甲型流感病毒蛋白质PB1-F2把线粒体通过Tom40渠道和损害先天免疫gydF4y2Ba

线粒体对RNA病毒导致细胞的先天免疫。Mitochondrial-mediated先天免疫是由招募到线粒体膜的信号分子,并依赖于线粒体内膜潜在(ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba)。我们检查Δ的生理意义gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba和mitochondrial-associating甲型流感病毒蛋白PB1-F2先天免疫。表达宿主细胞时,PB1-F2完全把进入线粒体内膜通过Tom40渠道空间,及其积累加速由于减少Δ线粒体碎片gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba。相比之下,PB1-F2变异缺乏c端多肽,是经常发现在低致病性亚型,不影响线粒体功能。ΔPB1-F2-mediated衰减的gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba抑制了rig - i的信号通路和激活NLRP3 inflammasomes。PB1-F2易位到强烈与线粒体受损细胞的先天免疫,使这个易位事件一个潜在的治疗目标。gydF4y2Ba

区分的线粒体,独特的细胞器外(MOM)和内部(MIM)膜影响,是真核生物的细胞强国。除了他们的主要功能为能源生产商通过ATP的生成通过有氧呼吸gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba、线粒体参与多种重要的细胞过程,如细胞凋亡gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba}、钙稳态gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}、细胞信号gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba和老龄化gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

最近的研究表明,线粒体作为细胞的先天免疫的中心在脊椎动物,尤其是哺乳动物gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。线粒体之间的联系和先天免疫最初发现基于视黄acid-inducible基因的激活我(rig - I)同受体(RLRs)信号转导途径,导致生产的I型干扰素(ifn)和促炎细胞因子对RNA病毒的第一道防线。在这个信号通路,细胞质virus-derived RNA收益被RLRs进入宿主细胞,和protein-nucleotide复杂把线粒体抗病毒信号蛋白(小牛)gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba,紧随其后的是招聘的各种信号下游效应器妈妈形成超分子组装免疫反应的关键gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。除了通过RLRs通路参与宿主细胞防御,线粒体还参与其他类型的炎症,如nod样受体的激活(NLR)家庭pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasomes。NLRP3 inflammasomes感应激活线粒体活性氧gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}生成通过线粒体呼吸或胞质释放的线粒体DNA受损的细胞器gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba结果inflammasome-dependent分泌的细胞因子,如interleukin-1β(IL-1β)和地震。虽然这些mitochondrial-mediated免疫反应是由不同的组织/细胞特定类型的和主要的刺激,妈妈表面multiprotein复合物的融合是一个关键的每个信号事件的过程,从而促进免疫反应的发展gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

我们以前的研究表明,线粒体膜电位(ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba),一个基本的线粒体的现象,必须激活RLRs通路和NLRP3 inflammasomes对抗病毒感染gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。这些发现的一个有趣的方面是,ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在MIM和妈妈平台上的超分子信号装配拓扑在生物膜耦合和激活免疫反应在音乐会。然而,Δ的生理意义gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在先天免疫尚未阐明,以往的研究大多是使用protonophore下进行化学处理,羰基氰化物gydF4y2Ba米gydF4y2Ba-chlorophenylhydrazone (CCCP)gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

PB1-F2 (ref。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba流感病毒蛋白,编码在大多数甲型流感病毒株的+ 1交替开放框架RNA聚合酶亚基(PB1基因段),可以表示为几个不同的多肽长度尺寸的氨基酸主要是87年或90年gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。PB1-F2耐人寻味的基因组的特点是高致病性毒株(例如H5N1亚型)表达不再包含大部分的90个氨基酸的多肽PB1-F2,而低致病性亚型(例如,H1N1,除了1918年的大流行毒株)倾向于表达较短的版本包含57个氨基酸被称为c端截短形式(gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。虽然PB1-F2来源于/波多黎各/ 8(本/ PR8 (H1N1)应变,有87个氨基酸(长多肽),被定位在线粒体gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}和诱导细胞凋亡gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}机制,它把线粒体和影响免疫反应尚不清楚。在目前的研究中,我们调查了机械和功能角色的PB1-F2 mitochondrial-mediated先天免疫。我们观察到PB1-F2易位到线粒体导致ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba衰减强烈,与受损细胞的先天免疫。gydF4y2Ba

不同的亚细胞定位PB1-F2变体gydF4y2Ba

我们首先确认PB1-F2的特异性与线粒体而不是其他细胞器,如内质网(ER)和/或过氧化物酶体。用生化方法,我们分离了细胞提取物/ PR8-infected细胞。翻译PB1-F2多肽在HEK293细胞感染主要观察厚膜分数,其中包含线粒体蛋白质,而不是根据微粒体膜或胞质分数(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。因为受感染的细胞也表达其他病毒蛋白质可能绕过PB1-F2针对厚膜分数,我们确认下是否蛋白质就足以应分馏成沉重的膜。正如预期的那样,一个类似的趋势在细胞提取物是暂时性的转染细胞(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba;上面板,PR8)。验证观察到的结果不是因为病毒毒株的独特特征,我们重复了同样的实验使用其他PB1-F2变异来自一个不同的应变(加州(CA) / / 04/09 (H1N1)突变体)gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba并证明这些变体也只出现在重膜分数(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba;88 w和58 w)。相比之下,c端截断版本PB1-F2编码57氨基酸(表示12 s),低致病性亚型的主要人口,主要在胞质分数。免疫荧光显微镜支持这些生化观察。与先前的报告相一致gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}完整的蛋白质(PR8 88 w和58 w)明显局部线粒体(而不是其他细胞器,包括ER和过氧化物酶体;gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba),N66S多态性gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba在PB1-F2并不影响其亚细胞定位(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)。然而,12个年代变体弥漫性局部细胞质(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。观察到的亲和力的长篇PB1-F2变异线粒体进一步证实了使用gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba进口试验(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

全身PB1-F2内膜空间物体定位gydF4y2Ba

然后分析了sub-mitochondrial PB1-F2变异的本地化。当从PB1-F2-expressing细胞线粒体分离处理高盐缓冲氯化钾(1米),没有一个变量提取颗粒(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba),这表明PB1-F2没有联想到妈妈通过静电相互作用。低渗的线粒体肿胀也未能PB1-F2释放到上清液(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba),证明蛋白质在矩阵或集成和/或与MIM关联紧密。蔗糖密度梯度离心法证明PB1-F2 co-fractionates CoxIV,一种内在的MIM蛋白(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。然而,治疗线粒体颗粒与碱性溶液的pH值(11.5)允许我们提取PB1-F2所属的(部分)和线粒体蛋白(CytgydF4y2BacgydF4y2Ba从可溶性分数,如果和Hsp60) (gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba;右车道)。这些蛋白质的行为不同于集成的妈妈或MIM蛋白质(Mfn1、进行Mfn2 Tom20和CoxIV)。gydF4y2Ba

我们证实PB1-F2抗蛋白酶K消化没有洋地黄皂苷,而这是完全消化的洋地黄皂苷浓度较低,特别是permeabilizes妈妈,排除的可能性PB1-F2本地化到矩阵(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。病毒蛋白质拓扑结构进一步证实了利用semi-permeabilized细胞gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba监控的可访问性PB1-F2抗体。PB1-F2可见当妈妈是专门permeabilized洋地黄皂苷浓度(比较低gydF4y2Ba补充图4 a, bgydF4y2Ba),这与蛋白水解作用的结果是相一致的。然后分析了线粒体的形态的结构特点有针对性的PB1-F2使用生物荧光共振能量转移(BRET)的测定gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba在活细胞。金星——和之间的交互NanoLuc荧光素酶(NLuc)标记PB1-F2但不是其他Venus-tagged蛋白成功监控(gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba)。这同型的互动结合互补分析(生物分子荧光互补)gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba显示PB1-F2复杂分子由三个以上(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。综上所述,这些生化证据表明PB1-F2既定定位线粒体内膜空间(IMS) MIM紧密相关,并组装成高度有序的低聚物。gydF4y2Ba

Tom40-dependent PB1-F2的导入线粒体gydF4y2Ba

确定了PB1-F2导入到线粒体IMS,接下来我们研究这种蛋白质是否可以通过外膜的移位酶(汤姆)机械主机导入系统gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。使用一种RNA干扰的方法,我们对海拉细胞与代表gydF4y2Ba汤姆gydF4y2Ba特殊技能(gydF4y2BaTOM22gydF4y2Ba- - - - - -,gydF4y2BaTOM40gydF4y2Ba,或gydF4y2BaTOM70gydF4y2Ba-)小干扰rna (siRNAs)和汤姆确认目标蛋白质被有效地抑制> 80% (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

正如所料,Tom40击倒,显然这是一个主要的妈妈进口通道,抑制进口线粒体matrix-targeted增强型绿色荧光蛋白(Su9-eGFP;gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba;中间图片);然而,妈妈的整合蛋白(Omp-25 MARCH-V / MITOL和进行Mfn2)是影响Tom40损耗(gydF4y2Ba补充图6 a - cgydF4y2Ba已报道)gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。我们观察到线粒体进口PB1-F2也极大地抑制了Tom40击倒,导致明显的胞质扩散分布(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,中间图片)。消除非目标效应的可能性,我们测试了二次siRNAs反对gydF4y2BaTOM40gydF4y2Ba,对寡核苷酸(gydF4y2BaTOM40gydF4y2Ba_gydF4y2Ba# BgydF4y2Ba和gydF4y2BaTOM40gydF4y2Ba_gydF4y2Ba# CgydF4y2Ba)引起的类似损伤线粒体PB1-F2纳入观察Su9-eGFP构造(gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba)。相比之下,Tom70击倒,这是一个重要的组件的易位妈妈蛋白质与多跨膜域gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba,并不影响线粒体Su9-eGFP或PB1-F2(进口gydF4y2Ba图3 b, cgydF4y2Ba,底部图片和gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba),尽管多面体的集成进行Mfn2 MARCH-V / MITOL和妈妈蛋白质,作为控制,显著抑制Tom70损耗(gydF4y2Ba补充图6 b, cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

有趣的是,我们证明了PB1-F2易位到线粒体不依靠规范化汤姆机械因为内生Tom20或Tom22生产的衰减,这是中央导入受体识别的带正电的氨基端presequence proproteins,并不影响PB1-F2定位在线粒体(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图7 bgydF4y2Ba)。的确,gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba分析显示缺乏线粒体靶向序列(MTS) PB1-F2蛋白(gydF4y2Ba补充图8gydF4y2Ba预测的基本残留),替换为线粒体定位至关重要gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba并没有改变其易位(gydF4y2Ba补充图8 bgydF4y2Ba)。具体来说,遗漏的几个基本残留PB1-F2 c端地区的潜在不稳定变异蛋白质gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图8 cgydF4y2Ba)。总的来说,这些发现表明,病毒蛋白在线粒体的易位机制有别于规范化宿主蛋白导入系统,通常是由Tom20 / Tom22受体(和Tom70前体疏水presequence),这可能占PB1-F2 MTS的独特的结构属性。gydF4y2Ba

中有缺陷的线粒体动力学PB1-F2-expressing细胞gydF4y2Ba

检查PB1-F2导入线粒体,过程中我们发现,线粒体的形态平衡网络是广泛转向分散结构/ PR8-infected细胞与未感染的细胞(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图9gydF4y2Ba)。当细胞被质疑反对/ CA / 04/09应变,这自然缺乏PB1-F2基因(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba;编码只有11个氨基酸),绝大多数线粒体表现出形态类似于细胞无毒性(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,底部面板和gydF4y2Ba补充图9gydF4y2Ba)。我们因此量化PB1-F2-expressing细胞线粒体形态,证实,> 50%的人口表现出支离破碎的线粒体(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba;红酒吧)。这种现象也观察到在瞬变表达全长PB1-F2变异细胞,而模拟- 12 s variant-transfected细胞表现出没有明显异常表型(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。有趣的是,点状的线粒体的积累在PB1-F2-expressing细胞的表达水平与线粒体gtpase(进行Mfn2 Drp-1, Mfn1)参与线粒体动力学,除了略微减少长OPA-1亚型(L-OPA-1),调节线粒体融合(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。这些发现表明,线粒体PB1-F2的积累导致缺陷线粒体动力学和提高的可能性,PB1-F2的生理功能是调节mitochondrial-mediated细胞功能。gydF4y2Ba

线粒体内进行PB1-F2减弱ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba

我们研究了ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在PB1-F2-expressing细胞由于蛋白水解处理是减少L-OPA-1ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba端依赖过程gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。虽然线粒体的细胞无毒性与Δ均匀染色gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba敏感染料MitoTracker红色(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba;上图),线粒体/ PR8-infected细胞不均匀染色显示,这些少强烈彩色线粒体可能与PB1-F2 co-localization(底层数据,用红线圈起的部分地区)。符合这些观察,海拉细胞转染质粒与全身PB1-F2变体普遍丧失Δ表现出类似的模式gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba,但这些昏暗的染色中,并未观察到线粒体的细胞表达12 s变体或/ CA / 04/09-infected细胞(gydF4y2Ba补充图10gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

此外fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)分析验证Δ之间的关系gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba和PB1-F2表达因为另一个Δ的荧光强度gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba敏感的染料,tetramethylrhodamine甲酯(TMRM),显著减少/ PR8-infected细胞(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba;红线在右面板)与未感染的细胞(黑线)。我们假设这种效果是由于PB1-F2在线粒体的积累,因为细胞转染质粒编码长篇PB1-F2变体也保留了ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba减少表型(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba;PR8和88 w),尽管其它流感病毒M2蛋白质,proton-selective离子通道,12 s没能证明这种效果(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图11gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

然后我们监控PB1-F2表达式及其Δ动能的状况gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba减少J774A。1米一个crophages infected with A/PR8. The ΔψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba感染细胞的检测到Mitoprobe JC-1开始减少~ 9 h后感染(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba;左面板),此概要的表达式模式匹配PB1-F2(右屁股)以及L-OPA-1处理细胞内(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Baa和b,乐队;和gydF4y2Ba补充图11 bgydF4y2Ba)。PB1-F2易位到线粒体没有受到CCCP-treatment (gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)也许是因为蛋白质不能穿过MIM (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。综上所述,这些观察结果表明,线粒体靶向PB1-F2导致Δ的衰减gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

PB1-F2功能线粒体裂变通路的上游gydF4y2Ba

鉴于PB1-F2在线粒体的积累会导致显著的线粒体分裂,我们试图阐明某些分子是否参与线粒体动力学与这一现象。PB1-F2-induced线粒体分裂细胞中没有观察到治疗Drp-1-specific核,广泛而细长的小管被发现(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba;中间行;PR8 88 w和58 w)。这些表型表明,线粒体分裂观察发生在野生型细胞通过Drp-1-dependent通路和PB1-F2上游Drp-1的级联。我们下一个测试的影响PB1-F2与减毒内生OMA-1细胞,线粒体metallopeptidase锌,因为蛋白酶介导L-OPA-1退化和负面压力条件下调节线粒体融合gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。在这些细胞中,线粒体仍有待细长结构,即使在PB1-F2变异的存在,且没有明显的点状的线粒体(gydF4y2Ba图6 a, bgydF4y2Ba)。这些结果表明,病毒蛋白OMA-1的上游。总的来说,这些发现强调PB1-F2机制参与线粒体分裂的早期通路(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba这个过程OMA-1激活)和潜在的联系。gydF4y2Ba

PB1-F2抑制rig - i信号通路gydF4y2Ba

上述实验表明,流感病毒蛋白PB1-F2有可能干扰基本线粒体功能。评估这种蛋白质的生理相关性在宿主细胞中,我们试图确定在mitochondrial-mediated PB1-F2免疫反应的影响,rig - i信号通路。我们检查是否的线粒体易位PB1-F2调节IFN-βRIG-I-mediated激活和核转录因子κB (NF-κB)记者结构。Myc-tagged小牛的过度表达,rig - i的下游衔接分子,强有力地激活IFN-β和NF-κB荧光素酶(记者gydF4y2Ba图7 a, bgydF4y2Ba;黑条)如前所述gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。然而,全身的co-expression PB1-F2变异,而不是12个年代,随着小牛足以抑制MAVS-dependent rig - i的激活信号通路在剂量依赖性的方式(gydF4y2Ba图7 a, bgydF4y2Ba;PR8, 88 w和58 w),即使有等量的小牛表达式(插图的屁股)或其线粒体定位(gydF4y2Ba补充图12gydF4y2Ba)。PB1-F2变异的抑制活动也证实通过刺激细胞转染质粒表达rig - i,小牛的上游分子(gydF4y2Ba补充图13gydF4y2Ba)。此外,聚(我:C)交付的HEK293细胞磷酸化的瞬时转染刺激内源性干扰素调节因子3 (IRF-3) IRF-3激活的标志,由全身抑制PB1-F2变异(gydF4y2Ba补充图13 bgydF4y2Ba)。符合这些发现,生产的内源性促炎细胞因子il - 6在回答/ PR8感染大幅下调而/北京/ 262/1995 (H1N1)病毒编码氨基酸PB1-F2 57 (gydF4y2Ba补充图13 cgydF4y2Ba)。此外,细胞Δ下降gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba由于长篇PB1-F2变异体的表达更容易感染了一种重组水泡性口炎病毒比细胞表达12年代由于mitochondrial-mediated免疫缺陷(gydF4y2Ba补充图13 dgydF4y2Ba)。验证的观察到抑制效应PB1-F2并非由于诱导细胞凋亡在我们的实验条件下,我们证实细胞表达完整的变体仍然可行的通过检查细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba版本(gydF4y2Ba补充图。14gydF4y2Ba)或激活caspase-3或聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP;gydF4y2Ba补充图。14 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

测试是否PB1-F2拓扑的线粒体信号事件对其抑制作用至关重要,我们设计了嵌合蛋白质将错误定位的妈妈。我们从Omp-25 c端跨膜段融合,这是一个妈妈蛋白质,PB1-F2变异和证实了这些突变体(PR8-Omp25和88 w-omp25)集成到妈妈没有衰减ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图。15 a, bgydF4y2Ba)。引人注目的是,无论是嵌合蛋白质表现出任何功能影响RIG-I-mediated激活IFN-β而完整的蛋白质(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。我们相信PB1-F2-induced rig - i的抑制途径并非归因于小牛齐聚反应的干扰,因为PB1-F2变体的存在不影响结构MAVS-MAVS互动(gydF4y2Ba补充图16gydF4y2Ba)。在一起,这些发现表明,PB1-F2徒小牛激活下游损害RLRs-dependent抗病毒信号,进一步强调Δ的重要性gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在移植MAVS-mediated信号转导gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

PB1-F2抑制激活NLRP3 inflammasomesgydF4y2Ba

除了rig - i信号通路,线粒体也作为一个平台,激活NLRP3 inflammasomes,参与早期的炎症反应通过传感细胞损伤或压力,包括病毒感染gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。激活NLRP3 inflammasomes开始通过一multi-complex适配器蛋白质的形成,凋亡和speck-like包含半胱天冬酶蛋白(ASC)和procaspase-1招聘领域。这个协会是紧随其后的是procaspase-1其成熟的处理形式,最终导致IL-1β成熟gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。我们与NLRP3由co-transfecting细胞重组NLRP3激活,ASC, procaspase-1 pro-IL-1βIL-1β的分泌表达质粒和评估gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba;控制)如前所述gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。除了rig - i通路,完整的表达PB1-F2变体(PR8, 88 w, 58 w)显著抑制IL-1β的分泌,类似于解偶联蛋白2(作为一个积极的控制gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba),而12 s废除的影响(gydF4y2Ba图7 d, egydF4y2Ba)尽管类似胞质pro-IL-1β表达水平(gydF4y2Ba图7 egydF4y2Ba;中间污点)。再次,MOM-localized PB1-F2失活突变体未受影响的NLRP3 inflammasomes (gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba插图图,gydF4y2Ba补充图。15 cgydF4y2Ba)。有趣的是,当细胞治疗gydF4y2BaTOM40gydF4y2Ba核,IL-1β诱导的抑制全身PB1-F2变异也不完整,导致经济复苏NLRP3激活(gydF4y2Ba补充图。15 dgydF4y2Ba)。这些发现表明,线粒体靶向PB1-F2充当消极的监管机构NLRP3 inflammasomes。gydF4y2Ba

我们还研究了ASC齐聚反应,激活的标志组装NLRP3 inflammasomes, PB1-F2变体的存在。减少累积的高阶低聚物是专门观察线粒体靶向版本的变异时(gydF4y2Ba图7 fgydF4y2Ba)。此外,我们确认NLRP3招聘线粒体,上游事件的NLRP3 inflammasome形成gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba是禁止PB1-F2的存在(gydF4y2Ba补充图17gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

综上所述,这些数据表明ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba引入耗散易位的甲型流感病毒PB1-F2进入线粒体与mitochondrial-mediated先天免疫缺陷的严重程度,包括rig - i的信号通路和激活NLRP3 inflammasomes。gydF4y2Ba

有些病毒编码的基因,有可能抑制宿主细胞免疫力由于病毒逃避策略。这种基因产物的一个例子是丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶NS3/4A,这proteolytically劈开小牛并最终废除mitochondrial-mediated抗病毒信号gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}。甲型流感病毒还编码一些援助逃脱免疫反应的基因产物,例如,非结构蛋白1,rig - i通路的抑制剂通过其绑定rig - igydF4y2Ba^39gydF4y2Ba,而PB1-F2会使mitochondrial-mediated免疫反应的衰减ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在目前的研究证明。gydF4y2Ba

编码的基因产物PB1-F2 PB1 + 1阅读框的转变,是一个独特的多肽与现有自然变异的不同长度从11到87或90氨基酸。令人奇怪的是,高致病性H5N1亚型和大流行(1918年、1957年和1968年)甲型流感病毒株往往长编码多肽;因此,我们推测这种分子签名可能会影响致病性(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。在这方面,以往的研究表明,与87年PB1-F2氨基酸colocalizes线粒体gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}提出的,它的目标是由c端地区充当MTS的多肽gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}和低致病性亚型(经常失踪gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。符合这些假设,我们表明,完整的版本的不同病毒株PB1-F2专门把进入线粒体,我们进一步揭示机械洞察病毒蛋白质是如何纳入的细胞器。gydF4y2Ba

我们首先证明PB1-F2定位线粒体与MIM IMS和紧密的同事(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。PB1-F2序列资料,有一个非常基本的等电点(~ pKa > 10),支持这样的看法,即PB1-F2有静电作用与带负电荷的膜。我们接下来观察到膜相关PB1-F2在膜形成一个稳定的同型的复杂,复杂的是一个高度有序的组装,其中包含三个多分子(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。鉴于PB1-F2在线粒体的积累导致线粒体功能缺陷如以下部分所述,这个复杂可能会与其他线粒体蛋白质。最后,我们澄清PB1-F2易位到线粒体汤姆依赖一个特定的组件,Tom40进口通道(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。有趣的是,我们的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba进口的分析清楚地表明,PB1-F2绕过一般导入受体Tom20 / Tom22和直接目标是Tom40通道可能逃避宿主细胞监测在导入。总的来说,我们的研究结果提供了一种机制PB1-F2导入线粒体和线粒体等本地化。还需要进一步的研究来确定其他病毒蛋白质(包括另一个流感病毒蛋白),线粒体有关联,并阐明这些蛋白质劫持宿主是否进口机械。gydF4y2Ba

我们的结果从流感A-infected细胞明显证明PB1-F2把进入线粒体,导致Δ的丧失gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba,从而导致异常线粒体碎片(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充无花果9和10所示gydF4y2Ba)。最可能的解释Δ的耗散gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba由PB1-F2是带正电的形成PB1-F2寡聚物的MIM导致呼吸链复合物中的一些功能缺陷,最终Δ广泛的异质性gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba。重要的是,PB1-F2-induced线粒体碎片没有观察到的细胞或Drp-1 OMA-1小干扰rna治疗被单独耗尽,这表明线粒体发生裂变通过Drp-1-dependent通路(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。特别是,OMA-1-mediated L-OPA-1的处理是一个与压力相关的细胞反应gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba,因此我们推测线粒体靶向PB1-F2可能引发OMA-1激活和诱导等点状的线粒体。gydF4y2Ba

我们还透露,细胞线粒体异常表现出缺陷mitochondrial-mediated先天免疫反应,包括rig - i的激活信号通路和NLRP3 inflammasomes (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。这些观察是我们先前的调查结果,有趣的细胞完全缺乏线粒体融合由于目标缺失gydF4y2BaMfn1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba进行Mfn2gydF4y2Ba也有对RNA病毒严重受损的免疫反应gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。Arnoult和他的同事们gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba报道,OPA-1击倒的负调节病毒诱导的转录激活因子NF-κB和耗尽Drp-1裂变的因素,从而上调rig - i信号通路。细胞压力,包括病毒感染,并不总是诱导线粒体碎片gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba},因此我们的研究结果强调了生理的影响通过Δ甲型流感病毒逃避宿主免疫gydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba监管与线粒体有关的动力学。虽然我们相信ΔgydF4y2BaψgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba操纵PB1-F2与先天免疫是非常重要的,我们不能排除这种可能性,线粒体靶向PB1-F2影响先天免疫通过另一个未知的路线。此外,PB1-F2-induced线粒体功能障碍也可能影响的致病性继发细菌感染。她从来和他的同事们报告说,/ PR8-challenged小鼠表现出明显的减肥和有更大的对肺炎所致gydF4y2Ba链球菌引起的肺炎gydF4y2Ba革兰氏阳性细菌,引起继发感染gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。值得注意的是,致病性表型是减少使用时的截断版本PB1-F2多肽gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba},这与缺乏c端区域,对线粒体易位是重要的。一般来说,继发性细菌感染与严重程度和增加杀伤力,和未来的研究旨在评估作用的PB1-F2微分病原体感染的易感性可能是有趣的。gydF4y2Ba

线粒体参与各种细胞过程和似乎也作为一个平台一线对RNA病毒先天免疫。本研究的结果显示线粒体的作用针对免疫逃避的PB1-F2 PB1-F2易位到细胞器的抑制可能作为一种潜在的治疗目标。gydF4y2Ba

试剂gydF4y2Ba

挺是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。MitoTracker红色CMXRos, MitoProbe JC-1试验装备和TMRM从分子探针/购买英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和bis (sulfosuccinimidyl)辛二酸盐(BS3)获得热科学(美国罗克福德,IL)。Furimazine是由Promega(美国麦迪逊,WI)和聚(我:C)从InvivoGen购买(美国圣地亚哥,CA)。所有其他试剂级生化研究。gydF4y2Ba

细胞系、病毒和动物gydF4y2Ba

HEK293细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;GlutaMAX GIBCO BRL)补充1%,青霉素(100 U mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})链霉素(100μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}牛),和10%牛血清有限公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和37°C。海拉,A549和J774A。1cell lines were maintained in DMEM medium supplemented with 1% GlutaMAX, penicillin (100 U ml^{−1gydF4y2Ba})链霉素(100μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),和10%的胎牛血清。骨骨髓来源的巨噬细胞从老鼠的胫骨和股骨,准备和细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清,1%gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺和30% L929细胞上清液含有巨噬细胞集落刺激因子在37°C 5天如前所述gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。流感病毒A / PR8株(H1N1)是生长在尿囊腔10天大的肥沃的鸡蛋gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba2天35°C,产生病毒是储存在−80°C,直到感染实验。流感病毒一种/ CA / 04/09 (H1N1)是一个慷慨的礼物教授喜田岛Kawaoka(东京大学)。动物实验(六至八周大女C57BL / 6 j小鼠,杰克逊实验室)被批准的动物委员会医学科学研究所的,东京大学。gydF4y2Ba

抗体gydF4y2Ba

anti-PB1-F2 (/ CA / 04/09突变体;88 w, 58 12 w和s;1:50 0)所产生的抗体是免疫兔子PB1-F2氨基端区域,这是由多肽合成(MEQEQDTPWTQSTEHTNTQKRESGRQT)。单克隆抗体对PB1-F2 (/ PR8株;1:10)被维克多Wixler和善的天才gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba(明斯特大学医院医学院)。1:1,000 Anti-Mfn1 (h - 65), anti-Tom40 (h - 300, 1:1,000) anti-cytochromegydF4y2BacgydF4y2Ba(1:50 0 h - 104), anti-calnexin (C-20 1:1,000) anti-IRF-3 (fl - 425, 1:1,000)和anti-Myc(14、1:1,000)多克隆抗体和anti-AIF (e 1, 1:1,000) anti-β-actin (C4,下),anti-Mfn2 (XX-1 1:1,000)和anti-Tom20(不会,1:50 0)单克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。anti-CoxIV (3 e11施用)anti-PDI (C81H6 1:200)和phospho-IRF-3 (Ser396;4 d4g 1:1,000)兔单克隆抗体和anti-Hsp60 (D307 1:1,000) anti-Tfam (1:1,000) anti-PARP (1:1,000) anti-caspase-3(1:1,000)和anti-cleaved caspase-3 (Asp175;1:1,000)多克隆抗体购自细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。Anti-Tom22 (1 c9-2 1:1,000)和anti-FLAG (M2, 1:1,000)单克隆抗体被Sigma-Aldrich提供。单克隆抗体血凝素(HA;HA.11 1:1,000)和Myc (9 e10, 1:1,000)获得Covance(普林斯顿,纽约,美国),和一个多克隆抗体对HtrA2 (Omi;1:200)购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。anti-cytochrome Anti-OPA-1 (1:1,000)gydF4y2BacgydF4y2Ba(1:50 0)和anti-Drp-1(1:1,000)单克隆抗体由BD生物科学(美国加利福尼亚州圣何塞),和一个anti-mitochondrial热休克蛋白70 (mtHsp70;下)单克隆抗体获得亲和力BioReagents(美国有限公司黄金)。抗流感病毒M2蛋白(1:1,000)单克隆和人类小牛(1:1,000)和IL-1β(1:1,000)多克隆抗体购自Abcam(美国Cambridge, MA)和反IL-1β(1:50 0)和anti-mouse il - 6(1:50 0)抗体用于ELISA获得eBioscience(美国圣地亚哥,CA)。Alexa的萤石488 (1:50 0)anti-mouse单克隆和Alexa萤石488(1:50 0)和Alexa萤石568(1:50 0)多克隆抗体anti-rabbit从分子探针/表达载体,获得和Cy3-conjugated羊anti-mouse(1:1,000)单克隆抗体从杰克逊ImmunoResearch实验室(美国西树林,PA)。gydF4y2Ba

质粒gydF4y2Ba

PB1-F2 (PR8)编码基因来自于一位/ PR8-infected HEK293细胞,和互补DNA(互补)subcloned成pcDNA3.1(−)(表达载体)向量。质粒表达PB1-F2变体(88 w, 58 12 w和s)是由切断PB1-F2 amplimers,使用pPolI / CA04-PB1-F2-stop88W生成gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba(喜田岛Kawaoka教授的礼物)作为PCR模板,到pcDNA3.1 (−)。构建PB1-F2(12)质粒的氨基端标记抗原决定基标记,扩增片段是subcloned菌进行基因进入p3×FLAG-CMV-10 (Sigma-Aldrich)向量。PR8 -和88年w-omp25融合表达质粒是由一段编码的最后37氨基酸鼠Omp25在坐标系与每个PB1-F2 cDNA 3′的地区。Fusion-tagged PB1-F2 (88 w)质粒用于BRET饱和度分析由切断PCR amplimer到向量编码一个氨基端金星或者NLuc (Promega)标记如前所述gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。所有PCR实验使用PrimeSTAR DNA聚合酶(豆类、东京、日本)。以下引物(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)被用来放大PB1-F2变体:PR8, TK797 / TK798;88 w, TK754 / TK755;58 w, TK754 / TK780和12个年代,TK754 / TK779。质粒编码人类NLRP3 ASC, caspase-1 pro-IL-1β,小牛(Myc和金星标记),解偶联蛋白2,rig - i (1 - 250), Omp25和matrix-targeted二氢叶酸还原酶是前面描述的gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。本研究中使用的所有结构经DNA测序(ABI 3100)。gydF4y2Ba

线粒体分离和蛋白质水解gydF4y2Ba

线粒体分离和蛋白质水解进行了化验如前所述gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba有轻微的修改。简单地说,病毒感染(A / PR8)或plasmid-transfected HEK293细胞(22 h后感染/转染)用冷洗一次1×磷酸盐(PBS);pH值7.2),刮掉培养板,细胞溶解在800年μl同质化缓冲区(20毫米玫瑰(pH值7.5),蔗糖70毫米和220毫米甘露醇)30中风Dounce均质机。匀浆离心机在800年gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟沉淀细胞核,得到的上层清液进一步离心机在10000gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟(4°C)沉淀原油线粒体分数。得到的上层清液进一步离心机在100000gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟(4°C)沉淀光膜的细胞器,最后浮层被用作胞质分数。gydF4y2Ba

蛋白酶K电阻测定,分离线粒体颗粒与均化缓冲洗一次。然后,颗粒在缓冲和处理resuspended蛋白酶K(100μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})没有或存在0.05%的洋地黄皂苷(重量/体积)。冰蛋白水解反应进行了15分钟,和反应物与表示抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2Ba线粒体进口分析gydF4y2Ba

无细胞蛋白质合成的PB1-F2变体(PR8, 88 w和58 w)进行使用TNT耦合的小麦胚芽提取系统(Promega)根据制造商的协议。合成的蛋白质与线粒体孵化隔绝HEK293细胞导入缓冲区(20毫米HEPES-KOH (pH值7.4),250毫米蔗糖,2.5毫米醋酸镁,氯化钾25毫米和2.5毫米EGTA) 25°C。然后反应物从每个时间点采用了蛋白酶K(μg 50毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),以避免非特异性结合的妈妈,和反应物进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba

Sub-mitochondrial分馏gydF4y2Ba

孤立的线粒体(悬浮在100μl同质化缓冲区)在900年被稀释μl低渗的缓冲区(10毫米HEPES-KOH缓冲区(pH值7.5)包含0.5毫米EDTA和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))和维护在冰上30分钟引起肿胀。混合物然后用近五次30年代每个离心排在第5000位gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。在200000年得到的上层清液进一步旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 45分钟,5毫米的颗粒在100年resuspendedμl HEPES-KOH缓冲区(pH值7.5),其次是分层在线性梯度(0.8到1.6米)的蔗糖低渗的缓冲区,最后离心机在100000gydF4y2BaggydF4y2Ba15 h在4°C的最适条件TL超离心机(贝克曼库尔特)。离心后,200 -μl分数被收集并进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba

BRET饱和度测定gydF4y2Ba

BRET化验都是表现如前所述gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba用细微的修改。总之,HEK293细胞(2.5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞每)与一个常数co-transfected数量(5 ng) NLuc-tagged PB1-F2 (88 w)质粒和越来越多的Venus-tagged构造使用Lipofectamine 2000试剂(表达载体)。细胞收获21 h后转染和转移的白色96孔酶标。NLuc衬底(furimazine;5μM)补充说,分析了板通过BRET饱和度测定使用Flexstation 3标(分子设备)在37°C。gydF4y2Ba

共焦显微镜gydF4y2Ba

细胞被镀在盖玻片12-well板块(5×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞每),第二天,这些细胞被感染了甲型流感病毒(或使用X-tremeGENE惠普与表达质粒转染试剂(罗氏))。22小时后感染(24 h后转染),这些细胞被固定为3.7%甲醛10分钟,permeabilized Triton x - 100 1×1% PBS (pH值7.2),牛5%牛血清和阻塞。PB1-F2检测使用单克隆(PR8)或多克隆(88 w, 58 12 w和s)主要抗体和Alexa萤石488 -共轭二次抗体,和线粒体可视化使用mitochondrial-targeted红色荧光蛋白(Mito-RFP)。Δ的gydF4y2BaΨgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba被监控MitoTracker红色CMXRos如前所述gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba,所有的细胞都是由共焦显微镜成像(卡尔蔡司LSM510)。一种抗流感病毒M2蛋白单克隆抗体被用来检测/ CA / 04/09-infected细胞。gydF4y2Ba

如前所述执行semi-intact细胞试验gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。简而言之,PB1-F2-expressing海拉细胞被固定为3.7%甲醛10分钟,permeabilizedμg要么400毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(pre-permeabilized)或2000μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}洋地黄皂苷在PBS(正常状态),然后对免疫荧光显微镜进行处理。gydF4y2Ba

核治疗和线粒体蛋白导入试验gydF4y2Ba

RNA干扰的可拆卸的实验中,小干扰RNA(感觉strand-only显示)21核苷酸对人类gydF4y2BaTOM20gydF4y2Ba(5′-aguuaccugaccuuaaagatt-3′), hgydF4y2BaTOM22gydF4y2Ba(5′-gcacauugaucuaucuaaatt-3′), hgydF4y2BaTOM40gydF4y2Ba(5′-caacugguuggcaacgguatt-3′), hgydF4y2BaTOM40_ # BgydF4y2Ba(5′-cgguauaaaucauguuuautt-3′), hgydF4y2BaTOM40_ # CgydF4y2Ba(5′-gguauaaaucauguuuauatt-3′), hgydF4y2BaTOM70gydF4y2Ba(5′-gacaauaagaaggaauguutt-3′), hgydF4y2BaTOM70_ # BgydF4y2Ba(5′-gaaugaccucugacuuuaatt-3′), hgydF4y2BaDrp-1gydF4y2Ba(5′-gcagaagaaugggguaaautt-3′)和hgydF4y2BaOMA-1gydF4y2Ba(5′-gaucaauuggguuauucautt-3′)购买的试剂盒。海拉细胞转染了50纳米核(最终浓度)24小时内两次使用Lipofectamine 2000(表达载体)制造商的协议。在初始治疗后72 h, siRNA-treated细胞转染的指示使用X-tremeGENE惠普试剂紧随其后的是一个表达质粒gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba导入试验。消极的时候小干扰rna(试剂盒)是用作控制控制。gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

Δ的gydF4y2BaΨgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba分析了BD FACSCalibur (BD生物科学)阳离子荧光染料TMRM(分子探针/表达载体)。细胞(~ 1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})感染/ PR8或质粒转染是洗一次1×PBS (pH值7.2)和收获到一个离心管。细胞被resuspended在1毫升1×PBS (pH值7.2)包含2μM TMRM和孵化为30分钟37°C。洗后三次1×PBS (pH值7.2),流式细胞术分析。数据分析和图表是准备使用FlowJo软件(树明星,Inc .)。gydF4y2Ba

Dual-luciferase记者化验gydF4y2Ba

HEK293细胞被镀在24-well板块(2×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞每)。第二天,这些细胞被co-transfected 100 ng的荧光素酶报告质粒(p125luc或pELAM), 2.5 ng Renilla荧光素酶内部控制向量phRL-TK (Promega),和每个表示表达质粒使用Lipofectamine 2000试剂(表达载体)后,制造商的协议。空向量(pcDNA3.1(−))被用来保持等量的DNA在每个。细胞收获24 h后转染和分析使用dual-luciferase记者分析GloMax 20/20n光度计(Promega)。每个实验至少重复三次。gydF4y2Ba

调整试验的NLRP3 inflammasomesgydF4y2Ba

HEK293细胞被镀24-well板块(4×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞每)。第二天,这些细胞被co-transfected pCA7-NLRP3 30 ng, 5 pCA7-ASC-FLAG ng, 5 ng pCA7-procaspase-1和150 ng pCA-pro-IL-1β和每一个使用Lipofectamine 2000表示表达质粒。空向量(pcDNA3.1(−))被用来保持等量的DNA在每个。转染24小时后,澄清中收集上层清液,并通过ELISA IL-1β分泌物进行了分析。每个实验至少重复三次。gydF4y2Ba

检测ASC齐聚,上述细胞被洗一次1×PBS (pH值7.2),收获在离心管中,然后在150毫米resuspended氯化钠溶液溶解紧随其后15中风21-gauge针通过注射器。离心后(12000gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟),阐明了上层的交联与4毫米BS3 30分钟之后在室温下通过孵化50 mM Tris-HCl缓冲区在室温下15分钟完全淬火交联反应。由此产生的样本决定10% sds - page和anti-FLAG单克隆抗体免疫印迹。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

方差分析测试(GraphPad QuickCalcs)是用于统计分析。一个gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

本文引用:gydF4y2BaYoshizumi, T。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba甲型流感病毒蛋白质PB1-F2把线粒体通过Tom40渠道和损害先天免疫。gydF4y2BaCommun Nat。gydF4y2Ba5:4713 doi: 10.1038 / ncomms5713 (2014)。gydF4y2Ba

我们感激Koji Okamoto(大阪大学、日本)和托马斯•兰格(科隆大学)为他们的有价值的评价研究。我们感谢技术支持的研究支持中心,医学科学的研究生院,九州大学的荧光测量和裕Fuchigami技术援助与DNA克隆和测序。anti-PB1-F2 (/ PR8株)单克隆抗体是一种礼物从维克多Wixler(明斯特大学医院医学院)。我们也感谢喜田岛Kawaoka(东京大学)请提供pPolI / CA04-PB1-F2-stop88W质粒和/ CA / 04/09 (H1N1)病毒,秀树长谷川(国家传染病研究所、日本)/北京/ 262/95 (H1N1)病毒,迈克尔?威特(田纳西大学的)重组水泡性口炎病毒和维多利亚艾伦(曼彻斯特大学的)ER-green质粒。这项工作得到了jsp KAKENHI拨款(25115515,26291032,和26620135 t),九州大学跨学科课程在教育和研究开发项目(t), Uehara纪念基金会(t),武田科学基金会(t),花王艺术与科学基金会(T.K.和T.I.),东京生化研究基金会(T.I.),医疗和制药研究Mochida纪念基金会(T.I.),并从日本世川科研资助科学学会(T.Y.)。这项研究也在一定程度上支持的格兰特对医学科学研究所的联合研究项目,东京大学(t)和研究员的日本促进社会科学(运行系统)。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 科学学院生物学系,九州大学,6-10-1 Hakozaki, 812 - 8581年,日本福冈gydF4y2Ba

   佐藤Yoshizumi Osamu佐佐木,Shun-ichiro川端康成& Takumi KoshibagydF4y2Ba

2. 病毒感染,传染病控制、国际传染病研究中心研究所的医学科学,东京大学,108 - 8639年,日本东京gydF4y2Ba

   Ichinohe武gydF4y2Ba

3. 分子生物学,医学研究生院,九州大学,812 - 8582年,日本福冈gydF4y2Ba

   Hidenori Otera & Katsuyoshi历经甲级gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

T.Y.,T.I. and O.S. performed most of the experiments. H.O. established the knockdown cell lines and performed the semi-intact cell assay, and S.-i.K. provided reagents. T.Y., T.I., K.M. and T.K. Analyzed data and interpreted all experimental results. T.K. designed the overall direction and contributed to writing the paper.

相应的作者gydF4y2Ba

Takumi Koshiba对应。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有竞争的经济利益。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba

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