血管紧张素转化酶2（ACE2）在SARS冠状病毒诱导的肺损伤中的一种至关重要的作用

在2003年的几个月中，一种新发现的称为严重急性呼吸系统综合症(SARS)的疾病在全世界迅速传播^1那2那3.．将新的冠状病毒（SARS-COV）鉴定为SARS病原体^{4.那5.那6.那7.}，引发严重的肺炎和急性，往往致命，肺部衰竭^8.．此外，受感染的个体之间的甲型流感，如西班牙流感^9.那10以及新呼吸道疾病病毒的出现^11那12由急性肺衰竭引起的高致死率¹³．在细胞系中，血管紧张素转化酶2（ACE2）已经被鉴定为潜在的SARS-CoV的受体¹⁴．SARS-COV感染的高致死性，其巨大的经济和社会影响，担心再生爆发以及作为生物武器的潜在滥用这种病毒使其能够了解SARS-COV的发病机制。在这里，我们提供了ACE2是至关重要的SARS-COV受体的第一个遗传证据体内．SARS-CoV感染和SARS-CoV的Spike蛋白降低ACE2的表达。值得注意的是，在小鼠体内注射SARS-CoV刺突可加重急性肺衰竭体内可以通过阻断肾素-血管紧张素途径来减弱。这些结果从分子上解释了为什么SARS- cov感染会导致严重的、通常是致命的肺衰竭，并为SARS和可能的其他呼吸道疾病病毒提供了合理的治疗方法。

最近，ACE2在细胞系中被鉴定为具有功能的SARS冠状病毒受体¹⁴．但也可以从中识别出可能的第二个受体，CD209L（L-SIGN）在体外学习¹⁵．因此，尚不清楚ACE2对SARS-CoV感染是否确实至关重要体内．为了从基因上解决这个问题，我们感染了ACE2.基因敲除¹⁶并控制sars冠状病毒野生型小鼠。之前报道¹⁷，野生型小鼠SARS-CoV感染导致病毒在肺部复制和大量恢复(>10^7.组织培养感染剂量，可感染50%的单层细胞(TCID)_50.T）每根克肺组织）传染病（图1一个)．在ACE2.基因敲除小鼠，仅感染SARS-CoV的病毒的非常低的量可被回收（<10²TCID._50.每克肺组织;图1一个）和SARS-CoV棘突RNA的拷贝数大大减少（图1 b)．小鼠的SARS冠状病毒感染与轻度病变在肺发展（相关图1 c, d)．此外，肺部病理改变减少了ACE2.与野生型小鼠比较的突变小鼠(图1 c, d)．这些数据提供了第一个基因证据，证明ACE2确实是一个关键因素体内需要感染SARS病毒的有效复制SARS受体。

我们最近表明，肾素 - 血管紧张素系统在严重的急性肺损伤中具有至关重要的作用，并且SARS-COV受体ACE2在急性肺部失效中具有保护作用¹⁸（图2一个)．值得注意的是，野生型小鼠的实验SARS-CoV感染体内导致肺中的ACE2表达相当减少（图2 b）表明降低的ACE2表达可能在SARS-COV介导的严重急性肺病变中具有作用。相比之下，在SARS-COV感染的小鼠中，ACE肺表达水平并未明显改变（图2 b)．因此，我们推测，SARS冠状病毒可能是通过影响ACE2肺疾病。为了验证这一想法，我们建立了定义模型系统使用重组SARS-CoV的表面刺突蛋白，其是用于ACE2结合的必要的配体¹⁴．这个模型系统使我们避免了病毒复制或感染可能产生的二次效应体内并直接测试SARS-COV穗蛋白是否可能通过调节ACE2对急性肺损伤产生不利影响。

我们首先测试了重组SARS-COV偶像蛋白（补充图1与人类和小鼠的ACE2蛋白结合使用在体外下拉测定。我们的重组穗-CC蛋白确实拉下了人和小鼠ACE2（图2 c)．SARS-COV尖峰-FC与人和小鼠ACE2的结合通过FACS-FC至293细胞过表达人或小鼠ACE2（图2 d)．此外，Spike-Fc与Vero E6细胞内源性ACE2结合(图2 e)．值得注意的是，在Vero E6细胞中，Spike-Fc与内源性ACE2的结合导致ACE2表面表达下调(图2 e和补充图1在线)。Spike-Fc还降低了人和小鼠293细胞中过表达ACE2的表面水平(未显示)，并触发了小鼠ACE2转染但未控制cd4转染293细胞的合胞体形成(数据未显示)。因此，类似于其他病毒与受体的相互作用¹⁹， SARS-CoV刺突蛋白结合ACE2细胞系或SARS-CoV感染体内导致减少的ACE2蛋白表达。

因为ACE2是一个至关重要的SARS冠状病毒受体（图1)， SARS-CoV刺突蛋白结合ACE2下调ACE2表达(图2），以及在严重急性呼吸衰竭的ACE2表达的结果损失¹⁸，我们检测了SARS-CoV的Spike蛋白，这是关键的ACE2结合蛋白^20.那21，可能影响急性肺损伤的严重程度体内．值得注意的是，Spike-Fc蛋白治疗加重了野生型小鼠的肺功能，而control-Fc蛋白没有显示出明显的效果(图3)．此外，Spike-Fc处理酸激野生型小鼠后，肺实质的病理改变增强(图3 b, c和补充表1在线）和增加由湿/干肺重量比定义的肺水肿（图3 d)．接下来，我们制作了一个spik缺失突变体，该突变体只包含先前绘制的ace2结合域(氨基酸318-510)²¹融合到人类Fc (图3 e和补充图1在线)。这种短穗(S318-510)-Fc蛋白含有最小的ACE2结合位点，也通过FACS检测与细胞系中的ACE2结合，并下调ACE2的细胞表面表达(补充图1在线)。Spike(S318-510)-Fc治疗后，野生型小鼠酸致急性肺损伤加重(图3 e)．值得注意的是,体内给药Spike-Fc蛋白对肺衰竭的严重程度没有影响ACE2.基因敲除小鼠(图3 f），表明穗蛋白对急性肺损损伤的影响是ACE2特异性。

为了进一步阐明腹膜内注射型穗-Fc蛋白是否直接影响小鼠的肺病理学，我们检查了肺中注射的尖刺-Fc蛋白的定位。通过使用人FC特异性抗体的Western印迹在肺匀浆中检测到尖峰-Fc（图4），未检测到注入的控制FC。此外，使用免疫组织化学，我们发现穗-Fc蛋白局部定位成支气管上皮细胞，炎症渗出物和肺泡肺细胞（图4 b)．值得注意的是，Spike-Fc主要定位于严重病变(图4 b)．穗-CC蛋白的本地化类似于SARS-COV感染的小鼠中的尖峰抗原染色²²．Spike-Fc处理导致酸处理野生型小鼠肺中ACE2蛋白表达下调体内（图4摄氏度)，与sars冠状病毒感染小鼠ACE2蛋白下调(图2一个)和Spike-Fc蛋白处理的细胞在体外（图2 e)．这些结果表明，SARS-CoV Spike蛋白可通过ACE2直接影响严重急性肺衰竭的发展。

ACE2作为一个羧肽酶，从血管紧张素I (AngI)中切割一个残基，生成Ang1-9(参考文献)。23那24)和血管紧张素II (AngII)的单个残基生成Ang1-7(参考文献。23)．相比之下，ACE2同源物ACE将十肽AngI切成八肽AngII²⁵．因此，ACE2抵消ACE的功能和血管紧张素Ⅱ的生产负调节（图2一个)．为了测试Spike-Fc注射是否确实影响肾素-血管紧张素系统的功能，我们分析了酸和Spike-Fc处理小鼠肺中的AngII水平。酸吸入增加了野生型小鼠肺中的AngII水平。值得注意的是，我们进一步观察到使用Spike-Fc (图4 d)．为了通过增加血管生成和肾素血管紧张素系统的功能改变促进肺病促进肺病发病机制，我们阻断了Angii受体类型1（AT1R）²⁶用特异性抑制剂。AT1R是介导血管诱导的血管渗透性和严重急性肺损伤的关键受体¹⁸．在AT1受体的抑制作用减弱确实在穗的Fc处理的小鼠急性重度肺损伤（图4 e)．抑制AT1R也减弱了肺水肿（图4 f)．综上所述，我们的数据表明，SARS-CoV峰值可以通过调节肾素-血管紧张素系统夸大急性肺衰竭。此外，抑制AT1R可以挽救SARS-CoV尖锋介导的肺衰竭。

据估计，西班牙流感病毒在20世纪初夺去了2000多万人的生命，大约0.5%的感染者是致命的^9.那10，而SARS-COV感染的致死性甚至达到10％，即使现代化的重症监护治疗^1那2那3.．考虑到SARS的高致死率和全球范围内SARS爆发的巨大经济和社会影响，阐明疾病发病机制对于未来再次爆发时的治疗至关重要。此外，最近在人类中爆发的甲型禽流感(H5N1)导致了高达70%的急性呼吸衰竭死亡率¹²．在发现SARS-CoV之前，已知有两种冠状病毒(HCoV-229E和HCoV-OC43)会感染人类，但它们只会引起自限性上呼吸道感染(普通感冒的30%)，从未报告会导致严重疾病²⁷．这些人冠状病毒与sars冠状病毒发病机制的显著差异的分子决定因素尚不清楚。

我们的数据为严重的肺部衰竭和与SARS相关的致死率提供了分子解释：我们假设通过将SARS-COV尖峰蛋白与ACE2结合的ace2下调，使SARS-COV的感染结果下调。鉴于ACE2是肺水肿和急性肺部衰竭严重程度的关键负调节因素，SARS-COV偶像蛋白介导的ACE2下调则有助于肺病理的严重程度。这种情况会解释这个“相对无害”的冠状病毒的家庭成员如何变成了致命病毒。值得注意的是，具有SARS的小群体中的近期数据表明，影响ACE函数的插入缺失ACE多态性与疾病严重程度相关²⁸暗示我们的发现确实与人类相关。

我们的数据提供了SARS发病机制和肾素-血管紧张素系统在肺衰竭中的作用之间的分子联系。因此，重组ACE2蛋白不仅可以阻断SARS冠状病毒的传播，而且调节肾素-血管紧张素系统也可以用于保护SARS患者，以及感染其他病毒的患者，如禽流感a株、发展为急性严重肺衰竭和急性呼吸窘迫综合征。

对于方法的详细信息，请参阅补充的方法网上。

在活的有机体内SARS感染。

本研究使用的SARS-CoV(北京株，PUMC01分离株)由中国医学科学院、中国国家人类基因组中心提供。所有小鼠研究均由中华人民共和国卫生部科学技术司批准。小鼠经鼻接种病毒100 μl (10^5.23TCID._50.)．第2天处死小鼠，取肺进行进一步分析。我们评估肺损伤评分如前所述^30.．

SARS-CoV刺突蛋白结合实验。

我们克隆了SARS-CoV刺突蛋白(Urbani株1 - 1190氨基酸)的编码序列或仅包含先前定位的刺突蛋白序列²¹ace2结合域(氨基酸318-510)与人IgG1的Fc部分产生融合蛋白。我们用亲和层析法从转染的CHO细胞中纯化了Spike-Fc蛋白。为在体外结合测定中，我们使用细胞裂解物从A549人肺泡上皮细胞或小鼠IMCD肾上皮细胞，我们拉下穗-Fc或对照人IgG-Fc蛋白使用蛋白G琼脂糖，随后通过Western印迹。用于流式细胞术，我们分离使用EDTA和PBS的2mM的混合物Vero E6细胞，并在4℃或37℃下3小时与钉-Fc或对照人IgG-Fc蛋白温育它们。然后，我们培养的细胞与ACE2特异性抗体或FITC缀合的人IgG特异性抗体。

重组Spike-Fc体内挑战在老鼠身上。

采用酸吸入致急性肺损伤小鼠模型¹⁸所有穗的Fc体内实验。在酸处理期间，小鼠腹腔注射Spike(S1190)-Fc、Spike(S318-510)-Fc或control-Fc(每个5.5 nmol/kg)三次(在酸处理前30分钟、1小时和2小时)。为了抑制AT1对Spike- fc介导的急性肺损伤，我们用AT1抑制剂氯沙坦(15 mg/kg)治疗Spike(S1190)- fc激发的小鼠。肺损伤评分如前所述^30.．

统计分析。

所有数据表示为平均值±S.E.M。在单一时间点测量用非配对分析T.- 试验（病毒滴度，SARS-CoV棘突-RNA水平），ANOVA和双尾T.-test(弹性变化百分比，湿/干比AngII水平)或Kruskal-Wallis测试(组织学评分)。时间过程采用重复测量(混合模型)方差分析与Bonferroni后T.测试。所有统计检验均使用GraphPad Prism 4.00 (GraphPad Software)和JMP (SAS Institute)程序进行计算。P.< 0.05为差异有统计学意义。

加入号码。

SARS冠状病毒(北京株，PUMC01分离株)的Genbank登录号为AY350750．

注意:补充信息可以在自然医学网站上找到．

登记入册

基因库/ EMBL / DDBJ

• AY350750

我们感谢C. Richardson和我们实验室的所有成员的讨论。我们也感谢B. Seed的讨论，并提供了产生重组Spike蛋白的系统。我们感谢朱q、阮l和张磊分享了未发表的小鼠SARS冠状病毒感染数据和病毒感染方案。这项工作得到了奥地利科学院分子生物技术研究所和奥地利国家银行Jubilaeumsfonds的支持。K.K.是由欧盟的居里夫人奖学金资助的。北京市科学技术委员会资助项目H030230010930，国家自然科学基金创新团队资助项目30421003,Joincare公司SARS基金资助项目。加拿大健康研究所和加拿大创新基金会提供了部分支持。

作者笔记

1. kuiji Kuba, Yumiko Imai和Shuan Rao:这些作者对这部作品贡献相同。

从属关系

1. 奥地利科学院分子生物技术研究所，Bohr-gasse博士7，维也纳，A-1030，奥地利

   Kuba Keiji, Imai Yumiko, Andreas Leibbrandt, Teiji Wada & Josef M Penninger

2. 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家实验室，北京东单三道5号，100005

   栓饶，郭峰，关斌，一环，杨鹏，艳丽张，刘广，柳艳新，郑德显，刘德沛成渝和江

3. 中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，北京东单Santiao 5, 100005

   高宏，桅灯，琳琳宝，滨临张川和秦

4. 中国医学科学院北京协和医学院附属北京协和医院，北京东单Santiao 5, 100005

   钟王

5. 高血压和血管疾病中心，维克森林大学医学院，格雷大楼，G054医学中心大道，温斯顿-塞勒姆，27157-1032，美国北卡罗来纳州

   马克Chappell

6. 多伦多大学医学系和重症监护室;圣迈克尔医院，30邦德街，多伦多，M5B 1W8，加拿大

   亚瑟年代Slutsky

相应的作者

对应于成渝江．

利益争夺

奥地利科学院分子生物技术研究所已经申请了一项关于调节肾素血管紧张系统治疗肺水肿的专利。

再版和权限