皮质类固醇抑制的抗病毒免疫增加细菌负荷在慢性阻塞性肺病急性加重和粘液生产gydF4y2Ba

吸入激素(ICS)疗效有限在减少慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重和增加肺炎风险,通过未知的机制。鼻病毒沉淀最恶化,增加对继发性细菌感染的易感性。在这里,我们表明,ICS丙酸(FP)损害先天和后天抗病毒免疫反应导致延迟病毒间隙和之前的未被确认的增强的粘液,不利影响抗菌肽分泌受损,增加肺部细菌负荷加重占据。外生interferon-β逆转这些影响。FP抑制干扰素可能通过抑制TLR3和rig - i virus-sensing通路。老鼠缺乏我interferon-α/β受体类型(gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba})抑制抗菌肽和增强粘蛋白反应鼻病毒感染。本研究确定了I型干扰素的中央监管机构抗菌免疫和粘液生产。抑制干扰素的ICS在病毒诱导慢性阻塞性肺病急性加重可能介导肺炎风险和吸入interferon-β疗法可以保护提出了建议。gydF4y2Ba

急性发作的呼吸道疾病发病率和死亡率的主要原因。鼻病毒(旅游房车)发作的最常见原因,和实验挑战研究哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)确认之间的因果角色RV感染和恶化gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba}。房车的先天免疫反应包括生产I型和III干扰素(ifn)气道上皮细胞和免疫细胞。干扰素对病毒感染的反应在哮喘受损gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba}和慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}和相关恶化严重程度增加gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

吸入激素(ICS)经常规定治疗气道疾病但仅略有降低COPD恶化的频率gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}。临床试验报告增加肺炎风险ICS使用在慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}这种效应,但机制不明。更严重的RV感染继发细菌感染在慢性阻塞性肺病的频率增加gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba,表明增加肺炎风险可能的后果严重程度的增加最初的病毒感染。gydF4y2Ba

新出现的证据表明,糖皮质激素可能损害天生的抗病毒免疫反应gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba},但没有研究已经评估了ICS对宿主抗病毒和抗菌反应的影响特别是在慢性阻塞性肺病,疾病与糖皮质激素不敏感gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。精确的机制,包括I型干扰素的作用,潜在的副作用尚未阐明。gydF4y2Ba

这里,使用鼻病毒感染和rhinovirus-induced COPD恶化的模型,我们表明,常用的ICS丙酸(FP)损害先天和后天抗病毒免疫反应导致延迟病毒清除,粘液分泌过多,增加肺部细菌负荷。我们的研究强调核心地位的I型干扰素调节抗菌免疫和粘液分泌急性加重占据。与免疫抑制相关的副作用,ICS提供一种机制来解释肺炎的风险增加相关的慢性阻塞性肺病的使用。gydF4y2Ba

FP影响转录因子调节免疫力房车gydF4y2Ba

确定行动的有效性和持续时间的ICS FP治疗的小鼠模型,我们评估了糖皮质激素受体(GR)激活通过测量核GR-DNA绑定。管理20μg FP,类似于在以前的动物研究gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}GR激活明显增加,而低剂量没有(图10倍。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。RV感染激活immune-regulating转录因子,包括核因子kappa-B (NFκB),促炎反应所需RV感染gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba和干扰素监管因素3 (IRF-3),所需的抗病毒反应gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。我们评估了FP管理局(图的影响。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)房车激活的转录因子在小鼠肺。FP抑制肺NFκB p65激活RV-infected老鼠(图8 h后感染。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。IRF-3,激活房车发生在2 h后感染和显著的抑制也FP-treated老鼠(图中观察到。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

ICS抑制先天免疫和病毒损害控制gydF4y2Ba

我们下一个评估的影响FP天生的抗病毒免疫反应RV感染的老鼠。FP抑制房车诱导的肺gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba信使rna(~ 75% ~ 60%减少,分别无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)和IFN-αIFN-β和IFN-λ2/3 BAL蛋白(~ 85% ~ 80% ~ 50%减少,分别无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。FP也抑制房车诱导干扰素刺激基因(isg) 2′5′gydF4y2Ba-oligoadenylate合成酶gydF4y2Ba(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba′gydF4y2Ba5gydF4y2Ba′gydF4y2Ba美洲国家组织gydF4y2Ba),gydF4y2Ba蛋白质kinase-RgydF4y2Ba(gydF4y2BaPKRgydF4y2Ba),gydF4y2BaviperingydF4y2Ba和CXCL10 / IP-10蛋白质BAL(~ 75% ~ 45% ~ 60% ~ 80%减少,分别无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

I型干扰素受体信号需要气道自然杀伤(NK)细胞反应旅游房车gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。总数量减少和激活(CD69表达)NK细胞中观察到RV-infected老鼠FP(图处理。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。符合天生的抗病毒反应的抑制(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba),《外交政策》治疗导致延迟病毒与RV RNA复制增加间隙FP-treated老鼠8点,24和48 h后感染(最大效应大小三倍8点48 h)和水平的提高传染性病毒在24小时(无花果。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

确认其他ICS化合物除了FP还能削弱抗病毒免疫,我们评估的影响另一个常用的代理,布地奈德,RV感染的老鼠。管理20μg布地奈德同样抑制房车诱导的肺gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba和增加RV RNA(补充图gydF4y2Ba1模拟gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP损害RV感染的适应性免疫反应gydF4y2Ba

我们接下来确定FP对RV感染的适应性免疫反应的影响(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。道达尔和激活CD4的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞被抑制在FP-treated老鼠(图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)的血清水平RV-specific IgG1 IgG2a抗体和中和抗体(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP抑制病毒诱导气道炎症gydF4y2Ba

FP政府之前RV感染(补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)抑制细胞与中性粒细胞数目减少气道炎症,淋巴细胞和巨噬细胞中观察到BAL(补充图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。FP也抑制房车诱导BAL嗜中性粒细胞趋化因子处于受控/ KC和CXCL2 / MIP-2和淋巴细胞趋化因子CCL5 /咆哮(补充图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP增强粘蛋白生产RV-infected老鼠gydF4y2Ba

我们评估的影响FP BAL液体浓度的黏蛋白MUC5AC MUC5B,主要气道粘液糖蛋白成分gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。RV感染仅增加气道黏液糖蛋白和生产都显著进一步增加了FP治疗~ MUC5B MUC5AC和85% ~ 80%,无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP损害抗菌反应RV-infected老鼠gydF4y2Ba

进一步评价不良反应与FP政府RV感染期间,我们评估肺部细菌负荷的测量细菌16 s rRNA。FP增加细菌负荷(~ 2.5倍)RV-infected老鼠(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。FP也抑制房车诱导分泌leukoprotease抑制剂(SLPI)蛋白质(~ 50%减少,无花果。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba),一个抗菌肽(AMP)与防止继发性细菌感染RV感染在慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。FP政府也抑制房车诱导促炎细胞因子il - 6和TNF(补充图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)和AMP pentraxin-3,但没有影响房车诱导其他安培α-defensin 1,β-defensin 2或mannose-binding lectin-2(补充图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)。安培表面活性剂protein-D和溶菌酶没有显著诱导由FP RV感染和抑制小鼠(补充图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP抑制TLR3和RIG-I-mediated干扰素反应gydF4y2Ba

调查机制,FP抑制先天和后天免疫反应,我们下一个评估模式识别受体(PRR)和干扰素信号通路被人类BEAS-2B FP抑制支气管上皮细胞。在小鼠体内,观察到FP治疗BEAS-2B细胞的体外抑制房车感应gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。双链RNA中间体形式在房车复制与激活PRRs TLR3 rig - i和mda - 5gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。FP处理明显抑制诱导gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2BaTLR3(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)和rig - i受体激动剂(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba对mda - 5),但没有影响受体激动剂(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

TLR3诱发干扰素表达通过衔接分子行动domain-containing适配器诱导IFN-β(TRIF),而mda - 5和rig - i信号通过线粒体抗病毒信号蛋白(小牛)gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。因此我们转染BEAS-2B细胞gydF4y2BaIFNβgydF4y2Bapromoter-reporter构造和使用质粒编码刺激持续活跃TRIF(ΔTRIF)或小牛(ΔMAVS)。转染ΔTRIF或ΔMAVS显著增加gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba推广活动(图。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)。符合我们发现FP抑制TLR3和RIG-I-mediated干扰素诱导,治疗与FP镇压ΔTRIFΔMAVS-inducedgydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba推广活动(图。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

二次扩增病毒诱导干扰素释放包括I型干扰素作用以自分泌的方式通过干扰素α/β受体(IFNAR)进一步刺激诱导干扰素和isggydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。评估FP对干扰素信号的影响,我们用重组IFN-βBEAS-2B刺激细胞,发现没有影响的FP IFN-βisg的感应gydF4y2Ba2gydF4y2Ba′gydF4y2Ba5gydF4y2Ba′gydF4y2Ba美洲国家组织gydF4y2Ba,gydF4y2BaviperingydF4y2Ba和gydF4y2Bamyxovirus抵抗一个gydF4y2Ba(gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。因此,示范FP抑制干扰素仅限于对初始virus-sensing通路的影响,而不是通过IFNAR二级放大。干扰素信号通过IFNAR诱发STAT1/2磷酸化。因此,为了进一步证实了这一发现,immunodetection STAT1磷酸化的Y701 (pY701)和STAT2磷酸化在Y690 (pY690)调查与重组IFN-βBEAS-2B细胞刺激。FP没有影响IFN-β感应STAT1或STAT2磷酸化(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。我们另外确认这些体外研究结果表明,FP政府没有对肺的影响研究小组感应IFN-β政府重组后小鼠(无花果。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IFNβ减少病毒负荷和逆转FP粘蛋白增加gydF4y2Ba

证明抑制干扰素的FP功能相关病毒负荷和粘蛋白产量的增加,我们管理重组IFN-β结合FP治疗和RV感染(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。为了清楚起见,选择实验小组在无花果。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba和完整的数据集在补充图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba。IFN-β逆转FP-mediated抑制肺gydF4y2Ba2gydF4y2Ba′gydF4y2Ba5gydF4y2Ba′gydF4y2Ba美洲国家组织gydF4y2Ba和gydF4y2BaviperingydF4y2Ba表达式(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)和BAL CXCL10 / IP-10和IFN-λ2/3蛋白质浓度(无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。相比FP-treated RV-infected老鼠,管理IFN-βFP和感染治疗后显著降低病毒负荷水平在治疗病毒感染小鼠(无花果。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。IFN-β治疗另外预防FP upregulation BAL MUC5AC糖蛋白水平(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IFNβ逆转FP抗菌免疫损伤gydF4y2Ba

RV-induced COPD急性加重继发性细菌感染是由病毒诱导中性粒细胞elastase-mediated安培的退化,包括SLPIgydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。因此,我们调查是否IFN-β可以防止这种情况发生。IFN-β待遇进一步提高FP落下帷幕中性粒细胞数量和抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的水平(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba),扭转了FP抑制BAL SLPI水平和预防FP细菌负荷的增大(图gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)RV-infected老鼠。然而,IFN-β治疗没有影响FP抑制抗菌介质il - 6、TNF或pentraxin-3(补充图。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}改变了老鼠粘蛋白和SLPI对房车的反应gydF4y2Ba

确认抑制干扰素的相关功能增强粘蛋白和抗菌免疫受损,我们评估MUC5AC SLPI表达RV-infected老鼠缺乏IFNAR信号(gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba})(图。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)。BAL MUC5AC在RV-infected蛋白质浓度gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠增加(图。gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)。确认IFNAR信号在RV感染SLPI生产也很重要,我们测量BAL SLPI RV-infected蛋白质gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠和观察浓度降低(图。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IFNβ不恢复和减少MUC5B获得响应gydF4y2Ba

没有观察到治疗IFN-βFP适应性免疫反应的抑制BAL CD4没有区别gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞数量或serum-neutralising RV-infected小鼠抗体水平接受FP和IFN-β与FP(补充图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。对比效果观察MUC5AC(无花果。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba),重组IFN-β也没有影响FP增强BAL MUC5B蛋白质含量(补充图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP抑制干扰素,增加粘液分泌细胞在慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba

我们下一个调查类似的负面影响是否FP发生在细胞慢性阻塞性肺病患者。我们评估FP的影响在气道上皮细胞(aec)对9名患者进行诊断取样黄金第三阶段的疾病,在气液界面培养。证实了质量文化的纤毛上皮,食用细胞,pseudostratified trans-epithelial电阻的结构和评估(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。人口/病人的临床特征表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。FP显著抑制早期房车感应gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5 a - cgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。FP也抑制了房车的感应gydF4y2Ba2gydF4y2Ba′gydF4y2Ba5gydF4y2Ba′-gydF4y2Ba美洲国家组织gydF4y2Ba,gydF4y2BaPKRgydF4y2Ba和gydF4y2BaviperingydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5 d-fgydF4y2Ba),另外抑制IFN-βIFN-λ1/3和CXCL10 / IP-10上层清液中蛋白质的慢性阻塞性肺病原子能委员会(无花果。gydF4y2Ba5胃肠道gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

符合我们的发现FP政府增强粘蛋白生产RV感染的老鼠,我们也注意到更多的粘液染色与FP治疗慢性阻塞性肺病RV-infected人类原子能委员会gydF4y2BangydF4y2Ba= 8学科来说,样本用于组织学分析(无花果。gydF4y2Ba5 jgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP损害干扰素反应在慢性阻塞性肺病恶化小鼠模型gydF4y2Ba

我们调查的影响FP RV-induced恶化COPD-like疾病小鼠模型的体内RV-exacerbated elastase-induced肺气肿(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)许多人类病毒诱导慢性阻塞性肺病急性加重的特点又一次重复gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。FP抑制房车诱导IFN-β和IFN-λ2/3蛋白质BAL elastase-treated小鼠(无花果。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba),增加了病毒在感染后的天1和4负载(无花果。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

FP抑制房车诱导BAL总细胞和淋巴细胞,但对中性粒细胞(图没有显著影响。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)。FP也抑制房车诱导淋巴细胞趋化因子CCL5 /咆哮和CXCL10 / IP-10拜尔(无花果。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba),另外抑制房车诱导il - 6、TNF和SLPI(无花果。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba)。FP也增强房车诱导BAL MUC5AC蛋白质(图。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba(图)在肺和粘液染色部分。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba),但没有显著影响BAL MUC5B蛋白质含量(无花果。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

ICS使用在人类慢性阻塞性肺病恶化带来的不利影响gydF4y2Ba

确认我们的研究结果的临床意义,我们测量的抗病毒反应痰样本一群40 COPD患者,18集的病毒诱导慢性阻塞性肺病急性加重发生(鼻病毒gydF4y2BangydF4y2Ba= 11,冠状病毒gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,RSVgydF4y2BangydF4y2Ba= 2,流感gydF4y2BangydF4y2Ba= 1)。36个样本评估患者足够的样本评估临床稳定(基线)和加剧恶化患者发病2周期间恶化(无花果。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。根据当前患者分层使用(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)或停用(gydF4y2BangydF4y2BaICS = 11),这些子组是在表的基线特征gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。ICS用户基准痰细胞被抑制了gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba表达和观察ICS吸毒者没有显著差异gydF4y2BaIFNλ1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

符合之前的发现在体外和动物模型,ICS用户痰细胞被抑制了gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba表达在恶化发病(无花果。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)。评价mRNA表达从基线还演示了叠化显著抑制ICS用户gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)。经常吸烟会影响抗病毒反应gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba外,我们还进行了sub-analysis不包括吸烟者。在这个群,ICS用户明显抑制痰细胞gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

痰液细胞的表达gydF4y2Ba2gydF4y2Ba′gydF4y2Ba5gydF4y2Ba′gydF4y2Ba美洲国家组织gydF4y2Ba和gydF4y2BaviperingydF4y2Ba在2周也显著抑制ICS观察用户和非用户没有区别gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。ICS用户也有抑制痰上层清液CXCL10 / IP-10蛋白质浓度在恶化发病(无花果。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)和增强痰MUC5AC糖蛋白含量在2周(图。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

继发性细菌感染发生在COPD受试者实验RV感染后不采取ICS,与细菌负荷峰值发生在15天邮报RV感染gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。来确定ICS使用增加继发性细菌感染在慢性阻塞性肺病,我们评估细菌负荷的16 s qPCR类似post-exacerbation发病2周的时间点,并发现显著增加ICS用户和非用户(图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)。符合FP在老鼠身上的影响,ICS用户也有抑制痰细胞gydF4y2BaSLPIgydF4y2Ba表达式在恶化(无花果。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

ICS使用在COPD恶化也与占据更大的最大百分比跌幅从基线post-bronchodilator呼气流量峰值ICS ICS用户和非用户(无花果。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

干扰素的相关性与MUC5AC或SLPI在恶化gydF4y2Ba

符合我们发现I型干扰素负调节粘蛋白生产在RV感染的老鼠,我们观察到峰值痰细胞的表达gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNλ2/3gydF4y2Ba和峰值痰CXCL10 / IP-10蛋白质浓度负相关与痰MUC5AC在病毒诱导慢性阻塞性肺病恶化(无花果。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba)。同样的,符合我们的发现在老鼠干扰素反应也参与SLPI生产在病毒感染过程中,我们发现,峰值痰细胞的表达gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba和gydF4y2BaviperingydF4y2Ba积极与gydF4y2BaSLPIgydF4y2Ba表达式(无花果。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

使用RV感染的模型我们已经表明,FP,人常用的ICS,抑制至关重要的抗病毒免疫反应,导致受损的肺病毒控制和之前的未被确认的粘蛋白的副作用增强抗菌免疫损伤,影响被IFN-β重组政府,从而改善与干扰素抑制与FP政府有关。我们重要的是表明,这些不利影响的FP也发生在慢性阻塞性肺病急性加重,从而确认相关性和人类疾病的重要性。gydF4y2Ba

在初级RV感染模型,FP抑制诱导型和III型干扰素房车和延迟病毒清除体内。这些数据扩展观察从先前的研究报道抑制干扰素对病毒感染的反应与皮质类固醇有关政府在外周血单核细胞gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba,成纤维细胞gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba和气道上皮细胞gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。一个完整的I型干扰素反应是重要的有效的肺病毒控制和我们以前报道gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠表现出增强的病毒感染RV时加载gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。除了显示受损体外干扰素反应gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}实验,COPD患者感染RV相比增加了呼吸道病毒负荷控制气道阻塞gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba},从而表明干扰素反应也是病毒控制在人的一个重要因素。我们发现老鼠模型中FP政府推迟病毒清除体内支持人类研究报道在房车后增加病毒滴定度与系统性皮质类固醇激素健康受试者的挑战gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba和增加房车脱落与鼻内FP政府在自然发生的感冒gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba},尽管存在相互矛盾的数据与另一项研究中只显示趋势增加病毒脱落后综合治疗口腔和鼻内皮质类固醇在实验房车的挑战gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。虽然效果大小观察小鼠模型中相对较小,我们观察延迟病毒间隙在一个有限的动物模型复制发生gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。在人类RV感染,复制是更健壮的和长期的gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba,ICS可能会有更加明显的效果。然而,我们承认肺RV感染的小鼠模型不精确模型持续鼻病毒复制中看到的人。这一限制在我们体内病毒复制意味着数据显示ICS-mediated增加病毒负荷进行解释时应特别谨慎,进一步确凿证据的影响ICS在病毒复制必需使用ICS管理实验病毒在慢性阻塞性肺病患者的挑战。gydF4y2Ba

我们另外确定哪些组件的病毒RNA识别和/或IFNAR信号通路中断了ICS使用体外方法与特定PRR-activating病毒RNA代理人。在使用的实验方法,FP政府没有影响研究小组表达式和STAT1和STAT2磷酸化,与重组IFN-β刺激后,从而表明抑制性的影响FP可能局限于初始virus-sensing途径而不是通过自分泌的影响通过IFNAR放大。我们曾表明,诱导干扰素的RV感染发生最初通过endosomal PRR TLR3和后来通过诱导胞质解旋酶rig - i和mda - 5gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。在最近的研究中,FP抑制TLR3-mediated干扰素表达,这表明皮质类固醇抑制干扰素生产发生的早期影响的初始endosomal传感旅游房车。根据这一发现,我们观察到FP抑制gydF4y2BaIFNβgydF4y2BaTRIF诱导启动子活动的衔接分子利用TLR3刺激I型干扰素的表达。我们另外评估FP的影响政府的刺激气道上皮细胞受体激动剂的胞质PRRs下游TLR3和惊讶地发现RIG-I-induced微分效应抑制,但不影响MDA-5-induced,干扰素的表达。此外,FP镇压gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba启动子活动引起的小牛,衔接分子所利用的mda - 5和rig - i刺激干扰素表达。差异的原因的影响FP通路介导的胞质受体rig - i和mda - 5(共享许多相似之处)尚不清楚。可能差异之间存在衔接分子小牛是如何利用mda - 5和rig - i刺激干扰素生产。尽管如此,我们的数据表明,FP可能发挥抑制性影响干扰素诱导的抑制TLR3 virus-sensing途径。这是符合的一项研究报道,FP抑制聚(我:C)诱导CXCL10 / IP-10 BEAS-2B细胞gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。然而,值得注意的是,尽管使用的受体激动剂的选择性是由以前的研究gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba},我们不能排除配体用于研究不触发额外的PRRs表示。进一步证明,ICS影响干扰素信号是我们老鼠模型所示,FP政府抑制激活肺IRF-3,先天反应信号的中间。然而,应该注意的是,任何核获得使用我们的方法将来自多个细胞类型,所以它是可能的,这些数据可能被解释为ICS细胞成分的影响。gydF4y2Ba

适应性免疫反应是重要的病毒清除和防止再感染gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}之前,我们观察到FP政府RV感染小鼠导致抑制细胞适应性反应和生产RV-specific受损免疫球蛋白和中和抗体。我们发现FP损害生产抗体反应RV感染的老鼠模型表明,使用这些常用的吸入器在慢性阻塞性肺病急性加重可能损害自然对未来RV感染的保护性反应,从而限制长期疗效的ICS减少急性加重。这是由以前的研究报道,exacerbation-prone COPD患者低RV-specific IgG1抗体水平比non-exacerbating病人在稳定状态gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba,这表明缺乏体液免疫反应RV可能恶化风险的一个重要因素。gydF4y2Ba

房车感应的主要气道黏蛋白MUC5AC MUC5B也增强了FP政府在老鼠模型中。受损的黏膜纤毛的清除粘液分泌过多是一种稳定的疾病在慢性阻塞性肺病和可能导致气流限制,加速肺功能下降和发病率增加gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}。此外,肺MUC5AC过度报道致命的哮喘和因此带来的不良结果gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。RV感染可以刺激粘液生产从气道上皮细胞,从而加强痰生产期间急性发作gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}我们发现FP政府减少控制RV感染导致粘蛋白表达增加进一步表明使用这些疗法可能恶化粘液分泌过多,导致增强和/或长期恶化症状,延迟复苏。gydF4y2Ba

管理重组IFN-β结合FP和RV感染小鼠重组先天反应抑制和改善病毒清除,表明FP抑制干扰素反应起着主要的机械作用的病毒控制的不利影响。RV-infected小鼠给予类固醇治疗,然后IFN-β也降低了MUC5AC表达与FP-treated RV-infected老鼠,这进一步支持了假设抑制干扰素是增强MUC5AC与FP相关生产管理。我们还观察到,gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠已经减少了I型干扰素的生产RV感染的反应gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba也增加了BAL MUC5AC,提供进一步的证据表明,I型干扰素负调节粘蛋白的生产。类似的观察曾被报导过gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠感染gydF4y2Ba新型隐球菌gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

ICS和肺炎之间的关系在2007年首次报道慢性阻塞性肺病的风险gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba,现在已经在许多研究中被证实。基于这一感知风险,一些临床医生现在广泛质疑不加批判的利用这些规定在慢性阻塞性肺病治疗持续的实践变化的证据gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。值得注意的是,这种效应的潜在机制从来没有被确认。我们以前报道,实验房车挑战诱发继发性细菌感染在慢性阻塞性肺病,通过抑制占据安培SLPI和弹力素gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。在当前的研究中,除了抑制干扰素,FP也抑制房车诱导的气道抗菌反应,包括SLPI,伴随着细菌负荷的增加。重组IFN-ß政府逆转SLPI抑制和减少增加细菌负荷与FP政府在不影响抑制其他抗菌反应。相结合,这些数据表明,FP可能增加的风险通过抑制SLPI继发性细菌性肺炎,占据重组干扰素治疗可以预防RV感染后细菌负荷增加。我们推测,这可能是一种机制解释了在慢性阻塞性肺病ICS使用相关肺炎风险增加gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}符合之前的数据显示,高房车加载与继发性细菌感染在慢性阻塞性肺病的风险增加gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba这ICS-related肺炎发作通常遵循旷日持久的症状加重gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

先前一些研究表明激素可能通过支气管上皮细胞体外增强SLPI生产gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba},但这些研究进行了模型的稳定而不是加剧了疾病和冲突的数据存在于皮质类固醇的影响在其他细胞类型,比如THP-1单核细胞,抑制而不是增强被观察到gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。在病毒感染,我们显然在一系列的模型表明,FP气道SLPI生产有抑制作用。因为STAT1此前调节SLPI的表达gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba期间,FP可能损害SLPI生产RV感染通过抑制PRR-induced干扰素生产从而减少后续IFNAR-mediated STAT1激活。这种机制是由我们的发现gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠也会降低房车SLPI的感应。额外的证据不足的重要性SLPI在慢性阻塞性肺病是细菌感染的一个重要机制所提供的研究显示减少气道SLPI频繁(值得注意的是,其中一个大比例正在ICS)和罕见的慢性阻塞性肺病exacerbatorsgydF4y2Ba^53gydF4y2Ba并在恶化患者积极的细菌培养gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

总的来说,我们的研究使用重组干扰素政府在老鼠和RV感染gydF4y2BaIFNAR1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}鼠标应变确定干扰素的中央监管机构在RV感染抗菌反应和粘液生产。在临床试验中在哮喘患者服用ICS发达感冒gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba,IFN-β疗法导致病毒负荷减少的趋势,与临床中度/重度疾病患者受益gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。我们发现IFN-β政府鼠标模型改进的病毒控制,增强抗菌免疫和扭转增强MUC5AC表达与FP治疗,进一步增加了重量的潜在好处吸入干扰素用于治疗病毒诱导气道疾病的发作。托马斯等人报道,IFN-αIFN-λ总局可能同样改善ICS损伤小鼠肺流感病毒的控制gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba虽然吸入IFN-β是临床治疗的发展,因此最大的活期利息。吸入IFN-β曾被证明是安全的哮喘患者,和专门的研究需要调查其在慢性阻塞性肺病的效用。gydF4y2Ba

应该注意,减少整体恶化与慢性阻塞性肺病ICS使用超过肺炎的潜在风险gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba。我们的数据表明,FP抑制气道炎症支持占据有利影响与使用这些疗法。似是而非,ICS的副作用host-defence报道在当前的上下文中研究可能发生更频繁更严重的感染,导致不利的扭曲的风险/收益比率。选择性类固醇,保留潜在的未来发展有益的抗炎作用不影响抗病毒免疫可以提供更有效的方法。gydF4y2Ba

我们另外证实,《外交政策》中确定的不利影响我们的主要感染模型也发生在慢性阻塞性肺病恶化的模型。评估这些不利影响是否发生在慢性阻塞性肺病很重要,因为据报道,慢性阻塞性肺病抗类固醇疾病反应是一个相对gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba因此它是可行的类固醇的副作用可能没有观察到在这个上下文。原发性慢性阻塞性肺病原子能委员会的领导下,金融产品部抑制房车诱导干扰素反应也增强粘液生产。我们确认这些发现体内使用鼠标COPD恶化的模型gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba,同样表明,FP抑制RV-induced干扰素反应导致延迟病毒体内间隙和粘液分泌过多。因此,FP政府在体外和体内COPD模型与抑制干扰素反应,证实这些副作用仍然抗类固醇疾病模型,反应发生在病毒负荷增加和粘液生产观察体内可能恶化严重不利影响。慢性阻塞性肺病的弹性蛋白酶鼠标模型再现了许多人类免疫病理特征的慢性阻塞性肺病恶化gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba,但它也认识到,现有的模型不能完全概括人类慢性阻塞性肺病的复杂性,这基因易感个体发生后长期吸烟暴露。弹性蛋白酶政府代表慢性阻塞性肺病的合成模型和进一步的动物实验使用替代建模方法,如烟雾暴露或遗传操作,需要确认我们的发现。gydF4y2Ba

我们确认我们的研究使用的直接相关性ICS在临床环境中通过分析病毒相关的COPD患者的痰样本呈现急性加重。ICS使用抑制干扰素反应在恶化,随之而来的MUC5AC的水平。符合我们的发现在老鼠RV感染模型和支持我们的假设ICS-mediated抑制SLPI促进肺炎增加慢性阻塞性肺病的风险,我们也观察到抑制痰gydF4y2BaSLPIgydF4y2Ba信使rna和细菌负荷增加ICS用户。这些数据表明,我们的之前的体外和体内小鼠模型的研究结果可以适用于人类慢性阻塞性肺病急性加重的背景下,并提供初步的临床证据表明,使用ICS加剧病人使用时可能有不利影响。进一步的研究将需要使用大量的COPD受试者确认这些数据。干扰素反应和MUC5AC浓度之间的负相关和正相关与干扰素反应SLPI表达式也观察到,进一步支持我们的结论,I型干扰素在监管中扮演着中心角色的粘液分泌和抗菌免疫在加重。gydF4y2Ba

总之,这些研究表明,吸入皮质类固醇使用抗病毒免疫反应有抑制作用,伴随着负面影响在粘蛋白生产和抗菌免疫病毒诱导慢性阻塞性肺病急性加重。重组干扰素作为一种辅助治疗的作用,否定ICS的不利影响慢性阻塞性肺病需要进一步探索。提出不良后果的示意图表示吸入皮质类固醇在发作期间使用干扰素治疗的和潜在的有利影响图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。未来发展的新型选择性类固醇,保留有益的抗炎作用,但缺乏影响抗菌免疫和粘蛋白生产可以更有效的治疗/预防慢性阻塞性肺病急性加重,因此在临床实践大有裨益。gydF4y2Ba

细胞和病毒gydF4y2Ba

BEAS-2B细胞(欧洲收集细胞培养)培养RPMI 1640中10%胎牛血清(FCS)。鼻病毒血清型A1在俄亥俄州的传播海拉细胞(欧洲收集细胞培养)的标准方法和暴露于紫外线灭活的1200 mJ /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba30分钟。体内用在老鼠模型中,病毒纯化使用沉淀在7%聚乙二醇6000 (Sigma-Aldrich), 0.5 M氯化钠,其次是使用0.2μm注射器过滤器过滤和缓冲交换和浓度Amicon Ultra-15离心过滤装置(100 KDa名义分子量限制)(美国微孔)gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

病毒感染和治疗与FP和受体受体激动剂gydF4y2Ba

BEAS-2B融合细胞培养至80% 12-well盘子。细胞治疗1或10 nM丙酸(Sigma-Aldrich)或稀释剂(模拟)1 h。文化随后刺激为0.2毫升RV-A1 (MOI 2)或5μg /毫升TLR3受体激动剂(聚(我:C);表达载体),250 ng / ml mda - 5受体激动剂(转染保利(我:C);高MW这对mda - 5是特定形式,如前所述gydF4y2Ba^35gydF4y2BaInvivogen), 0.5µg /毫升rig - i受体激动剂(5′三磷酸双链RNA (5′ppp-dsRNA),之前是一个特定的配体rig - igydF4y2Ba^36gydF4y2Ba;Invivogen)或2.5 ng / ml重组IFN-β(研发系统),适合1 h在室温下用颤抖的。病毒或受体激动剂被删除,取而代之的是1毫升媒体和孵化24 h在37°C。gydF4y2Ba

瞬时转染BEAS-2B细胞的质粒DNAgydF4y2Ba

BEAS-2B融合细胞培养至80% 12-well盘子。反应的混合0.65μg /宪法活跃TRIF或小牛(ΔTRIF或ΔMAVS Invivogen)或pUNO1控制向量(Invivogen), 0.25μg promoter-reporter质粒(gydF4y2BaIFNβgydF4y2Ba荧光素酶,一份礼物从t . Fujita),日本大阪大学0.1μg Renilla质粒(Promega)和3µl Superfect(试剂盒,克劳利,英国)是采用无血清稀释RPMI和孵化在室温下15分钟。然后用无血清RPMI 1:5稀释混合。细胞被洗两次与PBS紧随其后的475毫升的混合。细胞培养在37°C 3 h公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。转染后三个小时,细胞治疗与FP 1到10纳米浓度,如上所述,溶解产物收集24 h后转染。相对光单位评估使用双荧光素酶工具包(Promega)。gydF4y2Ba

治疗和主支气管上皮细胞的感染gydF4y2Ba

主支气管上皮细胞从黄金3期COPD患者获得诊断。所有科目给通知书面同意和批准的研究协议是人类猎人新英格兰研究伦理委员会(05/08/10/3.09)。主要细胞生长在完成BEGM (Lonza)与生长因子补充剂在单层培养的水中,然后播种在2×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞在transwells 12-well板(康宁)bebm ALI-initial媒体组成的50% / 50% dmem含有0.1%氢化可的松,0.1%牛胰岛素、肾上腺素0.1%,转铁蛋白0.1%,0.4%牛脑垂体提取物(所有从Lonza)和乙醇胺(最终浓度80μM), MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(最终浓度0.3毫米),MgSOgydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}(最终浓度0.4毫米),牛血清白蛋白(最终浓度为0.5毫克/毫升)、两性霉素B(250年最终浓度μg /毫升),all-trans视黄酸(30 ng / ml)和2%青霉素链霉素10 ng / ml重组人类上皮生长因子(rhEGF),直到支流(至少3天在顶端和基部箱内)。一旦支流,rhEGF浓度改为0.5 ng / ml在阿里阶段分化的基底室(transwell插入下)没有顶端媒体直到最初播种后21天。在最初播种后21天,基底媒体取代媒体包含1或10 nM丙酸,合适的井。0.1 RV-A1感染(MOI)应用于顶端表面在250年为2 hμl BEBM最小35°C,感染后,媒体取代500μl新鲜BEBM最小剩余的时间。样品收集在24、48、72和96 h后感染。在每个时间点,顶端媒体被撤的文化和储存蛋白表达分析和一半的transwell膜小心地插入和收集切成RLT缓冲区(试剂盒)含1%为下游分子分析2-mercaptoethanol RT-qPCR而其余transwell膜在neutral-buffered 10%福尔马林固定24小时组织学截面确定分化和沾周期性acid-Schiff (PAS)评估粘液生产。gydF4y2Ba

鼻病毒感染和治疗的老鼠gydF4y2Ba

体内协议:雌性老鼠(8 - 10周的年龄)对C57BL / 6背景用于所有动物研究。老鼠从查尔斯河实验室和购买特定的无菌条件下分别安置在通风的笼子里。所有动物的权威下执行工作中概述的英国内政部的动物伦理审查后(科学程序)法案1986年由伦敦帝国理工学院动物福利和伦理审查机构(项目许可证PPL 70/7234)gydF4y2Ba

FP粉(Sigma-Aldrich) resuspended 357μg /毫升的浓度在二甲亚砜(DMSO溶液;然后在PBS稀释1:1000 Sigma-Aldrich)。小鼠治疗鼻内光异氟烷麻醉下50μl FP解决方案(相当于20μg FP剂量)或车辆DMSO在PBS稀释1:1000控制。一小时后FP或车辆管理、老鼠感染鼻内50μl RV-A1 (5×10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)或UV-inactivated RV-A1控制(如上详细)gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。在不同的实验中,1 h RV-A1或UV-RV-A1挑战后,老鼠此外治疗鼻内的50μl PBS包含10gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}单位的重组IFN-β(研发系统)。gydF4y2Ba

Fluticasone政府在COPD恶化小鼠模型gydF4y2Ba

小鼠治疗鼻内光异氟烷麻醉下1.2个单位的猪胰弹性蛋白酶(默克公司)诱发肺气肿的肺的变化gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba弹性蛋白酶政府后十天,小鼠治疗鼻内20μg FP解决方案(准备详细上图),1 h鼻内感染前50μl RV-A1 (2.5×10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba,50%的剂量减少从主RV感染模型)或UV-inactivated RV-A1控制,上面详细。gydF4y2Ba

天然人类慢性阻塞性肺病恶化队列gydF4y2Ba

一群40 COPD受试者招募的一项研究调查2011年6月和2013年12月之间自然发生的急性加重。慢性阻塞性肺病的科目的成绩严重程度,证实了肺量测定法,招募和治疗都是允许的。所有科目给通知书面同意和批准的研究协议是伦敦东部研究伦理委员会(协议11号/ LO / 0229)。所有受试者初次访问期间的临床基线稳定医疗评估,呼气流速峰值测量,肺量测定法(在1 s用力呼气量(FEV1)、用力肺活量(FVC)和临床样本收集。gydF4y2Ba

痰诱导和处理:痰诱导用pre-medication 200µg舒喘灵通过计量剂量吸入器和大量垫片。百分之四盐水管理使用DeVilbiss UltraNeb99超声波nebuliser直到一个适当的痰样本。在2 h的诱导痰处理。从唾液痰栓被选宏观检验的样本。选择一个整除和存储未加工在-80°C。剩余的样品称重和0.1%二硫苏糖醇(德勤)添加比例4毫升德勤1 g痰。混合搅拌和过滤。同样的体积增加了PBS,滤液离心机和上层的整除和存储在−80°C。gydF4y2Ba

病毒检测:病毒被发现在痰液使用聚合酶链反应。以下病毒研究:腺病毒、冠状病毒人类bocavirus人类metapneumovirus流感(AH1 AH3, B),副流感病毒1 - 3,小核糖核酸病毒和呼吸道合胞病毒。使用QIAamp RNA提取病毒RNA迷你包(试剂盒)。小核糖核酸病毒,5µl RNA被除了反应转化为互补组合包含1.55µl OL27(表达载体),1µl德勤0.1米,0.2µl核苷酸(表达载体)和0.25µl (10000 u)逆转录酶(表达载体)。一个32轮PCR循环被用来检测小核糖核酸病毒互补。差异化的旅游房车肠道病毒是通过限制性内切酶消化的PCR产物。gydF4y2Ba

对于所有其他病毒,转换为互补达到了18µl RNA添加到反应混合物包含2.5µl随机六聚物引物(0.5µg /µl Promega)和6.5µl UHQ (nuclease-free水,Promega)。这种混合变性在70°C 10分钟。在淬火后冰,5×10µl第一链缓冲区,6µl UHQ,德勤5µl 0.1米,1.25µl核苷酸和2µl (200 u)的逆转录酶(试剂盒)被孵化后添加在37°C 1 h产生互补。一个整除4µl cDNA然后用于每一个rt - pcr在面板上,使用2720年的热循环执行(应用生物系统公司)。gydF4y2Ba

追问:受试者重复访问时每隔三个月临床稳定和随访至少6个月。学科研究团队报道时出现症状的急性恶化使用东伦敦队列定义的标准gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba见过48小时内出现症状。痰液样本收集恶化的发生和恶化期间2周。gydF4y2Ba

细胞分析gydF4y2Ba

在小鼠模型中,平衡是由管子通过气管与1.5毫升无菌PBS灌洗。细胞被离心分离颗粒状,resuspended ACK缓冲溶解红细胞,洗在PBS和resuspended RPMI中有10%的边后卫。细胞被沾快速Diff (Reagena)微分计算。流式细胞术分析、肺白细胞从落下帷幕,红细胞细胞溶解和ACK缓冲区。BAL细胞沾住/死亡可以解决的死细胞染色(生活技术,卡尔斯巴德,CA),孵化与anti-mouse CD16 / CD32 (FC块;BD生物科学),随后直接fluorochrome-conjugated单克隆抗体特定CD3ε(500年克隆;2 1µg /毫升,BD生物科学)、CD69(克隆H1.2F3 1µg / ml, BD生物科学),CD4(克隆RM4-5 0.25µg /毫升;BD生物科学)、CD8a(克隆53 - 6.7;0.5µg /毫升BD生物科学)和NK1.1(克隆PK136; 1µg / ml, BD生物科学)。数据获得在一个光敏电阻二流式细胞分析仪(BD生物科学)和分析使用FlowJo软件(版本10.0.6; Tree Star, Ashland, USA). Representative gating strategies used for analysis of cell surface staining are shown in Supplementary Fig.8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

蛋白质分析gydF4y2Ba

老鼠的细胞因子蛋白水平落下帷幕,人类痰上层清液或细胞上清液从体外实验化验使用商业duoset的酶联免疫吸附试验包(研发系统,阿宾顿,英国)。MUC5AC和MUC5B落下帷幕后测定蛋白质粘附到96孔板通过允许样品蒸发一夜之间在37°C。盘子洗了三次之间的步骤。盘子被封锁2 h和2%牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐。MUC5AC的测量,检测抗体使用生物素化的anti-MUC5AC(热科学)400 ng / ml。MUC5B试验,检测抗体是鼠标anti-MUC5B克隆EH-MUC5Ba。绑定anti-MUC5B抗体检测与peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(Sigma-Aldrich)。标准曲线粘蛋白elisa生成系列1:2稀释的上层清液从ionomycin-stimulated H292细胞(MUC5AC)和BAL上层清液之前从ovalbumin-induced hyper-allergic老鼠(MUC5B)。gydF4y2Ba

西方墨点法用于评估蛋白质BEAS-2B细胞提取物。细胞的细胞溶解radioimmunoprecipitation(里帕)缓冲区(Sigma-Aldrich)补充蛋白酶(罗氏)和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)。蛋白质含量是衡量bicinchoninic酸测定(热科学)。等量的蛋白质被加载到4 - 12% Bis-Tris sds - page凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(技术)。膜被封锁与5% BSA Tris-buffered盐在室温下1 h。以下主要使用抗体:兔子anti-pSTAT1 Y701(1:1000稀释;新英格兰生物学实验室),anti-pSTAT2 Y690(1:1000,新英格兰生物学实验室),anti-STAT1(1:1000稀释;新英格兰生物学实验室)和anti-STAT2(1:1000稀释;新英格兰生物学实验室)。一夜之间,主要的抗体被孵化在4°C和二级抗体结合辣根过氧化物酶(1:5000稀释; Jackson Immunoresearch) was incubated for 1 h at room temperature. Data were acquired using a Fusion FX7 image analyser (Vilber Lourmat). Uncropped western blot images are shown in Supplementary Fig9gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

测量血清抗体的小鼠模型,收集外周血颈动脉和血清RV-specific免疫球蛋白是衡量内部酶联免疫吸附试验。九十六孔板被涂上一层净化RV1B,用于体内感染,并在4°C孵化一夜之间,盘子被封锁在pbs - 0.05% 5%牛奶渐变20在室温下。整除的50µl /血清稀释1:50的5%牛奶/ PBS然后添加进一步在室温下2 h孵化。免疫球蛋白抗体检测是生物素化的老鼠anti-mouse IgG1(0.5µg /毫升克隆A85-1 BD生物科学)和IgG2a(0.5µg /毫升克隆R19-15。BD生物科学)。gydF4y2Ba

准备肺核提取测量转录因子激活,左肺切除,立即放入1.7毫升管和液氮快速冻结在紧随其后的是存储在−80°C。肺组织是手动单一化而沉浸在液氮使用杵和臼和核提取准备使用核提取工具(活动主题、La Hulpe、比利时)。激活的转录因子GR, NFκB p65单元和IRF-3评估小鼠肺组织使用商用DNA结合化验(活动主题)使用20μg /核蛋白质。gydF4y2Ba

中和化验gydF4y2Ba

中和的房车在俄亥俄州的测量海拉细胞(英国健康保护局一般细胞集合)增长直到~ 90%汇合的在96孔板上。汇集为每个给定的治疗组血清与纯化RV-A1孵化或介质控制在室温下用颤抖的1 h,然后添加到海拉细胞进一步孵化在37°C 48 - 72 h。保护细胞病变效应是由结晶紫测量细胞的可行性分析。细胞被沾0.1% (w / v)结晶紫(Sigma-Aldrich)在室温下10分钟。细胞然后用水洗,脱水和结晶紫与1%水溶性钠十二烷基硫酸盐(SDS)解决方案(w / v)。吸光度是衡量Spectramax +板读者在560海里。gydF4y2Ba

RNA提取,互补脱氧核糖核酸合成和定量PCRgydF4y2Ba

从BEAS-2Bs总RNA提取,主要气道上皮细胞或痰液细胞(RNeasy装备,试剂盒)和2µg用于互补脱氧核糖核酸合成(Omniscript RT工具包)。小鼠模型,对上部叶的总RNA提取小鼠肺癌和放置在RNA后,之前RNA提取和互补脱氧核糖核酸合成(如上详细)。定量PCR进行了使用先前描述的特定的引物和探针为每个感兴趣的基因gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}18 s rRNA,正常化gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。反应进行分析使用ABI 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。gydF4y2Ba

细菌16 s DNA提取和定量PCRgydF4y2Ba

从人类的痰和小鼠肺组织中提取DNA进行使用FastDNA旋转工具土壤(美国圣安娜议员生物医学),按照制造商的说明。Bead-beating进行了两个周期的30年代在6800 rpm (Precellys,贝尔坦公司技术)。总16 s细菌负荷测量使用定量PCR,一式三份执行使用Viia7实时PCR系统(技术)。除了模板,每个PCR反应混合包含0.2μl正向引物520 f(10μm;5′-AYTGGYDTAAAGNG-3′), 0.2μl反向引物802 r(10μm;5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′), 5μl SYBR快速普遍掌握混合(Kapa生物系统公司)和3.6μl HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bao . PCR循环条件:1 90°C的循环3分钟,其次是40周期的95°C(20岁),50°C(30岁),72°C(30岁)和熔化的条件1的循环95°C(15秒)和1周期60°C(1分钟)其次是游离在95°C(15秒)。建立标准曲线,1:10稀释系列(10gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}-10年gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba部分16 s rRNA基因的副本)gydF4y2Ba弧菌natriegensgydF4y2BaDSMZ 759(德意志Sammlung冯Mikroorganismen,布伦瑞克,德国)从职位27日到1492年gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba参考克隆使用威尼斯平底渔船TA克隆设备;(表达载体,ThermoFisher科学)使用。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

对老鼠的实验中,动物研究大小five-eight小鼠每组试验条件和数据提出了均值±SEM,代表至少两个独立实验相结合。数据分析使用一个与组间显著差异或双向方差分析评估Bonferroni的多重比较检验。五年间的体外BEAS-2B实验时间和数据表示为±SEM。数据进行分析的一个——或者双向方差分析测试组差异评估Bonferroni的多重比较检验。体外主要气道上皮细胞实验研究与一组的大小gydF4y2BangydF4y2Ba= 9病人和个人数据点所示。数据分析使用单向方差分析和组间显著差异评估Bonferroni的多重比较检验。数据从人类使用Mann-Whitney COPD组进行分析gydF4y2BaUgydF4y2Ba以及克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩的测试比较蛋白质含量或ICS用户和非用户之间的信使rna表达。数据集之间的相关性进行使用斯皮尔曼等级相关系数。所有的统计数据都使用GraphPad棱镜6执行软件。差异被认为是重要的时候gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

可用的数据支持这个研究的发现在这篇文章及其补充信息文件,或从相应的作者请求。gydF4y2Ba

这项工作是由威康信托基金会支持临床研究培训奖学金A.S.(批准号WT096382AIA),泵启动资助从英国肺脏基金会(批准号PPRG15-9),一个研究格兰特从英国医学协会(2015年格兰特裁判:HC左轮枪grant),国家卫生研究所(NIHR)高级研究员S.L.J.奖NIHR临床讲师资助计划(PM)和资金来自帝国理工学院和NIHR生物医学研究中心(BRC)计划。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 这些作者的贡献同样:帕特里克·Mallia内森·w·巴特利特塞巴斯蒂安·l·约翰斯顿。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. COPD和哮喘部分,国家心肺研究所、伦敦帝国理工学院,诺福克,伦敦,英国W2 1 pggydF4y2Ba

   伊阿然Singanayagam尼古拉斯·格兰维尔人京,安德里亚·Marcellini詹姆斯d·波特,玛丽•杜桑·罗斯·沃尔顿丽迪雅j·芬尼,朱莉娅•Aniscenko杰朱,Maria belen Trujillo-Torralbo,玛丽亚阿德莱德Calderazzo,罗伯托·索拉里,迈克尔·r·爱德华兹,帕特里克·Mallia Nathan w . Bartlett &塞巴斯蒂安·l·约翰斯顿gydF4y2Ba

2. 健康和医学学院和优先级研究中心健康的肺,猎人医学研究所和纽卡斯尔大学,纽卡斯尔,新南威尔士州,2305年,澳大利亚gydF4y2Ba

   杰森·l·Girkin克里斯•Grainge蔡慧厕所,Punnam Chander Veerati, Prabuddha s Pathinayake克里斯蒂s Nichol安德鲁·t·里德彼得·a·b·华克Darryl a骑士和Nathan w . BartlettgydF4y2Ba

3. 基因组医学、国家心肺研究所、伦敦帝国理工学院,凯尔街,伦敦,英国SW3 6光年gydF4y2Ba

   菲利普·l·詹姆斯,米里亚姆·莫法和威廉·o·CooksongydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

响亮的,N.G., M.R.E., P.M., N.W.B. and S.L.J. conceived and designed the experiments. A.S., N.G., J.L.G., Y.M.C., A.M., J.D.P., M.T., R.P.W., L.J.F., J.A., J.Z., M.-B.T.-T., M.A.C., S.-L.L., P.C.V., P.S.P., K.S.N., A.T.R., P.L.J., M.R.E., P.M. and N.W.B. performed experimental work and analysed data. A.S., N.G., J.L.G., Y.M.C., A.M., J.D.P., M.T., R.P.W., L.J.F., J.A., J.Z., M.-B.T.-T., M.A.C., C.G., S.-L.L., P.C.V., P.S.P., K.S.N., A.T.R., P.L.J., R.S., P.A.B.W., D.A.K., M.F.M., W.O.C., M.R.E., P.M., N.W.B. and S.L.J. contributed to writing and critical review of the manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba内森•w•巴特利特gydF4y2Ba或gydF4y2Ba塞巴斯蒂安·l·约翰斯顿gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

S.L.J.已经亲自收到Myelo疗法GmbH是一家咨询公司的费用,音乐会制药、拜耳、和赛诺菲安万特Pasteura Aviragen;他和他的机构收到Synairgen咨询费用,Novarits,勃林格殷格翰的发言,基耶西,葛兰素史克,年会。S.L.J.是专利的发明者使用吸入的干扰素治疗呼吸道疾病的发作。M.A.C.受雇于基耶西制药于2015年1月至2017年11月。其余作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意:gydF4y2Ba施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。gydF4y2Ba

188滚球软件本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到Creative Commons许可,并指出如果变化。本文中的图片或其他第三方材料都包含在本文的创作共用许可,除非另有说明在一个信用额度的材料。如果材料不包括在本文的创作共用许可证和用途是不允许按法定规定或超过允许的使用,您将需要获得直接从版权所有者的许可。查看本许可证的副本,访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba

通过提交评论你同意遵守我们的gydF4y2Ba条款gydF4y2Ba和gydF4y2Ba社区指导原则gydF4y2Ba。如果你发现一些滥用或不符合我们的条件或准则请国旗是不合适的。gydF4y2Ba