MERS-CoV通过突变模型在288年和330年通过CRISPR / Cas9因此人性化受体(hDPP4容易感染MERS-CoV)和渲染老鼠²²。小鼠血清羧酸酯酶1 c (Ces1c)大大降低RDV稳定。因此,必须执行所有体内研究老鼠基因删除Ces1c (Ces1c^−−/014096年,股票,杰克逊实验室)¹⁷。为了执行体内疗效研究RDV和MERS-CoV老鼠,我们生成的人性化DPP4老鼠缺乏Ces1c表达式(C57BL / 6 jCes1c^−−/hDPP4杰克逊实验室物料编号403188)。简单地说,我们的C57BL / 6 jhDPP4老鼠是重新推导出使用Ces1c^−−/卵母细胞。由此产生的杂合的老鼠了Ces1c^−−/小鼠产生纯合子小鼠Ces1c删除(Ces1c^−−/)和杂合的hDPP4等位基因。合成基因分型和繁殖后代来生成创始人的纯合子Ces1c^−−/和hDPP4。

MERS-CoV发病机制中Ces1c^−−/和hDPP4老鼠

以确定MERS-CoV的发病机理Ces1c^−−/和hDPP4是类似于父母的hDPP4行,我们在新创建的发病机理进行研究Ces1c^−−/和hDPP4线。类似的数字(N= 9 /性/组)23-24-week-old雄性和雌性小鼠被随机分配给每个感染组。小鼠麻醉与氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物,然后鼻内感染5 e + 04或5 e + 05 pfu即M35C4 50µl病毒收集媒介。监控发病率,小鼠体重每天6 dpi。老鼠开始损失> 20%的体重被isofluorane过量人道地牺牲了。为了更好地理解的大小MERS-CoV复制和疾病的典型指标,我们感染12 9-12-week-old雌性老鼠5 e + 04即M35C4 50µl病毒收集媒介上面做。每天监控发病率,小鼠体重。每个队列的一个子集是随机分配的肺功能测量全身体积描记法(WBP,数据科学国际)²⁸。6日dpi,动物被异氟烷过量,肺出血、肺得分和劣质右叶冻结在−80°C的病毒通过空斑实验滴定如上所述²²。肺出血是严重病理表型容易肉眼观察到由病毒复制的程度的颜色肺改变从粉色到深红色^25,26。大左叶放在10%缓冲福尔马林和储存在4°C 1 - 3周,直到组织学切片和分析。肺切片,苏木精和伊红染色以及MERS-CoV抗原(主要抗体1:50 0,从小鼠血清接种MERS-CoV核衣壳抗原)染色法是由动物组织病理学和实验室医学核心UNC。

干扰素β药效学研究

生成一个药代动力学和药效学IFNb (PK / PD)的关系,我们皮下注射小鼠IFNb (R + D系统)18 - 20周前男性和女性Ces1c^−−/或Ces1c^−−/hDPP4老鼠。人类等效剂量小鼠的计算是基于推荐的剂量策略Betaseron(人类IFNb 013万国际单位(个人)/公斤每隔一天)⁵⁴。人类的剂量是12.3乘以为了得到鼠标等效剂量的1.6个人/公斤或4.8 e4 IU / 30 g鼠标(40µg / 30 g鼠标)基于身体表面积⁵⁵。首先,我们相比1×2.5×人类等效剂量的IFNb军团(NCes1c = 20 /组)^−−/老鼠。在2、4、8、12 h治疗后,每组5老鼠人道安乐死,和等离子snap-frozen−80°C,和外周血单核细胞(PBMC)是孤立的,在试剂盒LS(热费希尔)和存储在−80°C到分析。第二,我们比较了反应人类等效剂量的IFNb 25×(即。40个人/公斤或1.2个人/ 30 g鼠标(1000µg / 30 g鼠标))Ces1c^−−/或Ces1c^−−/hDPP4老鼠(N= 25 /组),以确保这些鼠标线同样的回应。在0、2、4、8和12 h治疗后,小鼠人道安乐死和等离子和PBMCs孤立和存储如上所述。此外,在4和8 h治疗后肺孤立并存储在RNAlater(热费希尔)−80°C到分析。总RNA分离使用Zymo研究从PBMCs Direct-Zol RNA迷你工具包。肺组织均质在试剂盒(热费希尔)和总RNA PBMCs孤立的类似。响应IFNb治疗在PBMCs量化存在的典型的干扰素刺激基因MX dynamin-like GTPase 1 (mx₁)TaqMan试验(热费希尔Mm00487796_m1)使用TaqMan快速病毒互译大师混合(热费希尔)。mx₁管家基因的基因表达与信号glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH、热费希尔Mm99999915_g1)和褶皱变化/模拟或时间0处理后计算的∆∆Ct方法⁵⁶。监控诱导干扰素诱导蛋白表达,我们量化水平的鼠标IFN-gamma诱导蛋白10 (IP10 CXCL-10)等离子体通过ELISA(表达载体)。

预防体内疗效研究

对所有药物研究中,老鼠开始损失> 20%的体重重达两次,每天接受额外的目视检查临床症状(耸起,易于流动,嗜睡,等等)。小鼠体重下降< 70%的开始都被立即实施安乐死。死亡率被定义为意外发现老鼠死在笼子里。

一些预防性研究确定药物治疗方案进行可能影响病毒的复制和/或疾病进展。在最初的研究中,我们只RDV和汽车相比。简而言之,组9-12-week-old男性和女性Ces1c^−−/hDPP4被随机分配到组(n= 7 - 9)和适应了5 - 7天达到三级生物安全水平的实验室(BSL3)。治疗车(见上图)或RDV(25毫克/公斤,皮下注射)开始一天前感染。MERS-CoV感染,小鼠麻醉与氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物,然后鼻内感染5 e + 04或5 e + 05 pfu即M35C4 50µl病毒收集媒介。每天监控发病率,小鼠体重。4或6 dpi,动物被异氟烷过量,肺出血(如上所述),得分和下叶是冻结在−80°C的病毒通过空斑实验滴定如上所述²²。大左叶放在10%缓冲福尔马林和储存在4°C 1 - 3周,直到解剖和组织学分析。肺切片,苏木精和伊红染色,以及MERS-CoV抗原染色如上所述进行的动物组织病理学和实验室医学核心UNC。由于增加了感染的变化和结果在雄性老鼠,所有进行研究后只雌性老鼠。

然后我们进行预防性的两项研究确定LPV / RTV-IFNb或独自IFNb可能影响病毒的复制或疾病进展。研究旨在反映治疗效果研究。在第一项研究中,随机分配组(n11-13-week-old = 9)Ces1c^−−/hDPP4雌性老鼠,我们车辆相比,LPV / RTV-IFNb或IFNb孤单。所有治疗都开始一天前感染。MERS-CoV感染,小鼠麻醉的氯胺酮和甲苯噻嗪然后鼻内感染5 e + 04 pfu即M35C4 50µl病毒收集媒介。人类的等效剂量的coformulation LPV(160毫克/公斤)和室温硫化(40毫克/公斤)在5毫升/公斤管理通过口服填喂法每天一次。组织接收1×人类等效剂量的IFNb (R + D系统,1.6个人/公斤或4.8 e4 IU / 30 g鼠标(40µg / 30 g鼠标))通过皮下注射每隔一天服用。在LPV控制潜在的汽车影响/ RTV-IFNb组,我们服用口服车辆(丙二醇90%和10%乙醇)每日皮下注射PBS每隔一天。RDV(25毫克/公斤)在10毫升/公斤管理通过皮下注射每日两次。作为一个控制RDV,另一组给予皮下。老鼠体重每日监控发病率。(一个子集n= 4)每组随机分配为肺功能测量全身体积描记法(WBP,数据科学国际)²⁸。2日dpi,每组三种动物被isofluorane过量,肺出血(如上所述),得分和大叶是冻结在−80°C的病毒通过空斑实验滴定如上所述²²。6日dpi,动物被杀,完成2 dpi处理。

第二个预防性研究旨在优化潜在影响IFNb基于上述PK / PD研究。鉴于干扰素刺激基因表达高峰之间的2和4 h后管理,在本研究中所有组接收IFNb疗法在治疗开始前2 h感染,之后每隔一天。此外,最大化潜在干扰素效应只IFNb组,我们利用一个25×人类等效剂量而不是利用1×等效剂量做在前面的预防研究。在随机分配12-14-week-old组Ces1c^−−/hDPP4雌性老鼠,我们车辆相比,LPV / RTV-IFNb低(1.6个人/公斤或4.8 e4 IU / 30 g鼠标(40µg / 30 g鼠标)),LPV / RTV-IFNb高(40个人/公斤或1.2个人/ 30 g鼠标(1000µg / 30 g鼠标)),单独和IFNb高。LPV / RTV剂量数量和进度是类似于先前的研究。控制剂量效应,vehicle-treated老鼠收到车辆口服和皮下PBS镜子IFNb注射。同样,IFNb组口服车镜,前口头组。类似于之前的研究,RDV及其车辆管理控制。MERS-CoV感染进行完全按照先前的研究。老鼠体重每日监控发病率。与以往的研究不同的是,肺功能测量WBP(国际)科学数据进行所有组中的所有老鼠直到2 dpi,之后这些测量进行所有剩余老鼠每组(n= 6)²⁸。2日dpi,每组三种动物被isofluorane过量,肺出血(如上所述),得分和大叶是冻结在−80°C通过空斑实验对病毒滴定²²。6日dpi,动物被杀,完成2 dpi处理。

治疗体内疗效研究

为一对一的治疗效果研究比较RDV LPV / RTV-IFNb,女性9-12-week-oldCes1c^−−/hDPP4被随机分配到治疗组(n= 10 - 12)。适应在BSL3后5 - 7天,小鼠麻醉的氯胺酮和甲苯噻嗪然后鼻内感染5 e + 04 pfu即M35C4 50µl病毒集合中(见上图)。一天后感染,治疗开始。LPV /退货组,老鼠管理人类的等效剂量的coformulation LPV(160毫克/公斤)和性能(40毫克/公斤)5毫升/公斤每天一次通过口服填喂法。动物收到LPV /退货也收到鼠标IFNb (R + D系统)每隔一天在通过皮下注射两剂之一。IFNb高剂量组管理人类等效剂量的25×40个人/公斤或1.2个人/ 30 g鼠标(1000µg / 30 g鼠标)。IFNb低剂量组管理人类等效剂量为1×1.6个人/公斤或4.8 e4 IU / 30 g鼠标(40µg / 30 g鼠标)。在LPV控制潜在的汽车影响/ RTV-IFNb组,我们服用口服每天车辆(丙二醇、乙醇),皮下注射PBS每隔一天。RDV(25毫克/公斤)在10毫升/公斤管理通过皮下注射每日两次。控制RDV,另一组给予皮下车辆作为一个控制。 To monitor morbidity, mice were weighed daily. A subset of each cohort was randomly assigned for pulmonary function measurements by WBP (Data Sciences International) daily²⁸。6日dpi,动物被异氟烷过量,肺出血(如上所述),得分和大叶是冻结在−80°C的病毒通过空斑实验滴定如上所述²²。下叶放在10%缓冲福尔马林和储存在4°C 1 - 3周,直到解剖和组织学分析。肺切片,苏木精和伊红染色,以及MERS-CoV抗原染色如上所述进行的动物组织病理学和实验室医学核心UNC。

急性肺损伤的组织学评估工具

我们使用两个不同的和补充定量组织学工具来确定抗病毒治疗降低与肺损伤的病理特性。分析和得分都由一个委员会认证兽医病理学家被蒙蔽到治疗组。

第一个工具是一个肺损伤评分系统,是由美国胸科学会为了帮助量化阿里的组织学特征观察小鼠模型和提高他们的翻译对人类²⁶。盲法的方式,我们选择三个随机病变的肺组织高功率(60×),这是得分如下:(a)中性粒细胞在肺泡空间(= 1 = 0,1 - 5细胞,细胞> 5 = 2),(B)中性粒细胞在间隙空间/ septae(= 1 = 0, 1 - 5细胞,细胞> 5 = 2),(C)透明膜(= 0,没有一个膜= 1,> 1膜= 2),(D)蛋白质的碎片在空中空间(= 1 = 0,没有一个实例,实例> 1 = 2),(E)肺泡间隔增厚(< 2×模拟厚度= 0,2 - 4×模拟厚度= 1 > 4×模拟厚度= 2)。获得每个字段,肺损伤评分a e的分数然后放入下面的公式,其中包含乘数,分配不同程度的重要性对于每个疾病表型的状态。:分数= [(20 x) + (14 x B) + (7 x C) + (7 x D) + (2 x E)] / 100。三个字段/鼠标的分数平均获得最后得分从0到和包括1。

第二个组织学量化肺损伤的工具是由施密特et al .,在他们使用这个工具来量化弥漫性肺泡损伤(爸爸)RSV感染的老鼠^29日。爸爸是阿里的病理特点^26,29日,46。类似的实现ATS工具上面所描述的那样,我们得分三个随机的病变的肺组织高功率(60×)蒙蔽的方式如下:1 =没有细胞脱落、坏死,2 =不常见的孤独的细胞脱落,坏死(1 - 2焦点/字段),3 =多病灶的(3 +疫源地)细胞脱落和坏死少见间隔墙透明样变化,或4 =多病灶的字段(> 75%)细胞脱落和坏死常见和/或突出的透明膜。三个字段/鼠标的分数平均得到最后一个爸爸得分/鼠标。

裂解caspase-3抗原定量

积极和裂解形成caspase-3可以通过免疫组织化学方法有区别。肺组织部分染色了裂解caspase-3抗原(1:50 0、细胞信号# 9664)动物组织病理学和实验室医学核心UNC。UNC平移病理学实验室(TPL)核心,彩色幻灯片进行扫描一个Aperio ScanScope XT(徕卡生物系统)20 x能力目标和每像素相机分辨率为0.4942微米。图像分析在定义师XD 10/24/11与组织工作室2.7版本。在每一个组织部分,总面积计算。单个细胞检测最初基于核的苏木精染色,在组织和细胞边界插值工作室。每个单元格就得分为裂解半胱天冬酶染色强度基于线性低,规模中等和高规模。的总和的百分比高,中等caspase-3染色阳性画我们的研究。组织的病变小鼠小肠被用作积极控制。

统计分析

所有统计数据分析Graphpad棱镜7。每个端点确定统计学意义与特定的统计测试。对于每个测试,P值< 0.05被认为是显著的。特定的测试,以确定统计学意义在每个确定的传奇。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与这篇文章有关。

无花果的主要数据。1- - - - - -7,补充无花果。1- - - - - -6源数据文件中提供。

我们要感谢马博士达芙妮老鼠繁殖的出色的组织工作。动物组织病理学和/或临床服务是由动物组织病理学和实验室医学核心在北卡罗莱纳大学,由国家癌症中心的核心支持部分支持格兰特(5 p30ca016086-41) UNC Lineberger综合癌症中心。我们感谢宾利Midkiff UNC的临床病理实验室(TPL)专家的技术援助。UNC TPL的支持部分由NCI (5 p30ca016086-42), NIH (U54-CA156733), NIEHS (5 e ES010126-17), UCRF, NCBT (2015 - idg - 1007)。我们要感谢以下资金来源,抗病毒药物发现和开发中心(5 u19ai109680),由美国国立卫生研究院的合作(5 r01ai132178),和一个NIAID R01款项(AI108197)。A.C.S.收到基科学支持的合同在体外和体内疗效研究报道。

作者指出

1. 这些作者的贡献同样:蒂莫西·p·Sheahan艾米·c·西姆斯。

从属关系

1. 流行病学、北卡罗莱纳大学教堂山分校,教堂山,数控,美国

   蒂莫西·p·Sheahan艾米·c·西姆斯萨拉·r·Leist约翰赢了,亚历山德拉•谢弗阿丽亚娜j·布朗和拉尔夫·s .气压

2. 病理学和实验室医学系,北卡罗莱纳大学教堂山分校,数控,美国

   斯蒂芬妮·a·蒙哥马利

3. 吉利德科技公司,培育城市,加州,美国

   艾莉森·豪格,大流士Babusis迈克尔·o·克拉克杰米•e . Spahn劳拉·鲍尔斯科特卖家,丹尼尔波特,欢乐y .冯,托马斯Cihlar &罗伯特·乔丹

4. Pediatrics-Infectious疾病、病理学、微生物学和免疫学,范德比尔特大学医学中心,纳什维尔,TN,美国

   马克·r·丹尼森

贡献

A.C.S. J.Y.F.设计体外药效研究。A.C.S.,J.Y.F., and T.P.S. executed and/or analyzed in vitro efficacy studies. T.P.S., D.B., A.H., R.J., T.C., and R.S.B. designed in vivo efficacy studies. T.P.S., A.J.B, J.W., A.S., and S.R.L. executed and analyzed in vivo efficacy studies. A.S. and S.R.L. performed whole-body plethysmography for in vivo studies. S.A.M. assessed all lung pathology. M.O.C., J.E.S., L.B., and S.S. were responsible for synthesis, scale-up and formulation of small molecules. T.P.S., A.C.S., J.Y.F., R.J., A.H., D.P., T.C., M.D., and R.S.B. wrote the paper.

相应的作者

对应到蒂莫西·p·Sheahan或拉尔夫·s .气压的。

相互竞争的利益

A.C.S.收到基科学支持的合同在体外和体内疗效研究报道。这些作者基科学和员工持有股票在基列科学:艾莉森•霍格大流士Babusis,迈克尔·o·克拉克,杰米•e . Spahn劳拉·鲍尔斯科特卖家,丹尼尔波特,欢乐y,托马斯Cihlar,罗伯特·乔丹。

同行审查的信息自然通讯感谢匿名评论者对他们的贡献的同行评审工作。同行审查报告。

出版商的注意施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。

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