MCIDASgydF4y2Ba突变导致黏毛清除障碍与减少产生多个活动纤毛gydF4y2Ba

减少生成多运动纤毛(RGMC)是一种罕见的粘液纤毛清除疾病。受影响的人遭受反复感染的上呼吸道和下呼吸道，因为多个运动的呼吸纤毛的数量大大减少。在这里，我们报告了隐性功能丧失和错义突变gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba-编码多毛蛋白，该蛋白被证明促进多毛细胞分化的早期步骤gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍gydF4y2Ba。gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变的呼吸上皮细胞每个细胞只携带一或两根纤毛，缺乏纤毛运动相关蛋白(DNAH5;CCDC39)，见于原发性纤毛运动障碍。与这一发现一致，foxj1调节轴突运动蛋白的表达在呼吸细胞中缺失gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba变异个体。gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba当已知引起RGMC的突变时，在gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变的呼吸细胞，与其下游活动一致。因此，我们的研究结果确定了Multicilin是人类多毛细胞分化的CCNO/FOXJ1的关键调节因子，并突出了包含5q11的区域gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba作为RGMC的基础。gydF4y2Ba

每个纤毛呼吸细胞被多个纤毛覆盖，以协调的搏动模式大力跳动，将吸入的颗粒、细胞碎屑和困在粘液中的微生物移动到喉咙gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}。这种被称为粘液纤毛清除的机制对预防慢性气道疾病很重要。先天性疾病损害纤毛粘液清除，如原发性纤毛运动障碍(PCD);MIM244400)和囊性纤维化(MIM219700)是众所周知的反复上呼吸道和下呼吸道感染的原因。然而，在PCD和囊性纤维化中，纤毛搏动功能障碍或粘液粘度异常会导致粘纤毛清除缺陷，我们最近发现了一种独特的粘纤毛清除障碍，其特征是由于基因突变导致多运动纤毛(RGMC)的产生减少gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba-编码Cyclin O(参考文献)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.细胞周期蛋白O通过促进中心粒组装和成熟的过程来产生多个纤毛形成所必需的基体，这可能是这些细胞所特有的。引人注目的是,gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba位于染色体5q11上的基因附近，这些基因也与多毛细胞分化的早期方面有关gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。其中之一，gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba，编码一种核蛋白，称为多毛蛋白，它促进多毛细胞的形成gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍gydF4y2Ba皮肤和肾脏组织以及小鼠气道上皮细胞培养gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba，很可能是转录共激活剂。gydF4y2Ba

这里我们展示了突变gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba在人类中引起RGMC，强调了染色体区域5q11作为多纤体细胞分化的关键位点的重要性。gydF4y2Ba

突变分析确定了基因的隐性突变gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba

比利时个体BEL-1785II1的全外显子组测序，先前报道为睫状体发育不全患者gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba结果显示，在该基因的第5外显子中存在一个纯合无义突变c.441C >agydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba（gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba）.该突变导致过早终止密码子(p.Cys147*)，预测在蛋白质的螺旋结构域(CCDC)之前截断蛋白质，这对其功能至关重要。Sanger测序证实该突变，双亲均为杂合携带者，符合常染色体隐性遗传(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba）.gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba(CCDS54853)位于染色体5q11上，由7个外显子组成，编码一个1736 bp的转录本和385个氨基酸的蛋白。我们接下来进行了Sanger DNA测序gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba，包括外显子-内含子边界，在59个缺乏gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba突变。通过透射电子显微镜(TEM)、免疫荧光(IF)染色或两者均显示，所有受影响的个体纤毛数量减少。序列分析显示，另外三个家族共有8人出现双等位基因突变。在两名UCL-128巴基斯坦家族的患者中，检测到相同的c.441C>A (p.Cys147*) (gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba）.在一个大型以色列近亲血统OI-116/OP-34中，Soferman先前曾报道过gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba在一个高度保守的区域发现了一个纯合错义突变(c.1142 G> a;p. arg381 . he)在四个受影响的成员(gydF4y2Ba图1 b, cgydF4y2Ba）.纯合突变(c.1097 G;p.Gly366Asp)在土耳其BEL-1790家族的两兄弟中被发现。所有突变都不存在于1000个基因组数据库中，并且与常染色体隐性遗传一致分离。gydF4y2Ba

受影响个体的临床表型gydF4y2Ba

具有双等位基因的个体gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变表现出黏液纤毛清除障碍的典型症状，伴有上呼吸道(鼻炎、中耳炎、鼻息肉和鼻窦炎)和下呼吸道(复发性肺炎、支气管扩张、慢性阻塞性气道疾病;gydF4y2Ba图1 d, egydF4y2Ba）.所有个体均存在产后呼吸窘迫综合征。2例因呼吸功能不全死亡:BEL-1785, 27岁;UCL-128II1, 19岁，肺移植后2年。BEL-1790II1在27岁时出现慢性氧依赖。BEL-1785、UCL-128II1、UCL-128II2个体的鼻一氧化氮含量较低;OI-116II1, OI-116II2和BEL-1790II1和BEL-1790II3 (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)类似于PCD个体的诊断结果。9人均为双等位基因gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变是正常的gydF4y2Ba地点gydF4y2Ba这与先前的报道一致，表明在早期胚胎发生过程中，Multicilin在左右决定中没有功能作用gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。BEL-1785在此之后才怀孕gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba受精。这两个受影响的UCL-128双胞胎，以及两个兄弟BEL-1790II1、BEL-1790II3和BEL-1785已被逮捕gydF4y2Ba脑积水gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba）.可能，女性不育症(BEL-1785)和脑积水(UCL-128)的临床表现;贝尔- 1790;BEL-1785)分别与多睫状体输卵管和多睫状体室管膜细胞的RGMC有关，多睫状体室管膜细胞均密集分布有活动纤毛。室管膜纤毛运动在人类和小鼠脑积水的预防中具有重要作用gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。此外，输卵管纤毛运动缺陷被怀疑可能与女性不孕有关gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

p.Gly366Asp / p。arg381使内源性mcidas活性丧失gydF4y2Ba

验证检测到的氨基酸交换对c.1142 G . >A的影响;p.Arg381His家族i -116/OP-34和c.1097 G . >A;在BEL-1790家族p.Gly355Asp中，一个等效突变被引入gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍mcidasgydF4y2Ba(Arg370His/Gly355Asp)，并在功能获得实验中进行检测。如前所示，野生型异位表达gydF4y2BamcidasgydF4y2Ba在gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍gydF4y2Ba胚胎很容易诱导形成异位多毛细胞。然而，mcidas p.a g370his和p.a gly355asp在胚胎中的异位表达不会诱导异位多毛细胞，而是导致细胞数量减少和细胞大小增加，这是一种从表达缺乏保守c端TIRT结构域的mcidas形式的胚胎中已知的表型。gydF4y2BamcidasgydF4y2BaΔ334 - 374 (ref。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.事实是gydF4y2BamcidasgydF4y2Bap.Arg370His和p.Gly355Asp表现出相似的表型gydF4y2BamcidasgydF4y2BaΔ334-374表明这些突变使内源性McIdas在多纤毛虫细胞分化中的活性丧失(gydF4y2Ba附图1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

的表达gydF4y2BaMCIDAS, CCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BaCDC20BgydF4y2Ba

MCIDAS, CCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BamiRNA449a-cgydF4y2Ba在gydF4y2BaCDC20BgydF4y2Ba在保守的基因组区域中彼此相邻。接下来，我们使用定量PCR检测了这些基因在培养的人鼻上皮细胞纤毛发生过程中不同时间点的表达变化。这三个基因的表达在单层期非常低，在这个时间点上只有去分化，没有刺激多毛细胞的形成gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。细胞进入悬浮培养诱导纤毛发生和多纤毛细胞形成后不久，三种基因的表达均增加(gydF4y2Ba附图2gydF4y2Ba）.的坐标表达式gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba，gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BaCDC20BgydF4y2Ba是多运动纤毛(MMC)产生的保守特征，并进一步暗示MCIDAS在这一过程中。gydF4y2Ba

透射电镜显示纤毛数量减少，基底定位错误gydF4y2Ba

与MMC产生缺陷一致，我们通过透射电镜发现BEL-1785、UCL-128II1/II2、OI-116II1/II2和BEL-1790II1/II3的纤毛完全缺失或数量严重减少(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba）.顶端细胞区域微绒毛组成正常，但基小体(形成纤毛轴突的特殊中心粒)严重减少，表明MCIDAS功能障碍导致中心粒显著减少，而中心粒是MMC产生所必需的。偶尔，我们发现基底体在细胞质中定位错误。类似的TEM结果之前已经报道了OI-116II1/II2, OP-34II1/II2和BEL-1785gydF4y2Ba^{7 + 8gydF4y2Ba}。为了证实我们的发现，我们进行了实验gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba对BEL-1785、UCL-128II1/II2和BEL-1790II1/II3的原代呼吸细胞进行纤毛发生实验，证实了MMC代的缺陷。我们的TEM结果与gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba突变的呼吸细胞gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为了进一步研究观察到的MMC生成缺陷，我们从受影响个体OI-116II1/II2、BEL-1790II1/II3和健康对照中获得鼻呼吸道上皮细胞进行IF显微镜观察。针对乙酰化α-微管蛋白的抗体染色显示，与健康对照组相比，MMCs严重减少。纤毛定量显示，大多数呼吸细胞完全没有纤毛。少数有纤毛的呼吸细胞每个纤毛细胞只有一到两个纤毛。因此，我们的研究结果证实了MMC发生的严重缺陷gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变的细胞，类似于存在于gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba突变细胞gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为了进一步表征Multicilin的功能，我们通过western blot和IF分析分析了对照呼吸细胞中的蛋白表达。gydF4y2Ba

多毛蛋白在多毛细胞分化的对照细胞中定位于细胞核，而在完全分化的纤毛呼吸细胞中则不表达或表达极弱(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba）.相比之下，在受影响个体OI-116II1和OI-116II2的样本中，Multicilin分别不存在或严重减少(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Multicilin调控CCNO和FOXJ1的表达gydF4y2Ba

之前，我们报道CCNO作用于MCIDAS的下游gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaCCNO缺乏导致MMC生成减少。为了证实这些发现，我们分析了CCNO在gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变的呼吸细胞。与MCIDAS的上游功能一致，我们发现突变细胞中CCNO的表达严重降低或缺失(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)，进一步证明了Multicilin和CCNO在同一途径中起作用，任何一种蛋白的缺陷都会导致遗传性RGMC缺陷。Western blot分析在呼吸细胞裂解液中发现了预期大小的特定条带(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

先前已证明多毛素可诱导多毛发生相关基因的表达，如gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba是多毛细胞中中心粒组装和对接所必需的gydF4y2BaFOXJ1gydF4y2Ba这是中心粒对接和纤毛运动相关蛋白转录控制所必需的gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。为了进一步研究Multicilin如何促进多毛发生，我们分析了存在于细胞表面的少数残余纤毛是否含有轴突运动蛋白，如外动力蛋白臂重链DNAH5和连接蛋白-动力蛋白调节复合物相关蛋白CCDC39。有趣的是，与gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba突变细胞,gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变细胞缺乏任何轴突运动相关蛋白(gydF4y2Ba图4 a, bgydF4y2Ba）.这表明在gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变细胞不仅MMCs数量严重减少，而且纤毛运动相关蛋白(如DNAH5;CCDC39)被破坏。因此，我们在受影响和健康对照的呼吸道上皮细胞中染色FOXJ1(纤毛运动相关蛋白转录控制)(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba）.与轴突运动相关蛋白(DNAH5;CCDC39)， FOXJ1也在细胞核中缺失gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变体。因此，我们在人类呼吸细胞中的发现与先前报道的结果相符，表明Multicilin调节gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba(MMC代)和gydF4y2BaFOXJ1gydF4y2Ba(活动纤毛)产生gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

后核体介导的无中心途径需要MCIDASgydF4y2Ba

多毛细胞分化的基础是母体中心粒的大量膨胀，这种膨胀发生在一种叫做后小体的新结构上，多毛素可以诱导后小体异位生长gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。最近，发现了两个后体形成所需的蛋白，DEUP1和CCDC78(参考文献)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba）.因此，我们探索后体途径是否仍然活跃gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变细胞，通过分析表达gydF4y2BaCCDC78gydF4y2Ba在呼吸上皮细胞从gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba变异个体。这些细胞无法表达gydF4y2BaCCDC78gydF4y2Ba，提供了MCIDAS是人类呼吸细胞后核体介导的无中心装配途径所必需的遗传证据(gydF4y2Ba图3 e, fgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

总之，我们在gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba来自4个家族的9名患有先天性粘膜纤毛清除障碍的RGMC患者。gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba已经被证明可以诱导多毛细胞的产生gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍gydF4y2Ba皮肤和肾脏组织以及小鼠气道上皮细胞培养。我们已经证明了这一点gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba也是人类呼吸上皮中多纤毛细胞产生的必要条件，在纤毛产生的关键时期，其表达上调。gydF4y2Ba

突变gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba导致RGMC紊乱，伴有一些纤毛运动残余(CCNO型)gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba突变纤毛不表现出明显的轴突结构或跳动缺陷，这与PCD不同，PCD是由先天性呼吸纤毛跳动缺陷定义的。然而，基因突变gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba导致RGMC紊乱，有少量纤毛不动。这种缺陷也可以归类为一种新的PCD变体，因为gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变型纤毛表现出严重的轴突缺陷(缺乏纤毛运动相关蛋白)，不能运动，因此符合PCD的定义标准。我们的遗传发现强调了基因组区域包含的重要性gydF4y2BaCCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba作为多毛细胞分化的关键位点(gydF4y2Ba图3 ggydF4y2Ba)，并有助于这种慢性呼吸系统疾病的早期诊断。gydF4y2Ba

病人gydF4y2Ba

我们获得了受影响个体签署的知情同意，使用了由弗莱堡梅恩斯特大学和合作机构机构伦理审查委员会批准的协议。为了保护受影响个体的隐私(BEL-1785)，全外显子组分析的数据没有存储在公共或控制访问的数据库中。gydF4y2Ba

外显子组测序gydF4y2Ba

根据制造商推荐，使用DNA文库制备试剂盒TruSeq DNA Sample Prep kit v2 (Illumina)制备索引病例(BEL-1785)的DNA文库。根据制造商的建议，使用外显子组捕获试剂盒SeqCap EZ Human exome library v3.0 (Nimblegen)从该DNA文库中捕获部分外显子组。测序采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS和TruSeq SBS Kit v3-HS试剂盒(Illumina)，按照生产厂家的标准方案进行测序。测序在HiSeq 2000测序仪(Illumina)上进行。测序结果与hg19参考序列(gydF4y2Bahttp://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/databasegydF4y2Ba)，使用CLC Genomics Workbench软件CLCbio (gydF4y2Bahttp://www.clcbio.com/gydF4y2Ba）.使用CLC Genomics Workbench中的Probabilistic Variant Detection算法调用变体。该算法结合了贝叶斯模型和极大似然方法来计算贝叶斯模型的先验概率和误差概率。变异概率(贝叶斯方法的后验概率)的显著性设置为至少95。使用CLC Genomics Workbench，只需要在RefSeq基因的编码区和侧面30个核苷酸的编码深度至少为10个reads的位置上调用变异(gydF4y2Bahttp://genome.ucsc.edu/gydF4y2Ba)，而在SNP137 (gydF4y2Bahttp://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/gydF4y2Ba)数据库，也没有在12例特征性PCD患者中发现的内部全外显子组变异。gydF4y2Ba

突变分析gydF4y2Ba

采用标准方法从eb - barr病毒介导转化后的血液或淋巴细胞培养物中直接分离基因组DNA。包含所有外显子的六个基因组片段gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba像之前描述的那样被放大了吗gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

如果分析gydF4y2Ba

采用鼻刷活检法(Engelbrecht Medicine and Laboratory technology)获得呼吸道上皮细胞，悬浮于细胞培养基中。将样品铺在载玻片上，风干后保存在- 80°C以待使用。从鼻刷液中进行球形培养gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。在一抗(室温下2-3小时或4℃下过夜)和二抗(室温下25分钟)孵育前，细胞用4%多聚甲醛或100%冷藏甲醇、0.2% Triton X-100和1%脱脂牛奶处理。兔抗DNAH5多克隆抗体此前有报道gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。兔多克隆抗ccno(1:50)、抗mcidas(别名RP11-528L24.3, 1:500)、抗ccdc39(1:300)、抗ccdc78(1:100)。小鼠抗乙酰化微管蛋白单克隆抗体(1:10 000)和γ-微管蛋白单克隆抗体(1:500)分别来自Sigma公司和eBiosciences公司。兔多克隆抗cep164(1:200)购自Acris antibody公司，兔多克隆抗α/β-微管蛋白(1:300)购自Cell Signaling公司。高交叉吸收二抗来自Molecular Probes (Invitrogen)，包括Alexa Fluor 488偶联的山羊小鼠抗体(1:10 000,A11029)和Alexa Fluor 546偶联的山羊兔抗体(1:10 000,A11035)。DNA用Hoechst33342 (1:10 00, 14533-100MG, Sigma)染色。使用蔡司apoome Axiovert 200拍摄IF图像，并使用AxioVision 4.8和Adobe CS4进行处理。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

如前所述，从人呼吸道上皮细胞培养物中制备蛋白质提取物gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。蛋白质在NuPAGE 4-12%双-三凝胶(Invitrogen)上分离，并印迹到聚偏二氟乙烯膜(GE Healthcare)上。聚偏二氟乙烯过滤器在TBST中洗涤三次(每次10分钟)，然后在5%脱脂牛奶中在TBST中封闭，在4°C下过夜。滤片与一抗(用5%脱脂牛奶在TBST中稀释)在室温下孵育3小时或在4℃下过夜。滤网洗涤三次(每次10分钟)，然后与二抗山羊抗兔HRP抗体(1:3 000;NA934 (GE Healthcare)在室温下加热1小时。然后用Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare)用ECL冲洗滤网4次。使用FUSION-SL advanced Imager (PeqLab)对图像进行数字采集，并使用Adobe Photoshop v. CS4 (Adobe)对图像进行对比度修改。gydF4y2Ba

TEMgydF4y2Ba

从中鼻甲取鼻部活检。样品用2.5%戊二醛固定，用1.3%锇酸洗涤。将样品包埋在1,2-环氧丙烷- epon混合物(1:1)中，在4°C下过夜。聚合后，几个部分被挑出到铜网格上。切片用雷诺柠檬酸铅染色。透射电镜采用Philips CM10 (Philips)。gydF4y2Ba

Ciliogenesis过程gydF4y2Ba

通过穿孔活检获得呼吸道上皮细胞，并进行连续单层悬浮培养。部分活检标本制备TEM。纤毛发生后再次行透射电镜，以排除继发性损伤。gydF4y2Ba

首先，将活检样本带入单层培养(胶原层)，诱导呼吸上皮去分化和纤毛脱落。将分离的鼻上皮细胞播种并培养在几个T25培养瓶中，该培养瓶涂有胶原蛋白涂层(Life Technologies公司的培养基dmemm - ham’s F12)，并添加AB (50 U ml)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}青霉素50 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉素)和2% Ultroser G (Life Technologies)。3周后，当所有细胞都变成立方体并失去纤毛时，将细胞置于Life Technologies公司的DMEM-Ham's F12悬浮培养基中，并添加AB (50 U ml)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}青霉素50 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉素)和10% nu -血清(Becton Dickinson)，诱导纤毛上皮的球状形成和分化。这样，gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba纤毛发生是诱导的，继发性缺陷可以可靠地排除。gydF4y2Ba

实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

为了进行实时荧光定量PCR (quantitative PCR)，我们从3名对照鼻息肉患者的手术材料中分离出人鼻上皮细胞，并进行单层悬浮培养，结果显示纤毛活性正常。在纤毛发生的不同时间点(1周单层、2周单层、3周单层、3天悬浮、1周悬浮、10天悬浮、2周悬浮、3周悬浮)收集细胞。收集的细胞保存在−80°C。培养6周后，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)从培养的纤毛上皮细胞中提取RNA。对三个相邻基因进行定量PCR:gydF4y2BaMCIDAS, CCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BaCDC20BgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

利用Superscript逆转录酶II (Invitrogen)将3例对照患者纤毛发生过程中不同时间点培养的上皮细胞中提取的RNA (1 μg)逆转录为cDNA。gydF4y2Ba

在96孔透明光学反应板(Applied Biosystems)上对每位患者的三个基因进行实时荧光定量PCR (quantitative PCR)反应。每个反应在25 μl的溶液中进行，其中含有2 μl cDNA， × 1 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，每种正义和反义引物各200 nM。反应条件设置为95°C，持续10分钟，然后在ABI 7500系统(Applied Biosystems)上进行40个循环，95°C持续15秒，60°C持续1分钟。为了校正样品中存在的cDNA总量，在同一实验中扩增了两种不同的管家基因β2M (β2 -微球蛋白)和PPIA(亲环蛋白A)。gydF4y2Ba附图2gydF4y2Ba与两个内源性管家基因的几何平均值相比，显示了三个基因的负Ct(阈值循环)值。gydF4y2Ba

的表达分析gydF4y2BaMCIDAS, CCNOgydF4y2Ba和gydF4y2BaCDC20BgydF4y2Ba

利用上标逆转录酶II (Invitrogen)将RNA逆转录为cDNA。在两个不同的外显子中选择正向和反向引物。使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶试剂盒(Roche)进行扩增，每种引物分别为10 pmol(正向和反向)。使用以下温度进行扩增:在95°C下5分钟;35个循环，在95℃下30 s，在56℃下30 s，在72℃下1 min;在72°C和4°C下5分钟。gydF4y2Ba

用于PCR的引物列于gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba

如何引用这篇文章:gydF4y2Ba恩,M。gydF4y2Baet al。gydF4y2BaMCIDASgydF4y2Ba突变导致黏毛清除障碍与减少产生多个活动纤毛。gydF4y2BaCommun Nat。gydF4y2Ba[5:44 . 18] doi: 10.1038/ncomms5418(2014)。gydF4y2Ba

我们感谢所有受影响的患者、他们的家人和他们的照顾者参与这项研究。我们非常感谢德国患者支持小组“Kartagener综合征和原发性纤毛运动障碍”的帮助。我们感谢Cordula Westermann、Cordula Vorspohl、Laura Overkamp、Martina Herting、Simone Helms、Valerie vlaemink和Franz-Josef Seesing提供的技术援助。我们衷心感谢Mitali Patel和Alexandros Onoufriadis所做的工作。H.M.感谢行动医学研究(GN2101)和Milena Carvajal Pro-Kartagener基金会的资助。H. Omran实验室的工作由德国科学研究中心(DFG Om 6/4, DFG Om 6/5)，跨学科研究中心(IZKF Om2/009/12)明斯特(H. Omran)，欧洲共同体第七框架计划FP7/2009，根据拨款协议241955,SYSCILIA (H. Omran)和BESTCILIA，根据拨款协议305404 (H. Omran)， Schroeder Stiftung (H. Omran)和Kindness for Kids (H. Omran)资助。本文所报道的工作也得到了2011-R10150-003 (Koning Boudewijnstichting, Fonds Alphonse en Jean Forton)， IWT O&O 100500 (H.C.)和NIH拨款GM096021 (C.K.)的支持gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Mieke Boon和Julia Wallmeier:这两位作者对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 鲁汶大学医院儿科，儿科肺科，鲁汶3000，比利时gydF4y2Ba

   mike Boon, Kris De Boeck和Harry CuppensgydF4y2Ba

2. 明斯特大学医院儿科，明斯特48149，德国gydF4y2Ba

   Julia Wallmeier, Niki Tomas loes, Heike Olbrich, Gerard W. Dougherty, Johanna Raidt, Claudius Werner和Heymut OmrangydF4y2Ba

3. 美国索尔克生物研究所分子神经生物学实验室，加州圣地亚哥92186gydF4y2Ba

   莉娜·马和克里斯·金特纳gydF4y2Ba

4. 鲁汶大学医院耳鼻咽喉科，鲁汶，3000，比利时gydF4y2Ba

   Martine Jaspers和Mark JorissengydF4y2Ba

5. 以色列Bar IIan大学医学院Ziv医学中心儿科，以色列Safed 13100gydF4y2Ba

   以色列Amirav & revita AbitbulgydF4y2Ba

6. 哈达萨-希伯来大学医学中心肺科研究所，耶路撒冷，91120，以色列gydF4y2Ba

   Avigdor Hevroni & Avraham AvitalgydF4y2Ba

7. 特拉维夫苏拉斯基医疗中心，特拉维夫魏兹曼街6号，以色列，64239，达纳儿童医院，儿科肺科，重症监护和睡眠医学系gydF4y2Ba

   露丝SofermangydF4y2Ba

8. 荷兰鹿特丹，伊拉斯谟医学中心，临床遗传学系gydF4y2Ba

   马尔贾鞋号gydF4y2Ba

9. 伦敦大学学院儿童健康研究所呼吸、重症监护和麻醉科，大奥蒙德街儿童医院，英国伦敦吉尔福德街30号，WC1N 1EHgydF4y2Ba

   克里斯多夫奥卡拉汉gydF4y2Ba

10. 莱斯特大学感染系，PCD诊断与研究中心，免疫与炎症，RKCSB，莱斯特，le27lx，英国gydF4y2Ba

    Christopher O 'Callaghan, Andrew Rutman和Robert A. HirstgydF4y2Ba

11. 伦敦大学学院儿童健康研究所普通儿科和青少年儿科，伦敦吉尔福德街30号，英国，WC1N 1EHgydF4y2Ba

    钟明强gydF4y2Ba

12. 英国西约克郡布拉德福德大学布拉德福德皇家医院妇女和新生儿科妇女儿童服务部，bd96rjgydF4y2Ba

    爱德华多·莫亚gydF4y2Ba

13. 伦敦大学学院儿童健康研究所出生缺陷研究中心分子医学组，伦敦，WC1N 1EH，英国gydF4y2Ba

    汉娜·m·米奇森gydF4y2Ba

14. 根特大学医院儿科，儿科肺科，根特，9000，比利时gydF4y2Ba

    萨宾·范·戴尔gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

m.b.， m.j orissen, h.c.， J.W.和h.o Omran设计了这项研究。M.B.， J.W.和H. Omran撰写了这篇论文。h。c。n。t。l。动力局，h。奥尔布里希修改了论文。M. Jaspers, H.M.， H.C.， J.W.和H.Olbrich进行测序和测序分析。n.t.l进行了人呼吸道上皮细胞的生物化学实验。j.w.， c.w.， j.r.， m.j aspers和h.o Omran进行了电子显微镜研究和视频分析。m.j aspers和H.C.进行了定量PCR。C.K.和L.M.表演gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍gydF4y2Ba实验。文学硕士，文学硕士，文学硕士。和R.A.H.提供并分析了电子显微镜图片。M. b .， K.DeB, M. Jaspers和S.VanD。提供了比利时患者的临床资料。c.w.， i.a.， a.h.， r.a.， a.a.， r.s.， m.w.， c.o.。， E.M.C.K, E.M.提供了临床数据。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaHeymut奥木兰·gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

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